基于miRNA表達譜的流感病毒H5N1與16HBE細胞相互作用研究摘要：本研究旨在通過分析miRNA表達譜，深入探究流感病毒H5N1與16HBE（人支氣管上皮樣細胞）的相互作用機制。采用人全基因組芯片和miRNA芯片檢測流感病毒H5N1感染16HBE細胞后的mRNA和miRNA表達譜變化，并進行數(shù)據(jù)分析與初步驗證。結(jié)果顯示，流感病毒H5N1感染16HBE細胞后，多種miRNA的表達水平發(fā)生顯著改變。通過對差異表達miRNA的功能分析，發(fā)現(xiàn)其參與了病毒感染相關(guān)的多個生物學(xué)過程，如免疫反應(yīng)、細胞凋亡等。本研究有助于進一步理解流感病毒感染和致病的分子機理，為開發(fā)新型的流感防治措施提供理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：流感病毒H5N1；16HBE細胞；miRNA表達譜；相互作用一、引言流感病毒是引起人類和動物呼吸道感染的重要病原體，其中H5N1亞型禽流感病毒具有高致病性，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。病毒感染宿主細胞是一個復(fù)雜的過程，涉及病毒與宿主細胞之間的多種相互作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在病毒感染過程中發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子核糖核酸，長度約為18-22個核苷酸，通過與靶mRNA不完全或互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，參與多種生理和病理過程。了解流感病毒H5N1與宿主細胞在miRNA水平上的相互作用，對于深入認識病毒感染機制和開發(fā)有效的防治策略具有重要意義。16HBE細胞系來源于正常人的支氣管上皮組織，后經(jīng)Ad12SV40病毒感染并克隆，常被用于研究呼吸道病毒與宿主細胞的相互作用，本研究以此為細胞模型展開研究。二、材料與方法（一）細胞與病毒16HBE（人支氣管上皮樣細胞）購自上海通蔚實業(yè)有限公司，培養(yǎng)于LCH-8培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。流感病毒H5N1毒株由[病毒來源單位]提供。（二）主要試劑與儀器人全基因組芯片、miRNA芯片購自[芯片供應(yīng)商]；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒等購自[試劑供應(yīng)商]；細胞培養(yǎng)相關(guān)耗材購自[耗材供應(yīng)商]。實時熒光定量PCR儀、芯片掃描儀等儀器購自[儀器制造商]。（三）實驗分組將16HBE細胞分為對照組和感染組，感染組用流感病毒H5N1以一定的感染復(fù)數(shù)（MOI）感染細胞，對照組不做病毒感染處理，正常培養(yǎng)。（四）RNA提取與芯片檢測在病毒感染后特定時間點，分別收集對照組和感染組的16HBE細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA。對提取的RNA進行質(zhì)量檢測后，分別進行人全基因組芯片和miRNA芯片雜交檢測，按照芯片操作手冊進行實驗操作，最后用芯片掃描儀掃描芯片，獲取原始數(shù)據(jù)。（五）數(shù)據(jù)分析利用相關(guān)數(shù)據(jù)分析軟件對芯片原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出差異表達的mRNA和miRNA。差異表達的篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：與對照組相比，感染組中基因表達變化倍數(shù)（foldchange）≥2或≤0.5，且P值＜0.05。對差異表達的miRNA進行靶基因預(yù)測，并結(jié)合差異表達的mRNA進行關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用生物信息學(xué)工具對差異表達miRNA的靶基因進行功能富集分析，包括GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）信號通路富集分析，以確定差異表達miRNA參與的主要生物學(xué)過程和信號通路。（六）實時熒光定量PCR驗證隨機選取部分差異表達的miRNA，設(shè)計特異性引物，采用實時熒光定量PCR方法對芯片檢測結(jié)果進行驗證。以U6作為內(nèi)參基因，按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行反應(yīng)，采用2?ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量，比較實時熒光定量PCR結(jié)果與芯片檢測結(jié)果的一致性。三、結(jié)果（一）流感病毒H5N1感染16HBE細胞后miRNA表達譜變化通過芯片檢測和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)流感病毒H5N1感染16HBE細胞后，共有[X]個miRNA的表達水平發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)表達的miRNA有[X]個，下調(diào)表達的miRNA有[X]個。部分差異表達顯著的miRNA及其表達變化倍數(shù)見表1。[此處插入表1：流感病毒H5N1感染16HBE細胞后部分差異表達顯著的miRNA]（二）差異表達miRNA的靶基因預(yù)測與功能富集分析利用多個靶基因預(yù)測軟件對差異表達的miRNA進行靶基因預(yù)測，共得到[X]個潛在靶基因。對這些靶基因進行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，差異表達miRNA的靶基因主要富集在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、細胞凋亡調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程（圖1）。KEGG信號通路富集分析結(jié)果表明，靶基因顯著富集在Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路等與病毒感染和免疫應(yīng)答相關(guān)的信號通路（圖2）。[此處插入圖1：差異表達miRNA靶基因的GO功能富集分析結(jié)果圖][此處插入圖2：差異表達miRNA靶基因的KEGG信號通路富集分析結(jié)果圖]（三）miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)合差異表達的miRNA及其靶基因預(yù)測結(jié)果，以及差異表達的mRNA數(shù)據(jù)，構(gòu)建了miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)中，每個節(jié)點代表一個miRNA或mRNA，邊表示miRNA與mRNA之間的調(diào)控關(guān)系。通過分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵的miRNA在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，可能在流感病毒H5N1與16HBE細胞相互作用過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。（四）實時熒光定量PCR驗證結(jié)果隨機選取的部分差異表達miRNA的實時熒光定量PCR驗證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果基本一致，表明芯片檢測結(jié)果可靠。以miR-[X]為例，芯片檢測顯示其在感染組中的表達水平較對照組上調(diào)了[X]倍，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示上調(diào)了[X]倍（圖3）。[此處插入圖3：miR-[X]實時熒光定量PCR驗證結(jié)果圖]四、討論本研究通過對流感病毒H5N1感染16HBE細胞后的miRNA表達譜分析，發(fā)現(xiàn)多種miRNA的表達發(fā)生顯著改變，這些差異表達的miRNA參與了病毒感染相關(guān)的多個生物學(xué)過程和信號通路，提示miRNA在流感病毒H5N1與宿主細胞相互作用中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)方面，差異表達miRNA的靶基因富集在Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路等，這些信號通路在機體抗病毒免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。miRNA可能通過調(diào)控這些信號通路中的關(guān)鍵分子，影響宿主細胞的免疫反應(yīng)，從而影響病毒的感染和復(fù)制。例如，某些miRNA可能抑制免疫相關(guān)基因的表達，使宿主細胞的免疫防御功能減弱，有利于病毒的生存和繁殖；而另一些miRNA可能增強免疫反應(yīng)，促進機體對病毒的清除。在細胞凋亡調(diào)控方面，細胞凋亡是宿主細胞抵御病毒感染的一種重要機制。本研究中差異表達miRNA的靶基因參與細胞凋亡調(diào)控過程，說明miRNA可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)基因的表達，影響細胞凋亡的發(fā)生，進而影響病毒與宿主細胞的相互作用。病毒感染可能誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生特定的miRNA，這些miRNA通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，決定細胞是否發(fā)生凋亡。如果細胞過早凋亡，可能限制病毒的復(fù)制；而如果細胞凋亡被抑制，病毒則可能在細胞內(nèi)大量繁殖。此外，本研究構(gòu)建的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為進一步理解流感病毒H5N1與16HBE細胞相互作用的分子機制提供了重要線索。通過分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點miRNA，可以深入研究其在病毒感染過程中的具體調(diào)控功能，為尋找新的抗病毒靶點提供依據(jù)。然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，雖然通過生物信息學(xué)方法預(yù)測了差異表達miRNA的靶基因并進行了功能富集分析，但這些結(jié)果還需要進一步的實驗驗證，以明確miRNA與靶基因之間的直接調(diào)控關(guān)系。其次，本研究僅在體外細胞模型中進行，體內(nèi)環(huán)境更為復(fù)雜，病毒與宿主細胞的相互作用可能受到多種因素的影響，后續(xù)需要開展動物實驗進行深入研究。五、結(jié)論本研究利用miRNA表達譜分析技術(shù)，揭示了流感病毒H5N1感染16HBE細胞后miRNA表達譜的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA參與了免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、細胞凋亡調(diào)控等重要生物學(xué)過程，初步構(gòu)建了miRNA-