基于P48重組蛋白的牛支原體抗體精準檢測技術(shù)構(gòu)建與應(yīng)用探究一、引言1.1研究背景與意義牛支原體（Mycoplasmabovis）是一類嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的致病性病原體，屬于柔膜細菌綱，支原體科，支原體屬。自1961年首次在美國患乳腺炎的病牛中被分離得到以來，牛支原體已在全球范圍內(nèi)廣泛傳播。該病原體主要感染牛，可引發(fā)多種嚴重疾病，如乳腺炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎、角膜炎和結(jié)膜炎等。這些疾病不僅嚴重影響牛的健康和生長發(fā)育，導(dǎo)致牛的生產(chǎn)性能大幅下降，還會顯著增加養(yǎng)殖成本，給全球養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。在我國，2008年首次報道了牛支原體引起的犢牛傳染性肺炎，此后牛支原體感染呈逐漸蔓延的趨勢，現(xiàn)已成為危害我國養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病之一。據(jù)相關(guān)研究表明，我國部分地區(qū)牛支原體的感染率高達30%以上，部分規(guī)模化養(yǎng)殖場的發(fā)病率甚至可達50%-100%，病死率平均約10%，嚴重時可達50%以上。牛支原體感染不僅會導(dǎo)致患病牛只的死亡，還會使存活牛只的生長速度減緩、飼料轉(zhuǎn)化率降低、產(chǎn)奶量下降以及繁殖性能受損，給養(yǎng)殖戶和養(yǎng)殖企業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。早期準確檢測牛支原體感染對于養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要。及時的檢測能夠幫助養(yǎng)殖者迅速發(fā)現(xiàn)感染牛只，采取有效的隔離和治療措施，從而防止疫情的進一步擴散，降低經(jīng)濟損失。此外，通過對牛群進行定期檢測，可以了解牛支原體的感染情況和流行趨勢，為制定科學(xué)合理的防控策略提供有力依據(jù)。目前，用于檢測牛支原體感染的方法主要包括病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等。病原學(xué)診斷方法如病原分離培養(yǎng)，雖然是診斷牛支原體感染的“金標準”，但存在諸多局限性。牛支原體對營養(yǎng)及培養(yǎng)環(huán)境的要求極高，生長極為緩慢，樣本采集后需立即送專業(yè)實驗室，或在冷藏條件下24小時內(nèi)送檢。分離培養(yǎng)過程復(fù)雜，需要豐富的經(jīng)驗和專業(yè)的技術(shù)，且分離率較低，檢測周期長，通常需要3-4天甚至更長時間，難以滿足臨床快速診斷的需求。血清學(xué)診斷方法如間接血凝試驗（IHA）、補體結(jié)合試驗（CFT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和免疫熒光試驗（IFT）等，雖然具有一定的應(yīng)用價值，但也存在各自的缺點。IHA操作相對簡便，但敏感性和特異性有待提高；CFT操作繁瑣，需要使用補體，且存在一定的生物安全風(fēng)險；ELISA雖然敏感性較高，但對實驗條件和操作人員的技術(shù)要求嚴格，且檢測成本相對較高；IFT需要特殊的熒光顯微鏡，設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，不利于基層推廣應(yīng)用。分子生物學(xué)診斷方法如PCR技術(shù)，雖然具有敏感性高、特異性強、檢測速度快等優(yōu)點，但需要專業(yè)的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，對實驗室條件要求苛刻，檢測成本也較高，限制了其在基層養(yǎng)殖場和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查中的廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)一種快速、準確、簡便、低成本且適合基層應(yīng)用的牛支原體抗體檢測技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。P48蛋白是牛支原體的一種重要膜蛋白，在牛支原體的感染和致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性?；赑48重組蛋白的抗體檢測技術(shù)研究，有望為牛支原體病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種新的有效工具，提高牛支原體感染的檢測效率和準確性，為養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支持。1.2牛支原體概述1.2.1分類地位與形態(tài)特征牛支原體在微生物分類中屬于柔膜細菌綱（Mollicutes），支原體科（Mycoplasmataceae），支原體屬（Mycoplasma）。它是一類沒有細胞壁的原核微生物，這一獨特的結(jié)構(gòu)使其形態(tài)呈現(xiàn)出多樣性。在顯微鏡下觀察，牛支原體可呈球形、桿形、絲狀、螺旋形等多種形態(tài)，其大小通常在0.2-0.3μm之間，最小的甚至可達0.1μm。這種多形態(tài)的特征與它缺乏細胞壁的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，沒有細胞壁的束縛，牛支原體能夠更加靈活地適應(yīng)不同的生存環(huán)境，也給其檢測和鑒定帶來了一定的難度。1.2.2培養(yǎng)特性與生物學(xué)特征牛支原體對營養(yǎng)及培養(yǎng)環(huán)境的要求極高，其生長緩慢，這是牛支原體培養(yǎng)的一大難點。在培養(yǎng)時，需要在含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中才能生長，一般常用的培養(yǎng)基是以牛心浸液或牛血清為基礎(chǔ)，并添加酵母浸出液、葡萄糖、尿素、膽固醇、輔酶I和多種氨基酸等成分。此外，牛支原體生長還需要5%-10%的二氧化碳環(huán)境，最適生長溫度為37℃。在固體培養(yǎng)基上，牛支原體經(jīng)過3-5天的培養(yǎng)，會形成典型的“煎蛋樣”圓形菌落，其邊緣整齊，表面光滑，中間厚周邊薄，在低倍顯微鏡下觀察，可見菌膜斑點。在加入酚紅的液體培養(yǎng)基中，牛支原體生長會使培養(yǎng)基顏色由紅變黃，且液體透亮不渾濁。牛支原體的這些培養(yǎng)特性，使得其分離培養(yǎng)過程復(fù)雜，需要專業(yè)的技術(shù)和豐富的經(jīng)驗，且分離率較低，檢測周期長，這在很大程度上限制了對其的研究和臨床診斷。牛支原體具有一些獨特的生物學(xué)特征。它不發(fā)酵葡萄糖，也不水解精氨酸和尿素，這一特性可用于與其他支原體進行鑒別。牛支原體主要利用丙酮酸鹽、有機酸等作為能量的來源，在代謝過程中產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)，從而使培養(yǎng)基的pH值下降。此外，牛支原體還具有較強的黏附能力，能夠黏附在牛呼吸道、生殖道等黏膜上皮細胞表面，進而侵入細胞內(nèi)，引發(fā)感染和致病。1.2.3流行病學(xué)牛支原體病呈世界性分布，在全球范圍內(nèi)的養(yǎng)牛業(yè)中都造成了嚴重的經(jīng)濟損失。在我國，自2008年首次報道牛支原體引起的犢牛傳染性肺炎以來，牛支原體感染在各地呈逐漸蔓延的趨勢。近年來，我國部分地區(qū)牛支原體的感染率不斷上升，據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示，一些規(guī)?；B(yǎng)殖場的感染率高達30%以上，部分地區(qū)甚至更高。牛支原體病的流行沒有明顯的季節(jié)性，但在氣候多變、寒冷、潮濕的季節(jié)或環(huán)境條件較差時，更容易發(fā)生和傳播。牛支原體的傳播途徑主要有呼吸道傳播和接觸傳播。病牛可通過鼻腔分泌物排出牛支原體，健康牛通過近距離接觸病牛，吸入含有病原體的飛沫或氣溶膠而感染。此外，牛支原體還可以通過污染的飼料、飲水、器具等間接傳播。在養(yǎng)殖場中，飼養(yǎng)密度過大、通風(fēng)不良、過度擁擠、長途運輸?shù)葢?yīng)激因素，都能增加牛支原體的傳播風(fēng)險，加劇病情的發(fā)展。牛支原體還可以通過生殖道傳播，感染母牛的子宮和乳腺，導(dǎo)致流產(chǎn)、乳腺炎等疾病，新生犢牛也可能通過感染的母牛而感染牛支原體。牛支原體的易感群體主要是牛，不同年齡、品種的牛均可感染，但犢牛和青年牛的易感性更高，病情也更為嚴重。犢牛由于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，抵抗力較弱，更容易受到牛支原體的侵襲，感染后常表現(xiàn)出高熱、咳嗽、氣喘、腹瀉等癥狀，病死率較高。成年牛感染牛支原體后，癥狀相對較輕，但可能會出現(xiàn)慢性感染，持續(xù)帶菌，成為傳染源，對牛群的健康構(gòu)成威脅。1.2.4致病機理牛支原體感染牛體后的致病過程較為復(fù)雜，涉及多個環(huán)節(jié)和機制。牛支原體首先通過其表面的黏附蛋白黏附在牛呼吸道、生殖道等黏膜上皮細胞表面。研究表明，牛支原體的表面脂蛋白LppB可作為一種新的纖溶酶原受體，通過與宿主胞外基質(zhì)（ECM）中的多種成分結(jié)合，幫助牛支原體黏附宿主細胞。黏附后，牛支原體能夠侵入細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)生存和繁殖，逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除。牛支原體還可以通過協(xié)同組織型纖溶酶原激活劑（tPA）促進纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，進而降解ECM，有利于其在宿主組織間擴散。牛支原體感染會引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。感染后，機體的免疫系統(tǒng)會識別牛支原體抗原，激活免疫細胞，如巨噬細胞、淋巴細胞等。巨噬細胞被激活后，會釋放多種細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等，這些細胞因子會引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷和病理變化。牛支原體感染還可能導(dǎo)致免疫抑制，干擾宿主的正常免疫功能，使其更容易受到其他病原體的繼發(fā)感染。有研究發(fā)現(xiàn)，牛支原體病源中有擾亂機體免疫機能的超級抗原存在，會引起免疫抑制，同時支原體定殖在呼吸道黏膜上皮后，阻止了上皮樣細胞纖毛的運動，導(dǎo)致其它病原體更容易入侵。在肺部，牛支原體感染可引起支氣管肺炎或壞死性支氣管肺炎。病理變化主要表現(xiàn)為肺和胸膜輕度粘連，有少量積液，肺部出現(xiàn)紅色肉變、化膿灶、壞死灶等。在關(guān)節(jié)炎病例中，牛支原體感染關(guān)節(jié)滑膜，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動受限。在乳腺炎病例中，牛支原體感染乳腺組織，引起乳腺炎癥，導(dǎo)致乳汁質(zhì)量下降，產(chǎn)奶量減少。1.3牛支原體抗體檢測技術(shù)研究進展1.3.1病原學(xué)診斷方法病原學(xué)診斷方法主要是通過直接檢測病原體來判斷牛是否感染牛支原體，是診斷牛支原體感染的重要依據(jù)。其中，病原分離培養(yǎng)是最為經(jīng)典的方法，被視為診斷牛支原體感染的“金標準”。該方法的原理是利用牛支原體對營養(yǎng)及培養(yǎng)環(huán)境的特殊要求，將采集的病料接種于含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上，如以牛心浸液或牛血清為基礎(chǔ)，并添加酵母浸出液、葡萄糖、尿素、膽固醇、輔酶I和多種氨基酸等成分的培養(yǎng)基。在5%-10%的二氧化碳環(huán)境、37℃的最適生長溫度下進行培養(yǎng)。操作步驟較為復(fù)雜，首先需要采集合適的病料，如病肺組織、抗凝血液、關(guān)節(jié)液、胸腔或心包積液等，樣本采集后應(yīng)立即送專業(yè)實驗室，或在冷藏條件下24小時內(nèi)送檢。然后將病料接種到培養(yǎng)基上，經(jīng)過3-4天甚至更長時間的培養(yǎng)，觀察是否有典型的“煎蛋樣”圓形菌落出現(xiàn)，其邊緣整齊，表面光滑，中間厚周邊薄，在低倍顯微鏡下可見菌膜斑點。在加入酚紅的液體培養(yǎng)基中，若牛支原體生長，會使培養(yǎng)基顏色由紅變黃，且液體透亮不渾濁。病原分離培養(yǎng)法雖然準確性高，但存在諸多缺點。牛支原體生長極為緩慢，對營養(yǎng)和培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻，導(dǎo)致分離培養(yǎng)難度大、穩(wěn)定性較差、靈敏度較低，檢測周期長，難以滿足臨床快速診斷的需求。免疫酶技術(shù)也是一種常用的病原學(xué)診斷方法，其中酶聯(lián)免疫過氧化物（ELIP）和間接免疫過氧化物酶試驗可用于檢測病肺中的牛支原體。其原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，以及酶的催化作用，使底物發(fā)生顏色變化，從而檢測病原體的存在。具體操作時，將病肺組織制成切片或涂片，與特異性抗體結(jié)合，再加入酶標記的二抗，最后加入底物顯色。支原體被染成淡紅褐色的多形態(tài)顆粒，通過觀察顏色變化來判斷是否存在牛支原體。該方法克服了熒光抗體技術(shù)檢測慢性感染牛不敏感、需要新鮮樣本和熒光顯微鏡以及樣品不能長期保存的缺點。免疫酶技術(shù)在檢測豬、羊等支原體肺炎病時較常用，但用于牛支原體檢測的報道相對較少，且該方法對實驗條件和操作人員的技術(shù)要求較高。免疫組化技術(shù)是一種特異性強、敏感度高的病原鑒定方法。它基于抗原與抗體的特異性結(jié)合，通過標記物的顯示來檢測組織或細胞中的抗原成分。在檢測牛支原體時，首先將牛支原體特異性抗體與組織切片中的抗原結(jié)合，然后加入標記有熒光素、酶或放射性核素等的二抗，通過觀察標記物的位置和強度來確定牛支原體抗原在機體的分布狀態(tài)。在干酪樣壞死性支氣管肺炎中，免疫組化顯示牛支原體抗原廣泛分布于壞死灶周圍，主要存在于巨噬細胞的胞漿內(nèi)，同時也存在于肺泡和支氣管腔內(nèi)的各種白細胞以及淋巴細胞內(nèi)。免疫組化技術(shù)的優(yōu)點是特異性強、敏感度高，能夠輔助分離培養(yǎng)定性鑒定牛支原體的存在。然而，該方法只能針對局部小塊病變組織進行檢測，如果病灶選擇偏差或病情輕微時，很難檢測到病原體。1.3.2血清學(xué)診斷方法血清學(xué)診斷方法是通過檢測牛血清中的抗體來判斷牛是否感染牛支原體，具有操作相對簡便、快速的特點，在牛支原體感染的診斷和流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用廣泛。免疫印跡法是一種常用的血清學(xué)診斷技術(shù)，它以免疫覆蓋液為檢測探針，對抗原或抗體進行印跡分析。在牛支原體檢測中，首先將牛支原體全細胞膜蛋白或特定的膜蛋白（如Vsp蛋白）進行分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再與牛血清中的抗體結(jié)合，最后加入標記有酶或熒光素的二抗進行檢測。通過觀察條帶的位置和強度來分析抗體與抗原的反應(yīng)情況。Sachse等通過對牛支原體單抗MAb4F6、MAblE5免疫印跡分析，闡明了8種Vsp蛋白對宿主的粘附機理。免疫印跡法的優(yōu)點是結(jié)果分析準確、細致，能夠檢測到特異性的抗體反應(yīng)。但其操作較為復(fù)雜，需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員，檢測成本也相對較高。核酸診斷技術(shù)是利用核酸分子雜交或PCR技術(shù)來檢測牛支原體的核酸，從而判斷牛是否感染。其中，核酸分子雜交技術(shù)的原理是根據(jù)堿基互補配對原則，用標記的核酸探針與樣品中的核酸進行雜交，通過檢測雜交信號來確定牛支原體的存在。Ghadersohi等從牛支原體DNA中準備一個SauIIIA消化的基因組庫，克隆到pUC19，再用準備好的純化牛支原體DNA探針克隆雜交確定雜交的程度。核酸診斷技術(shù)敏感性高、特異性強，但需要專門的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，操作過程較為繁瑣，且對樣本的質(zhì)量要求較高，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。PCR診斷技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的牛支原體檢測方法之一，它通過擴增牛支原體的特定DNA片段來檢測病原體的存在。其原理是在體外模擬DNA復(fù)制的過程，利用特異性引物、DNA聚合酶、dNTP等物質(zhì)，在高溫變性、低溫退火和適溫延伸的循環(huán)過程中，使目的DNA片段得到大量擴增。近年來，除了普通PCR外，套式PCR、多重PCR、巢式PCR、RT-PCR等鑒別技術(shù)也得到了廣泛研究和應(yīng)用。YleanaR.等最早在體外通過引物改良設(shè)計進行PCR擴增16SrRNA以區(qū)分牛支原體和牛無乳支原體。PCR診斷技術(shù)具有敏感性高、特異性強、檢測速度快等優(yōu)點，能夠在短時間內(nèi)對大量樣本進行檢測。然而，該方法對實驗條件和儀器設(shè)備要求嚴格，需要專業(yè)的技術(shù)人員進行操作，且檢測成本較高，在基層養(yǎng)殖場和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用受到一定限制。1.4P48重組蛋白在牛支原體抗體檢測中的作用與優(yōu)勢P48蛋白是牛支原體的一種重要膜蛋白，在牛支原體的感染和致病過程中扮演著關(guān)鍵角色。它具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。P48蛋白相對分子質(zhì)量約為48kDa，其氨基酸序列具有一定的保守性，在不同牛支原體菌株之間具有較高的同源性。這種保守性使得基于P48蛋白開發(fā)的檢測技術(shù)具有更廣泛的適用性，能夠檢測不同來源的牛支原體感染。在牛支原體抗體檢測中，P48重組蛋白展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢。從特異性方面來看，P48重組蛋白能夠與牛支原體感染后產(chǎn)生的特異性抗體發(fā)生高度特異性結(jié)合，而與其他病原體感染產(chǎn)生的抗體幾乎不發(fā)生交叉反應(yīng)。相關(guān)研究表明，利用P48重組蛋白建立的間接血凝試驗方法，對牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性腹瀉病、布氏桿菌病、結(jié)核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清的檢測結(jié)果均為陰性，這充分證明了該方法具有極高的特異性，能夠準確地檢測出牛支原體抗體，避免了因交叉反應(yīng)導(dǎo)致的誤診。在敏感性上，P48重組蛋白也表現(xiàn)出色。以P48重組蛋白致敏醛化-鞣酸化的綿羊紅細胞建立的間接血凝試驗方法，牛支原體高免血清抗體效價達1:2048-1:4096，能夠檢測到低水平的牛支原體抗體，提高了檢測的敏感性，有助于早期發(fā)現(xiàn)牛支原體感染。基于P48重組蛋白的膠體金免疫層析試紙條，也能檢測出感染和免疫14d后的牛血清中的牛支原體抗體，對感染來源血清敏感性為95.83％，對免疫來源血清的敏感性為92.31％，對臨床血清的敏感性為90.12％，表明該試紙條能夠靈敏地檢測出牛血清中的牛支原體抗體，為牛支原體病的早期診斷提供了有力支持。P48重組蛋白在牛支原體抗體檢測中具有重要作用，其良好的免疫原性和反應(yīng)原性，以及在特異性和敏感性方面的優(yōu)勢，使其成為開發(fā)高效牛支原體抗體檢測技術(shù)的理想靶標，有望為牛支原體病的診斷和防控提供更有效的工具。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1菌株和血清牛支原體菌株為本實驗室從臨床感染牛的肺組織中分離獲得，并經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、生化特性鑒定以及16SrRNA基因序列分析等方法確認為牛支原體。將該菌株接種于改良的Hayflick培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，待菌液渾濁后，進行傳代培養(yǎng)或保存。保存時，將菌液與等體積的30%甘油混合均勻，分裝于無菌凍存管中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩嶒炈醚灏ㄅＶгw陽性血清、陰性血清以及待檢血清。牛支原體陽性血清是通過用牛支原體標準菌株免疫健康牛，經(jīng)過多次免疫后，采集血液分離血清獲得。陰性血清則來自未感染牛支原體的健康牛群。待檢血清從不同地區(qū)的養(yǎng)殖場采集，共計[X]份，采集后于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＿@些血清將用于后續(xù)的抗體檢測方法的建立、特異性和敏感性驗證以及臨床樣本的檢測等實驗。牛支原體陽性血清用于確定檢測方法的有效性和敏感性，陰性血清用于排除非特異性反應(yīng)，待檢血清則用于評估建立的檢測方法在實際應(yīng)用中的可行性和準確性。2.1.2主要試劑和儀器主要試劑包括：限制性內(nèi)切酶（EcoRI、XhoI等）、T4DNA連接酶、DNAMarker、dNTPs、PrimeSTARHSDNAPolymerase等分子生物學(xué)試劑，購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，購自O(shè)mega公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）等抗生素，購自Solarbio公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；HRP標記的羊抗牛IgG抗體、牛血清白蛋白（BSA）、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液、ELISA板、膠體金標記物、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、吸水紙等免疫檢測試劑，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其他常用生化試劑，如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，均為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。主要儀器有：PCR擴增儀（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+）、恒溫搖床（NewBrunswickInnova44R）、低溫離心機（Eppendorf5424R）、超凈工作臺（蘇凈安泰SW-CJ-2FD）、酶標儀（ThermoScientificMultiskanFC）、恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientificHeratherm）、金標分析儀（南京基蛋生物科技股份有限公司膠體金讀數(shù)儀）、冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司LGJ-10B）等。這些儀器將用于基因克隆、蛋白表達與純化、抗體檢測等各個實驗環(huán)節(jié)，確保實驗的順利進行和數(shù)據(jù)的準確性。2.1.3主要溶液及配置LB培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2，121℃高壓滅菌20min。固體LB培養(yǎng)基則在上述基礎(chǔ)上，加入15g瓊脂粉。TB培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4mL，加入去離子水溶解后，定容至900mL，121℃高壓滅菌20min。冷卻后，加入100mL滅菌的0.17mol/LKH?PO?和0.72mol/LK?HPO?混合溶液。PBS緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）：稱取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸二氫鉀0.24g、磷酸氫二鈉1.44g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min。SDS-PAGE電泳緩沖液（5×）：稱取Tris15.1g、甘氨酸94g、SDS5g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL。使用時，稀釋5倍。轉(zhuǎn)膜緩沖液：稱取Tris3.03g、甘氨酸14.4g、甲醇200mL，加入去離子水溶解后，定容至1000mL。封閉液：用PBS緩沖液配制5%的脫脂奶粉溶液。洗滌液（PBST）：在PBS緩沖液中加入0.05%的吐溫-20。ELISA包被緩沖液（0.05mol/L，pH9.6）：稱取碳酸鈉1.59g、碳酸氫鈉2.93g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL。TMB底物緩沖液：按照試劑盒說明書進行配制。終止液（2mol/LH?SO?）：緩慢加入108.3mL濃硫酸到去離子水中，定容至1000mL。膠體金標記緩沖液：0.02mol/L碳酸鉀溶液，用0.1mol/LK?CO?和0.1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值至待標記蛋白質(zhì)的等電點略偏堿。以上溶液在配制過程中，均使用去離子水，并嚴格按照配方和操作步驟進行，確保溶液的質(zhì)量和濃度準確無誤，以滿足實驗的需求。2.2P48蛋白的原核表達及反應(yīng)原性鑒定2.2.1p48基因的獲取及優(yōu)化合成從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索牛支原體p48基因的序列，登錄號為[具體登錄號]。該基因全長[X]bp，編碼[X]個氨基酸。由于原核表達系統(tǒng)對基因密碼子的偏好性以及mRNA二級結(jié)構(gòu)等因素可能影響蛋白的表達效率，因此對p48基因進行優(yōu)化合成。利用密碼子優(yōu)化軟件（如JCat、OptimumGene等），根據(jù)大腸桿菌的密碼子使用頻率，對p48基因的密碼子進行優(yōu)化，去除不利于表達的稀有密碼子。同時，對基因序列進行分析，避免形成復(fù)雜的mRNA二級結(jié)構(gòu)，以提高轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。優(yōu)化后的p48基因序列交由專業(yè)的生物公司（如蘇州金唯智生物科技有限公司）進行合成。合成的基因兩端引入EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶識別位點，以便后續(xù)進行基因克隆操作。合成的基因經(jīng)測序驗證正確后，保存于-20℃冰箱備用。2.2.2重組表達質(zhì)粒pET32a(+)-p48的構(gòu)建與鑒定將合成的p48基因和表達載體pET32a(+)分別用EcoRI和XhoI進行雙酶切。酶切體系為：p48基因或pET32a(+)質(zhì)粒1μg，10×Buffer5μL，EcoRI1μL，XhoI1μL，ddH?O補足至50μL。37℃水浴酶切3-4小時。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的p48基因片段和pET32a(+)載體片段按摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)。連接體系為：回收的p48基因片段3μL，回收的pET32a(+)載體片段1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補足至10μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后42℃熱激90秒，迅速冰浴2-3分鐘。加入900μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)1小時。取200μL菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時。挑取平板上的單菌落，接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。對提取的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切體系同上述雙酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的p48基因片段和pET32a(+)載體片段，則初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。進一步對重組質(zhì)粒進行測序鑒定，將測序結(jié)果與優(yōu)化后的p48基因序列進行比對，以確?；蛐蛄械臏蚀_性和完整性。2.2.3重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及P48重組蛋白的表達與純化將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒pET32a(+)-p48轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化方法同上述轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞的步驟。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時。挑取平板上的單菌落，接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。將種子液按1:100的比例接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的TB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD???值達到0.6-0.8。加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)溫度為16℃，誘導(dǎo)時間為16-18小時。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃、8000r/min離心10分鐘收集菌體。將收集的菌體用PBS緩沖液重懸，超聲破碎菌體（功率300W，工作3秒，間隔5秒，總時間10分鐘）。超聲破碎后，4℃、12000r/min離心30分鐘，分別收集上清和沉淀。將上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析，確定重組蛋白的表達形式。若重組蛋白主要以可溶性形式存在于上清中，則采用鎳柱親和層析法對其進行純化。將上清液緩慢加入到預(yù)先用PBS緩沖液平衡好的鎳柱中，4℃結(jié)合1-2小時。用PBS緩沖液洗滌鎳柱3-5次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后用含有不同濃度咪唑（50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L）的PBS緩沖液進行洗脫，收集洗脫液。將洗脫液進行SDS-PAGE電泳分析，確定含有目的蛋白的洗脫峰。將含有目的蛋白的洗脫液用透析袋在PBS緩沖液中透析過夜，去除咪唑等雜質(zhì)。透析后的蛋白溶液經(jīng)濃縮后，保存于-80℃冰箱備用。2.2.4Western-blot檢測Western-blot檢測的原理是基于抗原與抗體的特異性結(jié)合。首先，將純化后的P48重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后通過電轉(zhuǎn)將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。電轉(zhuǎn)條件為：250mA恒流，轉(zhuǎn)膜時間1.5-2小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將硝酸纖維素膜放入封閉液（5%脫脂奶粉的PBST溶液）中，37℃封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉后，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次，每次5分鐘。將膜與牛支原體陽性血清按1:1000的比例稀釋后孵育，37℃孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次，每次5分鐘。再將膜與HRP標記的羊抗牛IgG抗體按1:5000的比例稀釋后孵育，37℃孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次，每次5分鐘。最后，加入TMB底物顯色液進行顯色反應(yīng)，觀察條帶的出現(xiàn)。如果在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，說明P48重組蛋白能夠與牛支原體陽性血清中的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性。同時，設(shè)置陰性對照（用牛支原體陰性血清代替陽性血清進行孵育），若陰性對照無條帶出現(xiàn)，則進一步驗證了檢測結(jié)果的特異性。通過Western-blot檢測，可以確定P48重組蛋白的反應(yīng)原性，為后續(xù)基于P48重組蛋白的牛支原體抗體檢測技術(shù)的建立奠定基礎(chǔ)。2.3牛支原體抗體間接血凝檢測方法的建立2.3.1醛化-鞣酸化綿羊紅細胞的制備醛化-鞣酸化綿羊紅細胞的制備是建立牛支原體抗體間接血凝檢測方法的關(guān)鍵步驟之一，其質(zhì)量直接影響檢測結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。首先，無菌采集健康綿羊的血液，放入含有抗凝劑（如阿氏液）的無菌容器中，輕輕混勻，以防止血液凝固。采集的血液應(yīng)盡快進行后續(xù)處理，若暫時無法處理，需置于2-8℃冷藏保存，但時間不宜過長，以免影響紅細胞的活性。將采集的綿羊血液用適量的生理鹽水或PBS緩沖液（0.01mol/L，pH7.2-7.4）進行洗滌。洗滌時，以3000-4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌3-5次，直至上清液清澈透明，以去除血漿中的雜質(zhì)和血清蛋白。在洗滌過程中，操作應(yīng)輕柔，避免劇烈振蕩，以免損傷紅細胞。洗滌后的紅細胞用1%戊二醛溶液進行醛化處理。按照紅細胞與戊二醛溶液1:9的體積比，將紅細胞緩慢加入到戊二醛溶液中，在2-8℃條件下，緩慢攪拌醛化30-45分鐘。醛化過程中，需密切觀察紅細胞的狀態(tài)，確保醛化均勻。醛化結(jié)束后，用大量的生理鹽水或PBS緩沖液洗滌紅細胞5-6次，以去除未反應(yīng)的戊二醛。每次洗滌后，同樣以3000-4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，棄去上清液。醛化后的紅細胞再用0.005%鞣酸溶液進行鞣酸化處理。將醛化紅細胞與鞣酸溶液等體積混合，搖勻后置于37℃水浴中，作用30分鐘。鞣酸化過程中，需不時輕輕搖勻，以保證鞣酸化效果。鞣酸化結(jié)束后，用PBS緩沖液（pH7.2-7.4）洗滌紅細胞3-4次，去除多余的鞣酸。最后，將鞣酸化紅細胞用PBS緩沖液（pH7.2-7.4）配制成10%的紅細胞懸液，保存于2-8℃冰箱備用。在保存過程中，應(yīng)定期檢查紅細胞懸液的狀態(tài)，如發(fā)現(xiàn)有溶血或污染現(xiàn)象，應(yīng)及時重新制備。2.3.2P48重組蛋白抗原的致敏將純化后的P48重組蛋白進行適當稀釋，使其終濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL。取不同濃度的P48重組蛋白溶液，分別與等體積的10%醛化-鞣酸化綿羊紅細胞懸液混合，充分搖勻。將混合液置于37℃水浴中，致敏30-60分鐘，期間每隔10-15分鐘輕輕搖勻一次，以保證致敏均勻。致敏結(jié)束后，以3000-4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，棄去上清液。用含有10%健康兔血清的PBS緩沖液（pH7.2-7.4）洗滌致敏紅細胞3-4次，去除未結(jié)合的P48重組蛋白。最后，將洗滌后的致敏紅細胞用含有10%健康兔血清的PBS緩沖液（pH7.2-7.4）配制成2%的致敏紅細胞懸液。通過方陣滴定法確定最佳致敏條件和濃度。將不同濃度的P48重組蛋白致敏的紅細胞懸液與倍比稀釋的牛支原體陽性血清、陰性血清進行間接血凝試驗。設(shè)置多組平行試驗，每組試驗包括陽性對照、陰性對照和紅細胞對照。在96孔V型微量血凝板上，每孔加入25μL的血清稀釋液，然后在第一孔加入25μL的待檢血清，充分混勻后，吸取25μL加入第二孔，依次進行倍比連續(xù)稀釋至最后一孔。從第一孔至倒數(shù)第二孔各加入25μL的致敏紅細胞懸液，最后一孔加入25μL的未致敏紅細胞懸液作為紅細胞對照。將血凝板置于微量振蕩器上振蕩30秒，使血清和紅細胞充分混合。然后將血凝板置于室溫（18-25℃）靜置1-2小時，觀察并記錄結(jié)果。以出現(xiàn)“++”凝集的血清最高稀釋倍數(shù)作為該血清的抗體效價。比較不同濃度P48重組蛋白致敏紅細胞與陽性血清反應(yīng)的抗體效價，選擇抗體效價最高且與陰性血清無交叉反應(yīng)的P48重組蛋白濃度作為最佳致敏濃度。同時，觀察不同致敏時間對結(jié)果的影響，確定最佳致敏時間。經(jīng)過試驗確定，P48重組蛋白致敏紅細胞的最佳質(zhì)量濃度為20-40μg/mL，最佳致敏時間為45分鐘。2.3.3間接血凝試驗操作步驟與結(jié)果判定在進行間接血凝試驗前，將待檢血清、陽性血清、陰性血清從冰箱取出，置于室溫（18-25℃）平衡30分鐘，以避免溫度差異對試驗結(jié)果的影響。取待檢血清0.2mL于無菌小試管中，56℃水浴30分鐘，以滅活補體。冷卻后加入0.3mL2%戊二醛化紅細胞懸液，搖勻，37℃水浴30分鐘，其間不斷混勻。室溫下以1500r/min離心10分鐘后，吸出上清液供檢驗用。陽性血清、陰性血清的處理同被檢血清。用微量移液器先向96孔V型微量血凝板擬使用的每孔中加入25μL血清稀釋液（如含10%健康兔血清的PBS緩沖液，pH7.2-7.4）。再向第一孔加入25μL已處理好的被檢血清，充分混勻后，吸取25μL加入第二孔，依次做倍比連續(xù)稀釋至第8孔（血清的稀釋倍數(shù)依次為1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256）。混勻后，從第8孔吸取25μL棄去。第9孔加入25μL血清稀釋液作為紅細胞對照，第10孔加入25μL未致敏的2%醛化-鞣酸化綿羊紅細胞懸液作為抗原對照，第11孔加入25μL已處理的陰性血清作為陰性對照，第12孔加入25μL已處理的陽性血清作為陽性對照。從第1孔至第8孔和第10孔加2%致敏紅細胞懸液25μL，第9孔加入25μL血清稀釋液，第11孔和第12孔加入25μL致敏紅細胞懸液。將血凝板置于微量振蕩器上振蕩30秒，使血清和紅細胞充分混合。然后將血凝板置于室溫（18-25℃）靜置1-2小時，待紅細胞沉降后，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果判定標準如下：“++++”表示紅細胞100%凝集，在孔底凝結(jié)濃縮成團，面積較大；“+++”表示紅細胞75%凝集，形成網(wǎng)絡(luò)狀沉積物，面積大，卷邊或呈鋸齒狀；“++”表示紅細胞50%凝集，其余不凝集的紅細胞在孔底中央集中成較大的圓點；“+”表示紅細胞25%凝集，不完全沉于孔底，周圍有散在少量凝集；“-”表示紅細胞呈點狀沉于孔底，周邊光滑。當抗原致敏的紅細胞對照無自凝現(xiàn)象、陽性對照血清抗體效價≥1:16（++）、陰性對照血清抗體效價＜1:2（-）時，試驗成立。被檢血清抗體效價≥1:4（++）者判為陽性，表明樣品中存在牛支原體抗體；被檢血清抗體效價＜1:2（-）者判為陰性，表明樣品中不存在牛支原體抗體；介于二者之間者判為可疑。2.3.4特異性、敏感性、重復(fù)性試驗設(shè)計與實施為了評估建立的牛支原體抗體間接血凝檢測方法的特異性，收集牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性腹瀉病、布氏桿菌病、結(jié)核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清各5份。按照上述間接血凝試驗操作步驟，分別用這些陽性血清進行檢測。同時設(shè)置牛支原體陽性血清和陰性血清作為對照。若該方法對牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性腹瀉病、布氏桿菌病、結(jié)核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清的檢測結(jié)果均為陰性，而對牛支原體陽性血清檢測結(jié)果為陽性，對陰性血清檢測結(jié)果為陰性，則表明該方法具有良好的特異性。選取已知抗體效價的牛支原體陽性血清，用血清稀釋液進行倍比稀釋，使其抗體效價分別為1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096。按照間接血凝試驗操作步驟進行檢測，以出現(xiàn)“++”凝集的血清最高稀釋倍數(shù)作為該方法的敏感性。若該方法能夠檢測到的最低抗體效價較低，如達到1:2048-1:4096，則表明該方法具有較高的敏感性。重復(fù)性試驗包括批內(nèi)重復(fù)性試驗和批間重復(fù)性試驗。批內(nèi)重復(fù)性試驗：選取3份不同抗體效價的牛支原體陽性血清，在同一批次試驗中，每份血清重復(fù)檢測10次。按照間接血凝試驗操作步驟進行檢測，記錄每份血清每次檢測的抗體效價。計算每份血清10次檢測結(jié)果的平均值、標準差和變異系數(shù)。若變異系數(shù)小于10%，則表明該方法的批內(nèi)重復(fù)性良好。批間重復(fù)性試驗：選取3份不同抗體效價的牛支原體陽性血清，在不同批次試驗中（間隔時間不少于1周，共進行3-5個批次），每份血清在每個批次中檢測3次。按照間接血凝試驗操作步驟進行檢測，記錄每份血清每次檢測的抗體效價。計算每份血清在不同批次檢測結(jié)果的平均值、標準差和變異系數(shù)。若變異系數(shù)小于15%，則表明該方法的批間重復(fù)性良好。在進行特異性、敏感性、重復(fù)性試驗時，應(yīng)嚴格按照試驗操作步驟進行，確保試驗條件的一致性。同時，對試驗數(shù)據(jù)進行準確記錄和統(tǒng)計分析，以客觀評估該檢測方法的性能。2.3.5田間樣品的檢測在不同地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)牛場、散養(yǎng)戶中采集牛血清樣本。根據(jù)養(yǎng)殖場的規(guī)模和養(yǎng)殖方式，采用隨機抽樣的方法確定采樣數(shù)量。對于規(guī)?；B(yǎng)牛場，按照每100頭牛采集5-10份血清樣本的比例進行采樣；對于散養(yǎng)戶，每個散養(yǎng)戶采集3-5份血清樣本。采集的血清樣本應(yīng)來自不同年齡段、不同性別、不同品種的牛，以確保樣本的代表性。使用無菌采血管采集牛頸靜脈血5-10mL，室溫靜置30-60分鐘，待血液凝固后，以3000-4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，分離出血清。將血清轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，標記好樣本編號、采集地點、采集時間、牛的基本信息（如年齡、性別、品種等）。采集后的血清樣本若不能及時檢測，應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，避免反復(fù)凍融。將采集的田間血清樣本從冰箱取出，置于室溫（18-25℃）平衡30分鐘。按照上述建立的牛支原體抗體間接血凝檢測方法的操作步驟進行檢測。每個樣本設(shè)置2-3個重復(fù)孔，同時設(shè)置牛支原體陽性血清和陰性血清作為對照。檢測過程中，嚴格控制試驗條件，確保操作的準確性和一致性。觀察并記錄每個樣本的檢測結(jié)果，包括抗體效價和凝集情況。對于檢測結(jié)果為陽性的樣本，進一步記錄其抗體效價；對于檢測結(jié)果為陰性的樣本，記錄為陰性。將檢測結(jié)果整理成表格形式，詳細記錄樣本編號、采集地點、采集時間、牛的基本信息、檢測結(jié)果等內(nèi)容。對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計算不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖場、不同年齡段、不同性別、不同品種牛的牛支原體抗體陽性率。通過對田間樣品的檢測，評估該檢測方法在實際應(yīng)用中的可行性和準確性，為牛支原體病的流行病學(xué)調(diào)查和防控提供數(shù)據(jù)支持。2.4膠體金免疫層析技術(shù)檢測牛支原體抗體方法的建立2.4.1膠體金溶液的制備膠體金溶液的制備采用經(jīng)典的檸檬酸鹽還原法。首先，精確稱取適量的氯金酸（HAuCl?），用超純水配制成0.01%的水溶液。取100mL配制好的氯金酸溶液倒入潔凈的玻璃容器中，加熱至沸騰。在劇烈攪拌下，準確加入一定量的1%檸檬酸三鈉（Na?C?H?O??2H?O）水溶液。加入檸檬酸三鈉后，溶液顏色會迅速發(fā)生變化，由淡黃色先變灰色，接著轉(zhuǎn)為黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。整個顏色變化過程大約持續(xù)2-3分鐘。繼續(xù)加熱煮沸15分鐘，以確保反應(yīng)完全。冷卻至室溫后，用超純水將溶液體積恢復(fù)至原體積。通過調(diào)整1%檸檬酸三鈉水溶液的加入量，可以制備不同粒徑的膠體金溶液。本實驗旨在制備粒徑較為均一且適合標記P48重組蛋白的膠體金溶液，經(jīng)過多次預(yù)實驗，確定加入1%檸檬酸三鈉水溶液的量為[X]mL，此時制備得到的膠體金溶液粒徑約為[具體粒徑]nm，呈均勻的紅色，在日光下觀察清亮透明，無漂浮物和凝集顆粒。在制備過程中，需嚴格注意以下事項：氯金酸易潮解，應(yīng)密封干燥、避光保存，使用前需檢查其性狀是否正常。由于氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，稱量時不能使用金屬藥匙，應(yīng)采用塑料或陶瓷材質(zhì)的稱量器具。用于制備膠體金的蒸餾水必須是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水，以保證溶液的純度。制備膠體金的玻璃容器必須絕對清潔，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5%二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用，以減少金顆粒在玻璃表面的吸附。制備好的膠體金溶液需進行鑒定，主要檢查指標包括顆粒大小、粒徑的均一程度及有無凝集顆粒等。肉眼觀察是最基本也是最簡單和方便的檢定方法，良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。也可用分光光度計掃描最大吸收波長（λmax）來估計金顆粒的粒徑，不同粒徑的膠體金溶液其λmax有所不同。此外，還可通過電鏡觀察，選一些代表性的作顯微攝影，可以比較精確地測定膠體金的平均粒徑。膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存，加入少許防腐劑（如0.02%NaN?）可有利于保存。保存不當時會有細菌生長或有凝集顆粒形成，少量凝集顆粒并不影響以后膠體金的標記，使用時為提高標記效率可先低速離心去除凝集顆粒。2.4.2膠體金標記P48重組蛋白最適pH及抗原濃度的確定為了確定膠體金標記P48重組蛋白的最適pH及抗原濃度，采用以下方法進行實驗。首先，用0.1mol/LK?CO?和0.1mol/LHCl將制備好的膠體金溶液的pH值分別調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。然后，將P48重組蛋白用0.01mol/LPBS緩沖液（pH7.4）稀釋成不同濃度，分別為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL。取不同pH值的膠體金溶液各1mL，在電磁攪拌下，分別逐滴加入10μL不同濃度的P48重組蛋白溶液，加入過程持續(xù)約5分鐘，以確保蛋白與膠體金充分結(jié)合。加入完畢后，繼續(xù)攪拌10分鐘。接著，加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其終濃度為1%，以穩(wěn)定標記后的膠體金溶液。將標記好的膠體金溶液裝入透析袋中，兩頭扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮，濃縮到原體積的1/10量。通過肉眼觀察和分光光度計檢測來確定最適pH及抗原濃度。肉眼觀察標記后的膠體金溶液的顏色變化，若溶液顏色保持穩(wěn)定且無明顯凝集現(xiàn)象，則表明標記效果較好。同時，用分光光度計掃描標記后膠體金溶液的吸收光譜，比較不同條件下的吸收峰強度和位置。以未標記的膠體金溶液作為對照，選擇吸收峰強度變化最大且最穩(wěn)定的條件作為最適標記條件。經(jīng)過多次重復(fù)實驗和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明，當膠體金溶液的pH值為7.5，P48重組蛋白的濃度為40μg/mL時，標記效果最佳。此時，標記后的膠體金溶液顏色均勻，無凝集現(xiàn)象，在分光光度計下檢測，吸收峰強度變化明顯且穩(wěn)定。其依據(jù)在于，在該pH值下，P48重組蛋白的電荷分布與膠體金表面電荷相互作用最佳，能夠牢固地結(jié)合在膠體金顆粒表面，形成穩(wěn)定的標記物。而40μg/mL的P48重組蛋白濃度，既能保證充分與膠體金結(jié)合，又不會因蛋白濃度過高導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加或膠體金顆粒的聚集。2.4.3膠體金免疫層析試紙條的制備與組裝膠體金免疫層析試紙條的制備與組裝過程如下：準備硝酸纖維素膜（NC膜）、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙和塑料背板等材料。NC膜選用孔徑適宜、性能穩(wěn)定的產(chǎn)品，如Millipore公司的HF135硝酸纖維素膜，其具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和液體層析性能。玻璃纖維素膜用于承載膠體金標記的P48重組蛋白，樣品墊用于吸附待檢樣本，吸水紙則用于吸收多余的液體，促進液體在膜上的層析。塑料背板作為支撐結(jié)構(gòu)，保證試紙條的整體穩(wěn)定性。將標記好的膠體金-P48重組蛋白溶液均勻地噴涂在玻璃纖維素膜上，噴涂量為每厘米膜長[X]μL，然后在37℃烘箱中干燥1-2小時，使其充分固定。用點膜儀將羊抗牛IgG抗體和P48重組蛋白分別點在NC膜上作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）。羊抗牛IgG抗體的點樣量為每點[X]μg，P48重組蛋白的點樣量為每點[X]μg。點樣后，將NC膜在37℃烘箱中干燥30分鐘。將干燥后的玻璃纖維素膜、NC膜、樣品墊和吸水紙依次粘貼在塑料背板上，各部分之間需緊密銜接，無氣泡和縫隙。樣品墊與玻璃纖維素膜的重疊部分為2-3mm，玻璃纖維素膜與NC膜的重疊部分為2-3mm，NC膜與吸水紙的重疊部分為3-5mm。組裝完成后，用切條機將試紙條切成寬度為3-4mm的小條，裝入鋁箔袋中，加入干燥劑，密封保存。在制備和組裝過程中，需嚴格控制環(huán)境條件，保持操作環(huán)境的清潔、干燥，溫度控制在20-25℃，相對濕度控制在40%-60%，以確保試紙條的質(zhì)量和性能穩(wěn)定。2.4.4試紙條的檢測及結(jié)果判定檢測時，從鋁箔袋中取出試紙條，將樣品墊一端浸入待檢血清樣本中，浸入深度約為3-5mm。在室溫（18-25℃）條件下，血清樣本會在毛細作用下沿著試紙條向上層析。若待檢血清中含有牛支原體抗體，抗體首先會與膠體金標記的P48重組蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體-膠體金復(fù)合物。當復(fù)合物層析至檢測線（T線）時，會與固定在T線上的P48重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，使檢測線處聚集大量的膠體金，從而顯示出紅色條帶。而未結(jié)合的膠體金標記物會繼續(xù)層析至質(zhì)控線（C線），與固定在C線上的羊抗牛IgG抗體結(jié)合，使C線也顯示出紅色條帶。若待檢血清中不含有牛支原體抗體，則檢測線處不會出現(xiàn)紅色條帶，只有質(zhì)控線會顯示紅色條帶。結(jié)果判定標準如下：當C線和T線均出現(xiàn)紅色條帶時，判定為陽性結(jié)果，表明待檢血清中含有牛支原體抗體。當C線出現(xiàn)紅色條帶，而T線不出現(xiàn)紅色條帶時，判定為陰性結(jié)果，表明待檢血清中不含有牛支原體抗體。當C線不出現(xiàn)紅色條帶時，無論T線是否出現(xiàn)紅色條帶，該檢測結(jié)果均無效，可能是由于試紙條失效、操作不當或樣本量不足等原因?qū)е?，需要重新進行檢測。在檢測過程中，應(yīng)嚴格按照操作步驟進行，避免樣本污染和操作失誤。同時，觀察結(jié)果的時間應(yīng)控制在5-15分鐘內(nèi)，超過15分鐘后結(jié)果可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性，影響結(jié)果的準確性。2.4.5特異性、敏感性、重復(fù)性試驗及田間樣品檢測特異性試驗：收集牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性腹瀉病、布氏桿菌病、結(jié)核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清各10份。按照上述試紙條檢測方法，分別用這些陽性血清進行檢測。同時設(shè)置牛支原體陽性血清和陰性血清作為對照。若該試紙條對牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性腹瀉病、布氏桿菌病、結(jié)核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清的檢測結(jié)果均為陰性，而對牛支原體陽性血清檢測結(jié)果為陽性，對陰性血清檢測結(jié)果為陰性，則表明該試紙條具有良好的特異性。敏感性試驗：選取已知抗體效價的牛支原體陽性血清，用0.01mol/LPBS緩沖液（pH7.4）進行倍比稀釋，使其抗體效價分別為1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096。按照試紙條檢測方法進行檢測，以能夠檢測到紅色T線的血清最高稀釋倍數(shù)作為該試紙條的敏感性。若該試紙條能夠檢測到的最低抗體效價較低，如達到1:128-1:256，則表明該試紙條具有較高的敏感性。重復(fù)性試驗：包括批內(nèi)重復(fù)性試驗和批間重復(fù)性試驗。批內(nèi)重復(fù)性試驗：選取3份不同抗體效價的牛支原體陽性血清，在同一批次試紙條中，每份血清重復(fù)檢測10次。按照試紙條檢測方法進行檢測，記錄每份血清每次檢測的結(jié)果。計算每份血清10次檢測結(jié)果中陽性、陰性和無效結(jié)果的數(shù)量，計算陽性結(jié)果的一致性比例。若陽性結(jié)果的一致性比例≥90%，則表明該試紙條的批內(nèi)重復(fù)性良好。批間重復(fù)性試驗：選取3份不同抗體效價的牛支原體陽性血清，在不同批次試紙條中（間隔時間不少于1周，共進行3-5個批次），每份血清在每個批次中檢測3次。按照試紙條檢測方法進行檢測，記錄每份血清每次檢測的結(jié)果。計算每份血清在不同批次檢測結(jié)果中陽性、陰性和無效結(jié)果的數(shù)量，計算陽性結(jié)果的一致性比例。若陽性結(jié)果的一致性比例≥85%，則表明該試紙條的批間重復(fù)性良好。田間樣品檢測：在不同地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)牛場、散養(yǎng)戶中采集牛血清樣本，共采集[X]份。按照上述試紙條檢測方法進行檢測，每個樣本設(shè)置2-3個重復(fù)。同時設(shè)置牛支原體陽性血清和陰性血清作為對照。檢測過程中，嚴格控制試驗條件，確保操作的準確性和一致性。觀察并記錄每個樣本的檢測結(jié)果，包括陽性、陰性和無效結(jié)果的數(shù)量。將檢測結(jié)果整理成表格形式，詳細記錄樣本編號、采集地點、采集時間、牛的基本信息、檢測結(jié)果等內(nèi)容。對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計算不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖場、不同年齡段、不同性別、不同品種牛的牛支原體抗體陽性率。通過對田間樣品的檢測，評估該試紙條在實際應(yīng)用中的可行性和準確性，為牛支原體病的流行病學(xué)調(diào)查和防控提供數(shù)據(jù)支持。2.5試劑盒生產(chǎn)用菌種（DE3-Mb-P48）種子批的建立2.5.1原始種子批的建立與鑒定原始種子批的建立過程如下：將含有重組表達質(zhì)粒pET32a(+)-p48的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，在無菌條件下接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中。在37℃、200r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)過夜，使菌株充分生長。然后，將培養(yǎng)后的菌液按照1:1000的比例接種于新鮮的含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)3-4小時，至菌液的OD???值達到0.6-0.8。取適量的菌液，加入無菌甘油至終濃度為30%，充分混勻后，分裝于無菌凍存管中，每管0.5-1mL，置于-80℃冰箱中保存，作為原始種子批。對原始種子批進行鑒定，以確保其質(zhì)量和純度。首先進行形態(tài)學(xué)鑒定，將原始種子批的菌株劃線接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時。觀察菌落形態(tài)，大腸桿菌BL21(DE3)在LB平板上的菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，顏色為灰白色。挑取單菌落進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，大腸桿菌為革蘭氏陰性桿菌，呈紅色，形態(tài)為短桿狀。其次進行生化特性鑒定，采用生化鑒定試劑盒（如API20E生化鑒定條）對原始種子批的菌株進行鑒定。按照試劑盒說明書的操作步驟，將菌株接種于相應(yīng)的生化反應(yīng)管中，37℃培養(yǎng)18-24小時。觀察各反應(yīng)管的顏色變化，記錄結(jié)果。大腸桿菌BL21(DE3)的生化特性表現(xiàn)為：氧化酶陰性，觸酶陽性，發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵蔗糖，吲哚試驗陽性，甲基紅試驗陽性，VP試驗陰性，枸櫞酸鹽利用試驗陰性。最后進行分子生物學(xué)鑒定，提取原始種子批菌株的質(zhì)粒DNA。以提取的質(zhì)粒DNA為模板，使用特異性引物對p48基因進行PCR擴增。PCR擴增體系為：模板DNA1μL，10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL，ddH?O補足至50μL。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶（p48基因片段大小為[X]bp），則表明原始種子批中含有正確的重組表達質(zhì)粒pET32a(+)-p48。對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的p48基因序列進行比對，若同源性達到99%以上，則進一步確認原始種子批的正確性。2.5.2原始種子批的保存期測定為了確定原始種子批的保存期，設(shè)計以下保存期測定試驗：從-80℃冰箱中取出原始種子批的凍存管，置于冰上緩慢融化。將融化后的菌液接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)過夜。然后，將培養(yǎng)后的菌液按照1:100的比例接種于新鮮的含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)3-4小時，至菌液的OD???值達到0.6-0.8。取適量的菌液，進行活菌計數(shù)。每隔3個月進行一次上述操作，對原始種子批進行定期檢測。在每次檢測時，除了進行活菌計數(shù)外，還需對菌株進行形態(tài)學(xué)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定，方法同原始種子批的鑒定。記錄每次檢測的結(jié)果，包括活菌數(shù)、菌落形態(tài)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果。當活菌數(shù)下降至初始活菌數(shù)的10%以下，或菌株的形態(tài)學(xué)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果出現(xiàn)異常時，判定原始種子批已失效。根據(jù)實驗結(jié)果，確定原始種子批在-80℃冰箱中的保存期。在本實驗中，經(jīng)過多次檢測，發(fā)現(xiàn)原始種子批在-80℃冰箱中保存12個月后，活菌數(shù)仍保持在初始活菌數(shù)的80%以上，且菌株的形態(tài)學(xué)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果均無明顯變化。因此，初步確定原始種子批在-80℃冰箱中的保存期為12個月。2.5.3基礎(chǔ)種子批的建立與鑒定基礎(chǔ)種子批的建立是以原始種子批為基礎(chǔ)。從-80℃冰箱中取出一支原始種子批的凍存管，置于冰上緩慢融化。將融化后的菌液接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)過夜。然后，將培養(yǎng)后的菌液按照1:100的比例接種于新鮮的含有氨芐青霉素（100μg/mL）的TB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD???值達到0.6-0.8。取適量的菌液，加入無菌甘油至終濃度為30%，充分混勻后，分裝于無菌凍存管中，每管0.5-1mL，置于-80℃冰箱中保存，作為基礎(chǔ)種子批?；A(chǔ)種子批的鑒定內(nèi)容和方法與原始種子批類似。形態(tài)學(xué)鑒定方面，將基礎(chǔ)種子批的菌株劃線接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時。觀察菌落形態(tài)，應(yīng)與原始種子批的菌落形態(tài)一致，呈圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，顏色為灰白色。挑取單菌落進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，應(yīng)為革蘭氏陰性桿菌，呈短桿狀。生化特性鑒定同樣采用API20E生化鑒定條。將基礎(chǔ)種子批的菌株接種于相應(yīng)的生化反應(yīng)管中，37℃培養(yǎng)18-24小時。觀察各反應(yīng)管的顏色變化，記錄結(jié)果。其生化特性應(yīng)與原始種子批一致，即氧化酶陰性，觸酶陽性，發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵蔗糖，吲哚試驗陽性，甲基紅試驗陽性，VP試驗陰性，枸櫞酸鹽利用試驗陰性。分子生物學(xué)鑒定時，提取基礎(chǔ)種子批菌株的質(zhì)粒DNA。以提取的質(zhì)粒DNA為模板，使用特異性引物對p48基因進行PCR擴增。PCR擴增體系和條件同原始種子批的分子生物學(xué)鑒定。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，應(yīng)出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶（p48基因片段大小為[X]bp）。對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的p48基因序列進行比對，同源性應(yīng)達到99%以上。此外，還需對基礎(chǔ)種子批進行無菌檢驗，將菌株接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7天。觀察培養(yǎng)基上是否有雜菌生長，若均無雜菌生長，則表明基礎(chǔ)種子批無菌。2.5.4基礎(chǔ)種子批的最高代次鑒定與保存期測定為確定基礎(chǔ)種子批的最高代次，采用以下方法進行鑒定：從-80℃冰箱中取出一支基礎(chǔ)種子批的凍存管，置于冰上緩慢融化。將融化后的菌液接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)過夜，作為第1代培養(yǎng)物。然后，將第1代培養(yǎng)物按照1:100的比例接種于新鮮的含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜，依次類推，進行連續(xù)傳代培養(yǎng)。在傳代過程中，每隔5代對菌株進行一次形態(tài)學(xué)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定，方法同基礎(chǔ)種子批的鑒定。同時，測定各代菌株的生長特性，包括生長曲線和活菌數(shù)。當菌株的形態(tài)學(xué)、生化特性或分子生物學(xué)鑒定結(jié)果出現(xiàn)異常，或生長特性明顯改變（如生長速度明顯減慢、活菌數(shù)顯著下降等）時，判定該代次為基礎(chǔ)種子批的最高代次。保存期測定與原始種子批類似。從-80℃冰箱中取出基礎(chǔ)種子批的凍存管，置于冰上緩慢融化。將融化后的菌液接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)過夜。然后，將培養(yǎng)后的菌液按照1:100的比例接種于新鮮的含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)3-4小時，至菌液的OD???值達到0.6-0.8。取適量的菌液，進行活菌計數(shù)。每隔3個月進行一次上述操作，對基礎(chǔ)種子批進行定期檢測。在每次檢測時，除了進行活菌計數(shù)外，還需對菌株進行形態(tài)學(xué)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定。記錄每次檢測的結(jié)果，包括活菌數(shù)、菌落形態(tài)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果。當活菌數(shù)下降至初始活菌數(shù)的10%以下，或菌株的形態(tài)學(xué)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果出現(xiàn)異常時，判定基礎(chǔ)種子批已失效。根據(jù)實驗結(jié)果，確定基礎(chǔ)種子批在-80℃冰箱中的保存期。通過實驗，確定了基礎(chǔ)種子批的最高代次為[X]代，在-80℃冰箱中的保存期為[X]個月。在保存期內(nèi)，基礎(chǔ)種子批的菌株能夠保持良好的生物學(xué)特性和遺傳穩(wěn)定性，為后續(xù)的試劑盒生產(chǎn)提供了可靠的菌種來源。2.6標準陰、陽性血清的制備及檢驗2.6.1標準陽性血清的制備標準陽性血清的制備首先需要制備免疫原。將實驗室保存的牛支原體菌株接種于改良的Hayflick培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，待菌液渾濁后，進行傳代培養(yǎng)3-4次，以確保菌株的活性和純度。培養(yǎng)結(jié)束后，4℃、8000r/min離心30分鐘收集菌體。用PBS緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）洗滌菌體3次，每次洗滌后以相同條件離心收集菌體。將洗滌后的菌體用適量的PBS緩沖液重懸，采用超聲波破碎儀進行破碎（功率300W，工作3秒，間隔5秒，總時間10分鐘）。破碎后的菌液4℃、12000r/min離心30分鐘，收集上清液，即為牛支原體全菌抗原，作為免疫原備用。選取體重為20-25kg的健康成年牛，在免疫前采集血液，分離血清，經(jīng)檢測確認無牛支原體抗體。免疫程序如下：首次免疫時，將牛支原體全菌抗原與弗氏完全佐劑按1:1的體積比充分乳化。在牛的頸部兩側(cè)肌肉多點注射乳化后的抗原，每側(cè)注射5mL，共計10mL。首次免疫后14天進行第二次免疫，將牛支原體全菌抗原與弗氏不完全佐劑按1:1的體積比充分乳化。同樣在牛的頸部兩側(cè)肌肉多點注射乳化后的抗原，每側(cè)注射5mL，共計10mL。第二次免疫后14天進行第三次免疫，免疫方法同第二次免疫。第三次免疫后7天，采集牛的頸靜脈血5-10mL，分離血清，采用本研究建立的牛支原體抗體間接血凝檢測方法和膠體金免疫層析檢測方法進行檢測。若抗體效價達到1:128以上，則判定免疫成功，可進行大量采血。大量采血時，采用頸靜脈放血的方法，收集血液于無菌容器中。將血液在室溫下靜置30-60分鐘，待血液凝固后，4℃、3000-4000r/min離心15-20分鐘，分離出血清。將分離出的血清用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝于無菌離心管中，每管1-2mL，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.6.2標準陽性血清的檢驗標準陽性血清的檢驗包括抗體效價測定、特異性檢驗和無菌檢驗等項目。采用本研究建立的牛支原體抗體間接血凝檢測方法，對標準陽性血清進行抗體效價測定。具體操作步驟按照2.3.3間接血凝試驗操作步驟與結(jié)果判定進行。以出現(xiàn)“++”凝集的血清最高稀釋倍數(shù)作為該血清的抗體效價。要求標準陽性血清的抗體效價≥1:256，以確保血清中含有足夠濃度的牛支原體抗體，能夠用于后續(xù)的檢測方法的驗證和質(zhì)量控制。為了檢驗標準陽性血清的特異性，收集牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性腹瀉病、布氏桿菌病、結(jié)核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清各5份。采用本研究建立的牛支原體抗體間接血凝檢測方法和膠體金免疫層析檢測方法，分別用這些陽性血清和標準陽性血清進行檢測。若標準陽性血清對牛支原體檢測結(jié)果為陽性，而對牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性腹瀉病、布氏桿菌病、結(jié)核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清的檢測結(jié)果均為陰性，則表明標準陽性血清具有良好的特異性，能夠準確地與牛支原體抗體發(fā)生反應(yīng)，而不與其他病原體的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。取適量標準陽性血清，分別接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，每天觀察培養(yǎng)基上是否有雜菌生長。若兩種培養(yǎng)基上均無雜菌生長，則判定標準陽性血清無菌，符合質(zhì)量要求。只有經(jīng)過上述檢驗項目且均符合要求的標準陽性血清，才能用于后續(xù)的實驗和檢測工作，以保證實驗結(jié)果的準確性和可靠性。2.6.3標準陰性血清的制備與成品檢驗標準陰性血清的制備同樣需要選擇合適的牛只。選取體重為15-20kg的健康成年牛，這些牛需來自未發(fā)生過牛支原體感染的牛群，且在采集血清前3個月內(nèi)未接種過任何牛支原體疫苗。采集牛的頸靜脈血5-10mL，置于無菌采血管中。將采血管在室溫下靜置30-60分鐘，待血液凝固后，4℃、3000-4000r/min離心15-20分鐘，分離出血清。將分離出的血清用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝于無菌離心管中，每管1-2mL，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。成品檢驗時，首先采用本研究建立的牛支原體抗體間接血凝檢測方法和膠體金免疫層析檢測方法，對標準陰性血清進行檢測。按照相應(yīng)的操作步驟進行檢測，觀察結(jié)果。若檢測結(jié)果均為陰性，則表明標準陰性血清中不含有牛支原體抗體。為了確保標準陰性血清的質(zhì)量，還需進行無菌檢驗。取適量標準陰性血清，分別接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，每天觀察培養(yǎng)基上是否有雜菌生長。若兩種培養(yǎng)基上均無雜菌生長，則判定標準陰性血清無菌。只有經(jīng)過上述檢測且結(jié)果均為陰性、無菌的標準陰性血清，才能作為合格的標準陰性血清用于后續(xù)的實驗和檢測工作，為實驗提供可靠的陰性對照。2.7兩種試劑盒的實驗室試制及質(zhì)量研究2.7.1P48重組蛋白的制備與IHA抗原的試制P48重組蛋白的制備過程嚴格按照之前優(yōu)化的表達和純化條件進行。從基礎(chǔ)種子批中取出凍存的含有重組表達質(zhì)粒pET32a(+)-p48的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，迅速置于37℃水浴中解凍，隨后將其接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)過夜，獲得種子液。次日，按照1:100的比例將種子液接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的TB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD???值達到0.6-0.8。加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)溫度為16℃，誘導(dǎo)時間為16-18小時。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃、8000r/min離心10分鐘收集菌體。將收集的菌體用PBS緩沖液重懸，超聲破碎菌體（功率300W，工作3秒，間隔5秒，總時間10分鐘）。超聲破碎后，4℃、12000r/min離心30分鐘，分別收集上清和沉淀。將上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示重組蛋白主要以可溶性形式存在于上清中。采用鎳柱親和層析法對上清中的重組