1、第二章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)主要元素組成：c. H、0、N、S及P、Fe. Cu. Zn. Mo、I、Se 等微量元素。円首卜阿凱氏定第一節(jié)蛋白質(zhì)的分類、根據(jù)分子形狀分類、根據(jù)分子組成分類中.純蛋白質(zhì)（如淸蛋白等）結(jié)合蛋白質(zhì)（如核蛋門等）三.根據(jù)功能分類催化蛋白調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白運(yùn)輸?shù)鞍踪A藏蛋白運(yùn)動(dòng)蛋白 防御蛋白 電子傳遞蛋白第二節(jié) 蛋白質(zhì)的組成單位氨基酸J含芳香環(huán)及雜環(huán)R基：Phe、Trp. Pro不帶電荷的極性R基:Ser、Thr、Asn、Gin、Tyr、Cys極性R基氨基酸帶正電荷的極性R基：Lys、His、Arg帶負(fù)電荷的極竹H基：Asp、Glu2、按R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同來(lái)分類了 倉(cāng)氨基 竣基的Gl

2、y、Ala、Vai、Leu、lie.中網(wǎng)啟酸：“、Met金片旱的氨基酸：Ser.Thr、脂肪族氨基酸含1O的氨基酸：Asn.Gin含氨基二竣基的Acnril,fim氮基酸：心、Glu1含二氨基一滋基的LvsAm輕奴基酸：廬、舊芳存族氨基酸：Phe、Tyr雜環(huán)族帆莊購(gòu)：TrD、His、Pro三、氨基酸的理化性質(zhì)1、一般物理性質(zhì)2. 化學(xué)性質(zhì)廠萬(wàn)亞硝酸的反應(yīng)(1)氨基參加的反W與甲醛的反應(yīng)92, 4硝肚觸苯的反應(yīng)與界硫機(jī)酸苯酯的反應(yīng)/戈鹽和成脂反應(yīng)(2) 竣基參加的反應(yīng)T訛竣反應(yīng)(3) 氨基和竣基共同參加的反應(yīng)兩性解離(兩件離于、兩件解離、等電點(diǎn))苗三酮反應(yīng)I成肽反應(yīng)（4）由側(cè)鏈慕團(tuán)參加的反應(yīng)雙縮

3、尿反應(yīng) 黃蛋白反應(yīng) 乙醛酸反應(yīng) 坂口反應(yīng)酚試劑反應(yīng)米倫氏反應(yīng)第三節(jié) 肽_、肽的結(jié)構(gòu)幾個(gè)重要的概念：肽、肽鍵、氨味酸殘里、N端C端、多肽、.硫鍵、酰氨平面第四節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(一) 、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)定義 舉例：胰島素的級(jí)結(jié)構(gòu)(二) 、空間結(jié)構(gòu)包禽的內(nèi)容1、蛋門質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(1)、定義a 螺旋結(jié)構(gòu)(2) 、包含內(nèi)容彳B折廉結(jié)構(gòu)10轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(3) 、超級(jí)結(jié)構(gòu):aa、 Pap.祁0、卩曲折、結(jié)構(gòu)域2、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)舉例：兒纟I 丨的"3、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)舉例：血紅蛋I的四級(jí)結(jié)構(gòu)（亞基）三、維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化7鍵1、共價(jià)鍵：肽鍵、二硫鍵2、非共價(jià)鍵：型也范徳華力、鹽鍵（離子鍵）、疏水鍵第五

4、節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系仁種屬差異2、分f病二、蛋口質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系別構(gòu)現(xiàn)象第六節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離.分析技術(shù)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)1、蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量 沉降系數(shù)S2、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)等電點(diǎn)isoelectric poirH:蛋白質(zhì)分子所帶的 正電荷和負(fù)電荷相等時(shí)溶液的pH值.pl在有中性鹽時(shí)有明顯變化，因分子中某些 解離基團(tuán)可與鹽的離子如Ca2+、Mg2+、Cl->HPO42-結(jié)合，觀察到的pl在一定程度上決定于介 質(zhì)中離子的組成.pl是蛋白質(zhì)的一個(gè)特征常數(shù).不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)的一個(gè)特征常數(shù)，其等電點(diǎn) 是由可解離基團(tuán)的

5、種類和數(shù)目決定的，而這在不 同的蛋右質(zhì)中是不同的.不同蛋白質(zhì)的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸 殘基的多少，直接影響蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的大小。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)的溶解度最小，因此不同 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同來(lái)沉淀不同的蛋白質(zhì)，分離 蛋白質(zhì)混合物3、蛋白質(zhì)的變性(1) 、變性的概念在變性因素作用下，天然蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)保 持不變，高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了異常的變化，由天然態(tài) 的折迭態(tài)變成了變性的伸展態(tài)，引起生物功能的 喪失，理化性質(zhì)的改變的現(xiàn)象。氨基酸的甲醛滴定丄為aNib的反應(yīng)B.莊常溫，中性條件.甲醛與a - MljIR快反應(yīng).生成輕甲基衍生物.釋放氫離子.氨基酸定量分析一甲醯滴定法（間接滴定） 兒直接滴定.終點(diǎn)pHit

6、高（12） 沒有適當(dāng)指示劑. B與甲軽反應(yīng)，滴定終點(diǎn)在9左右.可用酚釀作指示劑. C.釋放一個(gè)氫離子.相當(dāng)于一個(gè)飢基（摩爾比1： 1）與異硫氣酸苯酯（PITC）的反應(yīng)?。ū疆惔_鼠酸酯法）：由Edm&n于1950年首先提出，為a- NH2的反應(yīng)，用于N末端分析，又稱 Ednmn降解法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將 肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離肽鏈（N«|氨基酸）與PITC偶聯(lián)，生成PTC肽環(huán)化斷裂：域確近PTC展的肽鍵斷裂，生成PTC氨堆酸和少一殘展的肽鏈，同時(shí)PTC 猱加酸壞化生成PTH似卑酸分離PTH氨基酸層析法鑒定 Edman-用DNS（-甲甲緊磺酰氯）測(cè)疋

7、N端氮基槪原理DNFB法相同但水解后的DNS氨肚酸不需分離，可直接用電泳或?qū)游龇?鑒定山于DNS臺(tái)強(qiáng)烈熒光，靈敏度比DNFB法髙100倍，比與2, 4-二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)A. 為a- NR?的反應(yīng)B. 氨基酸a- NH?的一個(gè)H原子可被炷基取代（鹵代炬）C在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成二硝基門月.鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸首先lllSanger應(yīng)用，確定了胰島索的一級(jí)結(jié)構(gòu)A. 肽分子與DNFB反應(yīng)，得DNP肽B. 水解DNP肽，得DNPN端氨基酸及工他游離氨 基酸C. 分離DNP 姐荒酸D.層析法定性DNP-M基酸,得出N端氨基酸的種Corey & Paul

8、ing(Corey1897 1971Paulinga螺旋(ahelix)特征1、每隔3. 6個(gè)AA殘 基螺旋上升一圈，螺距 0.54nm;2. H旋體中所有氨基 酸殘基R側(cè)鏈都伸向外側(cè)， 鏈中的全部（工0和NH幾 乎都平行于II旋軸：3、每個(gè)氨基酸殘基的 N-H與前面第四個(gè)氨基酸殘 基的C=O形成氫仏 肽桂上 所有的肽鍵都參與氫犍的形 成.形成因素與AA組成和排 列順序直接相關(guān).多態(tài)性多數(shù)為右手（較穩(wěn) 定），亦有少數(shù)左手螺旋存 在（不穩(wěn)定X存在尺寸不網(wǎng) 的媒瓠*影響a -螺旋形成的因素氨基酸組成和序列？R基團(tuán)？脯氨酸？P 折疊定義：兩條或幾條幾孚完全伸展的篡肽鏈側(cè)向聚集在 起相鄰 肢詵匸鏈上的

9、奴基和頊呈Z間形成右規(guī)則的氧鍵，維持這種片足結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)：纟肽鏈匸徒比絞伸展，相鄰如的軸心和為O.35nm.側(cè)鏈R殳 替分布在片層平面的上、下方.令平行和反平行兩面種兒f所仃的肽遜都參I if鏈間啦建的形成肌紅蛋白（myoglobin）分子由一條多肽鏈 （153個(gè)殘基）和一個(gè)血紅素組成.分子呈扁圓形， 大小為4.5nm x 3.5nm x 2.5nm°多肽鏈主鏈骨架包 含長(zhǎng)短不等的A、B、C、D、E、F、G、H共8個(gè) a螺旋。分子中幾乎80%的氨基酸殘基都是位于a 螺旋結(jié)構(gòu)中.a螺旋之間的拐彎處（AB、CD、EF、 FG、GH）是無(wú)規(guī)卷曲。絕大多數(shù)親水性R側(cè)鏈分 布在分子的外表面，與水

10、分子結(jié)合，使肌紅蛋白 可溶于水溶液中。絕大多數(shù)疏水性R側(cè)鏈埋藏在分分子表面有一個(gè)深陷的洞穴.該洞穴由C、E、 F、G共4個(gè)螺旋段構(gòu)成。洞穴周圍分布許多疏水 性R側(cè)鏈，從而為洞穴構(gòu)成了疏水性環(huán)境。平面 的血紅素分子埋人疏水的洞穴中.維持肌紅蛋白 分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的力是范德華引力、疏水鍵、氫健 和配位鍵。血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)V維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫犍V維系蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)：氫犍丁維系蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、 范律華力.鹽tt7維系蛋白成分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵a鹽犍（離子犍） b氫犍C疲水相互作用力d范德華力&二磕鍵f陌鍵中性脂肪族氛基酸COOHjN

11、-C-H$ H ?甘気酸«ilyX；)COOCOOCOOl 彳 iCHjj "CH z 、i15HX-C-K X|:HjC CH,:CH 、CH,:H,C CH,：1CH,亮氨酸異亮氯酸(AhuA)含疑基或硫膚驟氨基muc,)(IleJ)-C-Hcoo1COO 1H<N C HH,N C H9 丫 H C-OK：:<1 :1 :OH ：ch5絲氨隈蘇氨酸/TK.T、coocooHjN C-H1HjNC H I1 CH2 :? 1 :SH :ch2 :! 1 ?! s半甲硫氨酸:i? CH,：f w 彳rxtoi MA酸性氨基酸及酰胺COO*COO"CO

12、O"coo* 1 H.N-C-H.1 HjN-C-H 1 HjN-C-Hh3n - c -h| ch2 !1 ch21 CHi11ch2i 1 1;111 COOH i竿 c; ch2；COOHQNH2 =!<；& 0 NH,天冬氨酸谷氨酸天冬酰胺谷氮酰胺(AspJ)(Ghi.E)(AsnTN )(Gln.Q)堿性氨基遼COO"COCTCOCT 1 HjN-C-HH,N -C-H41HjN-C-Hi ch2 I 1CH?1CH,I 11 1i2i円:$ch2HC=C1X:ch2 i? 1 ;ich21xi /' i：H %zNH| 雜環(huán)I ch2 IN

13、HI£ iMJ:NH3 ： 夕、:h2n nh2H賴氨酸精氨酸組氨酸(Lys,K)(Arg.R)(HisJI)ch2HC = CNH脯氨酸(Prof)組氨酸(His Ji)芳香族氨基酸COOCOO*酪氨酸(TynY)色氨酸 (TrgV)苯丙氨酸(Phe.F)雜環(huán)氨基酸COOcoo4 Ih3n 一 ch氨基酸的兼性離子形式：氨基酸或肽在晶體或水中以兼性離子形式 存在，熔點(diǎn)高。 OO氨基酸的兩性解離R1+R1+ OHR .ICII-NH?V- ii N M、- 1CH-NIkCOOHCOO"+1 2 ccxrpH< pl(pic JpH = pIpH>pI凈電荷為正

14、凈電衙=0凈電荷為負(fù)pH = pl：蛋白質(zhì)處于中性環(huán)境，兩邊解離趨勢(shì)相等而成兼性離子 pH > Ph蛋白質(zhì)處于堿性環(huán)境，竣基解離趨勢(shì)大于氨基而成負(fù)離子 pH<pl：蛋白質(zhì)處于酸性環(huán)境，氨基解離趨勢(shì)大于敖基而成正離子氨基酸的等電點(diǎn)當(dāng)氨基酸溶液在某一定pH值時(shí).使某特定氮基酸分子上所帶正 負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng) ,此時(shí)溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(diǎn)(Isoelectric polnl, pl).在氨基酸等電點(diǎn)以上任何pH, AA帶凈的負(fù)電荷，在電場(chǎng)中 向陽(yáng)極移動(dòng)；在氨基酸等電點(diǎn)以下任何pH, AA帶凈的正電 荷，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng).在一定pH范圍中

15、，溶液的pH離AA等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，AA帶凈電荷pKj+pKjpKj+pKRCOOH pl= S一氮基一竣基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：二氨基一竣基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：pK2+pKRNH2pl= ;一氮基二竣基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：可見，奴基酸的pl值等于該氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側(cè) 的基團(tuán)pk，眨的一. °®白質(zhì)兩性解離性質(zhì)和等電點(diǎn)/ NH/+p / nh +/NH, pr、COOH+p COO"+ 1 COO-pH< plpH = pIpH>pI凈電荷為正凈電荷=0凈電荷為負(fù)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù) 電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向

16、陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)，此 時(shí)洛液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoekxmc point，pD P 轉(zhuǎn)角（0 -turn）:多肽 鏈中氨基酸 殘基n的撥基 上的氧與殘 基（n+3）的 氮原上的氫 之間形成氫 鍵，肽鍵回 折 180° A.呂絶稔椅牝希椅繊(1)超二級(jí)結(jié)構(gòu)(supersecondary structure )蛋白質(zhì)中相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單位(即單個(gè)a 螺錠或卩一折疊或卩 一轉(zhuǎn)角)組合在-起，形成有規(guī)則的、在空間上能辯認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組 合體稱為蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)基本組合方式：a n Bp p 0(2)(structure domain)在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽進(jìn)一步卷曲折疊成幾個(gè)

17、相對(duì)獨(dú)立、近 似球形的三維實(shí)體，再由兩個(gè)或兩個(gè)以上這樣的三維實(shí)體締合成三級(jí) 結(jié)構(gòu).這種相対獨(dú)立的三維實(shí)體稱為結(jié)構(gòu)域.形成意義：動(dòng)力學(xué)上更為合理蛋白質(zhì)(酶)活性部位往往位于結(jié)構(gòu)域之間，使其更具柔性a-氨基可與亞硝酸反應(yīng)產(chǎn)生氮?dú)?二級(jí)結(jié)構(gòu)secondary structure一級(jí)結(jié)構(gòu) primary structure三級(jí)結(jié)構(gòu) Tertiary structure結(jié)構(gòu)域 Structure doman超二級(jí)結(jié)構(gòu) supersecondary struc四級(jí)結(jié)構(gòu)quariernary structure氫鍵(hydrogen bond )主要維持蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)三、四級(jí)結(jié) 構(gòu)亦有一定作用.范

18、德華引力(Van der weals force )實(shí)質(zhì)是靜電引力，維持三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。包括： 二個(gè)極性基團(tuán)偶極之間的靜電吸引(取向力)； 極性基團(tuán)的偶極與非極性基團(tuán)的誘導(dǎo)偶極之間 的靜電吸引(誘導(dǎo)力)； 二個(gè)非極性基團(tuán)瞬時(shí)偶極之間的靜電吸引(色 散力)。疏水作用力(hydrophobic bond )2個(gè)或2個(gè)以上的疏水基團(tuán)(非極性基團(tuán))因極 性水分子的排斥而接近，因范德華引力而結(jié)合，這 種結(jié)合力稱疏水作用力或疏水鍵。主要維持三、四 級(jí)結(jié)構(gòu).離子鍵(ionic bond )正負(fù)離子之間的靜電吸引產(chǎn)生的化學(xué)鍵.在一 些蛋白質(zhì)分子中，離子鍵參與維持三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。二硫鍵(disulfide bond

19、 )指二個(gè)硫原子之間的共價(jià)鍵，又稱二硫橋、硫 硫橋。在一些蛋白質(zhì)中，二硫鍵對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子 構(gòu)象起重要的作用.患者的Hb量?jī)H為正常人（15-16g/i00ml ）的一 半，紅細(xì)胞數(shù)目是正常人（4.6-62） x 13個(gè)/ml的一 半左右，且形態(tài)不正常，除有大量的未成熟紅細(xì)胞 外，還有很多長(zhǎng)而薄、新月狀或鐮刀狀的紅細(xì)胞。 當(dāng)紅細(xì)胞脫氧時(shí)，這種鐮刀狀細(xì)胞明顯增加。純合子（50%紅細(xì)胞鐮刀狀化）多在童年死去 ,無(wú)后代；雜合子患者（1%的患者紅細(xì)胞鐮刀狀 化）的壽命也短，但能抵抗流行于非洲的致死性瘧 疾（malaria）,會(huì)有后代。正常紅細(xì)胞與 鐮刀形紅細(xì)胞 的掃描電鏡圖氨基酸序列的細(xì)微變化正常的血紅

20、蛋白Hb和異常的血紅蛋白HbS僅在卩 鏈的第&個(gè)氨基酸有Glu變?yōu)榱薟I,電泳時(shí)向正極的 移動(dòng)速度HbS比HbA稍慢。A鏈N端氨基酸排列順序12345678Hb-A （正常人）Val-His-Leu-Thr-Pm-Glu-Glu-Lys.Hb-S （患 者）Val-Hls-I.eu-Thr-lVal.Glu-Lys人類發(fā)現(xiàn)的30()多種血紅蛋白變體，絕大多數(shù)只 有一個(gè)氨基酸差異，因?yàn)槿〈奈恢貌煌?，?duì)功能的 影響程度有差異，但目前對(duì)取代氨基酸影響功能的了 解很少。鐮刀狀細(xì)胞血紅蛋白的治療性矯正體外用氛酸鉀處理患者的紅細(xì)胞，可防止在 去氧時(shí)形成鐮刀狀，輸氧能力有好轉(zhuǎn).®白質(zhì)兩性

21、解離性質(zhì)和等電點(diǎn)'cOOH'coo'coo.凈電荷=0pH > pl凈電荷為負(fù)pH<pI凈電荷為正當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù) 電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)，此 時(shí)溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isodtxtric point, pl) The thermal denaturationof ribonu clease變性是一 個(gè)協(xié)同過(guò) 程：在彳艮 窄的變性 劑濃度范 圍，很窄 PH或溫度.（2）、引起蛋白質(zhì)變性的因素有： .物理因素?zé)幔?0100°C）、紫外線、X射線、超聲波、 高壓、表

22、面張力，以及劇烈的振蕩、研磨、攪拌 等； .化學(xué)因素化學(xué)因素又稱為變性劑，包括：酸、堿、有 機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮等）、尿素、鹽酸肌、重 金屬鹽、三氯醋酸、苦味酸、磷鑄酸以及去污劑(3) 、變性表現(xiàn)及變性機(jī)理 生物功能喪失； 物理性質(zhì)發(fā)生改變； 化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變； .側(cè)鏈基團(tuán)暴露、復(fù)性復(fù)性：蛋白質(zhì)的變性作用如果不過(guò)于劇烈，則 是一種可逆過(guò)程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素 后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來(lái)的構(gòu)象，恢復(fù)原 有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象成為復(fù)性(renaturation)。如1條肽鏈、4個(gè)二硫鍵的RNA酶，被8mol/L尿 素和蔬基乙醇變性，二硫鍵全部斷裂，酶活性和結(jié) 晶能力全部喪失

23、，若透析除去變性劑，在氧存在下 二硫鍵重新生成，酶活性全部恢復(fù)，并恢復(fù)結(jié)晶能 力，說(shuō)明RNASI由變性態(tài)恢復(fù)到天然態(tài)。4、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1- lOOnm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征?？扇苄?蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對(duì)水 有很高的親和性，通過(guò)水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面 形成一層，同時(shí)這些顆粒帶有 ，因而蛋白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體。:利用蛋白質(zhì)不能透過(guò)半透膜的的性質(zhì)，將含有小 分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分 子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達(dá)到純化 蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析(dialysis).5、蛋白質(zhì)的沉

24、淀如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失 去水化層(消除相同電荷，除去水膜)，蛋白質(zhì)膠體溶液就 不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀.沉淀方法：(1) :在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的硫酸鞍、氯化鈉等中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化 層.同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而使蛋白 質(zhì)顆粒聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析分段鹽析沉淀反應(yīng)：不同蛋白質(zhì)分子的水 膜厚度和帶電量不同，發(fā)生鹽析所需要的 鹽濃度不同.改變鹽濃度可分離蛋白質(zhì)混 合物，這被稱為分段鹽析法.（2）.有機(jī)溶劑沉淀反應(yīng)降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。改變 有機(jī)溶劑的種類和濃度，可分離蛋白質(zhì)混合物，這被 稱為有機(jī)溶劑分級(jí)法。（3）.重金屬

25、鹽沉淀反應(yīng)在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子的負(fù)離子基團(tuán)（如 COO ）可以與重金屬鹽（如醋酸鉛、氯化高汞、硫 酸銅等）的正離子結(jié)合成難溶的蛋白質(zhì)重金屬鹽，并 從溶液中沉淀下來(lái).在臨床上，利用這種特性搶救重 金鹽審毒的病人和家畜。（4）.生物堿試劑沉淀反應(yīng)生物堿試劑（如苦味酸、單寧酸、三氯醋酸、 藥酸等）在溶液pH小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，其酸根負(fù) 離子能與蛋白質(zhì)分子上的正離子基團(tuán)相結(jié)合，變成 為溶解度很小的蛋白鹽，并從溶液中沉淀下來(lái)。臨 床化驗(yàn)時(shí)，常用上述生物堿試劑除去血漿中干擾測(cè) 定的蛋白質(zhì)。二、蛋白質(zhì)分離純化方法（-）.利用溶解度差別的純化方法（1）.等電點(diǎn)沉淀和pH控制蛋白質(zhì)是帶有正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)的

26、兩性電解質(zhì)， 蛋白質(zhì)分子的電荷性質(zhì)和數(shù)量則因pH不同而變化。蛋 白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì) 分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他 條件相同時(shí)，它的溶解度達(dá)到最低點(diǎn).在等電點(diǎn)以上或以下的pH時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶同 種符號(hào)的凈電荷而相互排斥，阻止了單個(gè)分子聚集成 沉淀、因此溶解度較大.（2）.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析鹽溶sailing in:在蛋白質(zhì)水溶液中加少量中性鹽, 增加分子表面電荷，增強(qiáng)分子與水的作用，使蛋 白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大的現(xiàn)象.鹽析salting out:在高濃度的鹽中，離子將蛋白質(zhì)水化 膜的水奪去，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀的現(xiàn)象.如飽和硫酸 鐵.中性鹽影響蛋白

27、質(zhì)溶解度的能力是離子強(qiáng)度的函 數(shù)。離子強(qiáng)度（ionic strength ）可以定義為： 弓Ci為各離子的濃度，Zj為各離子的凈電荷，E表示求和。 未解離的電解質(zhì)和攜帶電荷相等的兼性離子不計(jì)入電 荷的計(jì)算，它們不增強(qiáng)溶液的離子強(qiáng)度。（3）.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因是改變了介 質(zhì)的介電常數(shù)（dielectric constant）。水是高介電常 數(shù)物質(zhì)（20°C時(shí)，80）,有機(jī)溶劑是低介電常數(shù)物質(zhì) （20°C時(shí)，甲醇33,乙醇24,丙酮21.4）,因此有機(jī) 溶劑的加人使水溶液的介電常數(shù)降低。（4）.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響在040°C之間，

28、大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫 度升高而增加，但人的血紅蛋白從025°C,溶解度隨 溫度上升而降低.在4（）50°C以上，大部分蛋白質(zhì)變 得不穩(wěn)定并開始變性，在中性pH介質(zhì)中失去溶解力. 大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級(jí) 分離操作一般都在0°C或更低的溫度下進(jìn)行。（二）、根據(jù)分子大小不同的純化方法仃）.透析和超過(guò)濾dialysis and ultrafiltration透析：利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜，使 蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)分開的方法。半透膜：玻璃紙（cellophane paper,或稱賽 璐坊紙）、火棉紙（celloidin paper,又稱

29、賽璐碇 紙）和其他改型的纖維素材料.超過(guò)濾：透析時(shí)對(duì)半透膜加壓，一般液體與膜表面相切的方向流動(dòng)，使部分液體透過(guò)膜，另一部分液體切向流過(guò)膜表面，將膜哉留的蛋白質(zhì)分子沖走（反流回樣品槽），避免在濾膜表面堆積塞。樣品含量低時(shí)因吸附不能回收而采用此法.妥白質(zhì)的越濤(2).密度梯度(區(qū)帶)離心density gradient (zone) centrifugation蛋白質(zhì)顆粒在有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量 和密度大的顆粒沉降快，到與自身密度相等的介質(zhì)密 度梯度即停止，最后各種蛋白質(zhì)在離心管(常用塑料 管)中被分離成各自獨(dú)立的區(qū)帶，在管底小孔分部收 集。常用蔗糖梯度，聚蔗糖梯度和其他合成材料。蔗糖便宜

30、，純度高，濃溶液(60%, W/W)密度 可達(dá) 1.28g/cm3.聚蔗糖的商品名是Ficoll,由蔗糖和I氯2,3環(huán)氧 丙烷合成的高聚物，約400.000,需高密度和低滲 透壓的梯度時(shí)，可用Ficoll代替蔗糖。(3).凝膠過(guò)濾gel filtration又稱凝膠過(guò)濾層析、分子排阻(molecular- exclusion )層析、凝膠滲透(gel permeation )層析。 這是按大小分離蛋白質(zhì)混合物的最有效方法之一.常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖，聚丙烯酰胺凝膠和 瓊脂糖等。交聯(lián)葡聚糖是由線形的al,6葡聚糖與 氯2.3環(huán)氧丙烷反應(yīng)而成的化合物，商品名稱為 Sephadex»聚丙烯

31、酰胺凝膠(商品名稱為Bio-gel P ) 是一種人工合成的凝膠，它是由單體丙烯酰胺 (acrylamide )和交聯(lián)劑甲文雙丙烯酰胺(N,N， methylenebisacrylamide )共聚而成的。瓊脂糖是從 瓊脂中分離制得的，商品名稱微Sepharose或Bio GelA,這種凝膠的優(yōu)點(diǎn)是孔徑大，排阻極限高。O O OO CO %溶劑流動(dòng)方向小分子進(jìn)入凝 膠分子內(nèi)，被 滯留大分子在凝 膠顆粒間移 動(dòng)，較快流 出按分子量從大到小依次流出aoe q poo cB凝膠過(guò)濾層析原理（三）、根據(jù)電荷不同的純化方法（1）.電泳 electrophoresis電泳或離子泳ionphoresis:在

32、電場(chǎng)作用下、帶電顆粒向與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象.（2）.離子交換層析用于各種兩性分子混合物的分離，蛋白質(zhì)和核 酸大分子層析的支持介質(zhì)一般是纖維素離子交換劑 和交聯(lián)葡聚糖離子交換劑。陽(yáng)離子交換劑：CM纖維素（弱酸型）；P纖 維素（中強(qiáng)酸型）；SE纖維素（強(qiáng)酸型）；SP- Sephadex （強(qiáng)酸型）；陰離子交換劑：AE纖維素（弱堿型）；PAB- 纖維素（弱堿型）；DEAE-纖維素（中強(qiáng)戚型）； DEAE- Sephadex （中強(qiáng)戚型）；TEAE-纖維素（強(qiáng) 堿型）;QAE- Sephadex （強(qiáng)堿型）；(四) 、利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法 親和層析affinity chrom

33、atography:利用蛋白質(zhì)對(duì)其 配體分子特有的識(shí)別能力，即生物學(xué)親和力建立起來(lái) 的券請(qǐng)宛彳匕為法。最先用于酶的純化，現(xiàn)廣泛用于核昔酸.核酸、 免疫球蛋白、膜受體、細(xì)胞器甚至完整的細(xì)胞的純化.凝集素親和層析、免疫親和層析、金屬螯合層析(metal chelate chromatography )、染料配體層析和共 價(jià)層析等都屬于親合層析類抗體和抗原的結(jié)合：高度特異性把抗體作為“魚餌”，分離抗原,ai9 AiQen-coTibrrig stle親和層析的操作機(jī)理三、蛋白質(zhì)分子中氨基酸序列的測(cè)定 測(cè)定宙白質(zhì)的分f質(zhì)吊和幺肚創(chuàng) 拆丿1蛋門頃分/的鄉(xiāng)h , 斷幵多肽鏈內(nèi)的1硫鍵 分析毎條篇肽鏈的紅堆酸細(xì)成 器總務(wù)肽璉的N末端和C術(shù)端殘咗 虬I以I 一