1、免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（雙向雙擴(kuò)散）免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（雙向雙擴(kuò)散）2010級(jí)生物技術(shù)第四組實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解雙向瓊脂擴(kuò)散的原理和用途。 掌握抗體效價(jià)的測(cè)定方法。 觀察抗原、抗體在瓊脂板中形成的沉淀線。實(shí)驗(yàn)原理 雙向雙擴(kuò)散簡(jiǎn)稱雙擴(kuò)散，此法是一種定性試驗(yàn)。可溶性抗原與相應(yīng)的抗體在瓊脂凝膠中各自向四周擴(kuò)散，如果抗原和抗體相對(duì)應(yīng)，則在二者比例適當(dāng)處形成白色沉淀線；若抗原和抗體無(wú)關(guān)就不會(huì)出現(xiàn)沉淀線。此試驗(yàn)可以檢測(cè)抗原或抗體的純度，滴定抗體的效價(jià)，以及用已知抗原（抗體）檢測(cè)和分析未知抗體（抗原）。實(shí)驗(yàn)材料 生理鹽水、1%瓊脂（用于制作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)平板） 已知傳染性法氏囊病毒抗原、待檢血清 打孔器、微量加樣器、槍頭、酒精燈、

2、搪瓷盒等實(shí)驗(yàn)步驟制板：稱取1g瓊脂粉，加入100ml生理鹽水，煮沸使之溶解。待溶解的瓊脂溫度降至60左右時(shí)倒入平皿中，厚度為2-3mm。注意勿產(chǎn)生氣泡。打孔：待瓊脂凝固好后用打孔器打孔，孔徑和孔距依不同疫病檢疫規(guī)程而定，一般孔徑35mm，孔間距47mm。孔型多為7孔，中央1孔，周圍6孔（如梅花孔）。用針頭挑出孔內(nèi)瓊脂。封底：將瓊脂板無(wú)凝膠面在酒精燈火焰上輕輕灼燒，用手背感受微燙即可?？贵w效價(jià)測(cè)定：用微量加樣器于中央孔加入已知抗原，于周圍孔加倍比稀釋的血清，每個(gè)稀釋度加1孔。加樣時(shí)不要使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴(kuò)散結(jié)果。擴(kuò)散：加樣完畢后，將瓊脂板放于濕盒內(nèi)，保持一定的濕度，置于37溫

3、箱中擴(kuò)散2448小時(shí)觀察結(jié)果。圖圖1結(jié)果判定用以檢測(cè)抗原或比較抗原差異時(shí)，將抗血清置中心孔，將待測(cè)抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶完全融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不同。u用梅花孔檢測(cè)抗血清的效價(jià)，操作時(shí)將抗原置于中心孔，抗血清倍比稀釋后置于周圍孔，以出現(xiàn)沉淀帶的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的瓊擴(kuò)效價(jià)。u若凝膠中抗原、抗體是特異性的，則形成抗原抗體復(fù)合物，在兩孔之間出現(xiàn)清晰致密的白色沉淀線，為陽(yáng)性反應(yīng)。若在72小時(shí)內(nèi)仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)至少要做一陽(yáng)性對(duì)照。出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照與備檢樣品的沉淀線發(fā)生融合，才能確定待檢樣品為真正陽(yáng)性。結(jié)果判定結(jié)果判定 雙向免疫擴(kuò)散凝膠染色圖雙向免疫擴(kuò)散凝膠染色圖注意事項(xiàng) 澆制瓊脂板時(shí)要均勻、無(wú)氣泡。 孔要打得圓整光滑，邊緣不要破裂。 加樣時(shí)應(yīng)盡量避免氣泡或加到孔