1、淋巴細(xì)胞分層液有兩種（1）聚蔗糖一泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrosesolution）,商品名Ficoll，分子量400000，多配制成401（W/V）水溶液，也有干粉出售。應(yīng)用時(shí)，用蒸餾水配制9%溶液。泛影葡胺溶液（Megluminidiatrizoici），商品名Vrografin，結(jié)構(gòu)式為3，5二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1去氧甲氨基山梨醇。含量為60%或75%，每安瓶為20ml裝，常用于人的臟器造影。應(yīng)用時(shí)，取60%泛影葡胺原液20ml，加雙蒸餾水15.38ml,即為33.9%泛影葡胺。1.0770.001聚蔗糖泛影葡胺的配制：9%聚蔗糖液24份33.9%泛影葡胺液10份混合

2、即可。必要時(shí)，可測比重。需要備用，可用G5漏斗過濾除菌或1143C高壓滅菌15min,4C保存。一般可保存3個(gè)月。（2）泛影葡胺一右旋糖酐（dextran）液34%泛影葡胺液10份60%右旋糖酐液12.5份混合，即為比重1.071.09的分層液。分裝于棕色瓶中，4C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ?、淋巴?xì)胞分離人淋巴細(xì)胞的方便來源是外周血，分離的原則是收率較高，根據(jù)不同試驗(yàn)有相對純度，盡最大可能保持細(xì)胞應(yīng)有活性。分離的技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞的物理性狀和表面標(biāo)志設(shè)計(jì)，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康目刹捎妹芏忍荻入x心法、吸附分離法和其它特殊分離法。本文介紹常用的密度梯度離心法的原理及方法。人外周血中各種細(xì)胞的密度不同，人紅細(xì)胞密度為1

3、.093，粒細(xì)胞為1.092，淋巴細(xì)胞為1.0740.001。密度梯度離心法的原理主要根據(jù)各類血細(xì)胞比重的差異，利用比重介于某兩類細(xì)胞之間的細(xì)胞分離液對血液離心，使一定比重的血細(xì)胞依相應(yīng)的密度梯度分布于不同的獨(dú)立帶，從而達(dá)到分離的目的。常用的分層液有Ficoll，F(xiàn)icoll是一種合成性蔗糖聚合物的商品名，無毒，但高濃度溶液往往不等滲，且粘性高，易使細(xì)胞聚集，常使用60g/L低濃度溶液（密度1.020）加入泛影葡胺（Hypague），應(yīng)用濃度為340g/L（密度1.200），以泛影葡胺適當(dāng)比例與Ficoll混合，可配制成比重合適的細(xì)胞分層液（密度1.0770.001）。稱為Ficoll-Hyp

4、ague分層液或稱淋巴細(xì)胞分離液。【材料】1、抗凝管。2、淋巴細(xì)胞分離液（有商品供應(yīng)，比重1.0770.001）。3、無Ca+、Mg+、Hanks液（D-Hankls）。4、刻度吸管、毛細(xì)吸管、離心管、離心機(jī)等?！痉椒ā?、采靜脈血2ml加入抗凝管，輕輕搖動試管，混勻，5min后加入Hanks液2ml，手動輕輕搖勻。2、將抗凝血全部沿管壁緩慢加至另一含2ml淋巴細(xì)胞分離液管的液面上，注意保持兩種液體界面清晰。3、將試管平衡后置水平式離心機(jī)，1000rpm離心20min。4、用毛細(xì)吸管仔細(xì)吸取血漿與分層液界面處淋巴細(xì)胞層至一刻度離心管內(nèi)。5、加入5倍體積的Hanks液，手動旋轉(zhuǎn)試管使液體混勻，1

5、000rpm離心10min,棄上清，沉淀即主要為淋巴細(xì)胞（或單位個(gè)核細(xì)胞）。加入含10%滅活小牛血清Hanks液1ml，混勻后進(jìn)行計(jì)數(shù)。（備注：如做淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化或其它培養(yǎng)，所用試劑、器材應(yīng)是無菌的。尚需細(xì)胞存活率檢查，見下頁。）（一）T、B細(xì)胞分離技術(shù)為了深入研究T、B細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能，需從淋巴細(xì)胞群中分離出單一的T細(xì)胞或B細(xì)胞。根據(jù)T、B細(xì)胞膜表面標(biāo)志及粘附能力等不同。可將二者加以分離。常用的方法有E花結(jié)形成法，尼龍棉柱法、免疫吸附法、免疫磁珠分離法等。應(yīng)用流式細(xì)胞儀可以分離出均質(zhì)性的單一細(xì)胞類型或細(xì)胞亞群。花環(huán)沉降法分離T細(xì)胞綿羊紅細(xì)胞（SRBC能與人類T細(xì)胞形成E花環(huán)。經(jīng)溴化二氨基

6、異硫基異硫脲氫化物（AET處理的SRBC能與T細(xì)胞形成穩(wěn)定而巨大的E花環(huán)。用淋巴細(xì)胞分離液分離時(shí)，AET-E花環(huán)沉于管底，在分離液界面的淋巴細(xì)胞為B細(xì)胞；沉于管底的AET-E花環(huán)經(jīng)低滲溶液溶解花環(huán)周圍的SRBC即可獲得純的T細(xì)胞。【村料】1、AET溶液。2、綿羊紅細(xì)胞懸液。3、淋巴細(xì)胞分離液。4、含10小牛血清、1640培養(yǎng)液。5、Hanks液。6、生理鹽水。7、單個(gè)核細(xì)胞懸液?！痉椒ā?、用AET處理SRBC取綿羊紅細(xì)胞懸液，加入Hanks液，輕輕搖勻，1500rpm離心5min,共3次。取一份壓積的SRBC加入4份新配制的AET液混懸，置于37C水浴15min，不斷搖勻。加入冷生理鹽水，混

7、勻，1500rpm離心5min，并5次。觀察無溶血，細(xì)胞凝集后，加入含小牛血清的1640培養(yǎng)液，混勻，離心同上。在1份SRBC中加入9份含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液制成AET-SRB懸液；2、用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋AET-SRB懸液至I%AET-SRBC3、取2X106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞/ml與等量1%AET-RBC昆合，37C水浴15min后，1000rpm離心5min，再靜置于4C水箱45min；4、用毛細(xì)吸管輕輕吹吸，使細(xì)胞散勻；5、將細(xì)胞輕輕沿管壁鋪于具有等量淋巴細(xì)胞分離液的試管液面上；&2000rpm水平式離心20min,沉于管底者為AE-SRBC花環(huán)；7、取管底細(xì)胞，

8、加入Hanks液，混勻后2000rpm離心10min，沉淀中加入3ml雙蒸水，立即加入1ml3.5%氯化鈉溶液，500rpm離心5min,沉淀即為T細(xì)胞。尼尤棉柱法分離T、B細(xì)胞B細(xì)胞在37C時(shí)易粘附于尼龍棉（聚酰胺）纖維上，而T細(xì)胞不具此能力，從而可將T、B細(xì)胞分離。【材料】1、Hanks液。2、RBMI1640培養(yǎng)液。3、小牛血清。4、單個(gè)核細(xì)胞懸液1ml，含細(xì)胞23X107。5、聚乙酰塑料管或1ml注射器等。6、尼龍棉纖維?！痉椒ā?、尼龍毛柱的制備：稱取尼龍毛5070mg細(xì)致地撕開，使其松散均勻，用Hanks液浸透后裝入聚乙烯塑料管或注射器，柱高約2cm。2、取單個(gè)核細(xì)胞，用含10%小

9、牛血清的1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。3、用Hanks液和含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液各5ml洗柱，流速約12ml/10秒。4、將1ml細(xì)胞懸液上柱，放37C溫箱置1ml。5、用預(yù)溫37E含小牛血清的培養(yǎng)液5ml洗脫，收集洗脫液，2000rpm離心20min,沉淀即為T細(xì)胞，純度達(dá)90%左右。&用冷1640培養(yǎng)液5ml沖洗柱床，邊洗邊擠壓塑料管，收集洗脫液，2000rpm離心20min,沉淀即為B細(xì)胞，純度達(dá)80%左右。附：細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：A加樣：將淋巴細(xì)胞懸液混勻，吸取10卩l(xiāng)加入到40卩l(xiāng)含10液活小牛血清的Hanks液中，混勻后再吸取10卩l(xiāng)加入到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上。B加蓋玻片：取蓋玻片輕輕

10、覆蓋于標(biāo)本上，靜置片刻，置顯微鏡下計(jì)算淋巴細(xì)胞數(shù)。具體計(jì)數(shù)方法如下：C計(jì)算血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上四個(gè)角的四個(gè)大方格中淋巴細(xì)胞總數(shù)。計(jì)算：按下列公式求出單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)。四個(gè)大方格中單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)=x稀釋倍數(shù)x細(xì)胞懸液毫升數(shù)&細(xì)胞存活率檢測：取10卩l(xiāng)淋巴細(xì)胞懸液加入0.4%臺盼藍(lán)染色液10卩l(xiāng)，混勻。取10卩l(xiāng)加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，靜置片刻，置顯微鏡高倍鏡下觀察?！窘Y(jié)果判定】活細(xì)胞不著色，折光性強(qiáng)。死細(xì)胞由于染料可滲入細(xì)胞內(nèi)，故死細(xì)胞被染成藍(lán)色，死細(xì)胞體積較大，無光澤。正常情況下，活細(xì)胞存活率應(yīng)在95%以上。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中的死亡細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其存活率：活細(xì)胞數(shù)細(xì)胞存活率=x100%、淋巴細(xì)胞抗原片制備活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)561、將分離得到的淋巴細(xì)胞以RPMI1640培養(yǎng)液配成1x1010/ml細(xì)胞懸液；2、將細(xì)胞懸液用毛細(xì)吸管輕輕將細(xì)胞滴吹