1、2004年12月，第2卷，第12期Dec. 2004, Vol.2 , No. 12西北大學學報（自然科學網絡版）ScienceJournalofNorthwestUniversityOnline重組人粒細胞-巨噬細胞刺激因子的搖瓶發(fā)酵研究馬莉，白泉，王驪麗，斯琴，耿信篤（西北大學現代分離科學研究所/現代分離科學陜西省重點實驗室，陜西西安710069）摘要：為了優(yōu)化重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子搖瓶發(fā)酵工藝，利用搖瓶法選擇出最佳的rhGM-CSF的培養(yǎng)條件。結果表明：最佳條件為培養(yǎng)溫度32C,初始pH值7.2；.4,搖床轉速200r/min,種子菌齡在OD600為1.0左右時接種，并在對數

2、生長前期0.5M.8之間誘導4h。在此優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，在搖瓶中使用M9培養(yǎng)基時，rhGM-CSF的表達量占菌體總蛋白的24.3%,OD600達5.35,說明構建的rhGM-CSF工程菌發(fā)酵的穩(wěn)定性和重復性良好，可為rhGM-CSF的大規(guī)模生產提供可靠的放大依據。關鍵詞：重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；大腸桿菌；搖瓶發(fā)酵中圖分類號：TQ920.6文獻標識碼：A文章編號：1000-274X（2004）0117-08人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（humangranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,hGM-CSF）是一種重要的造血調控因子1,對

3、各種原因尤其是癌癥患者化療后引起的白細胞減少癥有明顯的療效。由于天然人GM-CSF來源有限，產量甚微，不能滿足科研和臨床的需要，1985年Wong等人克隆了人GM-CSFcDNA,并實現了表達2,1993年張智清等人在國內首次克隆了人GM-CSFcDNA,并在大腸桿菌中獲得表達3。近年來，許多科研人員也致力于這方面的研究，并取得了成功46。本文作者也克隆出了人GM-CSFcDNA,實現了在大腸桿菌中的表達。為了進一步開發(fā)研究，實現rhGM-CSF的產業(yè)化，本文以提高其表達量和細胞產量為目標，對重組大腸桿菌的搖瓶培養(yǎng)條件進行了研究，確定出最佳生產重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的培養(yǎng)條件，為以

4、后的大規(guī)模發(fā)酵生產奠定基礎。1材料和方法1.1 材料工程菌：菌種pDH/rhGM-CSF/DH5a,由本所分子生物學實驗室構建。試劑：酵母粉（Yeastextract,OXOID公司產品），蛋白月東（Tryptone,OXOID公司產品），瓊脂糖（Agarpowder,日本進口分裝公司，上?；瘜W試劑站分裝廠），氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、氯化俊均為分析純。收稿日期：2004-06-02審稿人：申煒華，女，西北大學化學系副教授。1.2 方法1.2.1 一級種子的制備選用LB培養(yǎng)基，其組成（g/L）:胰蛋白月東10.0,酵母粉5.0,氯化鈉10.0,氨茉青霉素0.1,

5、pH調至7.0,1.034M05Pa高壓滅菌20min。將種子接入其中后，于30C,200r/min的搖床內培養(yǎng)過夜，OD600達1.0左右時即可進行轉接。1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)選用M9培養(yǎng)基，其組成（g/L）:胰蛋白月東5.0,酵母粉5.0,葡萄糖10.0,Na2HPO412H2O17.1,KH2PO43.0,NaCl0.5,NH4Cl1.0,氨節(jié)青霉素0.1,pH調至7.2,1.034105Pa高壓滅菌20min。1.2.3 菌體密度的測定用721型分光光度計在600nm波長下測定OD600值。1.2.4 表達量的測定取500ML發(fā)酵液離心，棄上清液，向菌體中加樣品緩沖液。其組成為50mmo

6、l/LTris-HCl（pH6.8）,50mmol/LDTT,2%SDS,0.1%澳酚藍和10%甘油，然后攪拌土!勻，沸水煮5min,離心。走SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R250染色，用Cs-930雙波長掃描儀（Shimadzu）掃描測定rhGM-CSF表達量。2結果與討論2.1培養(yǎng)溫度對工程菌生長的影響微生物的生長和產物合成都是在各種酶催化下進行的，溫度是保證酶活性的重要條件，因此在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。本實驗中選擇培養(yǎng)溫度27、30、32、35七進行考察，實驗結果見圖1。時間/h27C,30C,x32C,35C圖1培養(yǎng)溫度對重組大腸桿菌生長情況的影響Fig.1Effe

7、ctofculturetemperatureonthethegrowthofbacteria從圖1可看出，在27、30和32七培養(yǎng)時菌體密度均能達到5.00,但在32七時為最高。其原因是在較低溫度（如27七）進行培養(yǎng)時細菌的生長代謝緩慢，菌體不能得到充分的增殖，而在較高溫度（如35七）進行培養(yǎng)時，雖然生長迅速，但代謝加快，生產期提前，對葡萄糖的利用過多，排謝出大量的代謝副產物（如乙酸等），抑制了菌體的生長，因而菌體密度較低7。所以，以下實驗均控制培養(yǎng)溫度在3032P。2.2 誘導時機對工程菌生長和rhGM-CSF表達的影響基因工程菌的兩階段培養(yǎng)法是為了在擴大菌體密度的同時，盡可能提高工程菌的表

8、達水平，因此誘導時機是至關重要的因素，在研究溫控誘導策略時應先確定最佳的誘導時機。圖1顯示出所用大腸桿菌pDH/rhGM-CSF/DH&在32c培養(yǎng)時的生長曲線。從圖1可見：13h為延遲期，OD600剛到0.3左右；410h為對數生長期，OD600從0.5迅速增加到4.3;1114h為穩(wěn)定期，OD60。變化不大；14h以上為衰亡期，OD600下降。以此為依據，在不同生長期（對數生長初期、中期和后期），OD600在0.3、0.5、0.8、1.0、2.0左右時分別升溫至42。誘導，誘導表達4h,實驗結果見表1。表1誘導時機對菌體生長和rhGM-CSF表達的影響Tab.1Effectsofi

9、nductiontimeonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF誘導時OD600菌體密度OD600rhGM-CSF表達量/%0.353.65216.40.525.19120.80.815.24520.41.104.78313.22.054.23210.1由表1可見：在菌體的對數生長前期（OD600=0.52、0.81）進行誘導可獲得較高的表達量，在OD600=0.35時誘導，由于菌體沒有充分增殖就擔負起表達外源基因產物和分裂后代的雙重任務，勢必難以獲得較高的菌體產量，比OD600大約0.5時誘導的產量低；當在對數生長中后期（OD600=1.10、

10、2.05）進行誘導時，此時菌體雖充分增殖，但由于生存環(huán)境已經惡化，pH下降，部分營養(yǎng)物質減少甚至缺乏，使得工程菌的活力衰弱，不能給基因表達提供大量活力旺盛的細胞。因此，最好選擇在OD600為0.50.8之間升溫誘導。2.3 誘導表達時間對工程菌生長和rhGM-CSF表達的影響采用兩階段培養(yǎng)法，在菌體生長到OD6000.5時升溫42c誘導，考察表達時間對菌體生長和表達的影響，試驗結果見圖2。10海量達表5 0 5 02 2 1150111111012345678誘導表達時間/hOD600,rhGM-CSF表達量圖2誘導表達時間對菌體生長和rhGM-CSF表達的影響Fig.2Effectsofex

11、pressiontimeonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF由圖2可看出，誘導45h之后，菌體密度與表達量均達最大值。這可能是因為：誘導后第23h,細菌培養(yǎng)物仍處于對數生長期，菌液密度較小，細菌培養(yǎng)物還在不斷繁殖，故此階段菌體密度和表達量都處于上升期；誘導45h后，細菌進入對數生長后期，培養(yǎng)液中細菌濃度趨于穩(wěn)定，表達也達最高；繼續(xù)誘導，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不足，生存環(huán)境已經惡化，菌體密度有所下降，表達量下降幅度較大。2.4pH值對工程菌生長和rhGM-CSF表達的影響培養(yǎng)基的pH值影響培養(yǎng)基中某些物質和中間代謝產物的解離，從而影響微生物對營養(yǎng)成分的

12、吸收和代謝。因此，各種微生物都有最適生長的pH值范圍，超出這個范圍，菌體的生長就會受到影響甚至停止。在工程菌的搖瓶發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的初始pH值是一個重要參數，它對于細胞的正常生長和外源基因的高效表達都有影響8。本實驗中采用初始pH值分另為6.67.6的培養(yǎng)基，考察對菌體生長和rhGM-CSF表達的影響，實驗結果見圖3。006 Do陛量達表OD600,rhGM-CSF表達量圖3培養(yǎng)基初始pH值對菌體生長和rhGM-CSF表達的影響Fig.3EffectsofinitialpHofculturemediaonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF從圖

13、3中發(fā)現，培養(yǎng)基初始pH值對工程菌生長和rhGM-CSF表達的影響趨勢基本一致，均有一個最優(yōu)值，當pH為7.2時，rhGM-CSF的表達處于最佳，當pH在7.4時的菌體密度最高，表達量稍稍次之。一般情況下，E.coli表達外源蛋白的最適pH為6.06.59,而在此優(yōu)化的初始pH在7.2或7.4。這是因為搖瓶發(fā)酵過程中，不斷產生乙酸等代謝廢物，使得培養(yǎng)基的pH下降。因此，培養(yǎng)基的初始pH應控制在7.27.4。2.5 接種量對工程菌生長和rhGM-CSF表達的影響接種量的大小影響發(fā)酵的產量和發(fā)酵周期。接入適量的種子，由于種子液中含有大量的體外水解酶類，有利于對基質的利用，可以縮短生長的延遲期，并且

14、使生產菌迅速占據了整個培養(yǎng)環(huán)境，可減少雜菌生長的機會。但是，如果接種量過多，往往使菌體生長過快，一方面會使培養(yǎng)液粘度增加，造成溶解氧不足，影響產物的合成，另一方面會加劇工程菌質粒的丟失，使菌體表達外源蛋白的能力下降10o同樣，如果接種量過小，就會使發(fā)酵周期延長，不利于外源基因表達。本實驗中采用不同的比例接種，考察對菌體生長和rhGM-CSF表達的影響，實驗結果見表2。表2接種量對菌體生長和rhGM-CSF表達的影響Tab.2EffectsofinoculumvolumesonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF接種量/%OD600表達量/%13.

15、5515.324.2717.935.3421.645.1219.354.8716.9從表2可見，無論從發(fā)酵菌體量還是從rhGM-CSF表達量上看，當接種量為3%時兩者均為最高，因此采用適當的接種量有利于重組菌的生長和外源基因的表達，以后實驗中采用3%的接種量。2.6 搖床轉速對菌體生長和rhGM-CSF表達的影響不同搖床轉速對工程菌生長和rhGM-CSF表達的影響如表3所示。表3搖床轉速對菌體生長和rhGM-CSF表達的影響Tab.3EffectsofrotationalspeedonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF轉速/rmin-1OD60

16、0rhGM-CSF表達量/%1404.23516.11604.76418.71805.01620.42005.12522.62205.20521.5表3結果顯示，隨著轉速的提高，rhGM-CSF菌體密度也提高，當轉速為220r/min時，菌體密度最高，而菌體表達量先增加后降低，轉速為200r/min時表達最好。這說明轉速越高，旋轉時發(fā)酵液與空氣接觸面積越大，氧氣傳質越快，供氧量能夠滿足菌體生長的要求11;當轉速低時供氧量不足，菌體生長緩慢，rhGM-CSF表達量較低，因此可以提高搖床轉速來提高外源蛋白的產量。通常生產中需要考慮的是rhGM-CSF的產量，因此需綜合考慮菌體密度和rhGM-CSF

17、表達量這兩個因素作為優(yōu)化指標。OD600與細胞干重成正比，所以用OD600乘以rhGM-CSF表達量的數值，表征其產量。200r/min和220r/min時，該數值分別為115.8和111.9,可見200r/min優(yōu)于220r/min,所以搖床轉速選定在200r/min左右。2.7 種子菌齡對工程菌生長和rhGM-CSF表達的影響種子液質量的優(yōu)劣對發(fā)酵生產起著關鍵的作用，若將過于年輕的種子接入搖瓶中，往往會出現前期生長緩慢、整個發(fā)酵過程周期延長、產物形成的時間推遲等現象，甚至會因菌體量過少而在發(fā)酵中結球，造成異常發(fā)酵。然而，菌齡過老，又會引起菌種生產能力的下降。因此，我們在實驗中將不同菌齡的種

18、子液按3%的接種量接于M9培養(yǎng)基中，培養(yǎng)OD600至0.5左右，升溫至42c誘導表達4h,實驗結果見表4。表4種子菌齡對菌體生長和rhGM-CSF表達的影響Tab.4EffectsofinoculumageonthegrowthofbacteriaandexpressionofrhGM-CSF種子菌齡OD600終止OD600rhGM-CSF表達量/%0.54.68916.11.05.13223.81.54.72520.42.04.48918.5由表4可見，種子液OD600在0.5立.0時，隨種子液濃度增高，發(fā)酵液的終止OD600先升后降，而rhGM-CSF的表達量亦有一最佳值。綜合考慮細胞密度

19、和rhGM-CSF的表達量，選擇種子菌齡的OD600為1.0左右時較為合適。3結論通過對工程菌pDH/rhGM-CSF/DH5口搖瓶發(fā)酵工藝條件的研究，確定出搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度32C；初始pH值7.2；4;搖床轉速200r/min；種子菌齡在OD600為1.0左右時進行接種；培養(yǎng)至OD6000.5-0.8,升溫至42c誘導表達4h。用選定的優(yōu)化條件，發(fā)酵3批，結果見表5,電泳結果見圖4,rhGM-CSF的表達量平均24.3%,平均OD600可達5.35。由此可見，用我們構建的工程菌發(fā)酵的穩(wěn)定性和重復性良好，可為rhGM-CSF的大規(guī)模生產提供可靠的放大依據。表5優(yōu)化條件下的實驗結

20、果Tab.5Theexperimentalresultsunderoptimalconditions實驗批次OD600rhGM-CSF表達量/%15.44524.224.75.23823.95.369平均5.350二0.11224.3二0.4rhGM-CSF圖4搖瓶優(yōu)化條件下SDS-PAGE圖Fig.4TheSDS-PAGEunderoptimalconditionsinshakingflask參考文獻：1 METALFD.Thegranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactorsJ.Science,1985,229:16-22.2 WONGGG,WIT

21、EKJS.HumanGM-CSF:molecularcloningofthecomplement?！盌NAandpurificationofthenaturalrecombinantproteinsJ.Science,1985,228：810-815.3張智清，張穎，路秀華，等.人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子cDNA5'端的修飾提高其在大腸桿菌的表達J.病毒學報，1993,9(2):136-143.4王嘉璽，鄒民吉，黃碧蓮，等.人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子在大腸桿菌中的克隆與表達J.生物工程學報，1995,11(1):33-38.5姚軍，甘人寶，張倩，等.人GM-CSFcDNA的克隆

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