1、石墨碳納米顆粒對體外培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量及超微結(jié)構(gòu)的影響劉東京 劉美洲 張陽德 劉東非 潘一峰 陳 偉 劉 輝 曾慶仁 張紅*（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部肝膽腸外科研究中心 長沙 410008） 摘要: 目的 了解石墨碳納米顆粒(carbon nanoparticles，CNP)的形態(tài)特征，觀察CNP其對體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖與超微結(jié)構(gòu)的影響。方法 用原子粒顯微鏡和電鏡觀察分析CNP 的大小、形狀。選擇人肝細(xì)胞株（L02）、人肝細(xì)胞株（Hl7702）、小鼠細(xì)胞株（3T3）和人肝癌細(xì)胞株（HepG2）作為觀察對象，在體外培養(yǎng)中，將每種細(xì)胞株按設(shè)計(jì)添加不同濃度CNP，每個濃度設(shè)3孔。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞數(shù)量

2、，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，通過方差分析和Dunnett檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果 CNP 約為20nm的球形微粒。添加有不同濃度CNP 的4株細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組，除HepG2細(xì)胞株外，其他三組細(xì)胞數(shù)量水平均顯著多于未添加CNP 的細(xì)胞對照組，其中以7.5g/ml濃度組最為突出。透射電鏡觀察添加濃度為7.5g/ml CNP 的細(xì)胞，可見到CNP 分布于細(xì)胞內(nèi)，而未見到對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象。結(jié)論 對體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長繁殖具有促進(jìn)作用，其作用強(qiáng)度與濃度有關(guān)。關(guān)鍵詞: 納米石墨碳；人肝細(xì)胞株；人肝癌細(xì)胞株；超微結(jié)構(gòu)Effects of Graphite Carbon Nanoparticles on Numb

3、ers and Ultramicrostructure of Cell Growth in VitroonLiu Dong-jing , Liu Mei-zhou, Zhang Yang-de, Liu Dong-fe, Pan Yi-feng, Chen Wei, Liu Hui, Zeng Qing-ren, Zhang-hong*Nathonal Hepatobiliary & Enteric Surgery Research Center Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University; No.87, Xia

4、ngya Road, Changsha, Hunan 410008, P. R. China.Abstract: Objective To investigate the effects of carbon nanoparticles (CNP) on cell proliferation and ultramicrostructure. Methods: Different concentrations of carbon nanoparticles were added into the HepG2 cells、L02 cells、Hl7702 cells and 3T3 cells to

5、 observe the effects of carbon nanoparticles on cell proliferation. The hemacytometry were used to count the number of cells. The cell submicrostructure was observed through transmission electron microscope. Related statistical methods were used to analyze the results. Results: When the medium was a

6、dded with carbon nanoparticles, the number of L02 cells、Hl7702 cells and 3T3 cells increased, reaching the highest when the concentration of carbon nanoparticles was 7.5g /ml. Under the transmission electron microscope, it was found that when the concentration of carbon nanoparticles was 7.5g /ml, t

7、he particles could easily enter the intracellular parts of L02 cells, Hl7702 cells, 3T3 cells and HepG2 cells but had no damage to the cell ultramicrostructure. Conclusion: CNPs have promoting effect on cell growth and their effect is related to the CNP concentration.Keywords: Carbon nanoparticles;

8、Human liver cell line; Human liver cancer cell line; Ultramicrostructure中圖分類號： 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：目前，納米無定型碳在制作高檔油墨、活性劑、催化劑等方面已進(jìn)入應(yīng)用階段。在生物學(xué)領(lǐng)域，有學(xué)者利用石墨碳納米顆粒 (carbon nanoparticles，CNP) 作基因或藥物載體研究1，2 ，但對其特性與生物相容性尚不十分清楚。本研究目的旨在了解本室制備的CNP 的形態(tài)特征基礎(chǔ)上1, HYPERLINK 石墨碳納米顆粒對體外培養(yǎng)細(xì)胞生長特性的影響英文.doc3，重點(diǎn)觀察其對體外培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量及超微結(jié)構(gòu)的影響，以期為CNP 在

9、醫(yī)藥領(lǐng)域中的運(yùn)用提供生物安全的實(shí)驗(yàn)證據(jù)HYPERLINK 石墨碳納米顆粒對體外培養(yǎng)細(xì)胞生長特性的影響英文.doc4,5。* 通訊作者：張紅 E-mail:liudongjing1 材料與方法1.1 CNP的母液配置 取石墨碳納米顆粒(carbon nanoparticles，CNP；本中心自制）0.5g加100ml三蒸水于塑料杯中，封口后在微型漩渦混合器上振蕩5min，用0.45m微孔濾器無菌過濾，置4冰箱保存?zhèn)溆谩?.2 CNP粒徑、形態(tài)與電位的測定 取CNP母液稀釋10倍后，用原子粒顯微鏡（ASYLUM RESEARCH產(chǎn)）測量其粒徑，觀察其表面形態(tài);電子顯微鏡下觀察CNP的形態(tài)特征. 1

10、.3 含不同濃度CNP培養(yǎng)液的配置 取含10 %胎牛血清（杭州四季青產(chǎn)品）、10104UL-1青霉素和100mgL-1 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基（?？寺‘a(chǎn)）100ml/瓶，共11瓶，分別加入2ml、1.5ml、1ml、0.5ml、0.4ml、0.3ml、0.25ml、0.2ml、0.15ml、0.1ml和0.0ml CNP 母液，使其分別成為含CNP 濃度為100g/ml、75g/ml、50g/ml、25g/ml、20g/ml、15g/ml、12.5g/ml、10g/ml、7.5g/ml、5g/ml和0。1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)不同濃度CNP作用下的細(xì)胞數(shù)量 取對數(shù)生長期的4種不同細(xì)胞株

11、分別調(diào)整為5104/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔0.5 ml，補(bǔ)充培養(yǎng)基1.5 ml進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去舊液，設(shè)1-5號孔為實(shí)驗(yàn)組，分別加入濃度為25g/ml、10g/ml、7.5g/ml、5g/ml、0.25g/ml CNP培養(yǎng)液2.0ml，設(shè)6號孔為對照組，不加CNP溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，終止培養(yǎng)。每孔0.25%的胰蛋白酶0.5 ml消化后加入1.5 ml培養(yǎng)基，用移液槍吹打使其細(xì)胞均勻，吸取細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。每種細(xì)胞株平行設(shè)A、B、C 3塊6孔板，4種細(xì)胞共用12塊6孔板。每種細(xì)胞株每個劑量水平設(shè)3孔培養(yǎng)和細(xì)胞計(jì)數(shù)，取3孔細(xì)胞平均數(shù)為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。1.5

12、透射電鏡觀察CNP7.5g/ml濃度作用下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞、L02細(xì)胞、Hl7702細(xì)胞、3T3細(xì)胞分別調(diào)整為5104/ml密度，加入濃度為7.5g/ml CNP培基液，培養(yǎng)24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化后，移入離心管中，1200 rpm離心6min, 棄去離心管中上清液，向管內(nèi)滴加2.5%戊二醛固定24 h以上，之后用2%鋨酸固定2h，經(jīng)50%、70%、90%、100%的丙酮梯度脫水，每級3次，每次10min，細(xì)胞在環(huán)氧樹脂混合液：純丙酮=1:1溶液中，37浸泡24h，之后送交湘雅醫(yī)學(xué)院超微結(jié)構(gòu)教研室進(jìn)行細(xì)胞包埋成塊，半薄切片、染色、超薄切片、電子染色后用日

13、立H7500型透射電鏡進(jìn)行觀察，采集圖片。對照組細(xì)胞為不加CNP樣本，其余作法同前。1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 測量結(jié)果采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，兩組均數(shù)間的比較用Dunnett檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較用方差分析，以P0.05為差異具有顯著性意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差( s)表示。2 結(jié)果2.1 CNP的形態(tài)特征用電鏡觀察和原子粒顯微鏡測量石墨碳納米顆粒（CNP）的形態(tài)特征，從圖1和圖2可見CNP呈微小的圓球形，分散良好、分布均勻，其粒徑 約20nm。 圖1. 原子粒顯微鏡觀察CNP形態(tài)圖 圖2. 電鏡觀察CNP形態(tài)(50000). 2.2 CNP對細(xì)胞數(shù)量的影響本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法分

14、析CNP對細(xì)胞生長繁殖數(shù)量的影響。所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)量，除HepG2細(xì)胞外，其余多數(shù)有顯著增加（P0.05)，其中以添加濃度為7.5g/ml的CNP培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)組對L02細(xì)胞、Hl7702細(xì)胞、3T3細(xì)胞、HepG2細(xì)胞數(shù)量的影響最為顯著(見表1)。表1 不同濃度CNP對4種細(xì)胞株作用后細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(104ml， s)CNP g/ml 25.00 10.00 7.50 5.00 0.25 0.00L02 2.370.64b 3.730.40 b 7.132.40ab 5.060.12ab 4.730.23 2.330.58Hl770

15、2 13.336.42b 18.675.03 26.337.23ab 23.335.51a 21.675.13 10.676.66 3T3 12.003.61b 14.004.58 24.335.31ab 21.004.36a 19.333.51 10.334.16HepG2 9.90.14b 11.550.07b 13.150.78b 16.151.20ab 14.650.85 14.051.34每種細(xì)胞株對每個劑量水平設(shè)立3孔，細(xì)胞數(shù)量為3個孔的平均數(shù)。各組不同濃度間數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其差異均有顯著性，P0.05。a表示與對照組比較，b表示組間比較。2.3 納米石墨碳顆粒對細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的

16、影響對添加濃度為7.5g/mlCNP的細(xì)胞做透射電鏡觀察結(jié)果顯示，CNP在細(xì)胞內(nèi)部，廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核，線粒體中。細(xì)胞膜及核膜未見損傷，線粒體未見損傷，細(xì)胞核未見損傷，其他亞顯微結(jié)構(gòu)與正常細(xì)胞無異，細(xì)胞未見有凋亡壞死征象。圖3、5為加入CNP的HepG2細(xì)胞，圖4、6為加入CNP的Hl7702細(xì)胞，可見到細(xì)胞內(nèi)部有大量的CNP分布，亦可見CNP成聚集現(xiàn)象。 圖3 加入CNP 的HepG2細(xì)胞（7000倍） 圖4 加入CNP 的Hl7702細(xì)胞（5000倍） 圖5 加入CNP 培養(yǎng)24h的HepG2細(xì)胞（80000倍） 圖6 加如CNP培養(yǎng)24h的Hl7702細(xì)胞（80000倍）3 討論迄

17、今為止，國內(nèi)外對石墨碳納米顆粒(carbon nanoparticles，CNP)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究較少，僅見用其作基因載體和藥物載體的成功研究報道HYPERLINK 石墨碳納米顆粒對體外培養(yǎng)細(xì)胞生長特性的影響英文.doc6,HYPERLINK 石墨碳納米顆粒對體外培養(yǎng)細(xì)胞生長特性的影響英文.doc7，也有應(yīng)用于人體的研究報道，認(rèn)為CNP的特性，當(dāng)進(jìn)入人體后作為異物被巨噬細(xì)胞吞噬，到達(dá)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)后，多分布集中在肝、脾、肺、骨髓、淋巴等器官部位，而且CNP栽藥作腹腔化療時還可以較少引起腹腔炎癥和粘連;其反向排出可能對于減少其進(jìn)入血液,避免引起循環(huán)栓塞也是有利的2。亦有研究報道，CNP具有強(qiáng)

18、大的吸附能力，容易與組織細(xì)胞吸附。只要盡可能將CNP濃度控制在有效濃度范圍內(nèi), 該類納米顆粒將會具有很好的細(xì)胞相容性6，明顯的催化、增敏效應(yīng)8。本研究為了解本實(shí)驗(yàn)所用CNP的形態(tài)特征，進(jìn)而證明CNP的生物相容性和安全性，在觀察CNP形態(tài)、粒徑和電位基礎(chǔ)上，選用了兩個人肝細(xì)胞株、1個人肝癌細(xì)胞株和1個小鼠細(xì)胞株作為觀察對象，在體外培養(yǎng)條件下，通過添加不同濃度水平CNP和不加CNP來比較了觀察CNP對生物體細(xì)胞生長與結(jié)構(gòu)的影響。對CNP形態(tài)特征觀察與測定的結(jié)果（圖1-圖2）表明，CNP粒徑在20-50 nm范圍內(nèi)，形態(tài)呈微小圓球形，顆粒穩(wěn)定且分散性良好，具備了優(yōu)質(zhì)納米材料的條件。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，

19、首先觀察了不同濃度水平CNP對4種細(xì)胞株繁殖能力的影響差異。直接計(jì)數(shù)結(jié)果（表1）表明，在一定濃度范圍內(nèi)的CNP能對L02細(xì)胞、Hl7702細(xì)胞和3T3細(xì)胞的生長速度具有促進(jìn)作用，其中在CNP濃度為7.5g/ml時，其促進(jìn)作用最為明顯。但對人肝癌HepG2細(xì)胞株的作用不明顯，其原因尚不清楚，這否為癌細(xì)胞株和正常細(xì)胞株在生長特性上存在差異而帶來的結(jié)果，則有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。但本研究的發(fā)現(xiàn)是CNP的促細(xì)胞生長和存活作用僅發(fā)揮在正常細(xì)胞株中。為了進(jìn)一步觀察CNP對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，我們選擇了上述實(shí)驗(yàn)證明CNP作用的最佳濃度（7.5g/ml）對4種細(xì)胞株進(jìn)行了培養(yǎng)觀察。用透射電經(jīng)觀察超微結(jié)構(gòu)結(jié)果（見圖3、

20、5）顯示，添有CNP的細(xì)胞未見病理學(xué)改變（細(xì)胞膜、核膜完整，細(xì)胞器、細(xì)胞核無損傷、無細(xì)胞調(diào)亡現(xiàn)象），見有CNP進(jìn)入細(xì)胞并分布于細(xì)胞質(zhì)、線粒體中（見圖7、9）。從這些結(jié)果可見 CNP能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而不誘導(dǎo)損傷。 本研究上述結(jié)果盡管是初步的，但從CNP應(yīng)用角度來看，有可能在細(xì)胞工程學(xué)發(fā)揮價值。參考文獻(xiàn)1 張陽德，張彥瓊，陳記稷等. 殼聚糖-碳納米粒的制備及其體外性質(zhì)的研究.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志J2006,6:13-18.1 ZHANG YD,ZHANG YQ,CHEN JJ. Preparation and in vitro evaluation of chitosan-carbon

21、nanoparticles. HYPERLINK 9/KNS50/Navi/Bridge.aspx?LinkType=BaseLink&DBCode=cjfd&TableName=cjfdbaseinfo&Field=BaseID&Value=ZXDY&NaviLink=%e4%b8%ad%e5%9b%bd%e7%8e%b0%e4%bb%a3%e5%8c%bb%e5%ad%a6%e6%9d%82%e5%bf%97 t _blank China Journal of Modern MedicineJ.2006,6:13-18.2 孫嵐，張英鴿.小鼠腹腔注射納米活性炭體內(nèi)去向追蹤觀察.生態(tài)毒理學(xué)報

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