第四章微生物優(yōu)良菌種的選育4BreedingoftheIndustrialStrains第四章微生物優(yōu)良菌種的選育4Breedingofth提綱微生物優(yōu)良生產(chǎn)菌種的特征自然突變選育誘變選育

原理基本方法雜交育種

細(xì)菌放線(xiàn)菌霉菌酵母菌原生質(zhì)體融合基因工程技術(shù)

基因表達(dá)系統(tǒng)利用大腸桿菌的基因表達(dá)系統(tǒng)利用酵母菌的基因表達(dá)系統(tǒng)基因工程菌的穩(wěn)定性提綱微生物優(yōu)良生產(chǎn)菌種的特征優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征對(duì)菌種的要求

1.生產(chǎn)力：能在廉價(jià)的培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)，所需的代謝產(chǎn)

物的產(chǎn)量高，其它代謝產(chǎn)物少2.操作性：培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，發(fā)酵易控制，產(chǎn)品易分離3.穩(wěn)定性：抗噬菌體能力強(qiáng)，菌種純，不易變異退化4.安全性：是非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征對(duì)菌種的要求優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征選擇生產(chǎn)菌種應(yīng)注意的因素1.原料方面：廣，轉(zhuǎn)化率高；2.產(chǎn)物方面：目的產(chǎn)物含量高，副產(chǎn)物少；3.菌體方面：生長(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)，耐受力強(qiáng)，抗污染、抗噬菌體能力強(qiáng)，遺傳特性穩(wěn)定4.設(shè)備方面：產(chǎn)泡沫少，適宜大罐生產(chǎn)。（培養(yǎng)條件要求低，周期短，需氧量小，抗污染能力強(qiáng)）

優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征選擇生產(chǎn)菌種應(yīng)注意的因素一、自然選育（spontaneousMutation）概念：不經(jīng)人工處理，利用微生物自然突變進(jìn)行的菌種選育的過(guò)程。自然突變的原因：多因素低劑量的誘變效應(yīng)；互變異構(gòu)效應(yīng)結(jié)果：負(fù)變大于正變，應(yīng)經(jīng)常分離純化優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，可與生產(chǎn)同步進(jìn)行。

缺點(diǎn)：頻率低，10-8—10-9/次分裂。自發(fā)突變的原因有三個(gè)層次：細(xì)胞外的原因(如紫外線(xiàn)、環(huán)境的化學(xué)突變劑等)；細(xì)胞內(nèi)的原因(代謝產(chǎn)生的突變因子，如亞硝酸、過(guò)氧化物等)；DNA分子內(nèi)的原因(堿基的互變異構(gòu)效應(yīng))。一、自然選育（spontaneousMutation）概念微生物優(yōu)良菌種的選育課件1、自然選育的內(nèi)容和作用對(duì)工業(yè)生產(chǎn)而言，自發(fā)突變的結(jié)果有兩種：菌種衰退(概率大)和菌種性能的提高(概率小)。定向培育(菌種馴化)利用微生物的自發(fā)突變，在特定的培養(yǎng)條件下或環(huán)境中培養(yǎng)微生物，篩選具有特殊性能的微生物的過(guò)程。卡介苗(BCGvaccine)

（230代，前后經(jīng)歷13年時(shí)間）、巴斯德定向選育炭疽桿菌疫苗。用特定的工業(yè)廢水馴化微生物得到能夠處理這種廢水的菌種。1、自然選育的內(nèi)容和作用對(duì)工業(yè)生產(chǎn)而言，自發(fā)突變的結(jié)果有兩種二、誘變選育誘導(dǎo)微生物發(fā)生突變進(jìn)行的菌種選育，包括誘變和篩選兩個(gè)步驟。概念：利用被稱(chēng)為誘變劑的物理因素或化學(xué)試劑處理微生物細(xì)胞，提高其基因突變頻率，再通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。原理：在誘變劑的作用下會(huì)出現(xiàn)染色體畸變（染色體或DNA片段發(fā)生缺失、易位、重復(fù)等）；基因突變(少數(shù)堿基改變)。二、誘變選育誘導(dǎo)微生物發(fā)生突變進(jìn)行的菌種選育，包括誘變和篩選影響誘變的因素：出發(fā)菌株（有一定生產(chǎn)能力，形態(tài)、生理強(qiáng)壯）；誘變劑的種類(lèi)（單一或復(fù)合）與劑量（不宜過(guò)高和過(guò)低，致死率：70-80％）。誘變劑：能提高基因突變頻率的物理、化學(xué)、生物因子。

篩選比誘變更重要。篩選的方法：通過(guò)選擇/鑒別培養(yǎng)基加以識(shí)別。

初篩→復(fù)篩→確定最佳發(fā)酵條件（負(fù)變多，正變少）影響誘變的因素：1、誘變選育的基本步驟1、誘變選育的基本步驟1、誘變選育的基本步驟選擇出發(fā)菌株具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；形態(tài)、生理強(qiáng)壯，產(chǎn)量較高；對(duì)誘變劑的敏感性大；變異幅度大。制備菌懸液盡可能均勻，避免因多細(xì)胞聚集造成誘變篩選得到的菌落不純。本身性能要好易經(jīng)誘變提高1、誘變選育的基本步驟選擇出發(fā)菌株本身性能要好易經(jīng)誘變提高誘變劑及劑量的選擇可以選擇單一誘變劑，也可以選擇復(fù)合誘變劑。常見(jiàn)的誘變劑包括：物理誘變劑，如紫外線(xiàn)、Ｘ射線(xiàn)、射線(xiàn)、激光、快中子等。化學(xué)誘變劑，如硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N－甲基-N’-N-亞硝基胍(NTG)、氮芥、乙烯亞胺等（烷化劑(alkylatingagent)），又如亞硝酸等（使堿基氧化脫氨基，AtoH,CtoU,GtoX

），又如5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、8-氮鳥(niǎo)嘌呤等（堿基類(lèi)似物）。誘變劑及劑量的選擇復(fù)合誘變劑使用兩種或數(shù)種誘變劑處理生產(chǎn)菌種，聯(lián)合使用的兩種或多種誘變劑稱(chēng)為復(fù)合誘變劑。增變因子：?jiǎn)为?dú)使用無(wú)誘變作用，但和誘變劑共同使用可以提高誘變效果乃至正突變頻率的物理或化學(xué)因素。復(fù)合誘變劑微生物優(yōu)良菌種的選育課件誘變劑量的表示方法可以直接用所使用的誘變劑的單位表示，如紫外線(xiàn)的強(qiáng)度、化學(xué)誘變劑的濃度和處理時(shí)間等。也可以用致死率表示。誘變劑量的選擇通常以致死率為依據(jù)，但須根據(jù)具體條件摸索。誘變劑量的表示方法變異菌株的篩選方案根據(jù)菌落的形態(tài)變化篩選根據(jù)特定產(chǎn)物的合成機(jī)理或菌種特性篩選抗代謝類(lèi)似物營(yíng)養(yǎng)缺陷型抗生素抗性菌株初篩（篩選的菌株多，不需要很精確）復(fù)篩（篩選的菌株少，需要很精確）用與生產(chǎn)條件相似的培養(yǎng)基培養(yǎng)突變株，對(duì)突變株的生產(chǎn)能力進(jìn)行驗(yàn)證。2、突變菌株的篩選篩選的重點(diǎn)在初篩(前面兩點(diǎn))，因?yàn)閺?fù)篩的工作量小。變異菌株的篩選方案2、突變菌株的篩選篩選的重點(diǎn)在初篩(前面兩2.1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選2.1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選野生型菌株：從自然界分離得到的微生物發(fā)生突變前的原始菌株，為野生型菌株（wildtypestrain）。營(yíng)養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)過(guò)人工誘變或者自然突變失去合成某種營(yíng)養(yǎng)（氨基酸，維生素，核酸等）的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺乏的營(yíng)養(yǎng)因子才能生長(zhǎng)，成為營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）。野生型菌株：從自然界分離得到的微生物發(fā)生突變前的原始菌株，為基本培養(yǎng)基：僅能滿(mǎn)足微生物野生型菌株生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基，成為基本培養(yǎng)基（minimalmedium,MM），有時(shí)用符號(hào)“[－]”來(lái)表示。不同微生物的基本培養(yǎng)基是不相同的。完全培養(yǎng)基：凡可滿(mǎn)足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或者半天然培養(yǎng)基，成為完全培養(yǎng)基（completemedium,CM），有時(shí)用符號(hào)“[+]”表示。完全培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，全面，一般可在基本培養(yǎng)基中加入富含氨基酸，維生素和堿基之類(lèi)的天然物質(zhì)配制而成?；九囵B(yǎng)基：僅能滿(mǎn)足微生物野生型菌株生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基，成為基2.1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選酶缺陷，結(jié)果造成中間產(chǎn)物積累；解除協(xié)同反饋，使另一分支末端產(chǎn)物積累；滲漏型突變（酶未完全喪失活性，下降），末端產(chǎn)物少，中間產(chǎn)物積累。方法？可使用影印平板法進(jìn)行篩選。完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)的菌落影印到基本培養(yǎng)基上，不長(zhǎng)的為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。2.1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選酶缺陷，結(jié)果造成中間產(chǎn)物積累；可2.2、抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种?/p>

突變株篩選調(diào)節(jié)基因或操縱基因突變，產(chǎn)生的阻遏蛋白與終產(chǎn)物不能結(jié)合或結(jié)合但不發(fā)生作用；方法：末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物篩選；（未突變者死）

2.2、抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种?/p>

突變株篩選調(diào)節(jié)基因或操縱基因2.3、組成型突變株篩選

誘導(dǎo)型依賴(lài)誘導(dǎo)物。組成型不依賴(lài)誘導(dǎo)物。突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因,解除對(duì)誘導(dǎo)物的依賴(lài),可獲組成型突變株。篩選方法：設(shè)計(jì)條件使組成型優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，或通過(guò)適當(dāng)方法分辨組成型菌落。

2.3、組成型突變株篩選誘導(dǎo)型依賴(lài)誘導(dǎo)物。組成篩選方法①加誘導(dǎo)酶合成抑制物如：加鄰硝基-β-D-巖藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。誘導(dǎo)型不能利用乳糖，不長(zhǎng)；組成型產(chǎn)酶，能利用乳糖，生長(zhǎng)，被富集。

②交替培養(yǎng)法含誘導(dǎo)物（乳糖）中培養(yǎng)——組成型快——不含誘導(dǎo)物（葡萄糖）中培養(yǎng)——誘導(dǎo)型失酶——反復(fù)。③顯色反應(yīng)法不含誘導(dǎo)物平板培養(yǎng)——加底物——分解（有顏色變化）——檢出。

篩選方法①加誘導(dǎo)酶合成抑制物2.4、抗（敏感）性突變株篩選包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體

①抗生素抗性突變：提高產(chǎn)量；

②抗噬菌體突變：消除噬菌體污染；③條件抗性突變：也稱(chēng)條件致死突變，如溫度

溫度敏感突變，乳糖短桿菌（谷氨酸產(chǎn)生菌）高溫呈營(yíng)養(yǎng)缺陷表型，在富含生物素的培養(yǎng)基中高溫培養(yǎng)，提高產(chǎn)量；

④物敏突變（檸檬酸轉(zhuǎn)化異檸檬酸）如：氟乙酸抑制順烏頭酸酶，氟乙酸敏感突變型，檸檬酸積累。

2.4、抗（敏感）性突變株篩選包括：抗生素、金屬離子、溫度、三、雜交育種

工業(yè)上長(zhǎng)期誘變會(huì)使菌種生活能力下降。借助有性重組，使不同菌株的遺傳物質(zhì)得以交換（獲優(yōu)良性狀集中的重組體）。

誘變育種：變異的范圍小，一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因發(fā)生突變，不太可能通過(guò)誘變獲得新產(chǎn)品；

雜交育種：變異的范圍大，可能導(dǎo)致大范圍遺傳物質(zhì)的改變，有可能通過(guò)雜交獲得新產(chǎn)品。雜交育種的思路類(lèi)似于農(nóng)作物或動(dòng)物的雜交思路，如A菌株產(chǎn)量高，但生長(zhǎng)慢；B菌株產(chǎn)量低，但生長(zhǎng)快。兩種雜交則有可能獲得產(chǎn)量高、生長(zhǎng)快的菌株。三、雜交育種工業(yè)上長(zhǎng)期誘變會(huì)使菌種生活能力下降。雜交1、細(xì)菌的雜交育種方法：轉(zhuǎn)化（transformation）、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）、接合（conjugation）。獲部分合子。出發(fā)菌株需帶遺傳標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷、抗生素抗性、溫敏、發(fā)酵性能。1、細(xì)菌的雜交育種方法：轉(zhuǎn)化（transformation）２、放線(xiàn)菌的雜交育種

基因重組過(guò)程近似細(xì)菌，育種方法與霉菌相似．放線(xiàn)菌的遺傳體系和雜交原理：異核現(xiàn)象：放線(xiàn)菌在雜交過(guò)程中，經(jīng)菌絲間接觸和融合形成異核體，同一細(xì)胞（菌絲）含不同基因型的核。無(wú)重組體出現(xiàn)。接合現(xiàn)象：發(fā)生部分染色體轉(zhuǎn)移（交換），形成部分合子。整+部分、部分+部分。異核系的形成：部分合子產(chǎn)生后形成的無(wú)性繁殖系。菌落很小，能在基本或選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。（單交換，二體區(qū)）重組體的形成：異核系不穩(wěn)定，可經(jīng)過(guò)雙交換形成重組子，產(chǎn)生重組子孢子。２、放線(xiàn)菌的雜交育種基因重組過(guò)程近似細(xì)菌，注意：兩個(gè)親本必需帶有遺傳標(biāo)記，如抗生素抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等，才能篩選重組體。注意：兩個(gè)親本必需帶有遺傳標(biāo)記，如抗生素抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等，放線(xiàn)菌的雜交方法混合培養(yǎng)法：兩互補(bǔ)缺陷型親株混合培養(yǎng)，制孢子懸液，選擇性平板分離。平板雜交法：一親株培養(yǎng)，形成孢子，影印至已分別鋪有另幾種孢子的平板上，獲孢子后再影印至選擇平板上。玻璃紙轉(zhuǎn)移法：兩親本需要雙標(biāo)記，混合帶紙培養(yǎng)，玻璃紙上長(zhǎng)出一層基內(nèi)菌絲，紙移至一選擇平板，獲異核系。解剖鏡下，小針收集小菌絲，于完全平板涂布，獲分離子。放線(xiàn)菌的雜交方法混合培養(yǎng)法：兩互補(bǔ)缺陷型親株混合培養(yǎng)，制孢３、霉菌的雜交育種

異核體的形成：兩不同性狀細(xì)胞（菌絲）連接，導(dǎo)致一細(xì)胞存在兩個(gè)不同遺傳型核。雜合二倍體形成；異核體偶爾發(fā)生不同核的融合，形成雜合核，為雙倍體。菌絲成斑點(diǎn)、扇面——扇變。體細(xì)胞重組：雜合二倍體只具有相對(duì)穩(wěn)定性，進(jìn)一步培養(yǎng)，繁殖過(guò)程發(fā)生染色體交換，單倍化，形成各種分離子。

３、霉菌的雜交育種異核體的形成：兩不同性狀細(xì)胞（菌絲）連接霉菌的雜交技術(shù)

誘變獲具標(biāo)記的親本。異核體的形成：基本培養(yǎng)基上，強(qiáng)迫進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)。還可用多種方法。雙倍體檢出：可從扇面上挑孢子分離。分離子檢出：雜合二倍體單孢子平板分離，檢菌落斑點(diǎn)或扇面，斑點(diǎn)處挑孢子至斜面，再純化鑒別。霉菌的雜交技術(shù)誘變獲具標(biāo)記的親本。４、酵母菌的雜交育種雙單特性：存在單倍體和二倍體的生活史

二倍體生活力強(qiáng)，生產(chǎn)能力高，可通過(guò)雜交得二倍體來(lái)育種。方法：首先獲得單倍體細(xì)胞；二倍體菌落大，橢圓形，可形成子囊。雜交。

雜交方式：孢子與孢子交配；孢子與單倍體細(xì)胞交配；單倍體細(xì)胞間交配。例：卡爾酵母，糖化酵母

４、酵母菌的雜交育種雙單特性：存在單倍體和二倍體的生活史四、原生質(zhì)體融合育種1、基本概念原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)：在高滲的條件下把兩個(gè)親本的細(xì)胞壁通過(guò)酶解瓦解，得到原生質(zhì)體，并在助融合劑（如PEG，Ca，Mg離子）或電擊的作用下使兩個(gè)親本的原生質(zhì)體發(fā)生融合的過(guò)程。原生質(zhì)體：在高滲溶液中除去細(xì)胞壁的細(xì)胞。四、原生質(zhì)體融合育種1、基本概念2、原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)勢(shì)沒(méi)有供體和受體之分，適用面廣，受親緣關(guān)系的限制??；打破了微生物的種界界限，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組。重組頻率高；遺傳物質(zhì)的傳遞更加充分2、原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)勢(shì)沒(méi)有供體和受體之分，適用面廣，受親3、原生質(zhì)體融合的步驟3、原生質(zhì)體融合的步驟

革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成溶菌酶微球菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌革蘭氏陰性菌不能直接溶壁，只有當(dāng)乙二胺四乙酸（EDTA）存在時(shí)，某些革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁才能夠被溶菌酶溶解。金黃色葡萄球菌溶菌酶不能溶解表皮葡萄球菌能產(chǎn)生一種內(nèi)肽酶——葡萄球菌素，溶解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成溶菌酶微球菌、枯草放線(xiàn)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類(lèi)似于革蘭氏陽(yáng)性菌也可采用溶菌酶真菌細(xì)胞壁主要由纖維素、幾丁質(zhì)和葡聚糖等組成青霉菌多用纖維素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等酵母菌細(xì)胞壁中的葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶或者EDTA處理后加細(xì)胞壁溶解酶放線(xiàn)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類(lèi)似于革蘭氏陽(yáng)性菌也可采用溶菌酶真菌細(xì)胞壁微生物優(yōu)良菌種的選育課件4、原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用：

選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株產(chǎn)生新的產(chǎn)物4、原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用：五、基因工程育種

精確的定向育種，技術(shù)含量高，應(yīng)用面廣。應(yīng)用：解決了一些藥物或材料來(lái)源困難，或制造技術(shù)復(fù)雜，或造價(jià)昂貴而無(wú)法大量生產(chǎn)和應(yīng)用的問(wèn)題。

1982年第一個(gè)基因工程產(chǎn)品-重組人胰島素（一）基因表達(dá)系統(tǒng)

從育種的角度考慮，最重要的是目的基因的高效表達(dá)。１.原核表達(dá)系統(tǒng)；２.真核表達(dá)系統(tǒng)．五、基因工程育種精確的定向育種，技術(shù)含量高，應(yīng)用１、原核表達(dá)系統(tǒng)原核生物不適宜表達(dá)需后加工處理的那一部分真核基因不能切除mRNA的內(nèi)含子；不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的糖基化；不能對(duì)氨基酸進(jìn)行修飾。①大腸桿菌：遺傳背景清楚；基因操作簡(jiǎn)便；易培養(yǎng)，世代短，生長(zhǎng)快；適宜大規(guī)模生產(chǎn)．注意：真核蛋白后修飾；多為胞內(nèi)產(chǎn)物；產(chǎn)物分離純化困難；內(nèi)毒素；蛋白酶破壞產(chǎn)物；免疫反應(yīng)。②枯草芽孢桿菌：優(yōu)點(diǎn)，分泌能力強(qiáng)；缺點(diǎn)，胞外蛋白酶強(qiáng)．③鏈霉菌：使用安全；分泌能力強(qiáng)。１、原核表達(dá)系統(tǒng)原核生物不適宜表達(dá)需后加工處理的那一部分真核２、真核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)具有一致的生理生化功能①酵母：真核生物蛋白質(zhì)的優(yōu)良表達(dá)系統(tǒng)

優(yōu)點(diǎn)：基因組小，操作方便；世代周期短，易培養(yǎng)；有單、雙倍體形式；能糖基化；能分泌產(chǎn)物到胞外。

應(yīng)用：干擾素、乙肝表面抗原基因已經(jīng)成功表達(dá)；釀酒酵母研究、應(yīng)用最廣泛。②絲狀真菌：

特點(diǎn)：能進(jìn)行翻譯后加工；表達(dá)產(chǎn)物分泌能力強(qiáng)；安全；發(fā)酵、純化工藝成熟。２、真核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)具有一致的生理生化功（二）利用大腸桿菌的基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因在大腸桿菌中的成功表達(dá)與表達(dá)載體、外源基因的調(diào)控序列等有關(guān)１.表達(dá)載體條件：①能獨(dú)立復(fù)制；②有靈活的多克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，位點(diǎn)位于起動(dòng)子后；③有很強(qiáng)的起動(dòng)子，能被大腸桿菌的RNA聚合酶識(shí)別；④有使起動(dòng)子受抑制的阻遏子，受誘導(dǎo)時(shí)才轉(zhuǎn)錄，可人為的通過(guò)理化因素選擇啟動(dòng)時(shí)機(jī)；⑤有很強(qiáng)的終止子，使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因；克服質(zhì)粒高轉(zhuǎn)錄引起的質(zhì)粒不穩(wěn)定。⑥產(chǎn)生的mRNA須有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼

AUG和SD序列。（二）利用大腸桿菌的基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因在大腸桿菌中的成功表２、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素

目的基因的表達(dá)產(chǎn)量與每個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)量和細(xì)胞濃度正相關(guān)。影響因素：①外源基因的拷貝數(shù)；②外源基因的表達(dá)頻率：

啟動(dòng)子的強(qiáng)度（轉(zhuǎn)錄水平）；起始密碼子AUG和SD序列的間距；核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性③表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性；融合蛋白及非融合蛋白，利用信號(hào)肽將產(chǎn)物運(yùn)送到細(xì)胞周質(zhì)空隙中。④細(xì)胞的代謝負(fù)荷。大量的外源基因表達(dá)會(huì)打破宿主代謝平衡。２、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素目的基因３、在大腸桿菌中真核基因的表達(dá)形式融合蛋白：N端原核序列，C端真核序列

表達(dá)高效、穩(wěn)定，但影響免疫原性，可酶切。非融合蛋白：保持生物活性，但易被水解

N端常帶甲硫氨酸，引起人體免疫反應(yīng)。分泌表達(dá)蛋白：使外源基因連接到編碼原核蛋白信號(hào)肽下游，構(gòu)建分泌表達(dá)質(zhì)粒。

常用信號(hào)肽堿性磷酸酶信號(hào)肽（PhoA）、胞外周質(zhì)蛋白信號(hào)肽（OmpA）、霍亂弧菌B亞單位信號(hào)肽（CTXB）。在周質(zhì)空間酶切，釋放產(chǎn)物。

３、在大腸桿菌中真核基因的表達(dá)形式融合蛋白：N端原核序列，C（三）利用酵母菌的基因表達(dá)系統(tǒng)１.載體系統(tǒng)：多用穿梭載體，同時(shí)帶有細(xì)菌和酵母復(fù)制原點(diǎn)和選擇標(biāo)記，在兩者中復(fù)制、選擇。①克隆載體（復(fù)制序列）酵母附加質(zhì)粒(YEP)酵母復(fù)制型質(zhì)粒(YRP)酵母著絲粒質(zhì)粒(YCP)酵母整合型質(zhì)粒(YIP)（三）利用酵母菌的基因表達(dá)系統(tǒng)１.載體系統(tǒng)：多用穿梭載體，同１.載體系統(tǒng)②表達(dá)載體

在克隆載體中插入酵母表達(dá)盒和終止子等調(diào)控序列,即可構(gòu)建酵母表達(dá)載體。需糖基化才有生物功能的重組蛋白必須是分泌型蛋白.要在外源DNA上游加前導(dǎo)肽序列。用啤酒酵母表達(dá)分泌型外源蛋白時(shí)，要求前導(dǎo)肽C端是賴(lài)—精，其內(nèi)切酶可識(shí)，切。１.載體系統(tǒng)②表達(dá)載體２、影響外源基因在酵母中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)，穩(wěn)定性，整合位置；外源基因的表達(dá)效率：

啟動(dòng)子：有上游激活序列、近端啟動(dòng)子TATA序列（轉(zhuǎn)錄必須）、mRNA起始密碼子；組成型，誘導(dǎo)型。

分泌信號(hào)：包括信號(hào)肽、前導(dǎo)肽序列；

終止序列：保證產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)奈恢媒K止；外源蛋白的糖基化：與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相同，分泌過(guò)程中發(fā)生N-糖苷鍵和O-糖苷鍵連接的兩種糖基化，其產(chǎn)物與天然產(chǎn)物相同．宿主菌株的影響：生長(zhǎng)力強(qiáng)、內(nèi)源蛋白酶弱、性能穩(wěn)定、分泌力強(qiáng)，用二、多倍體。２、影響外源基因在酵母中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)，（四）基因工程菌的穩(wěn)定性分裂不穩(wěn)定：分裂時(shí)，出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失、堿基重排或缺失。1.影響因素：（常見(jiàn)是分裂不穩(wěn)定）①產(chǎn)不含質(zhì)粒的子代菌的頻率；②兩種菌的比生長(zhǎng)速率。

質(zhì)粒拷貝數(shù)低時(shí)，可增加，但不宜太高（生長(zhǎng)負(fù)勢(shì)）。

2.提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法：兩段培養(yǎng)法（先長(zhǎng)菌，后表達(dá)，使比生長(zhǎng)速率差別減?。豢刂婆囵B(yǎng)條件（某些質(zhì)粒菌對(duì)環(huán)境改變的反應(yīng)比不含質(zhì)粒的差，溫度、PH、培養(yǎng)基組分、溶解氧）。（四）基因工程菌的穩(wěn)定性分裂不穩(wěn)定：分裂時(shí)，出現(xiàn)一定比例不含本章知識(shí)結(jié)構(gòu)1、微生物優(yōu)良生產(chǎn)菌種的特征2、自然突變選育3、★誘變選育4、★雜交育種5、★原生質(zhì)體融合

6、基因工程技術(shù)本章知識(shí)結(jié)構(gòu)1、微生物優(yōu)良生產(chǎn)菌種的特征ThanksforYourAttention!ThanksforYourAttention!第四章微生物優(yōu)良菌種的選育4BreedingoftheIndustrialStrains第四章微生物優(yōu)良菌種的選育4Breedingofth提綱微生物優(yōu)良生產(chǎn)菌種的特征自然突變選育誘變選育

原理基本方法雜交育種

細(xì)菌放線(xiàn)菌霉菌酵母菌原生質(zhì)體融合基因工程技術(shù)

基因表達(dá)系統(tǒng)利用大腸桿菌的基因表達(dá)系統(tǒng)利用酵母菌的基因表達(dá)系統(tǒng)基因工程菌的穩(wěn)定性提綱微生物優(yōu)良生產(chǎn)菌種的特征優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征對(duì)菌種的要求

1.生產(chǎn)力：能在廉價(jià)的培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)，所需的代謝產(chǎn)

物的產(chǎn)量高，其它代謝產(chǎn)物少2.操作性：培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，發(fā)酵易控制，產(chǎn)品易分離3.穩(wěn)定性：抗噬菌體能力強(qiáng)，菌種純，不易變異退化4.安全性：是非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征對(duì)菌種的要求優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征選擇生產(chǎn)菌種應(yīng)注意的因素1.原料方面：廣，轉(zhuǎn)化率高；2.產(chǎn)物方面：目的產(chǎn)物含量高，副產(chǎn)物少；3.菌體方面：生長(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)，耐受力強(qiáng)，抗污染、抗噬菌體能力強(qiáng)，遺傳特性穩(wěn)定4.設(shè)備方面：產(chǎn)泡沫少，適宜大罐生產(chǎn)。（培養(yǎng)條件要求低，周期短，需氧量小，抗污染能力強(qiáng)）

優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征選擇生產(chǎn)菌種應(yīng)注意的因素一、自然選育（spontaneousMutation）概念：不經(jīng)人工處理，利用微生物自然突變進(jìn)行的菌種選育的過(guò)程。自然突變的原因：多因素低劑量的誘變效應(yīng)；互變異構(gòu)效應(yīng)結(jié)果：負(fù)變大于正變，應(yīng)經(jīng)常分離純化優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，可與生產(chǎn)同步進(jìn)行。

缺點(diǎn)：頻率低，10-8—10-9/次分裂。自發(fā)突變的原因有三個(gè)層次：細(xì)胞外的原因(如紫外線(xiàn)、環(huán)境的化學(xué)突變劑等)；細(xì)胞內(nèi)的原因(代謝產(chǎn)生的突變因子，如亞硝酸、過(guò)氧化物等)；DNA分子內(nèi)的原因(堿基的互變異構(gòu)效應(yīng))。一、自然選育（spontaneousMutation）概念微生物優(yōu)良菌種的選育課件1、自然選育的內(nèi)容和作用對(duì)工業(yè)生產(chǎn)而言，自發(fā)突變的結(jié)果有兩種：菌種衰退(概率大)和菌種性能的提高(概率小)。定向培育(菌種馴化)利用微生物的自發(fā)突變，在特定的培養(yǎng)條件下或環(huán)境中培養(yǎng)微生物，篩選具有特殊性能的微生物的過(guò)程?？ń槊?BCGvaccine)

（230代，前后經(jīng)歷13年時(shí)間）、巴斯德定向選育炭疽桿菌疫苗。用特定的工業(yè)廢水馴化微生物得到能夠處理這種廢水的菌種。1、自然選育的內(nèi)容和作用對(duì)工業(yè)生產(chǎn)而言，自發(fā)突變的結(jié)果有兩種二、誘變選育誘導(dǎo)微生物發(fā)生突變進(jìn)行的菌種選育，包括誘變和篩選兩個(gè)步驟。概念：利用被稱(chēng)為誘變劑的物理因素或化學(xué)試劑處理微生物細(xì)胞，提高其基因突變頻率，再通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。原理：在誘變劑的作用下會(huì)出現(xiàn)染色體畸變（染色體或DNA片段發(fā)生缺失、易位、重復(fù)等）；基因突變(少數(shù)堿基改變)。二、誘變選育誘導(dǎo)微生物發(fā)生突變進(jìn)行的菌種選育，包括誘變和篩選影響誘變的因素：出發(fā)菌株（有一定生產(chǎn)能力，形態(tài)、生理強(qiáng)壯）；誘變劑的種類(lèi)（單一或復(fù)合）與劑量（不宜過(guò)高和過(guò)低，致死率：70-80％）。誘變劑：能提高基因突變頻率的物理、化學(xué)、生物因子。

篩選比誘變更重要。篩選的方法：通過(guò)選擇/鑒別培養(yǎng)基加以識(shí)別。

初篩→復(fù)篩→確定最佳發(fā)酵條件（負(fù)變多，正變少）影響誘變的因素：1、誘變選育的基本步驟1、誘變選育的基本步驟1、誘變選育的基本步驟選擇出發(fā)菌株具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；形態(tài)、生理強(qiáng)壯，產(chǎn)量較高；對(duì)誘變劑的敏感性大；變異幅度大。制備菌懸液盡可能均勻，避免因多細(xì)胞聚集造成誘變篩選得到的菌落不純。本身性能要好易經(jīng)誘變提高1、誘變選育的基本步驟選擇出發(fā)菌株本身性能要好易經(jīng)誘變提高誘變劑及劑量的選擇可以選擇單一誘變劑，也可以選擇復(fù)合誘變劑。常見(jiàn)的誘變劑包括：物理誘變劑，如紫外線(xiàn)、Ｘ射線(xiàn)、射線(xiàn)、激光、快中子等?；瘜W(xué)誘變劑，如硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N－甲基-N’-N-亞硝基胍(NTG)、氮芥、乙烯亞胺等（烷化劑(alkylatingagent)），又如亞硝酸等（使堿基氧化脫氨基，AtoH,CtoU,GtoX

），又如5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、8-氮鳥(niǎo)嘌呤等（堿基類(lèi)似物）。誘變劑及劑量的選擇復(fù)合誘變劑使用兩種或數(shù)種誘變劑處理生產(chǎn)菌種，聯(lián)合使用的兩種或多種誘變劑稱(chēng)為復(fù)合誘變劑。增變因子：?jiǎn)为?dú)使用無(wú)誘變作用，但和誘變劑共同使用可以提高誘變效果乃至正突變頻率的物理或化學(xué)因素。復(fù)合誘變劑微生物優(yōu)良菌種的選育課件誘變劑量的表示方法可以直接用所使用的誘變劑的單位表示，如紫外線(xiàn)的強(qiáng)度、化學(xué)誘變劑的濃度和處理時(shí)間等。也可以用致死率表示。誘變劑量的選擇通常以致死率為依據(jù)，但須根據(jù)具體條件摸索。誘變劑量的表示方法變異菌株的篩選方案根據(jù)菌落的形態(tài)變化篩選根據(jù)特定產(chǎn)物的合成機(jī)理或菌種特性篩選抗代謝類(lèi)似物營(yíng)養(yǎng)缺陷型抗生素抗性菌株初篩（篩選的菌株多，不需要很精確）復(fù)篩（篩選的菌株少，需要很精確）用與生產(chǎn)條件相似的培養(yǎng)基培養(yǎng)突變株，對(duì)突變株的生產(chǎn)能力進(jìn)行驗(yàn)證。2、突變菌株的篩選篩選的重點(diǎn)在初篩(前面兩點(diǎn))，因?yàn)閺?fù)篩的工作量小。變異菌株的篩選方案2、突變菌株的篩選篩選的重點(diǎn)在初篩(前面兩2.1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選2.1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選野生型菌株：從自然界分離得到的微生物發(fā)生突變前的原始菌株，為野生型菌株（wildtypestrain）。營(yíng)養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)過(guò)人工誘變或者自然突變失去合成某種營(yíng)養(yǎng)（氨基酸，維生素，核酸等）的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺乏的營(yíng)養(yǎng)因子才能生長(zhǎng)，成為營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）。野生型菌株：從自然界分離得到的微生物發(fā)生突變前的原始菌株，為基本培養(yǎng)基：僅能滿(mǎn)足微生物野生型菌株生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基，成為基本培養(yǎng)基（minimalmedium,MM），有時(shí)用符號(hào)“[－]”來(lái)表示。不同微生物的基本培養(yǎng)基是不相同的。完全培養(yǎng)基：凡可滿(mǎn)足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或者半天然培養(yǎng)基，成為完全培養(yǎng)基（completemedium,CM），有時(shí)用符號(hào)“[+]”表示。完全培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，全面，一般可在基本培養(yǎng)基中加入富含氨基酸，維生素和堿基之類(lèi)的天然物質(zhì)配制而成。基本培養(yǎng)基：僅能滿(mǎn)足微生物野生型菌株生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基，成為基2.1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選酶缺陷，結(jié)果造成中間產(chǎn)物積累；解除協(xié)同反饋，使另一分支末端產(chǎn)物積累；滲漏型突變（酶未完全喪失活性，下降），末端產(chǎn)物少，中間產(chǎn)物積累。方法？可使用影印平板法進(jìn)行篩選。完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)的菌落影印到基本培養(yǎng)基上，不長(zhǎng)的為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。2.1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選酶缺陷，結(jié)果造成中間產(chǎn)物積累；可2.2、抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种?/p>

突變株篩選調(diào)節(jié)基因或操縱基因突變，產(chǎn)生的阻遏蛋白與終產(chǎn)物不能結(jié)合或結(jié)合但不發(fā)生作用；方法：末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物篩選；（未突變者死）

2.2、抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种?/p>

突變株篩選調(diào)節(jié)基因或操縱基因2.3、組成型突變株篩選

誘導(dǎo)型依賴(lài)誘導(dǎo)物。組成型不依賴(lài)誘導(dǎo)物。突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因,解除對(duì)誘導(dǎo)物的依賴(lài),可獲組成型突變株。篩選方法：設(shè)計(jì)條件使組成型優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，或通過(guò)適當(dāng)方法分辨組成型菌落。

2.3、組成型突變株篩選誘導(dǎo)型依賴(lài)誘導(dǎo)物。組成篩選方法①加誘導(dǎo)酶合成抑制物如：加鄰硝基-β-D-巖藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。誘導(dǎo)型不能利用乳糖，不長(zhǎng)；組成型產(chǎn)酶，能利用乳糖，生長(zhǎng)，被富集。

②交替培養(yǎng)法含誘導(dǎo)物（乳糖）中培養(yǎng)——組成型快——不含誘導(dǎo)物（葡萄糖）中培養(yǎng)——誘導(dǎo)型失酶——反復(fù)。③顯色反應(yīng)法不含誘導(dǎo)物平板培養(yǎng)——加底物——分解（有顏色變化）——檢出。

篩選方法①加誘導(dǎo)酶合成抑制物2.4、抗（敏感）性突變株篩選包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體

①抗生素抗性突變：提高產(chǎn)量；

②抗噬菌體突變：消除噬菌體污染；③條件抗性突變：也稱(chēng)條件致死突變，如溫度

溫度敏感突變，乳糖短桿菌（谷氨酸產(chǎn)生菌）高溫呈營(yíng)養(yǎng)缺陷表型，在富含生物素的培養(yǎng)基中高溫培養(yǎng)，提高產(chǎn)量；

④物敏突變（檸檬酸轉(zhuǎn)化異檸檬酸）如：氟乙酸抑制順烏頭酸酶，氟乙酸敏感突變型，檸檬酸積累。

2.4、抗（敏感）性突變株篩選包括：抗生素、金屬離子、溫度、三、雜交育種

工業(yè)上長(zhǎng)期誘變會(huì)使菌種生活能力下降。借助有性重組，使不同菌株的遺傳物質(zhì)得以交換（獲優(yōu)良性狀集中的重組體）。

誘變育種：變異的范圍小，一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因發(fā)生突變，不太可能通過(guò)誘變獲得新產(chǎn)品；

雜交育種：變異的范圍大，可能導(dǎo)致大范圍遺傳物質(zhì)的改變，有可能通過(guò)雜交獲得新產(chǎn)品。雜交育種的思路類(lèi)似于農(nóng)作物或動(dòng)物的雜交思路，如A菌株產(chǎn)量高，但生長(zhǎng)慢；B菌株產(chǎn)量低，但生長(zhǎng)快。兩種雜交則有可能獲得產(chǎn)量高、生長(zhǎng)快的菌株。三、雜交育種工業(yè)上長(zhǎng)期誘變會(huì)使菌種生活能力下降。雜交1、細(xì)菌的雜交育種方法：轉(zhuǎn)化（transformation）、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）、接合（conjugation）。獲部分合子。出發(fā)菌株需帶遺傳標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷、抗生素抗性、溫敏、發(fā)酵性能。1、細(xì)菌的雜交育種方法：轉(zhuǎn)化（transformation）２、放線(xiàn)菌的雜交育種

基因重組過(guò)程近似細(xì)菌，育種方法與霉菌相似．放線(xiàn)菌的遺傳體系和雜交原理：異核現(xiàn)象：放線(xiàn)菌在雜交過(guò)程中，經(jīng)菌絲間接觸和融合形成異核體，同一細(xì)胞（菌絲）含不同基因型的核。無(wú)重組體出現(xiàn)。接合現(xiàn)象：發(fā)生部分染色體轉(zhuǎn)移（交換），形成部分合子。整+部分、部分+部分。異核系的形成：部分合子產(chǎn)生后形成的無(wú)性繁殖系。菌落很小，能在基本或選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。（單交換，二體區(qū)）重組體的形成：異核系不穩(wěn)定，可經(jīng)過(guò)雙交換形成重組子，產(chǎn)生重組子孢子。２、放線(xiàn)菌的雜交育種基因重組過(guò)程近似細(xì)菌，注意：兩個(gè)親本必需帶有遺傳標(biāo)記，如抗生素抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等，才能篩選重組體。注意：兩個(gè)親本必需帶有遺傳標(biāo)記，如抗生素抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等，放線(xiàn)菌的雜交方法混合培養(yǎng)法：兩互補(bǔ)缺陷型親株混合培養(yǎng)，制孢子懸液，選擇性平板分離。平板雜交法：一親株培養(yǎng)，形成孢子，影印至已分別鋪有另幾種孢子的平板上，獲孢子后再影印至選擇平板上。玻璃紙轉(zhuǎn)移法：兩親本需要雙標(biāo)記，混合帶紙培養(yǎng)，玻璃紙上長(zhǎng)出一層基內(nèi)菌絲，紙移至一選擇平板，獲異核系。解剖鏡下，小針收集小菌絲，于完全平板涂布，獲分離子。放線(xiàn)菌的雜交方法混合培養(yǎng)法：兩互補(bǔ)缺陷型親株混合培養(yǎng)，制孢３、霉菌的雜交育種

異核體的形成：兩不同性狀細(xì)胞（菌絲）連接，導(dǎo)致一細(xì)胞存在兩個(gè)不同遺傳型核。雜合二倍體形成；異核體偶爾發(fā)生不同核的融合，形成雜合核，為雙倍體。菌絲成斑點(diǎn)、扇面——扇變。體細(xì)胞重組：雜合二倍體只具有相對(duì)穩(wěn)定性，進(jìn)一步培養(yǎng)，繁殖過(guò)程發(fā)生染色體交換，單倍化，形成各種分離子。

３、霉菌的雜交育種異核體的形成：兩不同性狀細(xì)胞（菌絲）連接霉菌的雜交技術(shù)

誘變獲具標(biāo)記的親本。異核體的形成：基本培養(yǎng)基上，強(qiáng)迫進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)。還可用多種方法。雙倍體檢出：可從扇面上挑孢子分離。分離子檢出：雜合二倍體單孢子平板分離，檢菌落斑點(diǎn)或扇面，斑點(diǎn)處挑孢子至斜面，再純化鑒別。霉菌的雜交技術(shù)誘變獲具標(biāo)記的親本。４、酵母菌的雜交育種雙單特性：存在單倍體和二倍體的生活史

二倍體生活力強(qiáng)，生產(chǎn)能力高，可通過(guò)雜交得二倍體來(lái)育種。方法：首先獲得單倍體細(xì)胞；二倍體菌落大，橢圓形，可形成子囊。雜交。

雜交方式：孢子與孢子交配；孢子與單倍體細(xì)胞交配；單倍體細(xì)胞間交配。例：卡爾酵母，糖化酵母

４、酵母菌的雜交育種雙單特性：存在單倍體和二倍體的生活史四、原生質(zhì)體融合育種1、基本概念原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)：在高滲的條件下把兩個(gè)親本的細(xì)胞壁通過(guò)酶解瓦解，得到原生質(zhì)體，并在助融合劑（如PEG，Ca，Mg離子）或電擊的作用下使兩個(gè)親本的原生質(zhì)體發(fā)生融合的過(guò)程。原生質(zhì)體：在高滲溶液中除去細(xì)胞壁的細(xì)胞。四、原生質(zhì)體融合育種1、基本概念2、原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)勢(shì)沒(méi)有供體和受體之分，適用面廣，受親緣關(guān)系的限制小；打破了微生物的種界界限，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組。重組頻率高；遺傳物質(zhì)的傳遞更加充分2、原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)勢(shì)沒(méi)有供體和受體之分，適用面廣，受親3、原生質(zhì)體融合的步驟3、原生質(zhì)體融合的步驟

革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成溶菌酶微球菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌革蘭氏陰性菌不能直接溶壁，只有當(dāng)乙二胺四乙酸（EDTA）存在時(shí)，某些革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁才能夠被溶菌酶溶解。金黃色葡萄球菌溶菌酶不能溶解表皮葡萄球菌能產(chǎn)生一種內(nèi)肽酶——葡萄球菌素，溶解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成溶菌酶微球菌、枯草放線(xiàn)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類(lèi)似于革蘭氏陽(yáng)性菌也可采用溶菌酶真菌細(xì)胞壁主要由纖維素、幾丁質(zhì)和葡聚糖等組成青霉菌多用纖維素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等酵母菌細(xì)胞壁中的葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶或者EDTA處理后加細(xì)胞壁溶解酶放線(xiàn)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類(lèi)似于革蘭氏陽(yáng)性菌也可采用溶菌酶真菌細(xì)胞壁微生物優(yōu)良菌種的選育課件4、原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用：

選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株產(chǎn)生新的產(chǎn)物4、原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用：五、基因工程育種

精確的定向育種，技術(shù)含量高，應(yīng)用面廣。應(yīng)用：解決了一些藥物或材料來(lái)源困難，或制造技術(shù)復(fù)雜，或造價(jià)昂貴而無(wú)法大量生產(chǎn)和應(yīng)用的問(wèn)題。

1982年第一個(gè)基因工程產(chǎn)品-重組人胰島素（一）基因表達(dá)系統(tǒng)

從育種的角度考慮，最重要的是目的基因的高效表達(dá)。１.原核表達(dá)系統(tǒng)；２.真核表達(dá)系統(tǒng)．五、基因工程育種精確的定向育種，技術(shù)含量高，應(yīng)用１、原核表達(dá)系統(tǒng)原核生物不適宜表達(dá)需后加工處理的那一部分真核基因不能切除mRNA的內(nèi)含子；不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的糖基化；不能對(duì)氨基酸進(jìn)行修飾。①大腸桿菌：遺傳背景清楚；基因操作簡(jiǎn)便；易培養(yǎng)，世代短，生長(zhǎng)快；適宜大規(guī)模生產(chǎn)．注意：真核蛋白后修飾；多為胞內(nèi)產(chǎn)物；產(chǎn)物分離純化困難；內(nèi)毒素；蛋白酶破壞產(chǎn)物；免疫反應(yīng)。②枯草芽孢桿菌：優(yōu)點(diǎn)，分泌能力強(qiáng)；缺點(diǎn)，胞外蛋白酶強(qiáng)．③鏈霉菌：使用安全；分泌能力強(qiáng)。１、原核表達(dá)系統(tǒng)原核生物不適宜表達(dá)需后加工處理的那一部分真核２、真核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)具有一致的生理生化功能①酵母：真核生物蛋白質(zhì)的優(yōu)良表達(dá)系統(tǒng)

優(yōu)點(diǎn)：基因組小，操作方便；世代周期短，易培養(yǎng)；有單、雙倍體形式；能糖基化；能分泌產(chǎn)物到胞外。

應(yīng)用：干擾素、乙肝表面抗原基因已經(jīng)成功表達(dá)；釀酒酵母研究、應(yīng)用最廣泛。②絲狀真菌：

特點(diǎn)：能進(jìn)行翻譯后加工；表達(dá)產(chǎn)物分泌能力強(qiáng)；安全；發(fā)酵、純化工藝成熟。２、真核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)具有一致的生理生化功（二）利用大腸桿菌的基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因在大腸桿菌中的成功表達(dá)與表達(dá)載體、外源基因的調(diào)控序列等有關(guān)１.表達(dá)載體條件：①能獨(dú)立復(fù)制；②有靈活的多克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，位點(diǎn)位于起動(dòng)子后；③有很強(qiáng)的起動(dòng)子，能被大腸桿菌的RNA聚合酶識(shí)別；