1、響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌凍干保護(hù)劑的研究摘 要:采用單因素實驗和響應(yīng)面實驗設(shè)計聯(lián)用的方法，篩選優(yōu)化植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌真空冷凍干燥的保護(hù)劑配方。單因素實驗結(jié)果表明: 脫脂奶粉、麥芽糖和谷氨酸鈉 3 種保護(hù)劑效果較好，能夠顯著提高菌種對冷凍干燥環(huán)境的耐受能力。以細(xì)胞存活率為響應(yīng)值，混合保護(hù)劑的最佳配方為脫脂奶粉 7. 06%、麥芽糖 6. 46%和谷氨酸鈉 6. 70%，植物乳桿菌冷凍干燥存活率達(dá)到 92. 95%，凝結(jié)芽孢桿菌的冷凍干燥存活率達(dá)到 94. 1%。關(guān)鍵詞:植物乳桿菌; 凝結(jié)芽孢桿菌; 真空冷凍干燥; 保護(hù)劑; 響應(yīng)面法直投式發(fā)酵劑是一種不需活化和擴(kuò)增便能直接應(yīng)用于

2、生產(chǎn)的新型發(fā)酵劑，具有活菌含量高、菌種保質(zhì)期長等優(yōu)點，也防止了菌種退化和污染，提高了發(fā)酵制品工業(yè)的勞動生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量1。由于菌種對熱刺激的敏感性，直投式發(fā)酵劑工藝上多采用真空冷凍干燥法，冷凍和干燥過程中會使部分細(xì)胞損傷、死亡及某些蛋白酶分子鈍化2。為了提高菌種凍干后的存活率，凍干前加入保護(hù)劑減少凍干損傷是必要的，使其最大限度發(fā)揮保護(hù)功能，提高發(fā)酵菌劑的存活率3。不同的保護(hù)劑各有優(yōu)缺點，單一保護(hù)劑往往不能滿足菌體抵抗外界惡劣環(huán)境的條件，而復(fù)配保護(hù)劑中各保護(hù)劑在冷凍干燥中則發(fā)揮各自的特性并能起到增效作用4。本研究以凝結(jié)芽孢桿菌和植物乳桿菌為試驗菌株，采用單因素實驗選擇幾種效果較好的凍干保護(hù)劑，再

3、以植物乳桿菌為試驗菌株，采用 Design Expert 軟件的中心組合設(shè)計方法設(shè)計響應(yīng)面試驗對幾種保護(hù)劑的最佳水平和交互作用進(jìn)行研究探討5，然后對凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行冷凍干燥實驗，從而篩選出適用于兩菌種的優(yōu)良復(fù)合保護(hù)劑。1 材料與方法1. 1 材料與設(shè)備凝結(jié)芽孢桿菌 ( Bacillus coagulans) ，四川理工學(xué)院實驗室保藏; 植物乳桿菌 ( Lactobacillus plantarum) ，購于四川微生物菌種中心; MS 固體培養(yǎng)基; MS 液體培養(yǎng)基; MJ 250 生化培養(yǎng)箱( 上海美譜達(dá)儀器有限公司) ; LGJ 02 冷凍干燥機(jī)( 上海久世環(huán)保科技有限公司) ; 0. 22

4、 m 濾膜( 上海海凡濾材有限公司) ; TDL 5C型離心機(jī)( 上海安亭科學(xué)儀器廠) 。1. 2 試驗方法1. 2. 1 工藝流程菌種活化富集培養(yǎng)離心收集菌體加保護(hù)劑活菌計數(shù)預(yù)凍真空冷凍干燥凍干粉活菌計數(shù)1. 2. 2 試驗設(shè)計通過單因素試驗確定對細(xì)胞凍干存活率影響突出的幾個因素; 然后利用響應(yīng)面設(shè)計方法中的 Box Behnken Design 進(jìn)行試驗。1. 2. 3 菌體制備菌種以 5% 的接種量接種于 MS 液體培養(yǎng)基中，30 下培養(yǎng) 18 22 h，鏡檢無雜菌后，等量分裝于無菌離心管中，4000 r/min，4 離心15 min，棄上清液收集菌體。1. 2. 4 保護(hù)劑的制備預(yù)先將

5、脫脂奶粉、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸錳、甘露醇、谷氨酸鈉、L 半胱氨酸分別取一定量溶解于 100 mL 無菌水的試管中，其中，氨基酸類和糖類保護(hù)劑溶液用 0. 22 m 孔徑的濾膜過濾除菌，其它保護(hù)劑溶液 115 ，滅菌 15 min，備用。1. 2. 5 活菌計數(shù)平板混菌計數(shù)法( 參照 GB/T4789. 2 2003) 。1. 2. 6 真空冷凍干燥在無菌操作臺上，將離心所得菌泥樣品用滅菌后的保護(hù)劑溶液沖洗到無菌培養(yǎng)皿中，放在 80 條件下預(yù)凍 2 h，待樣品完全凍結(jié)后迅速轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥 24 h，菌粉含水量 3% 5%即可收獲成品。1. 3 菌種存活率的計算存活率 =凍干

6、后樣品測得的活菌數(shù)凍干前樣品測得的活菌數(shù)× 100%2 結(jié)果與分析2. 1 保護(hù)劑單因素實驗根據(jù)保護(hù)劑對菌體冷凍干燥的保護(hù)機(jī)理，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)報道6-7，選取脫脂奶粉、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸錳、1 甘露醇、谷氨酸鈉、L 半胱氨酸作為冷凍干燥保護(hù)劑，以存活率為指標(biāo)，考察對凝結(jié)芽孢桿菌與植物乳桿菌的凍干保護(hù)作用，結(jié)果見表 1。表 1 保護(hù)劑單因素實驗結(jié)果保護(hù)劑植物乳桿菌存活率( %)凝結(jié)芽孢桿菌存活率( %)脫脂奶粉 10% 78. 3 82. 5麥芽糖 10% 70. 4 74. 6蔗糖 10% 25. 6 42. 1可溶性淀粉 10% 22. 8 34. 7硫酸錳 5% 33.

7、 7 56. 9甘露醇 10% 52. 3 47. 6谷氨酸鈉 5% 51. 2 65. 3L 半胱氨酸 5% 23. 3 17. 6由表 1 可以看出，8 種保護(hù)劑對植物乳桿菌的保護(hù)作用影響大小次序為: 脫脂奶粉 麥芽糖 甘露醇 谷氨酸鈉 硫酸錳 蔗糖 L 半胱氨酸 可溶性淀粉;對凝結(jié)芽孢桿的影響大小次序為: 脫脂奶粉 麥芽糖 谷氨酸鈉 硫酸錳 甘露醇 蔗糖 可溶性淀粉 L 半胱氨酸，其中脫脂奶粉、麥芽糖和谷氨酸鈉對兩種菌種都有較好的凍干保護(hù)作用，存活率均能達(dá)到 50% 以上，進(jìn)而對這三種物質(zhì)組成的復(fù)配保護(hù)劑的比例做更深入的研究。2. 2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計結(jié)果與分析根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取脫脂

8、奶粉、麥芽糖和谷氨酸鈉為試驗因素，以植物乳桿菌為試驗菌種，利用Box Behnken 中心組合設(shè)計，設(shè)計 3 因素 3 水平的響應(yīng)曲面試驗，以存活率作為考核指標(biāo)，試驗因素與水平見表 2，結(jié)果見表 3。表 2 響應(yīng)面試驗因素與水平水平實驗因素A 脫脂奶粉 B 麥芽糖 C 谷氨酸鈉 1 5% 6% 2%0 10% 9% 6%1 15% 12% 10%表 3 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果序號A 脫脂奶粉( w/v)B 麥芽糖( w/v)C 谷氨酸鈉( w/v)存活率實測值( %)存活率預(yù)測值( %)1 10 12 10 81. 2 81. 02 5 9 2 78. 3 80. 23 10 12 2 74. 5

9、73. 54 10 9 6 89. 8 90. 55 15 6 6 85. 6 86. 56 15 9 2 76. 7 77. 97 5 9 10 89. 3 88. 08 5 6 6 92. 1 92. 39 10 9 6 91. 2 90. 510 15 9 10 84. 7 82. 811 10 6 10 86. 4 87. 412 15 12 6 81. 2 83. 413 5 12 6 83. 5 82. 614 10 6 2 87. 0 84. 8對表 3 中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得出冷凍干燥存活率對脫脂奶粉、麥芽糖、谷氨酸鈉冷凍保護(hù)劑的二次多項回歸方程模型:Y = + 90. 5

10、 1. 88A 3. 84B + 3. 14C + 1. 05AB 0. 75AC + 1. 82BC 2. 46A2 2. 44B2 5. 79C2其中，Y 為響應(yīng)值冷凍干燥菌種存活率，A、B、C分別為脫脂奶粉、麥芽糖、谷氨酸鈉單位體積溶質(zhì)質(zhì)量濃度。為了檢驗?zāi)Ｐ偷挠行?，對模型進(jìn)行方差分析結(jié)果表明( 表 4) ，多元相關(guān)系數(shù)為 2= 0. 9344，對方程的系數(shù)顯著性進(jìn)行檢驗，結(jié)果表明各因子系數(shù)均有意義; 表明冷凍干燥存活率的實測值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度; Prob( p) F 值并且 0. 0001 模型顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)面分析。2 4四川理工學(xué)院學(xué)報( 自然科學(xué)版) 2013 年

11、 10 月表 4 響應(yīng)面法對冷凍保護(hù)劑選擇的 ANOVA 分析結(jié)果因素 平方和 自由度 均方和 F 值 P 值 顯著性模型 491. 40 9 20. 16 26. 33 0. 0001 A 98. 13 1 98. 13 11. 43 0. 0103 *B 137. 81 1 137. 81 22. 56 0. 0041 C 118. 75 1 118. 75 18. 41 0. 0052 AB 41. 07 1 41. 07 4. 43 0. 1031AC 22. 25 1 22. 25 3. 22 0. 1536BC 63. 32 1 63. 32 9. 10 0. 0480 *A255

12、. 40 1 55. 40 17. 06 0. 0253 *B256. 01 1 56. 01 16. 00 0. 0285 *C2127. 18 1 127. 18 44. 89 0. 0001 殘差 25. 39 4 6. 35失擬 24. 41 3 8. 14 5. 30純誤差 0. 98 1 0. 98總和 386. 79 13圖 1、圖 2、圖 3 是由多元回歸方程式所作的響應(yīng)曲面三維圖和等高線圖。可以對任何兩個因素的交互作用進(jìn)行分析和評價，以確定最佳因素水平范圍。圖 1 脫脂奶粉和麥芽糖對冷凍干燥存活率交互影響利用 Expert Design 7. 0 軟件以存活率最大值為目標(biāo)優(yōu)化

13、出方案，得出唯一最優(yōu)方案為: 脫脂奶粉 7. 06%，麥芽糖 6. 46%，谷氨酸鈉 6. 70% 為組合保護(hù)劑使用時，能使植物乳桿菌冷凍干燥存活率達(dá)到 92. 95%。圖 2 脫脂奶粉和谷氨酸鈉對冷凍干燥存活率交互影響的等高線圖和三維曲面圖圖 3 麥芽糖和谷氨酸鈉對冷凍干燥存活率交互影響的等高線圖和三維曲面圖第 26 卷第 5 期 王世寬等: 響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌凍干保護(hù)劑的研究252. 3 凝結(jié)芽孢桿菌冷凍干燥實驗對植物乳桿菌優(yōu)化的最優(yōu)復(fù)合保護(hù)劑組合，脫脂奶粉 7. 06%，麥芽糖 6. 46%，谷氨酸鈉 6. 70%，應(yīng)用于凝結(jié)芽孢桿菌冷凍干燥，進(jìn)行存活率的檢測，得出凝結(jié)

14、芽孢桿菌冷凍干燥存活率為 94. 1%，可見優(yōu)化得出的保護(hù)劑組合配方對凝結(jié)芽孢桿菌的冷凍干燥也具有較好的保護(hù)效果。3 結(jié)束語通過響應(yīng)面分析方法，利用 Expert Design 7. 0 軟件以存活率最大值為目標(biāo)，確定對植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌具有最佳凍干保護(hù)作用的配方為脫脂奶粉 7. 06%，麥芽糖 6. 46%，谷氨酸鈉 6. 70%，使物乳桿菌冷凍干燥存活率達(dá)到 92. 95%，凝結(jié)芽孢桿菌的冷凍干燥存活率達(dá)到 94. 1%。此項研究為植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的復(fù)合發(fā)酵劑菌粉的實際生產(chǎn)提供了理論參考。參 考 文 獻(xiàn):1 陳 功，余文華，張其圣，等 泡菜直投式菌劑制備及應(yīng)用研究J 四川食品

15、與發(fā)酵，2008(4) :19-232 umian N，Tsvetkov T D，Angelov M Investigation of lac-tobacilli strains during lyophilizationJ Cryobiology，1993( 30) : 536-5403 李寶坤，田豐偉，劉小鳴，等 冷凍干燥對乳酸菌代謝活力的影響J食品工業(yè)，2011(9) :203-2054 袁亞宏，岳田利，高振鵬，等 凍干高活力乳酸菌粉保護(hù)劑的研究J 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2003( 31) : 82-845 潘 明，謝仁有，洪玉程 響應(yīng)面法優(yōu)化甘薯葉 SOD 的提取工藝J四川理工學(xué)院學(xué)報

16、: 自然科學(xué)版，2012，25(2) :5-76 張澤生，王婧宜，王 馨，等 保加利亞乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑的篩選J食品工業(yè)，2011(6) :48-507 熊 濤，黃錦卿，宋蘇華，等 植物乳桿菌真空冷凍干燥保護(hù)劑配方優(yōu)化J 南昌大學(xué)學(xué)報: 理科版，2010( 6) :561-565Optimization of Cryoprotectants for Bacillus Coagulans and Lactobacillus Plantarum byesponse Surface MethodsWANG Shi-kuan，HONG Yu-cheng，YUAN Xian-ling( School

17、of Biotechnology Engineering，Sichuan University of Science Engineering，Zigong 643000，China)Abstract: The formula of the freeze-dried protectants for Bacillus coagulans and Lactobacillus plantarum is optimizedand selected by the method that combines single factor experiment and response surface exper

18、iment design The single factorexperiment shows that the skim milk，maltose and sodium glutamate have outstanding protective effect，which contribute toimprove the cell's endurance capacity in freeze-dried environment By response surface analysis，the quadratic model for thethree significant factors is established with cell survival rate as the target response The optima formula is: the skim milk7. 06% ，maltose 6. 46% an