1、電化學發(fā)光免疫法定量檢測乙肝病毒的臨床應用    中國是乙型病毒性肝炎的高發(fā)國家，根據(jù)流行病學調查，人群發(fā)生率較高，表面抗原攜帶率約為15%nbsp;1nbsp;，乙肝的實驗診斷對于治療及預防有重要參考意義.但現(xiàn)常規(guī)使用的ELISA法，對低濃度HBsAg標本前后結果常不一致，嚴重影響了臨床的可比性.因此為提高     邱春嫦 ，勞小斌     摘要:目的 了解電化學發(fā)光法（ECL）檢測乙肝病毒標志物的應用價值。 方法 用ELISA法和ECL法平行測定360例疑似乙肝病人血清乙肝五項標志

2、物，并對ELISA法檢測為陰性而ECL法檢測為低濃度HBsAg的標本，再用微粒子酶免分析法（MEIA）進行復測并分析。 結果 ELISA法和ECL法對HBsAb、HBeAg、HBeAb三項標志物的檢出率無顯著性差異，但對HBsAg的檢測，ECL檢出率明顯高于ELISA法（P<0.05）。ELISA檢測為陰性而ECL法檢測為低濃度HBsAg的標本，用MEIA法復測均為陽性。 結論 ECL法檢測血清乙肝標志物的靈敏度和自動化程度均比ELISA法高，同時可動態(tài)觀察療效和監(jiān)測病情。       關鍵詞:電化學免疫分析法;乙肝標志物;臨床應用  &

3、#160;     Clinical application of hepatitis B virus attribute detected by electrical chemiluminescence immunoassay（ELC）.   QIU Chun-chang，LAO Xiao-bin.   （Laboratory Department of First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou510630，Guang-dong，P.R.China）   Abst

4、ract:Objective To understand the theory，the advantage and the clinic application of HBV determined by electrical chemiluminescence immunoassay（ECL）. Methods Five types of HBV in the serum of360cases have been determined directly by ELISA and ECL，the samples which are negative determined by ELISA how

5、ever are positive with low concentration of HBsAg should be determined again by MEIA method.At last the results determined by ELISA and ECL are processed by one-to-one 2 test with SPSS10.0statistics software. Results The result is that the rate of detection of HBsAb，HBeAg and HBeAb are have no disti

6、nct difference determined directly by ELISA and ECL.but the rate of detection of HBsAg determined by ECL is higher than that deter-mined by ELISA（P<0.05），and the rate of detection of HBcAb is have distinct difference（P<0.01）.The results determined a-gain by MEIA are all positive of HBsAg. Conc

7、lusion The degree of sensitive and automation determined by ECL are higher than that of ELISA，at the same time the curative effect of patients is be easily dynamic observed and the state of illness is also be easily in-spected by the method of ECL.       Key words:Electrical chem

8、iluminescence immunoassay analysis method;Hepatitis B virus attribute;Clinic application   中國是乙型病毒性肝炎的高發(fā)國家，根據(jù)流行病學調查，人群發(fā)生率較高，表面抗原攜帶率約為15% 1 ，乙肝的實驗診斷對于治療及預防有重要參考意義.但現(xiàn)常規(guī)使用的ELISA法，對低濃度HBsAg標本前后結果常不一致，嚴重影響了臨床的可比性.因此為提高乙肝實驗診斷方法的靈敏度、精確度和減少勞動強度，現(xiàn)試以電化學發(fā)光免疫分析法（ECL）進行檢測，并與ELISA平行比較分析評價。   1 材料和方法

9、60;     1.1 材料及主要儀器 收集360例疑似乙肝病人靜脈血樣離心，分離出血清待測;ELISA法測定乙肝“兩對半”試劑盒由上海實業(yè)科華生物技術有限公司生產，使用美國Bio-rad680型酶標儀和1575型洗板機;ECL法儀器和試劑采用德國羅氏公司生產的Elec-sys2010電化學發(fā)光免疫分析儀和其配套試劑產品;微粒子酶免法（MEIA）儀器和試劑采用美國雅培全自動酶免分析儀AxSYM及其配套試劑產品;乙肝五項標志物的定值參比血清由國家衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供。   1.2 方法       1.2.1 電化

10、學發(fā)光法（ECL）（以雙抗體夾心法為例）其原理為化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru（bpy）3 2+ 和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應。二價Ru（bpy）3 2+ 被氧化成三價強氧化劑。TPA失去電子后被氧化成陽離子自由基TPA + ，其不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個質子（H+），形成自由基TPA，變?yōu)閺娺€原劑，可將一個電子遞給三價的Ru（bpy）3 3+ 使其形成激發(fā)態(tài)的Ru（bpy）3 2+ 。激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個波長620nm的光子，回復成基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這過程可以在電極表面周而復始地進行，產生許多光子，使信號增強.將待測樣本與包被的順磁性微粒

11、和發(fā)光劑標記的抗體加在反應杯中共同溫育，形成磁性微珠包被抗體-抗原-反光劑標記抗體復合物。將復合物吸入流動室，同時用TPA緩沖液沖洗。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下面的磁鐵吸引住，而游離的發(fā)光劑標記抗體被沖走。同時在電極加電壓，啟動ECL反應，使Ru（bpy）3 2+ 和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發(fā)光。光的強度與待測抗原的濃度成正比 2 。       1.2.2 采用ELISA法 3 和ECL法 2，4 檢測收集的血清標本的乙肝五項標志物，每次以定值參比血清作為質控。對ELISA檢測為陰性而ECL法檢測出為低濃度HBsAg的標本

12、用MEIA法進行復測。具體操作均按其儀器和試劑盒說明書進行。       1.2.3 使用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件對ELISA和ECL兩種方法檢測結果進行配對 2 檢驗。   2 結果       2.1 ELISA與ECL法檢測乙肝標志物的結果見表1。表1 ELISA法檢測乙肝標志物的結果在ECL法的表現(xiàn)（略）注:P<0.05;P<0.01       2.2 用MEIA法對ELISA檢測為陰性而ECL法檢測出為低濃度HBsAg的9例標本，占進行中和

13、確證試驗，中和率均>50%，確定HBsAg結果均為陽性。       2.3 衛(wèi)生部定值血清HBsAg項室內質控CV值:ELISA法批內3%5%，批間5%10%，而ECL法批內小于3%，批間小于5%。   3 討論       3.1 ELISA與ECL法檢測乙肝五項指標的結果中，HBsAb、HBeAg、HBeAb三項標志物的檢出率無顯著性差異，但HBsAg的檢出率高于ELISA法（P<0.05），而HBcAb的檢出率則有顯著性差異（P<0.01）。從方法學角度看Elecsys系統(tǒng)使用固

14、相載體為順磁性微粒，直徑2.8m，由于顆粒體積小，比相同體積塑料珠的表面積大，因此擴大了反應面積，同時由于標志物的循環(huán)利用，使發(fā)光時間延長，強度增加，大大提高了檢測靈敏度 2 ，所以可檢出人群中低濃度的表面抗原（小于1g·L -1 ）和自然感染獲得的乙肝核心抗體。       3.2 Elecsys全自動免疫分析儀通過儀器所帶計算機編程制實現(xiàn)加樣分析、報告、質控和故障檢出等過程的自動化，且順磁性微粒在磁場中緊貼在電極上，易進行結合相和游離相的分離和洗滌，同時由于使用配套試劑使人為因素減至最低，提高了方法的穩(wěn)定性和結果的重復性，減少了污染機會。而

15、手工ELISA法由于手工加樣，孵育時間的控制，洗板等因素影響則容易造成低濃度的乙肝標志物結果不穩(wěn)定。       3.3 ECL法對乙肝血清標志物的定量檢測，靈敏度高，HBsAg可測至0.05g·L -1 ，故對急性乙肝能及早檢出HBsAg，確證乙肝病毒感染，在病程觀察中大大縮短“窗口期”時間。另外，電化學發(fā)光法定量檢測，克服了定性對灰區(qū)結果的判斷困難，對灰區(qū)結果能做出明確客觀的評價和判斷，能為醫(yī)生對病情療效做出合理的解釋，并且指導治療，更有利于醫(yī)患溝通。       3.4 在乙肝表面抗體的檢測上，EC

16、L法為定量結果，能夠對機體是否真正具有抵抗HBV的免疫力做出正確評價，避免誤導。Anti-HBs定量在10100IU·L -1 之間的標本，ELISA結果為陽性，但此時抗體對HBV并無中和作用，仍有感染HBV的危險.只有“定量”在100IU·L -1 以上時才具有抵抗HBV入侵的作用 5 ，因此對乙肝疫苗免疫力的評價和高危人群預防免疫具有重要意義。從方法學角度和自動化程度看，ECL法技術均優(yōu)于ELISA法，但由于儀器、試劑較貴，醫(yī)院可根據(jù)各自的工作實際、經濟能力選用。   參考文獻:   1陳慧英，張錦鋒，岑小鵬，等.ELISA檢測乙型肝炎HBsAg室內

17、質控血清的試劑和使用J.上海醫(yī)學檢驗雜志，2000，15（4）:203205.       2吳健民主編.臨床化學自動化免疫分析M.第1版.北京:科學出版社，2000:241243.       3葉應嫵，王毓三主編.全國臨床檢驗操作規(guī)程M.第二版.南京:東南大學出版，1997，410414.       4Duchna W，Hafner G，Navarro J，et al.1988.International multicenter evalu-ation of ELECSYS ? Ferritin on the ELECSYS ? 2010and1010analyzerJ.Clinical Chemistry，44（Suppl）:A47.       5Heijtink RA，Schneeberger PM，Postma B，et