1、實驗1 植物總DNA的提取生物總DNA的提取是分子生物學(xué)實驗的一個重要內(nèi)容。由于不同的生物材料細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同，而細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞是提取總DNA的關(guān)鍵步驟。同時細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)也根據(jù)生物種類的不同而有差異，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根據(jù)具體的情況來設(shè)計實驗方法。本實驗介紹采用CTAB法提取植物總DNA的技術(shù)。實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握學(xué)習(xí)CTAB法提取植物總DNA的基本原理和實驗技術(shù)。學(xué)習(xí)和掌握紫外光吸收法鑒定DNA的純度和濃度。實驗原理植物葉片經(jīng)液氮研磨，可使細(xì)胞壁破裂，加入去污劑（如CTAB），可使核蛋白體解析，然后使蛋白和多糖雜質(zhì)沉淀，DNA進(jìn)入水相，再用酚、氯仿抽提純化。本實驗

2、采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一種非離子去污劑，能溶解膜蛋白與脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的處理下， 結(jié)合 65 水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA 被釋放出來。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)過氯仿 / 異戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等沉淀劑將DNA沉淀分離出來。由于核酸、蛋白質(zhì)、多糖在特定的紫外波長都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高

3、峰在260nm。純的DNA樣品A260/2801.8，純的RNA樣品A260/2802.0，并且1g/ml DNA溶液A260=0.020。實驗器材1、高壓滅菌鍋2、冰箱3、恒溫水浴鍋4、高速冷凍離心機5、紫外分光光度計6、剪刀7、陶瓷研缽和杵子8、磨口錐形瓶（50ml）9、滴管10、細(xì)玻棒11、小燒杯（50ml）12、離心管（50ml）13、植物材料實驗試劑1、3CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris 25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% -巰基乙醇2、TE緩沖液（pH8.0）10mmol/L TrisHCl1mmol/L EDTA 3、氯仿-異戊醇混合液

4、（24：1，V/V）4、95乙醇5、液氮 實驗步驟1、稱取2g新鮮的植物葉片，用蒸餾水沖洗葉面，濾紙吸干水分。2、將葉片剪成1cm長，置預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快研磨成粉末。3、待液氮蒸發(fā)完后，加入15mL預(yù)熱（60）的CTAB提取緩沖液，轉(zhuǎn)入一磨口錐形瓶中，置于65水浴保溫0.5h，不時地輕輕搖動混勻。4、加等體積的氯仿/異戊醇，蓋上瓶塞，溫和搖動，使成乳狀液。5、將錐形瓶中的液體倒入50ml離心管中，在4下8000rpm離心10min。6、離心管中出現(xiàn)3層，用滴管小心地將上層清液吸入另一干凈的離心管中，棄去中間層的細(xì)胞碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。（根據(jù)需要，上清液可用氯仿/異戊醇反復(fù)提

5、取多次。）7、收集上層清液，并將其倒入小燒杯。沿?zé)诼尤?倍體積預(yù)冷的95乙醇。邊加邊用細(xì)玻棒沿同一方向攪動，可看到纖維狀的沉淀（主要為DNA）迅速纏繞在玻棒上。8、小心取下這些纖維狀沉淀，加12 mL 70%乙醇沖洗沉淀，輕搖幾分鐘，除去乙醇，即為DNA粗制品。9、將粗制品溶于TE緩沖液。10、在分光光度計上測定該溶液在260nm/280nm紫外光波長下的光密度值。注意事項1、液氮研磨時，小心操作，以免凍傷。2、所有操作均需溫和，避免劇烈震蕩。思考題1、 CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用分別是什么？2、 液氮研磨的原理是什么？實驗2 質(zhì)粒DNA的提取和酶切質(zhì)粒DNA是分子生物學(xué)實驗中

6、廣泛應(yīng)用的載體分子。質(zhì)粒是細(xì)菌獨立于染色體外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀的雙鏈DNA分子。由于質(zhì)粒比較小，并且能進(jìn)行獨立的自我復(fù)制，常常被改造為克隆和表達(dá)的載體分子。限制性內(nèi)切酶（Restriction enzyme，RE）是在細(xì)菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌降解外來DNA的保護機制。由于限制性內(nèi)切酶通過識別特定的核酸雙鏈序列并在特定的位點切斷磷酸二酯鍵。不同的限制性內(nèi)切酶識別的序列不同。實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗掌握堿裂解法提取質(zhì)粒和限制性內(nèi)切酶酶切的基本原理，掌握堿裂解小量提取質(zhì)粒的實驗技術(shù)。實驗原理堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.012.5這個狹

7、窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。限制性內(nèi)切酶通過識別特定的DNA序列并在特定序列的特定位點打開磷酸酯鍵。實驗器材1、恒溫培養(yǎng)箱2、恒溫?fù)u床3、 臺式離心機4、 高壓滅菌鍋

8、5、 Tip頭、Eppendorg管6、 含有目的質(zhì)粒的E.coli菌株實驗試劑1、 溶液I50mmol/L 葡萄糖5 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris）TrisHCl10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2、 溶液II0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等體積混合3、溶液III5mol/L乙酸鉀 60mL冰乙酸 11.5mL水 28.5mL4、 TE緩沖液10mmol/L TrisHCl1mmol/L EDTA(pH8.0)5、 70%乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）6、 EcoRI 及其緩沖液7、 HindIII及其緩沖液實驗步驟1、 將含有目的

9、質(zhì)粒的E.coli菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。2、 取1ml培養(yǎng)物倒入Eppendorf管中，12000r/min離心30sec。3、 吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。4、 將細(xì)菌沉淀懸浮于100L冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。5、 加200L溶液II（新鮮配制），蓋緊管皿，快速顛倒5次，混勻內(nèi)容物，將Eppendorf管放在冰上。6、 加入150L溶液III（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置5min。7、 12000r/min，離心5min，將上清液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中。8、 向上清液加入等體積的飽和酚，混勻。9、 12000r/min，離心5min

10、，將上清液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中。10、向上清液加入2倍體積乙醇，混勻后，室溫放置510min。12000r/min離心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸干液體。11、1ml 70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。12、20L TE緩沖液，使DNA完全溶解，-20保存。13、取4L所提取的質(zhì)粒DNA，加入1L酶切緩沖液，EcoRI或HindIII 1L，用超純水補至總體積10L。37保溫2h以上。14、酶切樣品待瓊脂糖電泳檢測。注意事項操作時，避免劇烈震蕩。思考題1、實驗操作中，飽和酚的作用是什么？2、SDS和NaOH的

11、作用是什么？參考文獻(xiàn)精編分子生物學(xué)實驗指南（第四版） 美 F M奧斯伯，R E 金斯頓等主編 科學(xué)出版社2005 圖 pBluescriptII SK質(zhì)粒載體實驗3 PCR基因擴增PCR技術(shù)是在1985年由美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明的聚合酶鏈反應(yīng)。這一技術(shù)具有劃時代意義的。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件-摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)。實驗原理多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain rea

12、ction , PCR）的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在待擴增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。1、 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。2、 退火：使溶液溫度降至5060，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，即退火階段。3、 延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按53方向復(fù)制出互補DNA，即引物的延伸階段。上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講

13、，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過2530個循環(huán)后DNA可擴增106109倍。典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。實驗器材1、 PCR熱循環(huán)儀2、 tip頭、冰盒3、 PCR管4、 超純水5、 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物6、 移液槍實驗試劑1、10緩沖液500mmol/l KCl100mmol/l TrisHCl(pH8.3 ,室溫)15mmol/l MgCl20.1% 明膠2、4dNTP 1mmol/l dATP1mmol/l dCTP1mmol/l dG

14、TP1mmol/l dTTP3、Taq酶 5U/L4、DNA模板 1ng/L5、引物1 、引物2 引物溶液濃度10pmol/l實驗步驟1、在PCR管內(nèi)配制20L反應(yīng)體系：反應(yīng)物體積/L10buffer2.0dNTP1.0引物11.0引物21.0Taq酶0.5Template1ddH2O13.5總體積 202、按下列程序進(jìn)行擴增：、95預(yù)變性5min、95變性1min、55退火1min、72延伸1min、重復(fù)步驟30次；、72延伸10min3、瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果配制0.7%瓊脂糖凝膠，取10L擴增產(chǎn)物電泳。保持電流40mA。電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察結(jié)果。注意事項1、PCR加樣時，盡量保

15、持低溫操作，避免酶失活和模板、引物降解。3、 取樣時注意不要污染藥品。思考題1、什么是引物二聚體？出現(xiàn)引物二聚體的原因是什么？ 2、PCR儀的熱蓋設(shè)置有什么優(yōu)點？參考文獻(xiàn)1、PCR技術(shù)操作和應(yīng)用指南 主編 林萬明 人民軍醫(yī)出版社 1995年2、PCR技術(shù)實驗指南美C.W.迪芬巴赫 G.S.德維克斯勒 科學(xué)出版社 2003年實驗4 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA瓊脂糖是從瓊脂中分離制備的鏈狀多糖，其結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖-3,6-L 半乳糖。許多瓊脂糖分子依靠氫鍵及其他力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。該物質(zhì)對尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強的抵抗力。在pH4.0-9.0 的緩

16、沖液中穩(wěn)定。由于其分子上無帶電基團，在緩沖液離子強度大于0.05時，對蛋白質(zhì)無吸附作用，也無電滲現(xiàn)象，因而分辨率和重現(xiàn)性均較好，是一種優(yōu)良的電泳材料。在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，如DNA分子的電泳遷移率與其分子量、分子構(gòu)型和所用緩沖液對遷移率相關(guān)。實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的實驗技術(shù)和原理，以及溴化乙錠染色檢測核酸的實驗技術(shù)。實驗原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子的高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的靜電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場

17、強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子，如pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（covalently closed circular DNA,簡稱cccDNA），開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 1條鏈斷裂（open circular DNA ,簡稱OCDNA），線狀質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條鏈發(fā)生斷裂（l

18、inear DNA,簡稱L DNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移速度不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。溴化乙錠可以嵌入核酸分子，并且在紫外燈下產(chǎn)生熒光，可用于檢測核酸物質(zhì)。實驗器材1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、凝膠成像系統(tǒng)3、DNA marker4、 檢測樣品5、 瓊脂糖實驗試劑1、5TBE（5倍體積的TBE貯存液）配1000ml 5TBE：Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0）2、凝膠加樣緩沖液（6）溴酚藍(lán) 0.25%蔗糖 40%3、溴化乙錠溶液（EB） 0.5g/ml 實

19、驗步驟（一）制備瓊脂糖凝膠1、按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚涵傊悄z濃度/% 線性DNA的有效分離范圍/kb0.3 5600.6 1200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.132、稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml 0.5TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1%瓊脂糖凝膠液。（二）膠板的制備1、 取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴(yán)，不能留縫隙）。2、 有機玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。3、 將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內(nèi)槽，

20、直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。4、 待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內(nèi)。5、 加入電泳緩沖液至電泳槽中，讓緩沖液蓋過凝膠。（三）加樣用移液槍將將上樣緩沖液與DNA樣品按1:5比例混合，加入加樣孔中（記錄點樣順序及點樣量）。（四）電泳1、接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。2、當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。 3、將凝膠小心放入溴化乙錠溶液中，染色30min。 4、將染色后的凝膠放入凝膠成像儀中拍照。注意事項因為EB是強致癌物質(zhì)，因此染色操作中應(yīng)注意安全

21、不要接觸，并且保持環(huán)境的潔凈。參考文獻(xiàn)精編分子生物學(xué)實驗指南（第四版） 美 F M奧斯伯，R E 金斯頓等主編 科學(xué)出版社2005實驗5 聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗?zāi)康?.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。2.學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)，用于分離蛋白質(zhì)。實驗原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺作為支持物的一種電泳形式。單體-丙烯酰胺和交聯(lián)劑-甲叉雙丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，該聚合反應(yīng)以TEMED作為催化劑，以APS 作為引發(fā)劑。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例可決定凝膠網(wǎng)孔的大小，交聯(lián)劑所占比重越大，凝膠的網(wǎng)孔就越小。 C=ONH2C=ONHCH2C=ONHCH2=CH+APTEMED

22、NHCH2C=ONHCH2CHC=ONH2CH2CHC=ONH2CH2CHC=ONH2CH2CHC=ONH2丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2=CH CH2=CH CH2 CHC=OCH2CH利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離主要依據(jù)以下兩個因素： 蛋白質(zhì)所帶靜電荷：在不同的pH條件下蛋白質(zhì)所帶電荷不同。在一定的電場條件下蛋白質(zhì)將向與其所帶電荷相反的電極方向移動，移動速率取決于蛋白質(zhì)表面電荷的數(shù)量，電壓越強或電荷越多則蛋白質(zhì)移動的越遠(yuǎn)。其次，蛋白質(zhì)的形狀和大小：蛋白質(zhì)在電泳中所受的阻力主要取決于樣品的大小與凝膠網(wǎng)孔大小之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)分子越小或凝膠網(wǎng)孔越大，所分離樣品所受阻力就愈小，則

23、在電場中的遷移率就越大。在非變性電泳中，天然蛋白質(zhì)的分離就是蛋白質(zhì)所帶電荷、分子大小及分子形狀等因素共同影響，作用的結(jié)果。電壓 x 樣品靜電荷遷移率 = 摩擦力濃縮效應(yīng)可顯著提高聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率，該效應(yīng)可通過引入濃縮膠和不連續(xù)緩沖溶液系統(tǒng)而獲得。濃縮膠處于分離膠的頂部，因此樣品在進(jìn)入分離膠之前首先要經(jīng)過濃縮膠。它是由較低濃度的丙烯酰胺構(gòu)成，當(dāng)樣品經(jīng)過濃縮膠時由于膠內(nèi)網(wǎng)孔較分離膠網(wǎng)孔大，樣品的移動速度較快，最終使樣品“堆積”在濃縮膠和分離膠之間。 另外，濃縮膠還具有比分離膠更低的pH。濃縮膠內(nèi)的緩沖溶液是Tris-HCl（pH 6.7）,該pH遠(yuǎn)低于Tris的pK值(8.1)。分離膠內(nèi)

24、的緩沖溶液是pH 8.9的Tris-HCl，而電泳正負(fù)兩極的緩沖溶液均為pH 8.3的Tris-甘氨酸緩沖溶液。在濃縮膠中，小分子并帶有大量負(fù)電荷的Cl-在凝膠中的移動速率較快，而電荷較少且分子量較大的甘氨酸的移動速率較慢。由于二者在同一電場中，具有相同的電流，由此形成的電壓梯度導(dǎo)致甘氨酸離子始終跟隨在Cl-的后面，帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)樣品則濃縮在甘氨酸離子和Cl-之間向正極移動。當(dāng)樣品進(jìn)入pH 8.9的分離膠時，甘氨酸的解離度增加，在電場中的遷移率高于樣品，蛋白質(zhì)不再夾于兩種離子之間向正極移動，這時的蛋白質(zhì)依靠分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)進(jìn)行分離。 樣品緩沖溶液 Tris/HCl pH 6.7Tris

25、/甘氨酸 pH 8.9-+Tris/甘氨酸 pH 8.9分離膠 Tris/HCl pH 8.9濃縮膠 Tris/HCl pH 6.7實驗材料1. 實驗器材Bio-Rad公司Mini-Protean型電泳儀；電源（電壓200V，電流500mA）；100沸水??；Eppendorf管；微量注射器（50l或100l）；帶蓋的玻璃或塑料小容器；搖床。2. 實驗試劑試劑號配方pH1分離膠緩沖溶液 1mol/L HCl 48.0 ml 三羥甲基氨基甲烷 36.3 g 加蒸餾水到100ml8.92單體交聯(lián)劑 丙烯酰胺 （Acr） 30g 甲叉丙烯酰胺（Bis） 0.8g 加蒸餾水到100ml3過硫酸銨 100

26、mg/ml4四甲基乙二胺（TEMED）5濃縮膠緩沖溶液 1mol/L HCl 48ml 三羥甲基氨基甲烷5.89 g 加蒸餾水到100ml6.76電極緩沖溶液 甘氨酸 28.8g三羥甲基氨基甲烷6.0 g 加蒸餾水到1000ml, 用前稀釋10倍8.37染色液 CBB G-250 0.1g 溶于95%乙醇后，加蒸餾水到100ml8示蹤染料 溴酚藍(lán) 0.05g溶于100ml 蒸餾水9樣品：蛇毒干粉200mg溶于20ml, pH6.7緩沖溶液（5）中，再加入25%蔗糖20ml和溴酚藍(lán)（8）10ml凝膠溶液的配方試劑分離膠（ml）濃縮膠(ml)125蒸餾水341.252.5-6.1950.050.0

27、05-1.01.257.640.100.005總體積（ml）1010Aa濃度（g%）7.53.0實驗操作 1.凝膠柱的制備 取l0cm0.6cm的玻璃管，選擇較平整的一端為底端，量取7.5cm、8cm兩處，畫線；底端管口用小塊膠布封口，插入橡皮墊中，垂直放置于試管架中。用巴斯德滴管吸取分離膠，緩慢貼壁加膠到管內(nèi)7.5cm處，立即加蒸餾水至8cm處。待分離膠凝固后，將膠面上的水分甩掉，殘留的水分用濾紙條吸干，用滴管速加濃縮膠到分離膠面上至8cm處，再小心地加一層覆蓋水。2.安裝電泳槽選擇無氣泡、無裂縫、長度合適的小玻璃管，撕掉膠布，安裝到電泳儀上，注意要緊密，以防止上槽緩沖溶液漏液；向下槽注入電

28、極緩沖液，注意用彎頭滴管除去玻璃管下端的氣泡；再向上槽倒入電極緩沖液淹沒小管，同樣用滴管除去氣泡。 3.加樣用微量注射器取樣品液30l，沿壁加在濃縮膠面上，注入時要慢，避免激起電極緩沖液。4.電泳連接電極，上槽與負(fù)極相連，下槽與正極相連；調(diào)節(jié)電流為lmA管，待示蹤染料進(jìn)入分離膠時調(diào)節(jié)電流為2mA管，待示蹤染料接近凝膠管底部約0.5cm處，切斷電源，電泳時間為2小時3小時。5.剝膠取下凝膠管，用局麻針頭注射器吸取一定量的蒸餾水，將針頭插入膠柱-與管壁之間，邊注水邊旋轉(zhuǎn)玻管，直至膠柱與管壁分開，然后用洗耳球輕輕在玻管的一端加壓，使凝膠柱從玻管緩慢滑出，將凝膠柱置于編號的試管內(nèi)，用蒸餾水沖洗幾次。6

29、.染色將考馬斯亮藍(lán)染色劑倒入放有膠條的小試管中，沒過膠條；60水浴保溫40分鐘50分鐘后取出，用水沖洗2次3次，觀察結(jié)果。實驗結(jié)果觀察凝膠條中的蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)染色劑結(jié)合后所形成的藍(lán)色復(fù)合物，并通過畫圖記錄結(jié)果。思考題 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離生物大分子的基本原理？ 樣品液中加入蔗糖和溴酚藍(lán)的目的是什么？實驗6 DNA重組實驗?zāi)康挠肨4DNA連接酶將載體pBR322 EcoR -CIP處理的DNA片段，與目的基因5.4KbEcoR 片段連接起來，構(gòu)建體外重組DNA分子，同時學(xué)習(xí)幾種DNA連接的方法。實驗原理重組的DNA分子是在T4DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖液系統(tǒng)中，

30、將上述二種酶切后的DNA分子進(jìn)行連接。（一）DNA連接酶的作用步驟1T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶AMP復(fù)合物（腺苷酰酶）2酶AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5-磷酸基和3-羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。3產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來。（二）DNA的連接方式在T4DNA連接酶的作用下的DNA連接反應(yīng)，一般是隨機的，但也可以通過對載體、目的基因的處理以控制與調(diào)整DNA的有效連接。連接的方式有：1自連2兩種片段相連3三個片段以上的自連與互連（三）連接反應(yīng)的條件1緩沖液：一般商品酶都帶有10倍的緩沖液，有Mg2、ATP作為輔助因子，提供能量，同時也有些保護與穩(wěn)定酶活性的物質(zhì)，如DTT（

31、二硫蘇糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。BSA（小牛血清蛋白）維持一定的蛋白量，以防止因蛋白濃度太低的酶變性失活。2溫度：連接反應(yīng)溫度在37時有利于連接酶的活性，但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，EcoR 酶所產(chǎn)生的末端，僅僅通過四個堿基對相結(jié)合，這不足以抵抗該溫度下的分子熱運動。因此在實際操作時，DNA分子粘性末端的連接反應(yīng)，其溫度是折中采取催化反應(yīng)與末端粘合的溫度，為1216。3時間：1216 1216小時（過夜）；或78 23天。實驗材料1pBR322 EcoR -CIP處理DNA片段。25.4Kb含有Str的EcoR 回收DNA片段。3T4DNA連接酶實驗儀器儀器、器皿（

32、見附錄）試劑：10T4DNA連接酶緩沖液 660mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 50 mmol/L MgCl2 50 mmol/L DDT 50 mmol/L ATP實驗步驟1取3只Eppendorf管，一管做重組連接，一管做pBR322未經(jīng)CIP處理的自連，另一管做pBR322經(jīng)CIP處理的自連。2用微量進(jìn)樣器按下表分別取樣各溶液于Eppendorf管中。DNA酶切反應(yīng)物10T4連接緩沖液ddH2OT4DNA連接酶總體積pBR322 EcoR-CIP5l（100ng）5.4Kb EcoR 片段5l（約400ng）2l7l1l20lpBR322 EcoR-CIP3l（60ng）2

33、l14l1l20lpBR322 EcoR3l（60ng）2l14l1l20l加樣順序為ddH2O，10T4緩沖液，DNA片段，最后加T4DNA連接酶（放于冰浴中）連接酶取好后應(yīng)立即放回20保存。3蓋緊蓋子用手指彈勻Eppendorf管，于臺式離心機上轉(zhuǎn)2秒鐘，以集中樣品。4將3管連接樣品放入溫度12恒溫水浴鍋中，過夜。5第二天上午各管取約25ng的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察連接反應(yīng)效果，電泳時要加入pBR322 EcoR 酶切片段作電泳對照。思考題1連接反應(yīng)為何選擇在低溫下長時間連接？實驗7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但

34、在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個細(xì)胞到另一個細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R,M),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實驗技術(shù)及熱激轉(zhuǎn)化的實驗技術(shù)。實驗原理細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)

35、化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型（如Ampr等）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。實驗器材1、超凈工作臺2、低溫離心機3、恒溫?fù)u床4、恒溫箱5、恒溫水浴器6、 Eppendorf管、Tip頭7、 轉(zhuǎn)化的目的質(zhì)粒8、 大腸桿菌菌株DH59、 試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶實驗試劑1、1mol/l CaCl2溶液（高壓滅菌）2、LB液體培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入：胰蛋白胨（bacto-typtone）

36、 10g酵母提取液（bacto-yeast extract） 5gNaCl 10g搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積為1L，121濕熱滅菌20 min。 3、LB固體培養(yǎng)基1000ml加15g瓊脂。4、氨芐青霉素（Amp），用無菌水配制成100mg/ml溶液，置-20冰箱保存。實驗步驟1、從大腸桿菌DH5平板上挑取一個單菌落接于2mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜。2、取0.5ml菌液轉(zhuǎn)接到一個含有50ml LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37振蕩培養(yǎng)23 h。（此時，OD6000.40.5，細(xì)胞數(shù)務(wù)必108/ml，此為實驗成功的關(guān)鍵）。3、吸菌液1

37、ml加入Eppendorf 管，10,000rpm離心15sec回收細(xì)胞。4、用冰預(yù)冷的0.1mol/l CaCl2 500L懸浮沉淀。5、再離心15 sec（10000rpm），回收細(xì)胞。6、 再用冰預(yù)冷的0.1mol/l CaCl2 60L重懸沉淀。7、 在-4下可保存2周（24 d時，轉(zhuǎn)化效率最高）。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。 8、同時做兩個對照管：受體菌對照：60L 感受態(tài)細(xì)胞 + 2L 無菌水質(zhì)粒對照：60L 0.1mol/L CaCl2溶液 + 2L 質(zhì)粒DNA溶液 9、將管放到42循環(huán)水浴12min。 10、冰浴2min。 11、每管加800L LB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1 h（慢搖）。

38、12、將適當(dāng)體積（200L）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。13、.倒置平皿37培養(yǎng)1216 h，觀察細(xì)菌生長情況。注意事項1、超凈上無菌操作注意安全。2、實驗過程中盡量避免雜菌污染。思考題1、 CaCl2制備感受態(tài)的可能原因是什么？2、 如果平板培養(yǎng)后出現(xiàn)衛(wèi)星斑的可能原因是什么？3、 如何提高轉(zhuǎn)化的效率？參考文獻(xiàn)精編分子生物學(xué)實驗指南（第四版） 美 F M奧斯伯，R E 金斯頓等主編 科學(xué)出版社2005實驗8 細(xì)菌總RNA提取實驗?zāi)康牧私釸NA的特性，掌握Trizol法提取RNA的原理及操作技術(shù)。實驗原理RNA分子是化學(xué)性質(zhì)非?；钴S的分子。在提取細(xì)胞內(nèi)RNA在的過程中，RN

39、A分子容易受細(xì)胞內(nèi)核酸酶、化學(xué)試劑、機械震蕩等多種因素影響而發(fā)生分子結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致提取失敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出核酸酶活性。Trizol適用于從多種組織和細(xì)胞中快速分離總的RNA。溶液與試劑1、Trizol試劑2、氯仿3、異戊醇 4、無水乙醇，4保存5、70%乙醇，4保存6、超純水7、2DEPC(二乙基焦碳酸酯)操作步驟材料準(zhǔn)備 E.coli細(xì)胞過夜活化，第二天按10%轉(zhuǎn)接新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4h。1、離心收集細(xì)胞樣品經(jīng)無菌水清洗后，用液氮速凍，將組織磨成粉末，趁液氮尚未揮發(fā)光時,將粉末轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中。每100

40、mg組織加入1.0ml的Trizol.細(xì)胞樣品:用常規(guī)方法收集細(xì)胞,按照106-107個細(xì)胞，加入1mlTrizol.。注意：如果者細(xì)胞數(shù)很少(102-104)，在樣品中加入800ul的Trizol。劇烈振蕩或用勻漿器勻漿。2、加入200ul氯仿/異戊醇(24:1)或氯仿，劇烈振蕩混勻30秒。3、12000轉(zhuǎn)/分，4，離心10分鐘。4、將上清液小心轉(zhuǎn)移到RNase-free 1.5ml離心管中，加入與上清等體積的異丙醇,-20置30分鐘。注意：不要吸取任何中間層物質(zhì),否則會出現(xiàn)Genomic DNA 污染。5、12000轉(zhuǎn)/分，4，離心5分鐘。6、小心移去上清液，防止沉淀丟失。7、用70%酒精

41、洗滌兩次，每次700u，12000轉(zhuǎn)/分,4離心5分鐘。8、盡可能徹底的吸走上清，防止丟失RNA沉淀。9、真空離心干燥3-5分鐘或者放在室溫下將酒精空干。10、沉淀用30-50ul的DEPC水融解，檢測，-70保存。結(jié)果采用電泳技術(shù)或光譜技術(shù)檢測RNA的濃度、純度情況。注意事項全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。實驗9 探針制備實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗掌握地高辛標(biāo)記探針的制備方法。實驗原理探針實際是已知的基因片段，應(yīng)該該片段與待測樣品雜交，如果靶基因和探針的核苷酸序列互補，就可以根據(jù)堿基配對的原則進(jìn)行核酸分

42、子雜交，從而達(dá)到檢測的目的。地高辛標(biāo)記探針利用偶聯(lián)抗體或抗生物素蛋白的磷酸酯酶檢測經(jīng)修飾的堿基，用氮藍(lán)四唑（Nitro blue tetrazolium, NBT）顯色，氮藍(lán)四唑轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苡谒挠猩镔|(zhì)，沉淀在雜交的原位。采用隨機引物法篩標(biāo)記反應(yīng)液，以隨機合成的六聚體核苷酸（ hexanucleotiide ）為引物， dATP 、 dCTP 、 dGTP 、 dTTP 和 DIG11dUTP 為合成底物，單鏈DNA為模板，在 Klenow 酶的作用下，合成滲入DIG的DNA 鏈。地高辛標(biāo)記屬高效標(biāo)記反應(yīng)，以 1 g DNA 探針為例， 1 h 反應(yīng)可產(chǎn)生 0.8 g 標(biāo)記探針，20 h可產(chǎn)生

43、 2g 探針。同時，該標(biāo)記方法操作簡單，適用于含量10 ng -3 g，片段大小100 bp10 kb，線性或高度卷曲 DNA 探針制備。儀器、材料與試劑（四） 儀器1 、 水浴鍋2 、 離心機（二）材料1 、 探針核酸片段2 、 PCR 小管（三）試劑1 、 10mM EDTA2 、 DIG random labeling Mix （高效）實驗步驟1 、 用超純水稀釋1g DNA 至總體積16g 。2 、 DNA 熱變性：將 DNA 置沸水中，水浴 10 min ，迅速插入冰中 3min 以上。3 、 加 4 l DIG random labeling Mix （高效），混勻后 2 000r

44、pm 離心 5 min 。4 、 置 37 反應(yīng)至少2 h ，反應(yīng)時間越長,產(chǎn)量越高。5 、 加入2 l 0.2M EDTA 或65度10分鐘終止反應(yīng)。反應(yīng)液可在20 保存至少1年以上，可反復(fù)使用 。實驗安排PCR 實驗完成后，將產(chǎn)物純化即可開始探針制備。實驗10 Southern 雜交實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗了解 Southern 雜交的原理，學(xué)習(xí) Southern 雜交的轉(zhuǎn)膜和雜交技術(shù)操作的詳細(xì)過程。實驗原理Southern 雜交是一種在復(fù)雜背景基因中識別特異 DNA 序列的重要技術(shù)，是 Southern 在 1975 年首先發(fā)明的?；驹硎蔷哂幸欢ㄍ葱缘膬蓷l核酸單鏈在一定的條件下，可以按堿

45、基互補配對的原則退火形成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸和標(biāo)記探針。雜交過程是高度特異的。將電泳分離的 DNA 片段在凝膠上經(jīng) N aOH 處理變性，用硝酸纖維素膜（ nitrocellulose filter Membrane,NC膜）放在凝膠上，使之按原有的順序?qū)l帶轉(zhuǎn)移到 NC 膜并固定。這就是 Southern 轉(zhuǎn)膜過程。Southern 雜交是將膜上的DNA 與DIG標(biāo)記的探針雜交，通過堿性磷酸酶顯色檢測結(jié)果。儀器、材料與試劑（一）儀器1 、 電泳槽2 、 電泳儀3 、 雜交爐或搖床（二）材料1 、 DIG 標(biāo)記探針2 、 NC 膜（ 5 cm X 5cm ）（三）試劑1 、 變性液： 1

46、.5M NaCl, 0.5M NaOH2 、 中和液： 3 M NaCl, 0.5M TrisHCl, pH 7 . 43 、 轉(zhuǎn)移液（ 20 SSC ）： 3M NaCl, 0.3M Na3Citrat, pH 7.0（ 2 SSC ）： 0 .3M NaCl, 0.03M Na3Citrat, pH 7.04 、 Wash SolutionI ： 2 SSC 、 0.1%SDS5 、 Wash SolutionII ： 0 .5 SSC 、 0.1%SDS6 、 （預(yù)）雜交液： 5 SSC, Nlaurolysarcosine,0.02%(w/v), SDS,1%(w/v), Blocking reagent, 50% 甲 酰胺7 、 AntiDIGAP （堿性磷酸酶標(biāo)記抗地高辛單抗體）8 、 BCIP/NBT 儲備液9 、