9TI0Z實驗一熒光分光光度法測定維生素B2一、 實驗?zāi)康?、 學(xué)習熒光分析法的基本原理2、 了解熒光分光光度計的構(gòu)造，掌握其使用方法。二、 實驗原理在一定波長紫外光的照射下，維生素B2會發(fā)出熒光。在PH6-7的溶液中熒光最強，在PH11時熒光消失。在低濃度時，溶液的熒光強度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。因此，選擇熒光峰值波長為測量波長，測量維生素B2溶液的熒光強度，可對維生素B2進行定量分析。本實驗采用標準曲線法來測定維生素B2的含量。三、 儀器與試劑儀器960型熒光分光光度計、比色皿1個、50ml容量瓶6個、5.0ml吸量管1支。試劑維生素B2標準溶液、1%醋酸溶液、維生素B2樣品溶液。四、 實驗內(nèi)容1、 配置標準溶液(實驗室準備)維生素B2標準溶液：取維生素B2約10mg，精密稱定，置1000ml容量瓶中，用1%醋酸溶解并稀釋至刻度。再精密量取此溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分別置50ml容量瓶中，以1%醋酸稀釋至刻度，待測。維生素B2樣品溶液：取維生素B2片20片，精密稱定，計算平均片重。研細混勻后，精密稱取2片量的維生素B2片樣品粉未，置1000ml容量瓶中，用1%醋酸溶解并稀釋至刻度。濾過。精密取續(xù)濾液2ml,置50ml容量瓶中，以1%醋酸稀釋至刻度。待測。2、 測定掃描圖譜：選擇EM=200-700nm，lEX=365nm(固定波長)對空白和維生素B2標準溶液進行掃描，找出熒光峰值處對應(yīng)的lEMmaXo標準工作曲線的繪制(F-C)：在lEMmax下分別測定上述五種維生素B2標準溶液的熒光強度(INT)，然后以濃度(ug/100ml)為橫坐標，熒光強度(INT)為縱坐標繪制標準工作曲線。維生素B2樣品溶液中維生素B2的含量測定：將配置好的維生素B2樣品溶液置1cm比色皿中，以1%醋酸為空白，在上述波長下測定熒光強度值，從工作曲線上求出維生素32樣品溶液中維生素B2的濃度。五、 數(shù)據(jù)處理及計算(1)標準工作曲線的繪制編號12345維生素B2標準溶液的濃度(ug/100ml)熒光強度(INT)(2)根據(jù)樣品液的F值，從工作曲線上求出維生素B2樣品溶液中維生素B2的濃度。根據(jù)測得結(jié)果，求算維生素B2片中維生素B2的含量(mg/片)。六、思考題1、熒光法有何優(yōu)缺點？它的適用范圍是什么？實驗二氣相色譜法測定混合溶劑的含量歸一化法定量一、 實驗要求掌握氣相色譜分析的基本原理和操作。掌握色譜條件優(yōu)化的原則及方法。學(xué)習定量校正因子及歸一化法定量分析的基本原理和測定方法。熟悉色譜工作站的操作。二、 基本原理氣相色譜法是以氣體（載氣）為流動相的柱色譜分離技術(shù)。其原理是利用被分離分析的物質(zhì)（組分）在色譜柱中的氣相（載氣）和固定（液）相之間分配系數(shù)的差異，在兩相作相對運動時，在兩相間作反復(fù)多次（103?106次）的分配，使得原來的微小差別變大，從而使各組分達到分離的目的。根據(jù)色譜圖進行組分的定量時，所用定量方法主要有歸一化法、內(nèi)標法和外標法三種。把所有出峰組分的含量之和按100%計的定量方法稱為歸一化法。歸一化法的優(yōu)點是計算簡便，定量結(jié)果與進樣量無關(guān)，且操作條件不需嚴格控制，是常用的一種色譜定量方法，當各組分色譜峰寬窄比較懸殊情況下，采用此法較為準確。該法的缺點是試樣中所有組分都必須分離流出，并且得到可測量的信號，其校正因子也均為已知。為了消除色譜條件對響應(yīng)值勤的影響，在色譜定量分析中通常采用相對校正因子廣.即被測物質(zhì)i與標準物質(zhì)s的絕對質(zhì)量校正因子之比值：f，=f/f=（m/A）/（m/A）=mA/mAiisiississi使用歸一化法定量，要求試樣中的所有組分都能得到完全分離，并且在色譜圖上都能出峰，計算式為：m%=fA/IfAix100本實驗通過測量混合烴試樣中各組分的峰面積，利用相對校正因子，用歸一化法計算出各組分百分含量。三、 儀器和試劑儀器：Agient7820A型氣相色譜儀；氫焰離子化檢測器（FID）；AgientHP-5毛細管色譜柱（30mx0.32mmx0.25gm，非極性柱）；載氣為氮氣。試劑和樣品：甲苯（沸點1106C）、氯仿（沸點61.2°C）、環(huán)己烷（沸點80.7°C）、二氯甲烷（沸點39.8C），均為分析純。待測樣品為含以上4種試劑的含量未知的混合液。四、色譜條件汽化溫度：200°C；柱溫：75C；檢測器溫度：200C；載氣流量：2mL/min；進樣量：0.1應(yīng)；分流比：5:1。五、 實驗步驟根據(jù)色譜條件按操作規(guī)程將色譜儀調(diào)至可進樣狀態(tài)，待儀器上的電路和氣路系統(tǒng)達到平衡，記錄儀上基線平直時，即可進樣。以甲苯為標準物質(zhì)測定氯仿、環(huán)己烷、二氯甲烷的相對校正因子。配制體積比為1：1：1：1的上述4種試劑的混合標準液，按色譜條件進樣。根據(jù)每種溶劑對照品的保留時間指認混合標準液圖譜上每個色譜峰對應(yīng)的組分，使用色譜工作站程序測算相應(yīng)的峰面積，計算各物質(zhì)的相對校正因子。注入待測樣品，測算相應(yīng)的峰面積，用歸一化法計算各物質(zhì)的質(zhì)量百分含量。按操作規(guī)程進行關(guān)機等操作。六、 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果計算將混合標準液和待測樣品中各溶劑的保留時間及峰面積列于下表中，并計算相對校正因子和質(zhì)量百分含量：組分保留時間(min)峰面積A.i相對校正因子￡樣品峰面積A.'i百分含量(%)甲苯1氯仿環(huán)己烷二氯甲烷七、思考題在色譜定量分析中，為什么常常需要測定被測組分的相對校正因子？氫焰離子化檢測器有什么特點，其相對校正因子能否用于其它檢測器？歸一化法定量分析有何特點？使用該法應(yīng)具備哪些條件？在色譜分析中，還有哪些定量分析方法？試簡述其原理。3、 本實驗中，主要色譜條件(汽化溫度、柱溫、檢測器溫度)確定的原則分別是什么？實驗三飲料中咖啡因的高效液相色譜法測定外標法定量一、 實驗要求熟悉高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)，理解反相HPLC的原理和應(yīng)用；掌握外標法定量。二、 實驗原理咖啡因又稱咖啡堿，屬黃嘌吟衍生物，化學(xué)名稱為1,3,7-三甲基黃嘌吟，是從茶葉或咖啡中提取的一種生物堿。它能興奮大腦皮層，使人精神亢奮。咖啡因在咖啡中的含量約為1.2%?1.8%，在茶葉中約為2.0%?4.7%?？蓸凤嬃稀⒅雇此幤Х纫??？Х纫虻姆肿邮綖镃8H10O2N4,結(jié)構(gòu)式為：在化學(xué)鍵合相色譜法中，對于親水性的固定相常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，這種情況稱為正相化學(xué)鍵合色譜法。反之，若流動相的極性大于固定相的極性，則稱為反相化學(xué)健合相色譜法，該方法目前的應(yīng)用最為廣泛。本實驗采用反相液相色譜法，以c18鍵合相色譜峰面積對其濃度作標準曲線，再根據(jù)試樣中的咖啡因峰面積，由標準曲線算出其濃度?？Х纫虻募状家涸?72nm波長下有最大吸收，其吸收值大小與咖啡因濃度成正比，樣品通過高效液相色譜分離，以保留時間定性，峰面積定量。三、 儀器與試劑儀器：Agilent1200型高效液相色譜儀；DAD檢測器；超聲波清洗器；0.45Hm微孔濾膜。試劑：甲醇為色譜純；水為高純水；咖啡因標準品，純度98%以上。樣品：市售的可口可樂、百事可樂、康師傅綠茶等瓶裝飲料。四、 實驗方法樣品溶液的制備分別取市售可口可樂、百事可樂、康師傅綠茶飲料適量，超聲脫氣15min，取脫氣試樣2ml經(jīng)稀釋定容至10mL，過微孔濾膜后作HPLC分析用。標準曲線系列溶液的配制用甲醇配制咖啡因濃度為1000gg/mL的標準儲備液，備用。用流動相（甲醇）將儲備液稀釋制成濃度分別5、10、20、30、40、50gg/mL的標準系列溶液，過微孔濾膜后作HPLC分析用。高效液相色譜參考條件色譜柱：C184.6x150mmx5pm，或其他型號C18柱；柱溫：25°C；流動相：甲醇+水（40+60）；流速：1mL/min；測定波長：272nm；進樣量：10pl。測定將流動相置于超聲波清洗器上脫氣15min，微孔濾膜過濾。根據(jù)實驗條件，將儀器按照儀器的實驗操作步驟調(diào)節(jié)至進樣狀態(tài)，待儀器液路和電路系統(tǒng)達到平衡時，色譜工作或記錄儀的基線呈直，即可進樣。依次分別吸取10gL的六個標準溶液進樣，記錄各個色譜數(shù)據(jù)。依次分別吸取10gL的市售飲料試樣進樣，記錄各色譜數(shù)據(jù)。五、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果計算1.處理色譜數(shù)據(jù)，將標準溶液及試樣溶液中咖啡因的保留時間及峰面積列于下表中：溶液tR/minA/mV-s標準溶液5gg/mL