1、基因工程操作程序培訓(xùn)課件8、載體主要有哪幾類？其中，最常用的是？它的本質(zhì)是？9、載體必須具備的四個(gè)條件是？10、寫出限制酶切割后的黏性末端。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)( (補(bǔ)充內(nèi)容）補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子不編碼蛋白質(zhì)。不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì)：編碼蛋白質(zhì) , ,連續(xù)不間斷連續(xù)不間斷編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)調(diào)控遺傳信息表達(dá)調(diào)控遺傳信息表達(dá), ,上上 游有啟動(dòng)子，下游有終止子游有啟動(dòng)子，下游有終止子真核

2、細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 真核細(xì)真核細(xì)胞的胞的 基因結(jié)基因結(jié)構(gòu)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用有調(diào)控作用, ,上游有啟動(dòng)子，下游上游有啟動(dòng)子，下游有終止子有終止子非編碼序列：非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子 基因工程的基本操作程序主要包基因工程的基

3、本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？括哪幾個(gè)步驟？1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測(cè)與鑒定、目的基因的檢測(cè)與鑒定問題問題1 1.目的基因主要是指目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的基因編碼蛋白質(zhì)的基因目的基因指的是：目的基因指的是：也可以是具有調(diào)控作用的因子也可以是具有調(diào)控作用的因子獲取目的基因的常用方法有哪些獲取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、從基因文庫(kù)中獲取、從基因文庫(kù)中獲取目的基因目的基因2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增目的基因目的基因3 3、人工合成、人

4、工合成目的基因目的基因反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法( (一一) )從基因文庫(kù)中獲取目的基因從基因文庫(kù)中獲取目的基因 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)物的不同基因，稱為基因文庫(kù)1.1.基因文庫(kù)概念基因文庫(kù)概念2.2.基因文庫(kù)類型基因文庫(kù)類型（）( (一一) )從基因文庫(kù)中獲取目的基因從基因文庫(kù)中獲取目的基因3.3.基因組文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當(dāng)?shù)挠眠m當(dāng)?shù)?限制酶限制酶一定大小的一定大小

5、的DNADNA片段片段將將DNADNA片段片段 與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)4.cDNA4.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建提取某種生物的某器官提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的或特定發(fā)育時(shí)期的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段重組載體重組載體與載體與載體 連接連接cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA DNA 聚合酶聚合酶導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌 中儲(chǔ)存中儲(chǔ)存兩種基因文庫(kù)的主要區(qū)別如下表（課本兩種基因文庫(kù)的主要區(qū)別如下表（課本P10）文庫(kù)類型文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)文庫(kù)基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小文庫(kù)大小

6、小小大大基因中啟動(dòng)子基因中啟動(dòng)子無(wú)無(wú)有有基因中內(nèi)含子基因中內(nèi)含子無(wú)無(wú)有有基因多少基因多少部分基因部分基因全部基因全部基因物種間的基因交流物種間的基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以總結(jié)總結(jié)1 1、概念：、概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項(xiàng)在生，是一項(xiàng)在生 物物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 3 3、條件：、條件：2 2、原理：、原理：_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNA片段片段DNA雙鏈雙鏈復(fù)制復(fù)制( (二二) )利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因模板模板（目的基因）（目的基因）原料原料( (脫氧核苷酸脫氧核苷酸) )引物引物（一小段單鏈（一小段

7、單鏈DNADNA）耐高溫的耐高溫的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）溫度控制溫度控制一段已知目的基因的核苷酸序列，一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。以便合成引物。6 6、結(jié)果、結(jié)果 ： 在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因7 7、過程：、過程：a a、變性（、變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板在熱作模板在熱作 用下，用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、復(fù)性（、復(fù)性（55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物與）：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA DNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-7

8、5）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物開始進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，合成與引物開始進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，合成與 模板互補(bǔ)的模板互補(bǔ)的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNA雙鏈雙鏈DNA鏈鏈( (二二) )利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫演示技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫演示反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNARNA為模板，為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNADNA，然后在酶的作，然后在酶的作用下合成雙鏈用下合成雙鏈DNADNA，從而獲得所需的基因。，從而獲得所需的基因。DNA合成儀合成儀推測(cè)推測(cè)推測(cè)推測(cè)合成合成前提前提：基因比較小、核苷酸序列已知

9、：基因比較小、核苷酸序列已知基因基因DNA的核苷酸序的核苷酸序列列問題問題43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_獲取目的基因的三種方法應(yīng)用獲取目的基因的三種方法應(yīng)用1、如果有目的基因的核苷酸序列，而且基因比、如果有目的基因的核苷酸序列，而且基因比較大，可采用較大，可采用_ 2、如果知道目的基因的序列，而且基因比較、如果知道目的基因的序列，而且基因比較小，可采用小，可采用_PCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增化學(xué)合成法化學(xué)合成法從基因文庫(kù)獲取的方法從基因文庫(kù)獲取的方法復(fù)習(xí)回顧1、基因工程的基本操作程序的四個(gè)步驟是？核心是？2、目的基因指的是什么基因？3、獲取目的

10、基因常用的三種方法是？其中人工合成法又包括哪兩種?4、基因文庫(kù)包括哪兩類？5、PCR的原理是？PCR全稱是？PCR擴(kuò)增過程中的解旋方式是？PCR需要的條件有？6、基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的是？7、一個(gè)基因表達(dá)載體的組成包括哪幾部分？8、標(biāo)記基因的作用是？9、啟動(dòng)子，終止子的位置，作用？起始密碼子，終止密碼子呢？二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心基因工程的核心1 1目的：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。表達(dá)和發(fā)揮作用。2 2組成：組成：目的基

11、因目的基因+ +啟動(dòng)子啟動(dòng)子+ +終止子終止子+ +標(biāo)記基因等標(biāo)記基因等啟動(dòng)子：位于基因的首端的一啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的段特殊的DNADNA片斷，片斷，RNARNA聚合酶聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 終止子：位于基因的尾端的終止子：位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，能終止片斷，能終止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄（與終止密碼子的轉(zhuǎn)錄（與終止密碼子區(qū)別）區(qū)別）標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程基因表達(dá)載體的構(gòu)

12、建過程質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理兩個(gè)切口兩個(gè)切口四個(gè)黏性末端四個(gè)黏性末端DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1 1轉(zhuǎn)化概念：轉(zhuǎn)化概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2 2轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)：轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)：目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNADNA上上生物種類生物種類植物細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)動(dòng)物細(xì)胞胞微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通

13、道法花粉管通道法顯微注顯微注射法射法Ca2處理法處理法受體細(xì)胞受體細(xì)胞 一般是體細(xì)胞一般是體細(xì)胞受精卵受精卵-4 4、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法1 1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力單子葉植物沒有感染能力原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的的DNA上上。三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、目的基因?qū)胧荏w

14、細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌植物細(xì)胞植物細(xì)胞導(dǎo)入導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)穩(wěn)定維持和表達(dá)過程：過程：（2 2）基因槍法：）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞（3 3）花粉管通道法：）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞 特點(diǎn)特點(diǎn):十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。 例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（我

15、國(guó)）例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（我國(guó)）（4 4）、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞）、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法目的基因表達(dá)載體提純目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物為什么動(dòng)物細(xì)胞要用受精卵做受體細(xì)胞？為什么動(dòng)物細(xì)胞要用受精卵做受體細(xì)胞？全能性受限制全能性受限制（5 5）、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞）、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞微生物作受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：微生物作受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少常用菌：大腸桿菌常用菌：大腸桿菌常用法：常用法：CaCa處理獲得感受態(tài)細(xì)胞處理獲得感

16、受態(tài)細(xì)胞 （改變細(xì)胞壁的通透性）（改變細(xì)胞壁的通透性）過程：過程：導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝 入入重組重組DNADNA分子嗎？分子嗎？目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？和表達(dá)？ 問題問題4問題問題5檢查是否成功檢查是否成功分子分子水平水平個(gè)體水平：個(gè)體水平：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒

17、定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法、工具：方法、工具：方法、工具：方法、工具：方法、工具：方法、工具：DNADNA分子雜交、分子雜交、DNADNA探針探針分子雜交、分子雜交、DNADNA探針探針抗原抗原- -抗體雜交、抗體抗體雜交、抗體 四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定方法：方法：接種實(shí)驗(yàn)接種實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因生轉(zhuǎn)基因生物的物的DNA探針探針15151414方法方法DNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)知識(shí)延伸知識(shí)延伸DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) 該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解解開，把單股的開，把單股的DNA小片段用同位

18、素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的從而檢出所要查明的DNA或基因?；蚧?。方法方法分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)探針探針1515轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因生物的的mRNA1414提取提取蘇云金桿菌蘇云金桿菌Bt毒素蛋白毒素蛋白將將Bt毒蛋白注射毒蛋白注射小鼠體內(nèi)小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血從小鼠血管抽出血液分離出抗液分離出抗Bt毒素毒素的抗體的抗體抗體抗體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 出現(xiàn)雜出現(xiàn)雜交帶交帶脫分化脫分化組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)檢查是否成功檢查是否成功分子分子水平水平個(gè)體水平：個(gè)體水平：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法、工具：方法、工具：方法、工具：方法、工具：方法、工具：方法、工具：DNADNA分子雜交、分子雜交、DNADNA探針探針分子雜交、分子雜交、DNADNA探針探針抗原