ICS07.100C53中華人民共和國國家標準GB15193.20—2003TK基因突變試驗TKgenemutationtest2003-09-24發(fā)布2004-05-01實施中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布中國國家標準化管理委員會

GB15193.20—2003本標準全文強制。本標準參考美國FDA營養(yǎng)素補充劑與食品安全中心食品添加劑安全辦公室發(fā)布的“食品成分安全評價毒理學(xué)原則2000年版紅皮書(2001年9月發(fā)布)：IV.C.1.c.小鼠淋巴瘤胸腺喀啶激酶基因突變試驗(IV.C.1.c,MouselymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssay)”。本標準由中華人民共和國衛(wèi)生部提出并歸口.本標準起草單位：四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院、中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所本標準主要起草人：張立實、張建清、帥培強、王怡凈。本標準首次發(fā)布。

GB15193.20—2003TK基因突變試驗范圍本標準規(guī)定了體外哺乳類細胞TK位點基因突變試驗的基本技術(shù)要求與方法本標準適用于評價食品生產(chǎn)、加工、保藏、運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的化學(xué)生物和物理因素的遺傳毒性，檢驗對象包括食品添加劑(含營養(yǎng)強化劑)、食品新資源及其成分、新資源食品、輻照食品、食品容器與包裝材料、食品工具、設(shè)備、洗滌劑、消毒劑、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、食品工業(yè)用微生物等。2原理TK基因突變試驗的檢測終點是胸苷激酶(thymidinekinase,TK)基因的突變。在人類，TK基因定位于17號染色體長臂遠端;在小鼠則定位于11號染色體。故TK基因的突變屬于常染色體基因TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷（TdR)生成胸苔酸（TMP)的反應(yīng)。在正常情況下,此反應(yīng)并非生命所必需，原因是體內(nèi)的「MP主要來自于脫氧尿喀啶核苷酸(dUMP).即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應(yīng)生成TMP。但如在細胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物（如三氟胸苷,即TFT一trifluorothymidine),則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸,進而摻入DNA,造成致死性突變，故細胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變,導(dǎo)致胸苷激酶缺陷,則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA,故細胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)出對TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù),計算突變頻率，以判定受試物的致突變性。3試劑與材料3.1細胞：15178Y「k+-3.7.2C小鼠淋巴瘤細胞。為清除自發(fā)突變的k--基因型細胞,在正式實驗前，應(yīng)使用含3g/mL胸甘,5g/mL次黃驃嶺,0.1Pg/mL氮甲碟嶺和7.5g/ml甘氮酸的THMG培養(yǎng)基中處理24h,離心、洗滌后在不含氨甲碟嶺的THMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天.3.2試劑：PBS磷酸鹽緩沖液，三氟胸香（trifluorothymidine）,次黃原吟（hypoxanthine）.甘氨酸（gly-cine），氨甲碟嶺(methotrexate),胸腺喀啶核苷(thymidine),陽性對照物(MMS,MMC,環(huán)磷酰胺等)。試驗設(shè)計-般應(yīng)進行細胞毒性預(yù)試驗，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，在相對存活率(relativesurvival,RS)為陰性對照組的20%～80%范圍內(nèi)設(shè)3個～4個劑量(濃度)水平。每次試驗均需設(shè)陰性(雙蒸水)對照.通常亦需設(shè)陽性對照。陽性對照通常使用MMS、EMS、MMC、CP(環(huán)磷酰胺)等。如使用非水溶劑,則亦需設(shè)溶劑對照。5操作步驃5.1培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件：含10%馬血清和適量抗菌素的RPMI1640培養(yǎng)液(96孔板培養(yǎng)時使用含20%馬血清的RPMI1640培養(yǎng)液).5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下作常規(guī)懸浮培養(yǎng)。5.2處理:取生長良好的細胞.調(diào)整密度為5×10°/mL,按1%體積加入受試物.3