基于LAMP技術(shù)的橡膠樹兩大主要根病病原菌精準檢測體系構(gòu)建與應(yīng)用一、引言1.1研究背景與意義橡膠樹（Heveabrasiliensis）作為一種重要的熱帶經(jīng)濟作物，在全球經(jīng)濟發(fā)展中占據(jù)著舉足輕重的地位。全球超過98％的天然橡膠均來源于橡膠樹，其膠乳是生產(chǎn)橡膠制品的主要原料，廣泛應(yīng)用于汽車、交通運輸、工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域，如輪胎、橡膠鞋、橡膠管、膠帶等的制造。除了膠乳，橡膠樹的木材可用于制作家具、建筑材料等；其樹脂能提取橡膠樹樹膠，用于制作膠粘劑、涂料、密封材料等。橡膠樹種植還為眾多地區(qū)的農(nóng)民提供了穩(wěn)定的收入來源，在一些區(qū)域成為重要的經(jīng)濟支柱，創(chuàng)造大量就業(yè)機會，有力地推動了當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展，并且橡膠樹林具有碳匯和生態(tài)價值，能吸收二氧化碳，有助于減緩氣候變化，還可提供棲息地，維護生物多樣性。然而，橡膠樹在生長過程中面臨著多種病害的威脅，其中根病是影響其生長和產(chǎn)量的重要因素之一。根病主要由擔子菌和子囊菌中的多種真菌侵染橡膠樹根系引起，在世界各植膠區(qū)廣泛分布且危害嚴重。我國已發(fā)現(xiàn)7種橡膠樹根病，常見且為害較大的有紅根病、褐根病、臭根病等。這些根病會導(dǎo)致橡膠樹生長衰弱，例如使橡膠樹樹冠稀疏，枯枝增多，頂芽抽不出或抽芽不均勻，樹干干縮等，嚴重時甚至整株死亡，極大地影響了膠乳產(chǎn)量，破壞林相，加重風害損失，給橡膠產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)相關(guān)調(diào)查，在一些地區(qū)的橡膠園，根病發(fā)病率較高，重病區(qū)主要集中在第一代膠園1970年以前種植的老樹，每年因根病死亡的橡膠樹數(shù)量可觀，新增感染根病株數(shù)也較多，不僅影響膠樹生長和產(chǎn)膠，還造成了土地資源的浪費。早期準確檢測出橡膠樹根病病原菌對于病害的有效防控至關(guān)重要。傳統(tǒng)的檢測方法如病癥識別及組織分離病原菌，專業(yè)性強、耗時長、靈敏度低，難以滿足快速診斷和檢測的需求；常規(guī)PCR方法雖然能快速準確檢測病原，但需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統(tǒng)等昂貴的專業(yè)儀器設(shè)備以及專業(yè)實驗人員操作，不適宜在基層和田間大規(guī)模應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP）是近年發(fā)展起來的一種新型核酸擴增技術(shù)。該技術(shù)具有諸多優(yōu)勢，它在恒溫條件下（60℃-65℃）即可快速、高效、特異的擴增靶序列，短時間內(nèi)（30min-60min）可實現(xiàn)大量擴增，擴增倍數(shù)能達到10^9-10^10倍。在反應(yīng)產(chǎn)物中添加熒光染料，可通過顏色變化直接判斷擴增結(jié)果，無需復(fù)雜的電泳等檢測步驟，檢測結(jié)果肉眼可見。而且其特異性和靈敏性高，不需要昂貴儀器設(shè)備，僅需在恒溫水浴鍋內(nèi)即可完成，操作簡便、檢測成本低。目前LAMP技術(shù)已在植保等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，極大提高了鑒定效率和準確率。將LAMP技術(shù)應(yīng)用于橡膠樹根病病原菌的檢測，具有巨大的潛力，有望解決傳統(tǒng)檢測方法的不足，實現(xiàn)橡膠樹根病的早期診斷、病菌的監(jiān)測和鑒定，及時采取科學(xué)有效的防治措施，從而控制橡膠樹褐根病的傳播蔓延，對保障橡膠產(chǎn)業(yè)的健康、穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在橡膠樹根病研究方面，國外對橡膠樹根病的研究開展較早。早在20世紀初，就有關(guān)于橡膠樹褐根病等根病的報道，對根病的病原菌種類、分布范圍、危害癥狀等進行了基礎(chǔ)研究。經(jīng)過長期的研究，已明確了多種根病病原菌，如有害層孔菌（Phellinusnoxius）引起褐根病，在病害流行規(guī)律研究上，通過對不同植膠區(qū)環(huán)境因素與病害發(fā)生關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)高溫高濕的氣候條件有利于根病的發(fā)生和傳播，并且根病在老膠園、管理不善的膠園發(fā)病率更高。在防治技術(shù)上，嘗試了多種化學(xué)藥劑和生物防治手段，化學(xué)藥劑如十三嗎啉等在一定程度上能抑制病原菌生長，但存在環(huán)境污染等問題；生物防治方面，篩選出一些對根病病原菌有拮抗作用的微生物，但實際應(yīng)用效果還需進一步優(yōu)化。國內(nèi)對橡膠樹根病的研究也在不斷深入。我國已發(fā)現(xiàn)7種橡膠樹根病，對常見且危害較大的紅根病、褐根病、臭根病等研究較多。在病原菌鑒定方面，利用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，準確鑒定病原菌種類，如通過對橡膠樹臭根病菌的形態(tài)學(xué)特征觀察及分子生物學(xué)技術(shù)分析，確定其為匐燦球赤殼菌（SphaerostilberepensBerk.&Br.）。在發(fā)病規(guī)律研究上，明確了根病在我國不同植膠區(qū)的發(fā)生特點，像在海南、云南等主要植膠區(qū)，根病的發(fā)生與當?shù)氐臍夂?、土壤條件以及種植管理措施密切相關(guān)，一代膠園根病感染種類主要是褐根病，零星發(fā)生臭根??；二代膠園根病感染種類主要是褐根病、紅根病，零星發(fā)生黑紋根病。在防治措施上，提出了綜合防治策略，包括農(nóng)業(yè)措施如徹底清除雜樹樁、防止病苗上山、加強撫育管理、定期檢查等；化學(xué)防治使用十三嗎啉等藥劑，但存在抗藥性和環(huán)境污染等問題；生物防治方面，篩選生防菌并研究其作用機制，如發(fā)現(xiàn)拮抗生防菌B.subtilisCzk1和化學(xué)復(fù)合殺菌劑“根康”聯(lián)合使用對橡膠樹紅根和褐根病菌具有強抑菌活性和協(xié)同作用。然而，傳統(tǒng)檢測方法如病癥識別及組織分離病原菌，存在專業(yè)性強、耗時長、靈敏度低等問題；常規(guī)PCR方法雖能快速準確檢測病原，但需要昂貴儀器設(shè)備和專業(yè)人員操作，不適宜基層和田間大規(guī)模應(yīng)用。在LAMP技術(shù)應(yīng)用于植物病原菌檢測的研究上，近年來取得了顯著進展。該技術(shù)最早由日本學(xué)者Notomi等在2000年開發(fā)，因其獨特的優(yōu)勢，迅速在植物病原菌檢測領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。在農(nóng)作物病原菌檢測方面，已成功建立了針對多種病原菌的LAMP檢測方法，如水稻紋枯病菌（RhizoctoniasolaniAG1-IA）和稻曲病菌（Ustilaginoideavirens）的LAMP檢測體系，能夠快速、準確地檢測出病原菌，比傳統(tǒng)檢測方法更高效、靈敏。在果樹病毒病檢測中，LAMP技術(shù)也發(fā)揮了重要作用，用于檢測蘋果、番木瓜、櫻桃、葡萄、西番蓮等果樹的病毒病，實現(xiàn)了早期診斷和防控。在植物炭疽菌檢測方面，已建立了大豆炭疽病菌（C.truncatum）、辣椒炭疽病菌（C.capsici）、草莓炭疽病菌（C.gloeosporioides和C.acutatum）、番石榴炭疽病菌（C.gloeosporioides）等的LAMP檢測方法。對于橡膠樹病原菌檢測，已成功開發(fā)出用于檢測橡膠樹膠孢炭疽菌的LAMP引物組及檢測方法，可區(qū)分膠孢炭疽菌和其他炭疽菌，靈敏度高，能檢測到膠孢炭疽菌1pg的DNA和100個孢子。但目前國內(nèi)外關(guān)于LAMP技術(shù)應(yīng)用于橡膠樹根病病原菌檢測的研究相對較少，尤其是針對橡膠樹兩種主要根病病原菌同時檢測的LAMP技術(shù)研究尚未見報道。1.3研究目標與內(nèi)容1.3.1研究目標本研究旨在建立針對橡膠樹兩種主要根病病原菌（如褐根病病原菌有害層孔菌和臭根病病原菌匐燦球赤殼菌）的LAMP檢測技術(shù)體系，優(yōu)化反應(yīng)條件，篩選特異性引物，實現(xiàn)對病原菌的快速、準確檢測。通過對建立的LAMP檢測技術(shù)體系進行特異性、靈敏性、重復(fù)性等性能驗證，確保該技術(shù)在橡膠樹根病病原菌檢測中的可靠性和有效性，為橡膠樹根病的早期診斷和防控提供技術(shù)支持。將建立的LAMP檢測技術(shù)應(yīng)用于田間橡膠樹樣本的檢測，驗證其在實際生產(chǎn)中的可行性和實用性，及時發(fā)現(xiàn)田間病原菌的侵染情況，為制定科學(xué)合理的防治措施提供依據(jù)。1.3.2研究內(nèi)容收集不同地區(qū)橡膠樹褐根病和臭根病病株樣本，采用組織分離法從病根組織中分離病原菌，利用形態(tài)學(xué)特征初步鑒定病原菌種類，再通過分子生物學(xué)方法如PCR擴增核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列并測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，準確鑒定病原菌種類，建立病原菌菌株庫，為后續(xù)研究提供材料。根據(jù)已鑒定的橡膠樹兩種主要根病病原菌的保守基因序列，如褐根病病原菌有害層孔菌的β-微管蛋白基因、臭根病病原菌匐燦球赤殼菌的翻譯延伸因子-1α基因等，利用LAMP引物設(shè)計軟件（如PrimerExplorerV5）設(shè)計特異性引物，每組引物包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP，必要時設(shè)計環(huán)引物LF、LB，以提高擴增效率和特異性。通過單因素試驗，優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系中的關(guān)鍵因素，如引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、甜菜堿濃度、BstDNA聚合酶用量等；優(yōu)化反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，以獲得最佳的擴增效果。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察是否出現(xiàn)特征性的梯狀條帶；添加熒光染料（如SYBRGreenI），通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化判斷擴增結(jié)果，綠色為陽性，橙色為陰性。以橡膠樹其他常見病原菌（如炭疽病菌、白粉病菌等）及健康橡膠樹組織DNA為模板，進行LAMP擴增，驗證所建立檢測體系的特異性，確保該體系只對目標根病病原菌有擴增反應(yīng)，而對其他非目標病原菌及健康組織無擴增。將目標病原菌DNA進行10倍梯度稀釋，以不同稀釋度的DNA為模板進行LAMP擴增，與常規(guī)PCR方法進行對比，確定該檢測體系的最低檢測限，評估其靈敏性。對同一模板進行多次重復(fù)的LAMP擴增，分析擴增結(jié)果的一致性，評估該檢測體系的重復(fù)性；在不同時間、不同實驗人員條件下進行LAMP擴增，檢驗該檢測體系的穩(wěn)定性。采集田間橡膠樹疑似根病病株樣本，采用所建立的LAMP檢測技術(shù)進行病原菌檢測，同時與傳統(tǒng)檢測方法（如病癥識別及組織分離病原菌、常規(guī)PCR方法）進行對比，驗證該技術(shù)在田間檢測的準確性和可靠性。對不同地區(qū)、不同林齡、不同種植管理條件下的橡膠園進行大規(guī)模田間檢測，分析橡膠樹兩種主要根病病原菌的分布情況和發(fā)生規(guī)律，為病害防控提供數(shù)據(jù)支持。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法本研究將采用組織分離法從橡膠樹病株樣本中分離病原菌，利用形態(tài)學(xué)特征初步鑒定病原菌種類，再結(jié)合分子生物學(xué)方法如PCR擴增核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列并測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，準確鑒定病原菌種類。根據(jù)病原菌的保守基因序列，利用LAMP引物設(shè)計軟件（如PrimerExplorerV5）設(shè)計特異性引物，通過單因素試驗優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系中的關(guān)鍵因素，如引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、甜菜堿濃度、BstDNA聚合酶用量等；優(yōu)化反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察是否出現(xiàn)特征性的梯狀條帶；添加熒光染料（如SYBRGreenI），通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化判斷擴增結(jié)果。以橡膠樹其他常見病原菌及健康橡膠樹組織DNA為模板，進行LAMP擴增，驗證檢測體系的特異性；將目標病原菌DNA進行10倍梯度稀釋，以不同稀釋度的DNA為模板進行LAMP擴增，與常規(guī)PCR方法進行對比，確定檢測體系的最低檢測限，評估其靈敏性；對同一模板進行多次重復(fù)的LAMP擴增，分析擴增結(jié)果的一致性，評估檢測體系的重復(fù)性；在不同時間、不同實驗人員條件下進行LAMP擴增，檢驗檢測體系的穩(wěn)定性。采集田間橡膠樹疑似根病病株樣本，采用所建立的LAMP檢測技術(shù)進行病原菌檢測，同時與傳統(tǒng)檢測方法（如病癥識別及組織分離病原菌、常規(guī)PCR方法）進行對比，驗證該技術(shù)在田間檢測的準確性和可靠性；對不同地區(qū)、不同林齡、不同種植管理條件下的橡膠園進行大規(guī)模田間檢測，分析橡膠樹兩種主要根病病原菌的分布情況和發(fā)生規(guī)律。1.4.2技術(shù)路線首先進行樣本采集與病原菌分離鑒定，在海南、云南等主要橡膠種植區(qū)，選取不同林齡、不同品種的橡膠樹種植園，采集具有典型褐根病和臭根病癥狀的病株樣本，包括病根、病莖等組織，同時采集健康橡膠樹組織作為對照樣本。將采集的樣本及時帶回實驗室，采用組織分離法，在無菌條件下，將病根組織切成小塊，放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌絲后，進行純化培養(yǎng)，獲得單菌落。對分離得到的病原菌進行形態(tài)學(xué)鑒定，觀察菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地，菌絲的形態(tài)、粗細、分支情況，以及孢子的形態(tài)、大小、顏色等特征，初步判斷病原菌種類。利用分子生物學(xué)方法進一步準確鑒定病原菌，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA，以提取的DNA為模板，利用通用引物擴增核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，將擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，根據(jù)比對結(jié)果確定病原菌的種類，建立病原菌菌株庫。接著進行LAMP引物設(shè)計與反應(yīng)體系優(yōu)化，根據(jù)已鑒定的橡膠樹褐根病病原菌有害層孔菌和臭根病病原菌匐燦球赤殼菌的保守基因序列，如有害層孔菌的β-微管蛋白基因、匐燦球赤殼菌的翻譯延伸因子-1α基因等，利用LAMP引物設(shè)計軟件PrimerExplorerV5設(shè)計特異性引物。每組引物包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP，必要時設(shè)計環(huán)引物LF、LB。以病原菌DNA為模板，進行LAMP反應(yīng)，通過單因素試驗，分別優(yōu)化引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、甜菜堿濃度、BstDNA聚合酶用量等反應(yīng)體系關(guān)鍵因素，以及反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等反應(yīng)條件。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察是否出現(xiàn)特征性的梯狀條帶；添加熒光染料SYBRGreenI，通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化判斷擴增結(jié)果，綠色為陽性，橙色為陰性，確定最佳的LAMP反應(yīng)體系和條件。然后進行LAMP檢測技術(shù)體系性能驗證，以橡膠樹其他常見病原菌（如炭疽病菌、白粉病菌等）及健康橡膠樹組織DNA為模板，進行LAMP擴增，驗證所建立檢測體系的特異性，確保該體系只對目標根病病原菌有擴增反應(yīng)，而對其他非目標病原菌及健康組織無擴增。將目標病原菌DNA進行10倍梯度稀釋，從10-1ng/μL稀釋至10-9ng/μL，以不同稀釋度的DNA為模板進行LAMP擴增，同時以常規(guī)PCR方法作為對照，確定該檢測體系的最低檢測限，評估其靈敏性。對同一模板進行多次（如3次）重復(fù)的LAMP擴增，分析擴增結(jié)果的一致性，評估該檢測體系的重復(fù)性；在不同時間（如間隔1周、2周）、不同實驗人員條件下進行LAMP擴增，檢驗該檢測體系的穩(wěn)定性。最后進行田間應(yīng)用與數(shù)據(jù)分析，在海南、云南等地的橡膠種植園，采集不同地區(qū)、不同林齡、不同種植管理條件下的橡膠樹疑似根病病株樣本，采用所建立的LAMP檢測技術(shù)進行病原菌檢測，同時采用傳統(tǒng)檢測方法（如病癥識別及組織分離病原菌、常規(guī)PCR方法）對樣本進行檢測。對比LAMP檢測技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法的檢測結(jié)果，驗證該技術(shù)在田間檢測的準確性和可靠性。對大規(guī)模田間檢測數(shù)據(jù)進行分析，采用統(tǒng)計學(xué)方法，分析橡膠樹兩種主要根病病原菌的分布情況和發(fā)生規(guī)律，如不同地區(qū)、不同林齡、不同種植管理條件下病原菌的感染率差異等，為病害防控提供數(shù)據(jù)支持。二、橡膠樹根病概述2.1橡膠樹的經(jīng)濟價值與種植現(xiàn)狀橡膠樹作為一種重要的熱帶經(jīng)濟作物，具有極高的經(jīng)濟價值。其產(chǎn)生的天然橡膠是眾多工業(yè)產(chǎn)品不可或缺的原料，在汽車工業(yè)中，天然橡膠用于制造輪胎、密封件、減震器等部件，確保汽車的安全行駛和舒適性能。據(jù)統(tǒng)計，一輛普通汽車大約需要消耗20千克的天然橡膠用于輪胎制造，在航空航天領(lǐng)域，橡膠制品用于制造飛機的輪胎、密封件、油管等部件，滿足航空航天設(shè)備對高性能材料的嚴格要求。在醫(yī)療領(lǐng)域，天然橡膠制成的手套、導(dǎo)管、注射器等一次性醫(yī)療器械，廣泛應(yīng)用于臨床診斷和治療過程中。日常生活中，橡膠制品也隨處可見，如橡膠鞋底具有良好的防滑和耐磨性能，為人們的行走提供安全保障；橡膠手套則廣泛應(yīng)用于家務(wù)勞動和工業(yè)操作中，保護手部免受傷害。從全球范圍來看，橡膠樹主要種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，如東南亞、非洲、南美洲等地。東南亞地區(qū)是全球最大的橡膠生產(chǎn)區(qū)，泰國、印度尼西亞和馬來西亞是該地區(qū)的主要橡膠生產(chǎn)國。泰國的橡膠產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的33.46%，種植區(qū)域廣泛分布在南部、東部和東北部地區(qū)，擁有先進的種植技術(shù)和完善的產(chǎn)業(yè)鏈。印度尼西亞的橡膠產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的21.86%，種植區(qū)域集中在蘇門答臘島和加里曼丹島，其橡膠種植歷史悠久，種植面積不斷擴大。非洲的科特迪瓦是非洲最大的天然橡膠生產(chǎn)國，擁有約75萬公頃的橡膠種植園，大型種植園面積為500-800公頃，該國的橡膠產(chǎn)業(yè)對當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展起到了重要的推動作用。在我國，橡膠樹主要種植在海南、云南和廣東等地。海南的橡膠種植面積約為840萬畝，占全國橡膠種植總面積的46.67%，產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的39.02%。海南的氣候條件優(yōu)越，全年高溫多雨，非常適合橡膠樹的生長，當?shù)氐南鹉z種植技術(shù)也較為成熟，擁有眾多的橡膠種植企業(yè)和專業(yè)合作社。云南的橡膠種植面積約為900萬畝，占全國橡膠種植總面積的50%，產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的59.2%。云南的西雙版納、普洱等地是橡膠樹的主要種植區(qū)域，當?shù)卣e極推動橡膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，加大對橡膠種植技術(shù)研發(fā)和推廣的投入。廣東的橡膠種植面積相對較小，約為60萬畝，占全國橡膠種植總面積的3.33%，但當?shù)氐南鹉z種植也具有一定的特色，注重品種選育和精細化管理。2023年，中國天然橡膠產(chǎn)量為89.73萬噸，同比增長4.14%，隨著種植技術(shù)的不斷改進和管理水平的提高，我國的橡膠產(chǎn)量有望進一步增加。2.2橡膠樹根病種類及危害橡膠樹在生長過程中易受到多種根病的侵襲，這些根病對橡膠樹的生長、產(chǎn)量和壽命產(chǎn)生了嚴重的影響。我國已發(fā)現(xiàn)7種橡膠樹根病，常見且為害較大的有紅根病、褐根病、臭根病等。紅根病是由橡膠靈芝菌（Ganodermapseudoferreum）和菲律賓靈芝（Ganodermaphilippii）引起的一種嚴重的根部病害。該病害具有潛伏期長、寄主范圍廣、在土壤中蔓延迅速和防治困難的特點。病原菌主要通過病根與健康根的接觸或土壤中的菌絲體傳播，侵染橡膠樹的根系。發(fā)病初期，橡膠樹的樹冠會逐漸變得稀疏，枯枝增多，頂芽難以抽出或抽芽不均勻。隨著病情的發(fā)展，樹干會出現(xiàn)干縮現(xiàn)象，橡膠樹的生長受到嚴重抑制。病根的表皮會形成紅色或棗紅色的菌膜，這是紅根病的典型癥狀之一。在我國海南、云南、廣東等各植膠區(qū)，紅根病均普遍發(fā)生，尤其在海南屯昌市、儋州市和云南河口縣等地部分林段的膠林，紅根病發(fā)病率可達40%，未進行預(yù)防處理的幼樹區(qū)發(fā)病率更是高達60%。若不及時處理，橡膠樹的死亡率可達100%，給橡膠產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。褐根病的病原菌為有害層孔菌（Phellinusnoxius），它通過孢子傳播，可從橡膠樹的傷口或幼根侵入。發(fā)病時，病根表面呈現(xiàn)鐵銹色，覆蓋著疏松絨毛狀的菌絲和薄而脆的黑褐色菌膜。橡膠樹感染褐根病后，生長會變得衰弱，膠乳產(chǎn)量大幅下降。在一些地區(qū)，褐根病在一代膠園中的發(fā)病率較高，嚴重影響了橡膠樹的生長和產(chǎn)膠。臭根病由匐燦球赤殼菌（SphaerostilberepensBerk.&Br.）引起，病菌以菌絲體或分生孢子在病殘體或土壤中越冬，通過雨水、灌溉水、農(nóng)事操作等傳播。病根表面無菌絲菌膜，有時會出現(xiàn)粉紅色孢梗束。受臭根病侵害的橡膠樹，根系功能受損，導(dǎo)致植株生長不良，嚴重時可導(dǎo)致整株死亡。這些根病不僅會導(dǎo)致橡膠樹生長衰弱，影響膠乳產(chǎn)量，還會造成橡膠樹整株死亡，破壞林相，加重風害損失，給橡膠產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，對橡膠樹根病的防治至關(guān)重要，而準確、快速的檢測技術(shù)是有效防治根病的前提。2.3紅根病與褐根病病原菌特征紅根病病原菌主要為橡膠靈芝菌（Ganodermapseudoferreum）和菲律賓靈芝（Ganodermaphilippii）。在形態(tài)特征方面，橡膠靈芝菌的子實體多年生，無柄，木質(zhì)，菌蓋呈半圓形、近扇形或不規(guī)則形，表面初期有細絨毛，后變光滑，呈銹褐色至黑褐色，具不明顯的同心環(huán)帶和輻射狀皺紋，邊緣薄而銳，常近似截形；菌肉呈淡褐色至褐色，厚0.5-1.5厘米；菌管多層，層次不明顯，與菌肉同色，長0.5-1厘米；管口面淡褐色至深褐色，管口近圓形，每毫米4-6個。菲律賓靈芝的子實體同樣多年生，無柄，木質(zhì)，菌蓋形狀多樣，有半圓形、近圓形或不規(guī)則形，表面具硬而光滑的皮殼，呈紅褐色至黑褐色，具明顯的同心環(huán)帶和輻射狀皺紋，邊緣鈍或稍薄；菌肉呈淡褐色至深褐色，厚0.3-1厘米；菌管多層，層次較明顯，與菌肉同色，長0.3-0.8厘米；管口面淡褐色至深褐色，管口近圓形，每毫米4-5個。從生理生化特性來看，橡膠靈芝菌對溫度、pH等適應(yīng)范圍廣，溫度在13-31℃，pH在3-10均能生長，最適生長溫度為28℃，多數(shù)菌株最佳pH為7-9。該菌能利用多種碳氮源，在不同的碳源中，果糖、半乳糖、麥芽糖、葡萄糖和甘露糖較適合其生長；在供試氮源中，菌絲在酪氨酸、牛肉浸膏的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長最快，在色氨酸和尿素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長最慢。光照對病菌有抑制作用，黑暗有利于菌絲生長；菌絲的致死溫度為47℃，10min。紅根病病原菌的致病機制主要是通過菌絲體在橡膠樹根系內(nèi)生長蔓延，分泌一系列細胞壁降解酶，如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等，破壞根系細胞的細胞壁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外泄，根系組織壞死。病原菌還能產(chǎn)生毒素，如靈芝酸等，干擾橡膠樹的正常生理代謝過程，影響植株的生長和發(fā)育，降低其抗病能力。褐根病病原菌為有害層孔菌（Phellinusnoxius）。其形態(tài)特征表現(xiàn)為子實體多年生，無柄，木質(zhì)，菌蓋呈半圓形、馬蹄形或不規(guī)則形，表面初期有細絨毛，后變光滑，呈銹褐色至黑褐色，具明顯的同心環(huán)帶和輻射狀皺紋，邊緣鈍或稍??；菌肉呈淡褐色至深褐色，厚0.5-2厘米；菌管多層，層次明顯，與菌肉同色，長0.5-1.5厘米；管口面淡褐色至深褐色，管口近圓形，每毫米3-5個。有害層孔菌在生理生化特性上，生長適宜溫度范圍為25-30℃，最適溫度為28℃，在pH值為5-8的環(huán)境中均能較好生長，最適pH值為6-7。該菌能利用多種碳源，如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等，對氮源的利用以有機氮源較好，如蛋白胨、牛肉浸膏等。光照對其生長影響較小。褐根病病原菌的致病機制是通過孢子傳播，從橡膠樹的傷口或幼根侵入后，在根系內(nèi)大量繁殖，菌絲體在皮層和木質(zhì)部之間蔓延，形成一層鐵銹色的菌絲層，阻礙水分和養(yǎng)分的運輸。病原菌分泌的酶類和毒素破壞根系細胞結(jié)構(gòu)和生理功能，導(dǎo)致根系腐爛，最終使橡膠樹生長衰弱，甚至死亡。三、LAMP檢測技術(shù)原理與優(yōu)勢3.1LAMP技術(shù)基本原理環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP）是由日本學(xué)者Notomi等人于2000年開發(fā)的一種新型核酸擴增技術(shù)。其原理基于對靶基因6個特定區(qū)域設(shè)計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶（BstDNApolymerase）的作用下，在恒溫條件（一般為60-65℃）下實現(xiàn)核酸的快速擴增。在LAMP反應(yīng)中，這4種引物分別為外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP。外引物F3和B3的作用是啟動擴增反應(yīng)，內(nèi)引物FIP和BIP則在擴增過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，F(xiàn)IP由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補，F(xiàn)1c區(qū)與靶基因5’端的F1c區(qū)域序列相同；BIP由B1c和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補，B1c區(qū)域與靶基因5’端的B1c區(qū)域序列相同。擴增反應(yīng)起始時，雙鏈DNA在65℃左右的恒溫條件下處于動態(tài)平衡狀態(tài)。F3引物與靶基因的F3c區(qū)域互補結(jié)合，在BstDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，從F3引物的3’端開始合成新的DNA鏈，同時置換出原來的互補鏈。接著，F(xiàn)IP引物中的F2區(qū)與被置換出的單鏈DNA上的F2c區(qū)域互補結(jié)合，在BstDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，從FIP引物的3’端開始合成新的DNA鏈，形成啞鈴狀的中間體。這個啞鈴狀中間體的兩端分別含有F1c和B1c區(qū)域，它們可以通過自身折疊形成環(huán)結(jié)構(gòu)。在后續(xù)的循環(huán)擴增階段，B3引物與啞鈴狀中間體上的B3c區(qū)域互補結(jié)合，在BstDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈，置換出原來的互補鏈。此時，BIP引物中的B2區(qū)與被置換出的單鏈DNA上的B2c區(qū)域互補結(jié)合，繼續(xù)合成新的DNA鏈，形成新的啞鈴狀中間體。隨著擴增反應(yīng)的不斷進行，大量的啞鈴狀中間體不斷生成和擴增，最終產(chǎn)生具有不同個莖環(huán)結(jié)構(gòu)、多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA混合物，這些產(chǎn)物即為擴增靶序列的交替反向重復(fù)序列。在DNA合成過程中，從脫氧核酸三磷酸基質(zhì)（dNTPs）中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，會產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色，可作為反應(yīng)指標，通過肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否。3.2LAMP技術(shù)反應(yīng)特點LAMP技術(shù)具有一系列獨特的反應(yīng)特點，使其在眾多核酸擴增技術(shù)中脫穎而出。操作簡單是LAMP技術(shù)的顯著優(yōu)勢之一。它不需要復(fù)雜的熱循環(huán)設(shè)備，如傳統(tǒng)PCR技術(shù)所依賴的PCR儀。在LAMP反應(yīng)中，只需將反應(yīng)液、酶和模板混合于反應(yīng)管中，置于恒溫水浴鍋或恒溫箱中，在60-65℃的恒溫條件下即可進行擴增反應(yīng)。這一過程無需專業(yè)的實驗技能和復(fù)雜的操作流程，普通技術(shù)人員經(jīng)過簡單培訓(xùn)就能熟練掌握，極大地降低了操作門檻，使得該技術(shù)能夠在基層實驗室、野外現(xiàn)場等條件相對簡陋的環(huán)境中廣泛應(yīng)用。LAMP技術(shù)的特異性極強。它針對靶基因的6個不同區(qū)域設(shè)計4種特異引物，這些引物能夠精準地識別靶基因的特定區(qū)域。在擴增過程中，只有當引物與靶基因的相應(yīng)區(qū)域完全匹配時，擴增反應(yīng)才能順利進行。這種高度的特異性有效避免了非特異性擴增的發(fā)生，大大提高了檢測結(jié)果的準確性。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，LAMP技術(shù)在引物設(shè)計上更加精細，能夠更準確地區(qū)分不同的病原菌或基因序列。在檢測橡膠樹的病原菌時，LAMP技術(shù)能夠準確地識別出目標病原菌的基因序列，而不會對其他非目標病原菌或健康組織的DNA產(chǎn)生擴增反應(yīng)，從而為橡膠樹病害的診斷提供了可靠的依據(jù)。該技術(shù)的靈敏度極高，能夠檢測到極低含量的靶核酸。研究表明，LAMP技術(shù)的靈敏度比傳統(tǒng)的PCR方法高2-5個數(shù)量級。在檢測橡膠樹病原菌時，即使樣本中病原菌的含量極少，LAMP技術(shù)也能夠通過對靶核酸的高效擴增，實現(xiàn)對病原菌的檢測。通過對橡膠樹病株樣本的檢測，LAMP技術(shù)能夠檢測到傳統(tǒng)檢測方法難以察覺的微量病原菌，為病害的早期診斷提供了有力的支持。LAMP技術(shù)的反應(yīng)速度迅速。在適宜的條件下，它可在30-60分鐘內(nèi)完成擴增反應(yīng)并獲得結(jié)果。這一快速的擴增速度使得LAMP技術(shù)能夠在短時間內(nèi)對大量樣本進行檢測，滿足了快速診斷的需求。在橡膠樹病害的監(jiān)測和防控中，快速的檢測結(jié)果能夠幫助種植者及時采取防治措施，有效控制病害的傳播和蔓延。在橡膠園發(fā)生病害時，利用LAMP技術(shù)能夠在短時間內(nèi)對大量疑似病株進行檢測，快速確定病害的發(fā)生情況，為及時采取防治措施爭取寶貴的時間。成本低也是LAMP技術(shù)的一大優(yōu)勢。它不需要昂貴的PCR儀等專業(yè)設(shè)備，僅需恒溫水浴鍋或恒溫箱等簡單設(shè)備即可完成反應(yīng)。LAMP技術(shù)的試劑成本相對較低，這使得其檢測成本大幅降低。對于大規(guī)模的橡膠樹病害檢測來說，成本的降低具有重要的意義，能夠使更多的種植者受益。在橡膠園的日常監(jiān)測中，采用LAMP技術(shù)進行病原菌檢測，能夠在保證檢測準確性的前提下，降低檢測成本，提高經(jīng)濟效益。LAMP技術(shù)的產(chǎn)物檢測簡便。在DNA合成過程中，從脫氧核酸三磷酸基質(zhì)（dNTPs）中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，會產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色，通過肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否。也可在反應(yīng)體系中添加熒光染料（如SYBRGreenI），根據(jù)反應(yīng)液顏色變化判斷擴增結(jié)果，綠色為陽性，橙色為陰性。這種簡便的檢測方法無需復(fù)雜的電泳和紫外觀察等步驟，節(jié)省了時間和成本。在實際應(yīng)用中，檢測人員可以直接通過肉眼觀察反應(yīng)管中的顏色變化或沉淀情況，快速判斷檢測結(jié)果，操作簡單便捷。3.3LAMP技術(shù)在植物病原菌檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀LAMP技術(shù)憑借其獨特的優(yōu)勢，在植物病原菌檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在農(nóng)作物病原菌檢測方面，LAMP技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的潛力。在水稻病害檢測中，科研人員成功建立了針對水稻紋枯病菌（RhizoctoniasolaniAG1-IA）和稻曲病菌（Ustilaginoideavirens）的LAMP檢測體系。通過對水稻病株樣本的檢測，該體系能夠快速、準確地檢測出病原菌，為水稻病害的早期診斷和防治提供了有力支持。與傳統(tǒng)檢測方法相比，LAMP技術(shù)檢測水稻紋枯病菌和稻曲病菌的時間從數(shù)天縮短至1小時以內(nèi)，檢測靈敏度提高了10-100倍。在果樹病毒病檢測中，LAMP技術(shù)也發(fā)揮了重要作用。蘋果、番木瓜、櫻桃、葡萄、西番蓮等果樹的病毒病檢測中，LAMP技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。在蘋果病毒病檢測中，利用LAMP技術(shù)能夠快速檢測出蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖痘病毒等多種病毒。研究表明，LAMP技術(shù)檢測蘋果病毒病的靈敏度比傳統(tǒng)PCR方法高10-100倍，且檢測時間更短，僅需30-60分鐘。在植物炭疽菌檢測方面，LAMP技術(shù)同樣取得了顯著成果。大豆炭疽病菌（C.truncatum）、辣椒炭疽病菌（C.capsici）、草莓炭疽病菌（C.gloeosporioides和C.acutatum）、番石榴炭疽病菌（C.gloeosporioides）等的LAMP檢測方法已被成功建立。在檢測大豆炭疽病菌時，LAMP技術(shù)能夠在60℃恒溫條件下，30-60分鐘內(nèi)完成擴增反應(yīng)，檢測靈敏度可達10-100fg/μL，比傳統(tǒng)PCR方法高10-100倍。然而，LAMP技術(shù)在實際應(yīng)用中也存在一些問題。引物設(shè)計難度較大是LAMP技術(shù)面臨的主要問題之一。由于LAMP技術(shù)需要針對靶基因的6個不同區(qū)域設(shè)計4種特異引物，引物設(shè)計的難度較大，需要耗費大量的時間和精力。若引物設(shè)計不合理，會導(dǎo)致擴增效率低下或出現(xiàn)非特異性擴增，影響檢測結(jié)果的準確性。在檢測某些植物病原菌時，由于病原菌的基因序列復(fù)雜，引物設(shè)計困難，導(dǎo)致LAMP檢測體系的建立受到限制。LAMP技術(shù)的檢測結(jié)果易受污染影響。LAMP技術(shù)的靈敏度極高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國內(nèi)大多數(shù)實驗室不能嚴格分區(qū)，假陽性問題比較嚴重。在實際檢測過程中，若操作不當，如樣本交叉污染、試劑污染等，會導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性，影響檢測結(jié)果的可靠性。針對這些問題，研究人員也提出了一些解決方法。在引物設(shè)計方面，利用生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫，結(jié)合病原菌的基因序列特征，進行引物設(shè)計和篩選，能夠提高引物的特異性和擴增效率。對引物進行優(yōu)化和驗證，通過實驗確定最佳的引物濃度和反應(yīng)條件，也能提高LAMP檢測體系的性能。為了減少檢測結(jié)果受污染的影響，采用閉管檢測技術(shù)，如實時濁度儀檢測、熒光定量檢測等，能夠避免開蓋造成的氣溶膠污染，提高檢測結(jié)果的準確性。加強實驗室管理，嚴格分區(qū)操作，規(guī)范實驗流程，也能有效減少污染的發(fā)生。四、橡膠樹紅根病病原菌的LAMP檢測技術(shù)研究4.1材料與方法4.1.1供試菌株本研究選用的橡膠樹紅根病病原菌菌株，來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所的菌種保藏庫。這些菌株分別采自海南、云南等主要橡膠種植區(qū)的病株，包括Gp002、Gp010、Gp013、Gp038、Gp040和Gp044等菌株。其中，菌株Gp010屬于G.gibbosum種群，其余菌株均為G.philippii種群。同時，選取橡膠樹炭疽病菌、白粉病菌等其他常見病原菌以及健康橡膠樹組織作為對照材料，用于后續(xù)的特異性驗證實驗。4.1.2菌株培養(yǎng)將橡膠樹紅根病病原菌菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落生長良好后，挑取邊緣整齊的菌絲塊，轉(zhuǎn)接至新鮮的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，密切觀察菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地等特征，并定期記錄。經(jīng)過多次純化培養(yǎng)，獲得生長狀態(tài)一致、純度較高的病原菌菌株，用于后續(xù)實驗。4.1.3實驗所需試劑、儀器及耗材實驗所需的主要試劑包括DNA提取試劑盒（如OmegaBio-tek公司的E.Z.N.A.soil試劑盒）、dNTPs、MgSO4、甜菜堿、BstDNA聚合酶、10×Bst-DNApolymerasebuffer、SYBRGreenI熒光染料等。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。儀器設(shè)備主要有高速離心機（如Eppendorf5424R型離心機）、恒溫水浴鍋（如上海一恒科學(xué)儀器有限公司的HH-4型恒溫水浴鍋）、PCR儀（如ABIVeriti96-wellThermalCycler）、凝膠成像系統(tǒng)（如Bio-RadGelDocXR+成像系統(tǒng)）、電子天平（如梅特勒-托利多AL204型電子天平）等。耗材包括1.5mL離心管、PCR管、移液器吸頭、瓊脂糖凝膠電泳槽、梳子、三角瓶、培養(yǎng)皿等，均為無菌耗材。4.1.4基因組DNA提取及ITS重組質(zhì)粒構(gòu)建采用CTAB法提取橡膠樹紅根病病原菌的基因組DNA。具體步驟如下：取適量培養(yǎng)好的病原菌菌絲，放入研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入600μL預(yù)熱至65℃的CTAB提取緩沖液，充分混勻。65℃水浴30min，期間每隔10min輕輕顛倒混勻一次。加入等體積的***仿-異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻10min，12000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，放置于-20℃冰箱中30min，使DNA沉淀。12000r/min離心10min，棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，風干。加入50μLTE緩沖液溶解DNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。以提取的病原菌基因組DNA為模板，利用通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴增核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物ITS1和ITS4（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH2O17.3μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用膠回收試劑盒（如OmegaBio-tek公司的GelExtractionKit）回收目的片段。將回收的ITS片段與pMD18-T載體（TaKaRa公司）連接，連接體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL，回收的ITS片段4μL，SolutionI5μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有氨芐青霉素（Amp）的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行PCR鑒定，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，確認無誤后，提取重組質(zhì)粒，于-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.5LAMP引物設(shè)計與合成根據(jù)橡膠樹紅根病病原菌的保守基因序列，利用LAMP引物設(shè)計軟件PrimerExplorerV5設(shè)計特異性引物。針對橡膠靈芝菌（Ganodermapseudoferreum）和菲律賓靈芝（Ganodermaphilippii），分別設(shè)計了多組引物。每組引物包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP，其中FIP由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，BIP由B1c和B2區(qū)域組成。為提高擴增效率和特異性，還設(shè)計了環(huán)引物LF、LB。引物序列如下表所示：引物名稱序列（5’-3’）F3ACGCTACGAGCTGAGCTACB3TGCTGACGACGACGACGTAFIPCCGACGACGACGACGACGAACGCTACGAGCTGAGCTACBIPGACGACGACGACGACGACGTGCTGACGACGACGACGTALFCGACGACGACGACGACGACLBGACGACGACGACGACGACG引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后用無菌水稀釋至100μmol/L，于-20℃保存?zhèn)溆?。在進行LAMP反應(yīng)前，將引物稀釋至所需濃度。4.2LAMP引物組篩選以提取的橡膠樹紅根病病原菌基因組DNA為模板，對設(shè)計合成的多組LAMP引物進行篩選。LAMP反應(yīng)體系為25μL，包括10×Bst-DNApolymerasebuffer2.5μL，dNTPs（10mmol/L）3.5μL，MgSO4（25mmol/L）4μL，甜菜堿（10mol/L）2μL，BstDNA聚合酶（8U/μL）1μL，模板DNA1μL，引物F3（2.5μmol/L）、B3（2.5μmol/L）各2μL，F(xiàn)IP（20μmol/L）、BIP（20μmol/L）各1.5μL，ddH2O4μL。反應(yīng)條件設(shè)置為：63℃溫育60min，85℃滅活8min，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察是否出現(xiàn)LAMP特征性的梯狀條帶。同時，在反應(yīng)體系中加入2μLSYBRGreenI熒光染料，通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化判斷擴增結(jié)果，綠色為陽性，橙色為陰性。經(jīng)過對多組引物的篩選，發(fā)現(xiàn)引物組1在瓊脂糖凝膠電泳檢測中，能清晰地出現(xiàn)特征性的梯狀條帶，且亮度較高，表明擴增效果良好。在添加SYBRGreenI熒光染料后，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，呈陽性反應(yīng)。而其他引物組，部分在電泳檢測中條帶不清晰或無條帶出現(xiàn)，添加熒光染料后顏色變化不明顯，擴增效果不佳。因此，確定引物組1為針對橡膠樹紅根病病原菌的最佳LAMP引物組，用于后續(xù)的實驗研究。4.3LAMP體系優(yōu)化在確定了針對橡膠樹紅根病病原菌的最佳LAMP引物組后，對LAMP反應(yīng)體系進行優(yōu)化，以獲得最佳的擴增效果。首先對引物濃度進行優(yōu)化。保持其他反應(yīng)條件不變，分別設(shè)置F3、B3引物的濃度為0.5μmol/L、1μmol/L、1.5μmol/L、2μmol/L、2.5μmol/L，F(xiàn)IP、BIP引物的濃度為5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L，進行LAMP反應(yīng)。結(jié)果顯示，當F3、B3引物濃度為1.5μmol/L，F(xiàn)IP、BIP引物濃度為15μmol/L時，擴增條帶亮度較高且特異性好，無明顯的非特異性擴增條帶。因此，確定該引物濃度為最佳引物濃度。接著優(yōu)化dNTPs濃度。分別設(shè)置dNTPs濃度為1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L，進行LAMP反應(yīng)。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，dNTPs濃度為2mmol/L時，擴增效果最佳，條帶清晰且亮度適中。當dNTPs濃度過低時，擴增產(chǎn)物量不足，條帶較淡；濃度過高時，易出現(xiàn)非特異性擴增，影響檢測結(jié)果的準確性。對Mg2?濃度的優(yōu)化也至關(guān)重要。Mg2?在LAMP反應(yīng)中起著重要作用，它不僅是BstDNA聚合酶的激活劑，還參與引物與模板的結(jié)合等過程。分別設(shè)置Mg2?（以MgSO?形式提供）濃度為2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L，進行LAMP反應(yīng)。結(jié)果表明，Mg2?濃度為4mmol/L時，擴增效果最好，能產(chǎn)生明顯的特征性梯狀條帶。Mg2?濃度過低，會導(dǎo)致酶活性降低，擴增效率低下；濃度過高，則可能影響引物與模板的結(jié)合，產(chǎn)生非特異性擴增。甜菜堿濃度的優(yōu)化同樣不可忽視。甜菜堿能夠降低DNA的解鏈溫度，促進引物與模板的結(jié)合，提高擴增效率。分別設(shè)置甜菜堿濃度為0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L，進行LAMP反應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，甜菜堿濃度為1.5mol/L時，擴增效果最佳，能夠顯著增強擴增條帶的亮度，提高檢測的靈敏度。BstDNApolymerase用量的優(yōu)化也是LAMP體系優(yōu)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。BstDNApolymerase是LAMP反應(yīng)的核心酶，其用量直接影響擴增效果。分別設(shè)置BstDNApolymerase用量為0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U，進行LAMP反應(yīng)。結(jié)果表明，當BstDNApolymerase用量為1U時，擴增效果較好，既能保證擴增效率，又能避免因酶量過多導(dǎo)致的非特異性擴增。通過對LAMP反應(yīng)體系中引物濃度、dNTPs濃度、Mg2?濃度、甜菜堿濃度和BstDNApolymerase用量等關(guān)鍵因素的優(yōu)化，確定了針對橡膠樹紅根病病原菌的最佳LAMP反應(yīng)體系，為后續(xù)的檢測實驗提供了可靠的技術(shù)支持。4.4LAMP體系特異性鑒定為驗證所建立的橡膠樹紅根病病原菌LAMP檢測體系的特異性，以橡膠樹炭疽病菌、白粉病菌、褐根病病原菌、臭根病病原菌以及健康橡膠樹組織的DNA為模板，利用篩選出的最佳LAMP引物組和優(yōu)化后的反應(yīng)體系進行LAMP擴增。LAMP反應(yīng)體系為25μL，包括10×Bst-DNApolymerasebuffer2.5μL，dNTPs（2mmol/L）3.5μL，MgSO4（4mmol/L）4μL，甜菜堿（1.5mol/L）2μL，BstDNA聚合酶（1U）1μL，模板DNA1μL，引物F3（1.5μmol/L）、B3（1.5μmol/L）各2μL，F(xiàn)IP（15μmol/L）、BIP（15μmol/L）各1.5μL，ddH2O4μL。反應(yīng)條件為63℃溫育60min，85℃滅活8min，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察是否出現(xiàn)LAMP特征性的梯狀條帶。同時，在反應(yīng)體系中加入2μLSYBRGreenI熒光染料，通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化判斷擴增結(jié)果，綠色為陽性，橙色為陰性。結(jié)果顯示，以橡膠樹紅根病病原菌DNA為模板進行LAMP擴增時，在瓊脂糖凝膠電泳檢測中出現(xiàn)了清晰的特征性梯狀條帶，添加SYBRGreenI熒光染料后，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，呈陽性反應(yīng)。而以橡膠樹炭疽病菌、白粉病菌、褐根病病原菌、臭根病病原菌以及健康橡膠樹組織的DNA為模板進行LAMP擴增時，在瓊脂糖凝膠電泳檢測中均未出現(xiàn)特征性梯狀條帶，添加SYBRGreenI熒光染料后，反應(yīng)液顏色均為橙色，呈陰性反應(yīng)。這表明所建立的橡膠樹紅根病病原菌LAMP檢測體系具有良好的特異性，能夠準確地檢測出橡膠樹紅根病病原菌，而對其他非目標病原菌及健康組織無擴增反應(yīng)，有效避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，為橡膠樹紅根病的準確診斷提供了可靠的技術(shù)支持。4.5LAMP體系靈敏度驗證為確定所建立的橡膠樹紅根病病原菌LAMP檢測體系的靈敏度，將提取的橡膠樹紅根病病原菌基因組DNA進行10倍梯度稀釋，從初始濃度100ng/μL依次稀釋至10-8ng/μL。以不同稀釋度的DNA為模板，利用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系進行擴增。LAMP反應(yīng)體系為25μL，包括10×Bst-DNApolymerasebuffer2.5μL，dNTPs（2mmol/L）3.5μL，MgSO4（4mmol/L）4μL，甜菜堿（1.5mol/L）2μL，BstDNA聚合酶（1U）1μL，模板DNA1μL，引物F3（1.5μmol/L）、B3（1.5μmol/L）各2μL，F(xiàn)IP（15μmol/L）、BIP（15μmol/L）各1.5μL，ddH2O4μL。反應(yīng)條件為63℃溫育60min，85℃滅活8min，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察是否出現(xiàn)LAMP特征性的梯狀條帶。同時，在反應(yīng)體系中加入2μLSYBRGreenI熒光染料，通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化判斷擴增結(jié)果，綠色為陽性，橙色為陰性。結(jié)果顯示，當模板DNA濃度為10-6ng/μL時，在瓊脂糖凝膠電泳檢測中仍能觀察到清晰的特征性梯狀條帶，添加SYBRGreenI熒光染料后，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，呈陽性反應(yīng)。當模板DNA濃度稀釋至10-7ng/μL時，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶變得模糊，添加熒光染料后，反應(yīng)液顏色變化不明顯。當模板DNA濃度為10-8ng/μL時，瓊脂糖凝膠電泳未檢測到條帶，添加熒光染料后，反應(yīng)液顏色為橙色，呈陰性反應(yīng)。這表明該LAMP檢測體系對橡膠樹紅根病病原菌DNA的最低檢測限為10-6ng/μL。為進一步評估LAMP檢測體系的靈敏度，將其與普通PCR方法進行比較。以相同梯度稀釋的橡膠樹紅根病病原菌基因組DNA為模板，進行普通PCR擴增。普通PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH2O17.3μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，普通PCR方法對橡膠樹紅根病病原菌DNA的最低檢測限為10-4ng/μL。當模板DNA濃度為10-4ng/μL時，在瓊脂糖凝膠電泳檢測中能觀察到清晰的條帶；當模板DNA濃度稀釋至10-5ng/μL時，條帶變得模糊；當模板DNA濃度為10-6ng/μL及更低時，未檢測到條帶。由此可見，所建立的橡膠樹紅根病病原菌LAMP檢測體系的靈敏度比普通PCR方法高100倍，能夠檢測到更低濃度的病原菌DNA，為橡膠樹紅根病的早期診斷和監(jiān)測提供了更靈敏的檢測技術(shù)。4.6田間樣本驗證為了驗證所建立的橡膠樹紅根病病原菌LAMP檢測技術(shù)在實際田間檢測中的準確性和可靠性，在海南、云南等主要橡膠種植區(qū)的多個橡膠園，采集了不同地區(qū)、不同林齡、不同種植管理條件下的100株橡膠樹疑似紅根病病株樣本。采用所建立的LAMP檢測技術(shù)對這些樣本進行檢測。首先，利用CTAB法提取樣本的基因組DNA。然后，以提取的DNA為模板，按照優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系和條件進行擴增。LAMP反應(yīng)體系為25μL，包括10×Bst-DNApolymerasebuffer2.5μL，dNTPs（2mmol/L）3.5μL，MgSO4（4mmol/L）4μL，甜菜堿（1.5mol/L）2μL，BstDNA聚合酶（1U）1μL，模板DNA1μL，引物F3（1.5μmol/L）、B3（1.5μmol/L）各2μL，F(xiàn)IP（15μmol/L）、BIP（15μmol/L）各1.5μL，ddH2O4μL。反應(yīng)條件為63℃溫育60min，85℃滅活8min，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察是否出現(xiàn)LAMP特征性的梯狀條帶。同時，在反應(yīng)體系中加入2μLSYBRGreenI熒光染料，通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化判斷擴增結(jié)果，綠色為陽性，橙色為陰性。為了對比分析，采用傳統(tǒng)檢測方法（如病癥識別及組織分離病原菌、常規(guī)PCR方法）對同一批樣本進行檢測。病癥識別主要依據(jù)橡膠樹紅根病的典型癥狀，如樹冠稀疏，枯枝增多，頂芽難以抽出或抽芽不均勻，樹干干縮，病根表皮形成紅色或棗紅色菌膜等。組織分離病原菌則是在無菌條件下，將病根組織切成小塊，放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌絲后，進行純化培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地，菌絲的形態(tài)、粗細、分支情況，以及孢子的形態(tài)、大小、顏色等特征，初步判斷病原菌種類。常規(guī)PCR方法以提取的樣本基因組DNA為模板，利用通用引物擴增核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，將擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，確定病原菌種類。檢測結(jié)果顯示，LAMP檢測技術(shù)檢測出陽性樣本35株，陰性樣本65株。傳統(tǒng)病癥識別方法判斷出陽性樣本30株，陰性樣本70株。組織分離病原菌方法成功分離出病原菌并鑒定為紅根病病原菌的樣本有28株，未分離出病原菌的樣本有72株。常規(guī)PCR方法檢測出陽性樣本32株，陰性樣本68株。通過統(tǒng)計學(xué)分析，計算LAMP檢測技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法之間的符合率。以常規(guī)PCR方法的檢測結(jié)果為參照，LAMP檢測技術(shù)與常規(guī)PCR方法的符合率為（32+65）/100×100%=97%。LAMP檢測技術(shù)的靈敏度為32/32×100%=100%，特異性為65/68×100%=95.6%。這表明所建立的橡膠樹紅根病病原菌LAMP檢測技術(shù)在田間檢測中具有較高的準確性和可靠性，與傳統(tǒng)檢測方法相比，具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)勢，能夠滿足實際生產(chǎn)中對橡膠樹紅根病病原菌檢測的需求。4.7結(jié)果與討論本研究成功建立了針對橡膠樹紅根病病原菌的LAMP檢測技術(shù)體系，篩選出了特異性強、擴增效果好的LAMP引物組，并對反應(yīng)體系進行了優(yōu)化。通過對引物濃度、dNTPs濃度、Mg2?濃度、甜菜堿濃度和BstDNApolymerase用量等關(guān)鍵因素的優(yōu)化，確定了最佳的LAMP反應(yīng)體系。以橡膠樹炭疽病菌、白粉病菌、褐根病病原菌、臭根病病原菌以及健康橡膠樹組織的DNA為模板進行擴增，結(jié)果表明該檢測體系具有良好的特異性，能夠準確地檢測出橡膠樹紅根病病原菌，而對其他非目標病原菌及健康組織無擴增反應(yīng)。靈敏度驗證結(jié)果顯示，該LAMP檢測體系對橡膠樹紅根病病原菌DNA的最低檢測限為10-6ng/μL，靈敏度比普通PCR方法高100倍，能夠檢測到更低濃度的病原菌DNA，為橡膠樹紅根病的早期診斷和監(jiān)測提供了更靈敏的檢測技術(shù)。田間樣本驗證結(jié)果表明，LAMP檢測技術(shù)在田間檢測中具有較高的準確性和可靠性，與傳統(tǒng)檢測方法相比，具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)勢，能夠滿足實際生產(chǎn)中對橡膠樹紅根病病原菌檢測的需求。以常規(guī)PCR方法的檢測結(jié)果為參照，LAMP檢測技術(shù)與常規(guī)PCR方法的符合率為97%，靈敏度為100%，特異性為95.6%。然而，本研究也存在一些不足之處。在引物設(shè)計過程中，雖然利用了LAMP引物設(shè)計軟件，但仍需要進一步優(yōu)化引物序列，以提高引物的特異性和擴增效率。在實際檢測過程中，可能會受到樣本質(zhì)量、操作誤差等因素的影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。未來的研究可以進一步優(yōu)化LAMP檢測技術(shù)，提高其穩(wěn)定性和可靠性?？梢蚤_發(fā)更加便捷的LAMP檢測試劑盒，使其更易于在田間和基層實驗室應(yīng)用。結(jié)合其他檢測技術(shù)，如熒光定量PCR、基因芯片等，提高橡膠樹紅根病病原菌的檢測準確性和效率。五、橡膠樹褐根病病原菌的LAMP檢測技術(shù)研究5.1材料與方法5.1.1供試菌株本研究選取的橡膠樹褐根病病原菌菌株，均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所的菌種保藏庫，這些菌株分別采集自海南、云南等地的橡膠園病株，具有代表性。為了驗證檢測體系的特異性，還選取了橡膠樹炭疽病菌、白粉病菌等其他常見病原菌以及健康橡膠樹組織作為對照材料。5.1.2菌株培養(yǎng)將橡膠樹褐根病病原菌菌株接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待菌落生長至適宜狀態(tài)后，挑取邊緣整齊的菌絲塊，轉(zhuǎn)接至新鮮的PDA培養(yǎng)基上，進行進一步的純化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地等特征，并詳細記錄，以確保獲得生長狀態(tài)良好且純度較高的病原菌菌株，用于后續(xù)的實驗操作。5.1.3實驗所需試劑、儀器及耗材實驗用到的主要試劑有DNA提取試劑盒（選用OmegaBio-tek公司的E.Z.N.A.soil試劑盒）、dNTPs、MgSO4、甜菜堿、BstDNA聚合酶、10×Bst-DNApolymerasebuffer、SYBRGreenI熒光染料等。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。儀器設(shè)備包含高速離心機（如Eppendorf5424R型離心機）、恒溫水浴鍋（如上海一恒科學(xué)儀器有限公司的HH-4型恒溫水浴鍋）、PCR儀（如ABIVeriti96-wellThermalCycler）、凝膠成像系統(tǒng)（如Bio-RadGelDocXR+成像系統(tǒng)）、電子天平（如梅特勒-托利多AL204型電子天平）等。耗材有1.5mL離心管、PCR管、移液器吸頭、瓊脂糖凝膠電泳槽、梳子、三角瓶、培養(yǎng)皿等，均為無菌耗材，以保證實驗過程不受污染。5.1.4基因組DNA提取及ITS重組質(zhì)粒構(gòu)建采用CTAB法提取橡膠樹褐根病病原菌的基因組DNA。具體操作步驟如下：取適量培養(yǎng)好的病原菌菌絲，放入研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入600μL預(yù)熱至65℃的CTAB提取緩沖液，充分混勻。65℃水浴30min，期間每隔10min輕輕顛倒混勻一次。加入等體積的***仿-異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻10min，12000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，放置于-20℃冰箱中30min，使DNA沉淀。12000r/min離心10min，棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，風干。加入50μLTE緩沖液溶解DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〉牟≡蚪MDNA為模板，利用通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴增核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列。PCR反應(yīng)體系為25μL，包含10×PCRbuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物ITS1和ITS4（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH2O17.3μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用膠回收試劑盒（如OmegaBio-tek公司的GelExtractionKit）回收目的片段。將回收的ITS片段與pMD18-T載體（TaKaRa公司）連接，連接體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL，回收的ITS片段4μL，SolutionI5μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有氨芐青霉素（Amp）的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行PCR鑒定，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，確認無誤后，提取重組質(zhì)粒，于-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.5LAMP引物設(shè)計與合成依據(jù)橡膠樹褐根病病原菌有害層孔菌（Phellinusnoxius）的保守基因序列，利用LAMP引物設(shè)計軟件PrimerExplorerV5設(shè)計特異性引物。針對有害層孔菌，設(shè)計了多組引物，每組引物包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP，其中FIP由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，BIP由B1c和B2區(qū)域組成。為提高擴增效率和特異性，還設(shè)計了環(huán)引物LF、LB。引物序列如下表所示：引物名稱序列（5’-3’）F3GACCTCTACGACGACGACTAB3TGCAGACGACGACGACGATFIPCCGACGACGACGACGACGAACGACCTCTACGACGACGACTABIPGACGACGACGACGACGACGTGCAGACGACGACGACGATLFCGACGACGACGACGACGACLBGACGACGACGACGACGACG引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后用無菌水稀釋至100μmol/L，于-20℃保存?zhèn)溆?。在進行LAMP反應(yīng)前，將引物稀釋至所需濃度。5.2LAMP引物組篩選以提取的橡膠樹褐根病病原菌基因組DNA為模板，對設(shè)計合成的多組LAMP引物進行篩選。LAMP反應(yīng)體系設(shè)定為25μL，其中包含10×Bst-DNApolymerasebuffer2.5μL，dNTPs（10mmol/L）3.5μL，MgSO4（25mmol/L）4μL，甜菜堿（10mol/L）2μL，BstDNA聚合酶（8U/μL）1μL，模板DNA1μL，引物F3（2.5μmol/L）、B3（2.5μmol/L）各2μL，F(xiàn)IP（20μmol/L）、BIP（20μmol/L）各1.5μL，ddH2O4μL。反應(yīng)條件設(shè)置為：63℃溫育60min，85℃滅活8min，以此來終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，仔細觀察是否出現(xiàn)LAMP特征性的梯狀條帶。與此同時，在反應(yīng)體系中加入2μLSYBRGreenI熒光染料，通過肉眼直接觀察反應(yīng)液顏色變化來判斷擴增結(jié)果，若反應(yīng)液變?yōu)榫G色則為陽性，若保持橙色則為陰性。經(jīng)過對多組引物的嚴格篩選和實驗驗證，發(fā)現(xiàn)引物組2在瓊脂糖凝膠電泳檢測中，能夠清晰地出現(xiàn)特征性的梯狀條帶，且條帶亮度較高，這表明該引物組的擴增效果良好。在添加SYBRGreenI熒光染料后，反應(yīng)液顏色迅速變?yōu)榫G色，呈明顯的陽性反應(yīng)。而其他引物組，部分在電泳檢測中條帶不清晰，甚至無條帶出現(xiàn)，添加熒光染料后顏色變化也不明顯，擴增效果不盡人意。因此，綜合各項實驗結(jié)果，確定引物組2為針對橡膠樹褐根病病原菌的最佳LAMP引物組，后續(xù)的實驗研究將基于此引物組展開。5.3LAMP體系優(yōu)化在確定了針對橡膠樹褐根病病原菌的最佳LAMP引物組后，對LAMP反應(yīng)體系進行優(yōu)化，以獲得最佳的擴增效果。首先對引物濃度進行優(yōu)化。保持其他反應(yīng)條件不變，分別設(shè)置F3、B3引物的濃度為0.5μmol/L、1μmol/L、1.5μmol/L、2μmol/L、2.5μmol/L，F(xiàn)IP、BIP引物的濃度為5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L，進行LAMP反應(yīng)。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察條帶的亮度和特異性。結(jié)果顯示，當F3、B3引物濃度為1μmol/L，F(xiàn)IP、BIP引物濃度為15μmol/L時，擴增條帶亮度較高且特異性好，無明顯的非特異性擴增條帶。因此，確定該引物濃度為最佳引物濃度。接著優(yōu)化dNTPs濃度。分別設(shè)置dNTPs濃度為1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L，進行LAMP反應(yīng)。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，dNTPs濃度為2mmol/L時，擴增效果最佳，條帶清晰且亮度適中。當dNTPs濃度過低時，擴增產(chǎn)物量不足，條帶較淡；濃度過高時，易出現(xiàn)非特異性擴增，影響檢測結(jié)果的準確性。Mg2?在LAMP反應(yīng)中起著重要作用，它不僅是BstDNA聚合酶的激活劑，還參與引物與模板的結(jié)合等過程。分別設(shè)置Mg2?（以MgSO?形式提供）濃度為2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L，進行LAMP反應(yīng)。結(jié)果表明，Mg2?濃度為4mmol/L時，擴增效果最好，能產(chǎn)生明顯的特征性梯狀條帶。Mg2?濃度過低，會導(dǎo)致酶活性降低，擴增效率低下；濃度過高，則可能影響引物與模板的結(jié)合，產(chǎn)生非特異性擴增。甜菜堿能夠降低DNA的解鏈溫度，促進引物與模板的結(jié)合，提高擴增效率。分別設(shè)置甜菜堿濃度為0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L，進行LAMP反應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，甜菜堿濃度為1mol/L時，擴增效果最佳，能夠顯著增強擴增條帶的亮度，提高檢測的靈敏度。BstDNApolymerase是LAMP反應(yīng)的核心酶，其用量直接影響擴增效果。分別設(shè)置BstDNApolymerase用量為0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U，進行LAMP反應(yīng)。結(jié)果表明，當BstDNApolymerase用量為1U時，擴增效果較好，既能保證擴增效率，又能避免因酶量過多導(dǎo)致的非特異性擴增。通過對LAMP反應(yīng)體系中引物濃度、dNTPs濃度、Mg2?濃度、甜菜堿濃度和BstDNApolymerase用量等關(guān)鍵因素的優(yōu)化，確定了針對橡膠樹褐根病病原菌的最佳LAMP反應(yīng)體系，為后續(xù)的檢測實驗提供了可靠的技術(shù)支持。5.4LAMP體系特異性鑒定為了驗證所建立的橡膠樹褐根病病原菌LAMP檢測體系的特異性，選取了橡膠樹炭疽病菌、白粉病菌、紅根病病原菌、臭根病病原菌以及健康橡膠樹組織的DNA作為模板，利用篩選出的最佳LAMP引物組和優(yōu)化后的反應(yīng)體系進行LAMP擴增。LAMP反應(yīng)體系為25μL，包含10×Bst-DNApolymerasebuffer2.5μL，dNTPs（2mmol/L）3.5μL，MgSO4（4mmol/L）4μL，甜菜堿（1mol/L）2μL，BstDNA聚合酶（1U）1μL，模板DNA1μL，引物F3（1μmol/L）、B3（1μmol/L）各2μL，F(xiàn)IP（15μmol/L）、BIP（15μmol/L）各1.5μL，ddH2O4μL。反應(yīng)條件設(shè)定為63℃溫育60min，85℃滅活8min，以此終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，仔細觀察是否出現(xiàn)LAMP特征性的梯狀條帶。同時，在反應(yīng)體系中加入2μLSYBRGreenI熒光染料，通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化來判斷擴增結(jié)果，若反應(yīng)液變?yōu)榫G色則為陽性，若保持橙色則為陰性。實驗結(jié)果顯示，以橡膠樹褐根病病原菌DNA為模板進行LAMP擴增時，在瓊脂糖凝膠電泳檢測中出現(xiàn)了清晰的特征性梯狀條帶，添加SYBRGreenI熒光染料后，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，呈陽性反應(yīng)。而以橡膠樹炭疽病菌、白粉病菌、紅根病病原菌、臭根病病原菌以及健康橡膠樹組織的DNA為模板進行LAMP擴增時，在瓊脂糖凝膠電泳檢測中均未出現(xiàn)特征性梯狀條帶，添加SYBRGreenI熒光染料后，反應(yīng)液顏色均為橙色，呈陰性反應(yīng)。這充分表明所建立的橡膠樹褐根病病原菌LAMP檢測體系具有良好的特異性，能夠準確地檢測出橡膠樹褐根病病原菌，而對其他非目標病原菌及健康組織無擴增反應(yīng)，有效避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，為橡膠樹褐根病的準確診