1、大鼠肝細胞原代培養(yǎng)模型的研究摘要摘要 目的目的: 為肝細胞功能及相關(guān)的研究提供一種客觀的、簡便的大鼠肝細胞原代培養(yǎng)模型, 并鑒定肝細胞的功能。方法方法: 在傳統(tǒng)的兩步灌流法的基礎(chǔ)上代肝細胞的細胞周期和細胞凋亡情況。 結(jié)果結(jié)果: 分離得到的肝細胞成活率可達90% 以上, 純度可達95%以上; 流式細胞術(shù)結(jié)果表明原代肝細胞大多處于G0、G1 期, 且基本無凋亡 。結(jié)論結(jié)論: 體外培養(yǎng)的肝細胞活力和純度均較高, 體外培養(yǎng)后細胞功能正常, 是一種實用的體外研究肝細胞良好的細胞學(xué)模型。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞 ：大鼠; 肝細胞; 原代培養(yǎng); 細胞模型; 中圖分類號: R965. 1文獻標(biāo)識碼: A文章編號: 100

2、9-2501( 2005) 07-0743-01 材料與方法材料與方法 1. 1 主要材料 SPF( special pathogen free) 級雄性Sprague-Dawley 大鼠, 體重150 200 g。1. 2 大鼠原代肝細胞培養(yǎng)和細胞純度及活率鑒定 以0. 6% 戊巴比妥鈉麻醉大鼠, 開腹, 分離肝門靜脈, 經(jīng)門靜脈插管, 開放下腔靜脈, 以流速5mlmin- 1灌流500 ml 37 的前灌流液( 142 mmolNaCl、6. 7mmol KCl、10 mmol HEPES、pH 7. 4) , 沖洗肝臟中的血液。將肝臟完整分離下來, 轉(zhuǎn)入自制的循環(huán)灌流杯中, 以37 預(yù)熱

3、的0. 1% IV 膠原酶循環(huán)灌流10 min, 流速4 ml#min- 1。當(dāng)肝包膜下肝組織呈龜背狀裂隙、膠原酶灌流液充滿肝包膜下時停止。去除肝包膜, 分離肝細胞, 置于37 e度低速振蕩10 min 過150 目篩, 以清洗液清洗細胞, 50 g 離心5 min 3 次獲取肝細胞。細胞計數(shù), 臺盼藍染色計數(shù)細胞活率。將細胞以105 個Pml 濃度接種于96孔板中, 37 、5 % CO2、100% 濕度條件下培養(yǎng)24 h,換液去掉未貼壁的細胞, 以后每24 h 換液1 次。取部分細胞離心收集, 20% 甲醛固定, 常規(guī)HE 染色后, 鏡下計數(shù)每視野的肝細胞來計算細胞純度。1. 3 流式細胞

4、術(shù)測定細胞周期 將分離下來的肝細胞以800 rmin離心5 min, 收集細胞, PBS 洗2次。冰浴下加入- 20 度預(yù)冷的70% 的乙醇( PBS 稀釋) , 放置4 過夜。14 000 g , 短時離心, 棄上清, 去除乙醇, PBS 洗2 次。以500 Ll PBS 重懸細胞, 加RNase A 至終濃度為20 mgL, 于37 e孵育30 min。置于冰上, 加PI( Potassium iodide) 至終濃度為50 mgL,冰浴30 min, 流式細胞儀檢測細胞熒光, CellQuest軟件包分析數(shù)據(jù), 計算原代大肝細胞細胞周期的比率。1. 4 流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 根據(jù)Ann

5、exin VPPI雙標(biāo)試劑盒說明書操作, 將分離下來的肝細胞調(diào)整細胞濃度為 105 106 個Pml; 取1 ml 細胞液,4 度, 1 000 rmin 離心10 min, 棄上清; 加入1 ml 預(yù)冷的PBS, 輕輕震蕩, 重懸細胞; 4 度 , 1 000 rmin離心10 min, 棄上清; 重復(fù)步驟離心2 次; 將細胞重懸于200 Binding Buffer 中; 加入10 Ll Annexin VFITC和5 Ll PI, 輕混勻, 避光室溫反應(yīng)15 min; 加入300 Ll Binding Buffer, 在1 h 內(nèi)上機檢測。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)“加減 ”標(biāo)準(zhǔn)

6、差( x s ) 表示, 應(yīng)用SPSS 11. 0軟件分析, 各組之間顯著性比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)。2 結(jié)果結(jié)果 2. 1 原代肝細胞培養(yǎng)存活率和純度 所分離的肝細胞以臺盼藍拒染法檢測細胞成活率平均達90%以上; 將肝細胞1 000 rmin離心沉淀, 20% 甲醛固定, 常規(guī)HE 染色觀察。肝細胞純度鑒定的結(jié)果顯示, 本實驗中分離的肝細胞純度可達95% 以上, 細胞核藍染, 細胞外形呈多角形, 胞體較大, 大部分是單核, 也有雙核的細胞, 適合用于進一步的實驗研究。( 圖1) 圖1 大鼠肝細胞( HE染色) 2. 2 原代肝細胞細胞周期和細胞凋亡 PI 染色,

7、 流式細胞術(shù)測定結(jié)果表明, 處于G0、G1 期的肝細胞占總細胞數(shù)的90. 62%, 說明原代肝細胞大部分處于非增殖狀態(tài); 采用Annexin V 和PI 雙標(biāo)記、流式細胞儀測定熒光強度的方法, 進一步確定原代肝細胞凋亡率。一般情況下, 凋亡細胞應(yīng)出現(xiàn)在象限圖的右上( UR) 和右下( LR) 象限, 呈高密度團塊狀, 如圖可見原代肝細胞基本無凋亡( 圖2) 。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明原代肝細胞的凋亡率為( 0. 120. 11)%,基本無細胞凋亡。參考文獻 1 白文啟. 大腸癌診治進展中的哲學(xué)思考 J . 臨床醫(yī)藥實踐雜志, 2003; 12: 875- 7 2 Marc I, Brand, S

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