(19)國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(62)分案原申請(qǐng)數(shù)據(jù)(71)申請(qǐng)人熱帶生物科學(xué)英國有限公司地址英國諾里奇市(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限專利代理師孫占華張擁A01H5/00(2018.01)A01H6/00(2018.01)(54)發(fā)明名稱修飾用于沉默基因表達(dá)的植物非編碼RNA分子的特異性的方法本發(fā)明公開一種在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成不具有RNA沉默活性的一非編碼RNA分子的一基因進(jìn)行修飾的方法，所述方法包括將一DNA編輯劑引入至所述植物細(xì)胞中，所述DNA編輯劑賦予所述非編碼RNA分子針對(duì)一感興趣的靶RNA的一沉默特異性。本發(fā)明還公開一種在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾的方法，所述方法包括將一DNA編輯劑引入至所述植物細(xì)胞中，所述DNA編輯劑將所述非編碼RNA分子的所述沉默特異性重定向至針對(duì)一感興趣的靶RNA。本發(fā)明還公開動(dòng)21.一種在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成不具有RNA沉默活性的一非編碼RNA分子的一基因進(jìn)行修飾的方法，其特征在于：所述方法包括：將一DNA編輯劑引入至所述植物而對(duì)用于編碼或被加工成所述非編碼RNA分子的所述基因進(jìn)行修飾。2.一種在一植物細(xì)胞中將用于編碼或被加工成針對(duì)一靶RNA的一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾的方法，其特征在于：所述方法包括：將—DNA編輯劑引入至所3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：用于編碼或被加工成所述非編碼RNA分子的所述基因?qū)λ鲋参锛?xì)胞是內(nèi)源性的。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：用于編碼所述RNA沉默分子的所述基因?qū)λ鲋参锛?xì)胞是內(nèi)源性的。5.如權(quán)利要求1或3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：對(duì)用于編碼或被加工成所述非編碼RNA分子的所述基因的所述修飾包括：賦予所述非編碼RNA分子針對(duì)所述感興趣的靶RNA具有至少45%的互補(bǔ)性。6.如權(quán)利要求2或4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：對(duì)用于編碼所述RNA沉默分子的所述基因的所述修飾包括：賦予所述RNA沉默分子針對(duì)所述第二靶RNA具有至少45%的互補(bǔ)性。7.如權(quán)利要求1、3或5中任一項(xiàng)所述的方8.如權(quán)利要求2、4或6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述RNA沉默分子的所述特異性是通過測(cè)量所述第二靶RNA的一RNA水平來確定的。9.如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的所述沉默特異性是由表型上確定的。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述由表型上確定的是通過確定選自于由受性以及一非生物脅迫耐受性所組成的群組中的至少一種植物表型來實(shí)現(xiàn)。11.如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述非編碼RNA分子的所述沉默特異性是由基因型上確定的。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于：一植物表型是在一植物基因型之前確定13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于：一植物基因型是在一植物表型之前確定14.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述非編碼RNA分子或所述15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于：所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子是RNA(piRNA)以及一反式作用siRNA(tasiRNA)所組成的群組中的一種RNA干擾(RNAi)分子。3子是選自于由一小核RNA(snRNA)、一小核仁RNA(snoRNA)、一長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)、一核糖17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于：設(shè)計(jì)所述RNAi分子，使得所述RNAi分子的一序列被修飾，以保留結(jié)構(gòu)的獨(dú)創(chuàng)性及以便通過多個(gè)細(xì)胞RNAi因子來識(shí)別。18.如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：對(duì)所述基因的所述修飾是通過選自于由一缺失、一插入、一點(diǎn)突變及其組合所組成的群組中的一種修飾來實(shí)現(xiàn)。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于：所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于：所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述21.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于：所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的一非結(jié)構(gòu)化區(qū)域中。22.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于：所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的一莖區(qū)域以及一環(huán)區(qū)域中。23.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于：所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的一莖區(qū)域、一環(huán)區(qū)域以及一非結(jié)構(gòu)化區(qū)域中。24.如權(quán)利要求18至23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述修飾包括一種至多200個(gè)核苷酸的修飾。25.如權(quán)利要求18至24中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述方法還包括：將多個(gè)供體寡核苷酸引入至所述植物細(xì)胞中。26.如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述DNA編輯劑包括與一植物可表達(dá)啟動(dòng)子在運(yùn)作上相連接的至少一個(gè)gRNA。27.如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述DNA編輯劑不包括一核酸內(nèi)切酶。28.如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述DNA編輯劑包括一核酸內(nèi)切酶。29.如權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述DNA編輯劑是一種DNA編30.如權(quán)利要求28或29中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述核酸內(nèi)切酶包括Cas9。或RNP的形式施加至所述細(xì)胞。32.如權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述DNA編輯劑與用于監(jiān)測(cè)在一植物細(xì)胞中的表達(dá)的一報(bào)道子連接。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于：所述報(bào)道子是一螢光蛋白。34.如權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述感興趣的靶RNA或所述第二靶RNA對(duì)所述植物細(xì)胞是內(nèi)源性的。35.如權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述感興趣的靶RNA或所述第436.如權(quán)利要求1至35中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述植物細(xì)胞是一原生質(zhì)體。37.一種植物細(xì)胞，其特征在于：所述植物細(xì)胞為根據(jù)權(quán)利要求1至36中任一項(xiàng)所述的方法所產(chǎn)生的。38.一種植物，其特征在于：所述植物包括如權(quán)利要求37所述的植物細(xì)胞。39.一種產(chǎn)生具有一靶基因表達(dá)降低的一植物的方法，其特征在于：所述方法包括：(b)選擇具有所述感興趣的靶RNA或所述第二靶RNA表達(dá)降低的多個(gè)子代植物、或選擇在針對(duì)一感興趣的靶RNA的所述非編碼RNA分子中包括一沉默特異性的子代，且所述多個(gè)子從而產(chǎn)生具有一靶基因表達(dá)降低的所述植物。40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于：所述育種包括雜交或自交。41.一種產(chǎn)生具有提升的脅迫耐受性、增加的產(chǎn)量、提升的生長(zhǎng)速率或提升的產(chǎn)量質(zhì)量中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是對(duì)脅迫具有敏感性、減少的產(chǎn)量、降低的生長(zhǎng)速率或降低的產(chǎn)量質(zhì)量的所述植物的一基因，從而產(chǎn)生所述植物。42.一種產(chǎn)生一耐病原體或抗病原體植物的方法，其特征在于：所述方法包括：根據(jù)權(quán)利要求1至40中任一項(xiàng)，在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是對(duì)所述病原體具有敏感性的所述植物的一基因，從而產(chǎn)生所述耐病原體或抗病原體植物。43.一種產(chǎn)生一耐病原體或抗病原體植物的方法，其特征在于：所述方法包括：根據(jù)權(quán)利要求1至40中任一項(xiàng)，在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是所述病原體的一基因，從而產(chǎn)生所述耐病原體或抗病原體植物。44.一種產(chǎn)生一耐害蟲或抗害蟲植物的方法，其特征在于：所述方法包括：根據(jù)權(quán)利要求1至40中任一項(xiàng)，在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是所述害蟲的一基因，從而產(chǎn)生所述耐害蟲或抗害蟲植物。45.一種產(chǎn)生一耐害蟲或抗害蟲植物的方法，其特征在于：所述方法包括：根據(jù)權(quán)利要求1至40中任一項(xiàng)，在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是對(duì)所述害蟲具有敏感性的所述植物的一基因，從而產(chǎn)生所述耐害蟲或抗害蟲植物。46.一種產(chǎn)生一抗除草劑植物的方法，其特征在于：所述方法包括如：根據(jù)權(quán)利要求1至40中任一項(xiàng)，在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是對(duì)所述除草劑具有敏感性的所述植物的一基因，從而產(chǎn)生所述抗除草劑植物。47.一種植物，其特征在于：所述植物為根據(jù)權(quán)利要求39至46中任一項(xiàng)所述的方法所產(chǎn)生的。48.如權(quán)利要求38或47中任一項(xiàng)所述的植物，或如權(quán)利要求39至46中任一項(xiàng)所述的方5法，其特征在于：所述植物是非轉(zhuǎn)基因的(非-GMO)。49.一種種子，其特征在于：所述種子來自如權(quán)利要求38或47至48中任一項(xiàng)所述的植50.如權(quán)利要求1至36、39至46或48中任一項(xiàng)所述的方法、如權(quán)利要求37所述的植物細(xì)胞、如權(quán)利要求38或47至48中任一項(xiàng)所述的植物、或如權(quán)利要求49所述的種子，其特征在于：所述植物是選自于由一作物、一開花植物以及一喬木所組成的群組。6修飾用于沉默基因表達(dá)的植物非編碼RNA分子的特異性的方法[0001]本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，其原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2018年9月18日，申請(qǐng)?zhí)枮?01880073961.1(國際申請(qǐng)?zhí)朠CT/IB2018/057160),名稱為“修飾用于沉默基因表達(dá)的植物[0002]技術(shù)領(lǐng)域及背景技術(shù)[0003]本發(fā)明的一些實(shí)施例中是有關(guān)于對(duì)用于編碼或被加工成非編碼RNA分子(包含RNA沉默分子)的基因進(jìn)行修飾，且特別地但非完全地是有關(guān)于使用相同的基因在植物中沉默感興趣的內(nèi)源性或外源性靶基因表達(dá)。[0004]RNA沉默或RNA干擾(RNAi)是RNA分子抑制基因表達(dá)或翻譯的內(nèi)源性共轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄其他非編碼RNA已被認(rèn)為具有RNA沉默活性，包含轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA,tRNA)、小核RNA(smallnuclearRNA,snoRNA)、小核仁RNA(repeats-derivedRNA)。這些典型和非典型RNA沉默分子在其基質(zhì)(substrate)、生物發(fā)生(biogenesis)、效應(yīng)蛋白以及靶下調(diào)模式上有所不同。[0005]此外，Argonaute蛋白與小RNA復(fù)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)(RNA干擾(RNAi)效應(yīng)復(fù)合物)的核心。所述Argonaute總科分為[0006]小型干擾RNA(siRNA)是長(zhǎng)度為20至25個(gè)核苷酸(nt)的雙鏈RNA分子，通過在轉(zhuǎn)錄過程中或轉(zhuǎn)錄后降解其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而導(dǎo)致沒有翻譯，從而干擾具有互補(bǔ)核苷酸序列的特定基因的表達(dá)。[0007]微型RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為20至24nt的小的內(nèi)源性非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA),起源于長(zhǎng)的自互補(bǔ)前體。成熟的miRNA通過兩種方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)：(i)通過抑制翻譯或(ii)通過與所述靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的完全或接近完全互補(bǔ)來降解編碼mRNA。大多數(shù)植物靶剪切和降解。[0008]Piwi相互作用RNA(piRNA)是小的非編碼RNA,其是長(zhǎng)的單鏈前體分子的產(chǎn)物，且無需一切割步驟即可產(chǎn)生。piRNA的長(zhǎng)度通常為26至31nt,且大部分為反義的。piRNA通過與[0009]反式作用siRNA(tasiRNA)是一類通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默來抑制基因表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)。它們的生物發(fā)生是通過miRNA與tasiRNA前體的結(jié)合來引發(fā)的，其會(huì)募集RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependentRNA-polymerase,RdRp)從所述tasiRNA前體模板來合成dsRNA。接下來，將此類dsRNA通過DICER樣4(DICER-LIKE4,DCL4)加工成約21個(gè)核苷酸的7[0010]基因組編輯技術(shù)的最新進(jìn)展使得改變活細(xì)胞中的DNA序列成為可能的。通過僅編輯植物細(xì)胞中數(shù)十億個(gè)核苷酸的數(shù)個(gè)核苷酸，這些新技術(shù)可能是使作物在惡劣氣候下(作物表現(xiàn)和非生物脅迫)生長(zhǎng)更好并增強(qiáng)對(duì)生物脅迫(昆蟲、病毒、細(xì)菌、甲蟲、線蟲等)抗性的最有效方法。使用基因組編輯技術(shù)(例如，CRISPR/Cas9)實(shí)現(xiàn)對(duì)害蟲的抗性的方法是有限除(例如，眾所周知的MLO基因);或通過修飾調(diào)控元件(例如，啟動(dòng)子、微型RNA結(jié)合位點(diǎn)等)[0012]Zhao等人(Zhao等人，ScientificReports,2014年，4:3943)提供了一種在小鼠細(xì)通過靶向HeLa細(xì)胞中的5'區(qū)域從一群集中大量減少人類miR-93。在含有Drosha加工位點(diǎn)(即Drosha(一雙鏈RNA特異性RNaseIII酶)在一宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中結(jié)合、剪切并由此將初級(jí)miRNA(pri-miRNA)加工成pre-miRNA的位置)和種子序列(即保守的七系統(tǒng)序列miRNA5末端的2至7位)的靶區(qū)域中誘導(dǎo)各種小的插入缺失(indel)。根據(jù)Jiang等人，即使是一單個(gè)核苷酸的缺失，也可以完全敲除具有高特異性的靶miRNA。[0014]關(guān)于植物基因組編輯，Bortesi和Fischer(Bortesi和Fischer,Biotechnology用，以及Basak和Nithin(Basak和Nithin,FrontPlantSci.,2015年，6:1001)證明使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除典型植物(例如，南芥和煙草)以及作物(例如，小麥、玉米以及水稻)中的蛋白質(zhì)編碼基因。內(nèi)源性和外源性靶基因的基因沉默的基因沉默方法(Tiwari等人，PlantMolBiol.,2014盒(包含啟動(dòng)子、終止子等)中(Carbonel1等人，PlantPhysiology,2014年，pp.113.234989),通過小RNA生物發(fā)生和沉默機(jī)制進(jìn)行加工，并下調(diào)靶表達(dá)。根據(jù)Schwab等啟動(dòng)子下表達(dá)時(shí)，amiRNA是活性的，可用于植物中的特定基因沉默，特別是當(dāng)幾個(gè)相關(guān)但不完全相同的靶基因需要下調(diào)時(shí)。將一無啟動(dòng)子的抗病毒amiRNA工程改造成一內(nèi)源性miRNA基因座(locus)。具體來說，Senis前體轉(zhuǎn)基因(發(fā)夾pri-amiRNA)插入至一自然發(fā)生的miRNA基因(例如，miR122)的附近。此方法通過利用表達(dá)自然miRNA(miR122)的轉(zhuǎn)錄活性DNA來使用無啟動(dòng)子和無終止子的amiRNA,也就是說，內(nèi)源性啟動(dòng)子和終止子驅(qū)動(dòng)并調(diào)節(jié)插入的amiRNA轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄。8專利申請(qǐng)?zhí)?0160289675中描述了使用電穿孔和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofection)的RNA轉(zhuǎn)染(transfection)。Cho描述了通過顯微注射Cas9蛋白和gRNA復(fù)合物將Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物直接遞送至細(xì)胞(Cho等人，“通過直接注射Cas9-sgRNA核糖核蛋白在秀麗隱桿線蟲中的可遺傳基因敲除(HeritablegeneknockoutinCaenorhabditiselegansbydirectinjectionof糖核蛋白的遞送在人類細(xì)胞中的高效RNA引導(dǎo)基因組編輯(HighlyefficientRNA-guidedgenomeeditinginhumancellsribonucleoproteins)”,GenomeRes.,2014年，24:1012至1019)。Zuris報(bào)道了通過脂質(zhì)體遞送Cas9蛋白相關(guān)的gRNA復(fù)合物(Zuris等人，“陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的蛋白遞送使得能夠在體外和體內(nèi)進(jìn)行基于蛋白的有效基因組編輯(Cationiclipid-mediateddeliveryofproteinsenablesefficientprotein-based發(fā)明內(nèi)容[0018]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成不具有RNA沉默活性的一非編碼RNA分子的一基因進(jìn)行修飾的方法，所述方法包括：將一DNA編輯劑引入至所述植物細(xì)胞中，所述DNA編輯劑賦予所述非編碼RNA分子針對(duì)一感興趣的靶RNA的一沉默特異性，從而對(duì)用于編碼或被加工成所述非編碼RNA分子的所述基因進(jìn)行修飾。[0019]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成不具有RNA沉默活性的一非編碼RNA分子的一基因進(jìn)行修飾的方法，所述方法包括：將一DNA編輯劑引入至所述植物細(xì)胞中，所述DNA編輯劑賦予所述非編碼RNA分子針對(duì)一感[0020]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種在一植物細(xì)胞中將用于編碼或被輯劑引入至所述植物細(xì)胞中，所述DNA編輯劑將所述RNA沉默分子的一沉默特異性重定向至分子的所述基因進(jìn)行修飾。[0021]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種在一植物細(xì)胞中將用于編碼或被輯劑引入至所述植物細(xì)胞中，所述DNA編輯劑將所述RNA沉默分子的一沉默特異性重定向至[0022]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的所述方法所產(chǎn)生的。[0023]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種植物，所述植物包括本發(fā)明的一些實(shí)施例的所述植物細(xì)胞。[0024]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種產(chǎn)生具有一靶基因表達(dá)降低的一9植物的方法，所述方法包括：(a)育種本發(fā)明的一些實(shí)施例的所述植物；以及(b)選擇具有所述感興趣的靶RNA或所述第二靶RNA表達(dá)降低的多個(gè)子代植物、或選擇在針對(duì)一感興趣的靶RNA的所述非編碼RNA分子中包括一沉默特異性的子代，且所述多個(gè)子代植物或所述子代不[0025]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種產(chǎn)生具有提升的脅迫耐受性、增加的產(chǎn)量、提升的生長(zhǎng)速率或提升的產(chǎn)量質(zhì)量的一植物的方法，所述方法包括：根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例所述的在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是對(duì)脅迫具有敏感性、減少的產(chǎn)量、降低的生長(zhǎng)速率或降低的產(chǎn)量質(zhì)量的所述植物的一基因，從而產(chǎn)生所述植物。[0026]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種產(chǎn)生一耐病原體或抗病原體植物的方法，所述方法包括：根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例所述的在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是對(duì)所述病原體具有敏感性的所述植物的一基因，從而產(chǎn)生所述耐病原體或抗病原體植物。[0027]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種產(chǎn)生一耐病原體或抗病原體植物的方法，所述方法包括：根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例所述的在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成—RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是所述病原體的一基因，從而產(chǎn)生所述耐病原體或抗病原體植物。[0028]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種產(chǎn)生一耐害蟲或抗害蟲植物的方法，所述方法包括：根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例所述的在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是所述害蟲的一基因，從而產(chǎn)生所述耐害蟲或抗害蟲植物。[0029]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種產(chǎn)生一耐害蟲或抗害蟲植物的方法，所述方法包括：根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例所述的在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是對(duì)所述害蟲具有敏感性的所述植物的一基因，從而產(chǎn)生所述耐害蟲或抗害蟲植物。[0030]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種產(chǎn)生一抗除草劑植物的方法，所述方法包括如：根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例所述的在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一非編碼RNA分子的或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾，其中所述感興趣的靶RNA是對(duì)所述除草劑具有敏感性的所述植物的一基因，從而產(chǎn)生所述抗除草劑植物。[0031]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種植物，所述植物為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的所述方法所產(chǎn)生的。[0032]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一方面，提供了一種種子，所述種子來自如本發(fā)明的一些實(shí)施例的所述植物。[0033]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，用于編碼或被加工成所述非編碼RNA分子的所述基因?qū)λ鲋参锛?xì)胞是內(nèi)源性的。[0034]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，用于編碼所述RNA沉默分子的所述基因?qū)λ鲋参锛?xì)胞是內(nèi)源性的。[0035]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)用于編碼或被加工成所述非編碼RNA分子的所述基因的所述修飾包括：賦予所述非編碼RNA分子針對(duì)所述感興趣的靶RNA具有至少45%的互補(bǔ)性。[0036]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)用于編碼所述RNA沉默分子的所述基因的所述修飾包括：賦予所述RNA沉默分子針對(duì)所述第二靶RN[0037]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述非編碼RNA分子的所述沉默特異性是通過測(cè)量所[0038]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述RNA沉默分子的所述沉默特異性是通過測(cè)量所述[0039]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的所述沉默特異性是由表型上確定的。[0040]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，由表型上確定的是通過確定選自于由植物的一葉色、物脅迫耐受性所組成的群組中的至少一種植物表型來實(shí)現(xiàn)。[0041]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述非編碼RNA分子的所述沉默特異性是由基因型上確定的。[0042]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述植物表型是在一植物基因型之前確定的。[0043]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述植物基因型是在一植物表型之前確定的。[0044]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子是由一前體加工而成。[0045]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子是一RNA干擾[0046]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述RNA干擾(RNAi)分子是選自于由一小干擾RNA式作用siRNA(tasiRNA)所組成的群組。[0047]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，:所述非編碼RNA分子是選自于由一小核RNA(snRNA)、的一序列被修飾，以保留結(jié)構(gòu)的獨(dú)創(chuàng)性及以便通過多個(gè)細(xì)胞RNAi因子來識(shí)別。[0049]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)所述基因的修飾是通過選自于由一缺失、一插入、一點(diǎn)突變及其組合所組成的群組中的一種修飾來實(shí)現(xiàn)。[0050]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的一莖區(qū)域中。[0051]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的一環(huán)區(qū)域中。[0052]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的一非結(jié)構(gòu)化區(qū)域中。[0053]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的一莖區(qū)域以及一環(huán)區(qū)域中。11[0054]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述修飾是在所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子的一莖區(qū)域、一環(huán)區(qū)域以及一非結(jié)構(gòu)化區(qū)域中。[0055]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述[0056]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述[0057]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述修飾是一點(diǎn)突變。[0058]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述修飾包括一種至多200個(gè)核苷酸的修飾。[0059]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述方法還包括：將多個(gè)供體寡核苷酸引入至所述植物細(xì)胞中。[0060]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述DNA編輯劑包括與一植物可表達(dá)啟動(dòng)子在運(yùn)作上相連接的至少一個(gè)gRNA。是選自于由一大范圍核酸酶、一鋅指核酸酶(ZFN)、一轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)[0064]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述核酸內(nèi)切酶包括Cas9。[0066]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述DNA編輯劑與用于監(jiān)測(cè)在一植物細(xì)胞中的表達(dá)的一報(bào)道子連接。[0067]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述報(bào)道子是一螢光蛋白。[0068]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述感興趣的靶RNA或所述第二靶RNA對(duì)所述植物細(xì)胞是內(nèi)源性的。[0069]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述感興趣的靶RNA或所述第二靶RNA對(duì)所述植物細(xì)胞是外源性的。[0070]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述植物細(xì)胞是一原生質(zhì)體。[0071]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述育種包括雜交或自交。[0072]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述植物是非轉(zhuǎn)基因的(非-GMO)。[0073]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述植物是選自于由一作物、一開花植物以及一喬木所組成的群組。[0074]除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)及/或科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含意相同的含義。盡管與本文描述的那些類似或等同的方法及材料可以用于本發(fā)明的實(shí)施例的實(shí)踐或測(cè)試中，但是在下文中描述了示例性的方法及/或材料。在有沖突的情況下，以專利說明書及其定義為準(zhǔn)。另外，是說明性的，并不旨在必然地限制本發(fā)明。附圖說明[0075]在本文中僅通過示例的方式，參考所述多個(gè)附圖來描述本發(fā)明的一些實(shí)施例?，F(xiàn)在具體地參考所述多個(gè)附圖，應(yīng)當(dāng)理解，所示出的細(xì)節(jié)是作為示例并且出于對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例的說明性討論的目的。因此，顯而易見的，結(jié)合附圖中的描述使本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道如何實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施例。[0077]圖1是用靶向所述PDS基因的siRNA替代內(nèi)源性miRNA的基因組編輯誘導(dǎo)基因沉默(GenomeEditingInducedGeneSilencing,GEiGS)的一實(shí)施例流程圖，從而誘導(dǎo)所述內(nèi)源CAS9系統(tǒng)在一含有GFP的載體中，通過設(shè)計(jì)的多個(gè)特異性引導(dǎo)RNA在選定的基因座中產(chǎn)生一列所需要的修飾)作為用于所述HDR的一模板，以靶向新分配的多個(gè)基因。此系統(tǒng)正在用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化中，通過FACS富集(由于所述CRISPR/CAS9載體中的所述GFP信號(hào)),回收并再生為多個(gè)植物。[0078]圖2A至2C示出了所述PDS基因的沉默引起光致漂白(photobleaching)的照片。煙草(Nicotiana)(圖2A至2B)和擬南芥(Arabidopsis)(圖2C)植物中的所述PDS基因的沉默引起本生煙(N.benthamiana)(圖2B)和擬南芥(圖2C,右側(cè))中的光致漂白。照片是在PDS沉默3周半后拍攝。[0079]圖3A至3D是使用GEiGS敲低擬南芥中GFP表達(dá)水平的照片。與使用GEiGS編輯以表達(dá)GFPsiRNA的原生質(zhì)體(圖3C至3D)相比，表達(dá)GFP的擬南芥原生質(zhì)體顯示為對(duì)照組(圖3A[0080]圖4是用靶向GFP的siRNA替換內(nèi)源性miRNA的GEiGS的一實(shí)施例流程圖，用活性中，通過設(shè)計(jì)的多個(gè)特異性引導(dǎo)RNA在選定的基因座中產(chǎn)生一剪切，以促進(jìn)在所述位點(diǎn)中的過FACS進(jìn)行假定修飾的富集(由于所述CRISPR/CAS9載體中的所述RFP信號(hào))正在進(jìn)行和回向的RNAi產(chǎn)生抗GFP的擬南芥植物。值得注意的是，GEiGS植物在植物轉(zhuǎn)化后沉默GFP表達(dá)。RFP正在用于具有瞬時(shí)存在的CRISPR/CAS9載體的細(xì)胞富集。[0082]圖6是用靶向GFP的siRNA替換內(nèi)源性miRNA的GEiGS的一實(shí)施例流程圖，產(chǎn)生對(duì)病毒感染(例如，TMV感染(即外源性基因))具有抗性的植物。RFP正在用于具有瞬時(shí)存在的nematode)(Radopholussimi[0084]圖8示出在西原(TayNguyen)地區(qū)中不同作物上出現(xiàn)的香蕉穿孔線蟲(Radopholussimilis)和咖啡根腐線蟲(Pratylenchuscoffeae)的表格。[0085]圖9是產(chǎn)生多個(gè)GEiGS模板的計(jì)算管道的一實(shí)施例流程圖。所述計(jì)算GEiGS管道應(yīng)用生物元數(shù)據(jù)(biologicalmetadata),并能夠自動(dòng)產(chǎn)生多個(gè)GEiGSDNA供體模板，用于最小限度地編輯多個(gè)內(nèi)源性非編碼RNA基因(例如，多個(gè)miRNA基因),從而導(dǎo)致一新的功能增益，即將其沉默能力重定向至感興趣的靶基因表達(dá)。[0086]圖10是示出靶向任何所需的外源性害蟲基因的抗害蟲植物的設(shè)計(jì)的一實(shí)施例流程圖。用靶向病原體/害蟲必需基因的siRNA替代內(nèi)源性miRNA的GEiGS,產(chǎn)生對(duì)病原體/害蟲感染具有抗性的植物。[0087]圖11是示出設(shè)計(jì)RNA沉默分子并具有最小限度編輯的miRNA基因堿基所需的主要階段的一實(shí)施例流程圖。[0088]圖12A至12G示出了miR-390和修飾的miR-390結(jié)構(gòu)與靶向的序列的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本。miR390的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的二級(jí)結(jié)構(gòu)表示及其修飾形式-(圖12A)野生型；(圖12B至12C)靶向操作的靶向的區(qū)域以紫色勾勒輪廓，且NGG序列以黃色做標(biāo)記(圖12A)。[0089]圖13A至13G示出了miR-173和修飾的miR-173結(jié)構(gòu)與靶向的序列的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本。miR173的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的二級(jí)結(jié)構(gòu)表示及其修飾形式-(圖13A)野生型；(圖13B至13C)靶向GFP的修飾形式；(圖13D至13E)靶向AtPDS3的修飾形式；(圖13F至13G)靶向AtADH1的修飾形操作的靶向的區(qū)域以紫色勾勒輪廓，且NGG序列以黃色突出顯示(圖13A)。[0090]圖13H示出了多個(gè)GEiGS寡核苷酸設(shè)計(jì)的實(shí)施例實(shí)例，其中前體結(jié)構(gòu)在生物發(fā)生中不起作用，因此不需要被維持。設(shè)計(jì)是基于甘藍(lán)型油菜(Brass從上至下：野生型tasiRNA、具有序列變化最小的GEiGS設(shè)計(jì)、以及具有序列變化最大的和野生型序列之間的序列差異以紅色突出顯示。值得注意的是，不同于miRNA和tRNA,tasiRNA生物發(fā)生不依賴于所述前體二級(jí)結(jié)構(gòu)。[0091]圖14A至14D示出了通過miR-173及其修飾形式的基因靶向。(圖14A)野生型miR-以及10)設(shè)計(jì)為通過與它們的序列序列互補(bǔ)性(紅色)靶向(圖14B)GFP、[0092]圖15A至15D示出了通過miR-390及其修飾形式的基因靶向。(圖15A)野生型miR-390通過成熟miRNA與基因中一序列的序列互補(bǔ)性靶向TAS3轉(zhuǎn)錄物(紅色)。新修飾的miRNA以及12)設(shè)計(jì)為通過與它們的序列序列互補(bǔ)性(紅色)靶向(圖15B)GFP、[0093]圖16示出了PDS3表型/基因型：選擇漂白的表型植物，并通過內(nèi)部擴(kuò)增子PCR進(jìn)行基因分型，然后用BtsaI(NEB)進(jìn)行限制性酶切分析，以驗(yàn)證供體相對(duì)于野生型序列的存在。流道1:用無供體限制的經(jīng)處理的植物；流道2至4:含供體限制的經(jīng)PDS3處理的植物；流道5:未受限制的陽性質(zhì)粒供體對(duì)照組；流道6:無模板的水對(duì)照組；流道7:受限制的陽性質(zhì)粒供體；流道8:用限制的負(fù)性供體轟擊的植物；流道9:受限制的未經(jīng)處理的對(duì)照組植物。隨后對(duì)[0094]圖17示出了ADH1表型/基因型：通過對(duì)烯丙醇的抗性選擇植物，并通過內(nèi)部擴(kuò)增子的烯丙醇敏感的對(duì)照組植物；流道2至4:含供體限制的抗烯丙醇的植物；流道5:未受限制的陽性質(zhì)粒供體對(duì)照組；流道6:無模板對(duì)照組；流道7:受限制的陽性質(zhì)粒供體；流道8:用限制的非特異性供體轟擊的植物；流道9:受限制的非烯丙醇處理的對(duì)照組。[0095]圖18是示出了在靶向AtPDS3轉(zhuǎn)錄物的miR-173修飾的植物中的基因表達(dá)分析的靶向AtPDS3時(shí)，平均觀察到的基因表達(dá)水平降低了82%(誤差線顯示SD;基于Ct值計(jì)算的p值<0.01)。[0096]圖19是示出了在靶向AtPDS3轉(zhuǎn)錄物的miR-390修飾的植物中的基因表達(dá)分析的為靶向AtADH1時(shí)，平均觀察到的基因表達(dá)水平降低了82%(誤差線顯示SD;基于Ct值計(jì)算的p值<0.01)。具體實(shí)施方式[0097]本發(fā)明的一些實(shí)施例中是有關(guān)于對(duì)用于編碼或被加工成非編碼RNA分子(包含RNA沉默分子)的基因進(jìn)行修飾，且特別地但非完全地是有關(guān)于使用相同的基因在植物中沉默感興趣的內(nèi)源性或外源性靶基因表達(dá)。[0098]參考所述多個(gè)附圖以及所附說明，可以更好地理解本發(fā)明的原理以及操作。[0099]在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的應(yīng)用并不一定限于以下描述中所闡述的或由所述多個(gè)示例所舉例說明的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其他實(shí)施例，或者能夠以各種方式被實(shí)踐或執(zhí)行。此外，應(yīng)當(dāng)理解，本文中采用的措詞和術(shù)語是出于側(cè)重于使用轉(zhuǎn)基因破壞miRNA活性或多個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)。植物中的基因組編輯進(jìn)一步集中于此外，還描述了在多種植物中使用人工微型RNA轉(zhuǎn)基因以沉默多個(gè)內(nèi)源性和外源性靶基因的基因沉默(MolnarA等人，PlantJ.,2009年，58(1):165至74,doi:10.1111/j.1365-MolecularCellBiology|AOP,于2015年11月4日在線出版；doi:10.1038/nrm4085)。將所述多個(gè)人工miRNA轉(zhuǎn)基因引入至一人工表達(dá)盒(包含一啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記等)內(nèi)的多個(gè)[0101]在將本發(fā)明付諸實(shí)踐的同時(shí)，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一基因編輯技術(shù)，所述基因編輯技術(shù)針對(duì)多個(gè)非編碼RNA分子(例如，內(nèi)源性)設(shè)計(jì)用于靶向和干擾一非自然的感興趣的靶基因(對(duì)所述植物細(xì)胞為內(nèi)源性或外源性)。本文中所述的基因編輯技術(shù)并未實(shí)現(xiàn)包括多個(gè)表達(dá)盒(具有一啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記)的多個(gè)經(jīng)典分子遺傳和轉(zhuǎn)基因工具。[0102]如下文以及在其后的實(shí)例部分中所示，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一種基因組編輯誘導(dǎo)基因沉默(GenomeEditingInducedGeneSilencing,GEiGS)平臺(tái)，所述平臺(tái)能夠利用一植物細(xì)胞的多個(gè)內(nèi)源性非編碼RNA分子(包含例如多個(gè)RNA沉默分子(例如，siRNA、miRNA、piRNA、等)),并對(duì)它們進(jìn)行修飾以靶向和下調(diào)任何感興趣的RNA靶(參見圖1中的示例性流程圖)。使用GEiGS,本方法能夠篩選多個(gè)潛在的非編碼RNA分子，編輯這些內(nèi)源性RNA分子中的多個(gè)核苷酸，從而重定向其特異性以有效且特異性地靶向和下調(diào)任何感興趣的RNA(包含通過多種病原體和多種害蟲編碼的內(nèi)源性及/或外源性RNA(參見圖9中的示例性流程圖)。綜上所述，GEiGS可以用作一種新型的非轉(zhuǎn)基因的技除草劑的侵害。[0103]因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成不具有RNA沉默活性的一非編碼RNA分子的一基因進(jìn)行修飾的方法，所述方法包括將—DNA編輯劑引入至所述植物細(xì)胞中，所述DNA編輯劑賦予所述非編碼RNA分子針對(duì)一感興趣的靶RNA的一沉默特異性，從而對(duì)用于編碼或被加工成所述非編碼RNA分子的所述基因進(jìn)行修飾。[0104]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種在一植物細(xì)胞中將用于編碼或被加工成針對(duì)所述植物細(xì)胞中，所述DNA編輯劑將所述RNA沉默分子的所述特異性重定向至針對(duì)一第二靶因進(jìn)行修飾。[0105]本文中所使用的術(shù)語“植物”包括多個(gè)整株植物、一嫁接植物、所述多個(gè)植物的祖?zhèn)€根莖、多個(gè)接穗以及多個(gè)植物細(xì)胞、組織以及器官。所述植物可以是任何形式，包含多個(gè)個(gè)花粉以及多個(gè)小孢子。在本發(fā)明的所述多個(gè)方法中可能有用的多個(gè)植物包含屬于綠色植物總科(superfamilyViridiplantee)的所有植物，特別是選自以下的單子葉(monocotyledonous)和雙子葉(dicotyledonous)植物，包含一飼料(fodder)或豆科植物、野黃豆(Glycinejavanica)、墨西哥丁香屬(Gliricidiaspp.)、陸地棉(Gossypiumspp.)、鳥足豆屬(0rnithopusspp.)、豌豆(Pisumsativam)、新西蘭羅(Pogonarthriafleckii)、禮普格納西亞草(Pogonaffhriasquarrosa)、楊屬(Populusspp.)、瓜葉牧豆(Prosopiscin筍(asparagus)、球花甘藍(lán)(broccoli)、抱子甘藍(lán)(Brusselssprouts)、卷心菜、油菜viridiplantae)可以用于本發(fā)明的一些實(shí)施例的方法。[0107]根據(jù)一具體的實(shí)施例，所述植物是一木本(woody)植物物種，例如，獼猴桃(Actinidiachinensis)(獼猴桃科(Actinidiaceae))、木薯(Manihotesculenta)(大戟科(Euphorbiaceae))、北美鵝掌楸(Firiodendrontulipifera)(木蘭科(Magnoliaceae))、楊樹(Populus)(楊柳科(Salicaceae))、檀香樹(Santalumalbum)(檀香科(Santalaceae))、榆樹(Ulmus)(榆科(Ulmaceae))以(柑桔、小檸檬)的不同物種、裸子植物(例如，白云杉(Piceaglauca)和火炬松(Pinustaeda))、林木(例如，樺木科(Betulaceae)、殼斗科(Fagaceae)、裸子植物以及熱帶樹種)、芋頭、木瓜、芒果、大麥、豆類、木薯、鷹嘴樣的植物。如本文中所使用，所述多個(gè)術(shù)語同義地且可互換地使用。[0110]根據(jù)一具體的實(shí)施例，所述植物是一植物細(xì)胞，例如，在一胚細(xì)胞懸浮液中的植物[0113]如本文中所使用，術(shù)語“非編碼RNA分子”是指未翻譯成一氨基酸序列且未編碼一[0114]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子通常受制于所述RNA沉默加工機(jī)制或活性。然而，本文中還考慮了多個(gè)核苷酸的一些變化(例如，對(duì)于多達(dá)24個(gè)核苷酸的miRNA),其可能引起導(dǎo)致RNA干擾或翻譯抑制的一加工機(jī)制。[0115]根據(jù)一具體的實(shí)施例，所述非編碼RNA分子對(duì)所述細(xì)胞是內(nèi)源性的(自然發(fā)生的，例如，原生的)。應(yīng)當(dāng)理解的是，所述非編碼RNA分子也可以對(duì)所述細(xì)胞是外源性的(即外部添加的，且不是在所述細(xì)胞中自然發(fā)生的)。[0116]根據(jù)一些實(shí)施例，所述非編碼RNA分子包括一固有的翻譯抑制活性。[0118]根據(jù)一些實(shí)施例，所述非編碼RNA分子不包括一固有的翻譯抑制活性或一固有的特異性，且不會(huì)交叉抑制或沉默一第二靶RNA或感興趣的靶RNA,除非設(shè)計(jì)成這樣做(如下所述),與所述靶基因表現(xiàn)出100%或更低的全局同源性，例如低于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%的全局同源性；如通過RT-PCR、免疫印跡、免疫組織化學(xué)及/或流式細(xì)胞儀、測(cè)序或任何其他檢沉默分子”或“RNAi分子”)以一序列特異性方式介導(dǎo)對(duì)基因表達(dá)或翻譯的共轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后[0122]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述RNA沉默分子能夠在轉(zhuǎn)錄過程中介導(dǎo)RNA抑制(共轉(zhuǎn)錄基因沉默)。[0123]根據(jù)一具體的實(shí)施例，共轉(zhuǎn)錄基因沉默包含表觀遺傳沉默(epigenetic[0124]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述RNA沉默分子能夠在轉(zhuǎn)錄后介導(dǎo)RNA抑制(轉(zhuǎn)錄后基因沉默[0125]轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)通常是指多個(gè)信使RNA(mRNA)分子降解或剪切的過程(通分子的一引導(dǎo)鏈與一mRNA分子中的一互補(bǔ)序列配對(duì)，并通過例如Argonaute2(Ago2)誘導(dǎo)剪切。[0126]共轉(zhuǎn)錄基因沉默通常是指基因活性的失活(即轉(zhuǎn)錄抑制),且通常發(fā)生在細(xì)胞核和組蛋白甲基化。因此，在共轉(zhuǎn)錄基因沉默中，一小RNA與一靶RNA的結(jié)合(小RNA-轉(zhuǎn)錄物的相互作用)破壞了所述靶新生轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，且募集多個(gè)DNA和組蛋白修飾酶(即多個(gè)表觀遺傳因子),從而誘導(dǎo)染色質(zhì)重塑為抑制基因活性和轉(zhuǎn)錄的一結(jié)構(gòu)。此外，在共轉(zhuǎn)錄基因沉默中，與染色質(zhì)相關(guān)的多個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA支架可能以獨(dú)立于多個(gè)小RNA而募集多個(gè)染色質(zhì)修飾復(fù)合物。這些共轉(zhuǎn)錄沉默機(jī)制形成多個(gè)RNA監(jiān)視系統(tǒng)，所述系統(tǒng)檢測(cè)并沉默不適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄事件，且通過多個(gè)自我增強(qiáng)的表觀遺傳環(huán)提供這些事件的一記憶(如D.Hoch和D.Moazed中所述，RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控(RNA-mediatedepigeneticregulationof[0127]根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，[0128]根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，所述RNAi生物發(fā)生/加工機(jī)制產(chǎn)生所述RNA沉默分子，但尚未鑒定具體的靶。[0130]以下是根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)特定實(shí)施例可以使用的包括一固有的RNAi活性(例如，是多個(gè)RNA沉默分子)的多個(gè)非編碼RNA分子的詳細(xì)描述。[0132]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子是由一單鏈RNA(ssRNA)前體加工而成。[0133]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子是由一雙鏈結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體加工而成。[0134]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子是由一dsRNA前體(例如，包括完全和不完全的堿基配對(duì))加工而成。[0135]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子是由一非結(jié)構(gòu)化的RNA前體加工而成。[0136]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子是由一蛋白質(zhì)編碼RNA前體加工而成。[0137]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子或所述RNA沉默分子是由一非編碼RNA前體加工而成。[0138]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述dsRNA可以源自兩個(gè)不同的互補(bǔ)RNA,或源自折疊在其自身中多個(gè)長(zhǎng)dsRNA的存在刺激一核糖核酸酶III酶(ribonucleaseIIIenzyme)(稱為dicer)的活性。Dicer(也稱為核糖核酸內(nèi)切酶Dicer或具有RNase基序的解螺旋酶(helicase))是一種在多個(gè)植物中通常被稱為Dicer樣(DCL)蛋白的酶。不同植物具有不同數(shù)量的DCL基因，玉蜀黍基因組具有五個(gè)DCL基因。Dicer參與將所述dsRNA加工成多個(gè)短片段的dsRNA(稱為短干擾RNA(siRNA))的過程。源自dicer活性的siRNA的長(zhǎng)度通常為約21至約23個(gè)核苷酸，且包括具有兩個(gè)3'核苷酸突出端的約19個(gè)堿基對(duì)雙鏈體。[0140]因此，本發(fā)明的一些實(shí)施例考慮修飾用于編碼一dsRNA的一基因，以將一沉默特異性(包含沉默活性)重定向至針對(duì)一第二靶RNA(即感興趣的靶)。于沉默基因表達(dá)而不會(huì)誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)或引起顯著的脫靶作用-例如參見(Strat等人，[0142]術(shù)語“siRNA”是指誘導(dǎo)所述RNA干擾(RNAi)途徑的小的抑制性RNA雙鏈體(通常在18至30個(gè)堿基對(duì)之間)。通常，siRNA被化學(xué)合成為21個(gè)聚體(mer),具有一中心19bp雙鏈體區(qū)域且在末端具有對(duì)稱的2-堿基3'-突出端，盡管最近已經(jīng)描述了化學(xué)合成的25至30個(gè)堿基長(zhǎng)的RNA雙鏈體與在相同位置處具有21個(gè)聚體相比，效力可提高100倍。表明使用較長(zhǎng)的RNA觸發(fā)RNAi所獲得的觀察到的提高效力是由為Dicer提供一基質(zhì)(27個(gè)聚體)而不是一產(chǎn)物(21個(gè)聚體)引起的，這提高了所述siRNA雙鏈體進(jìn)入RISC的速度或效率。[0143]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所述3'-突出端的位置(而不是組成)影響一siRNA的效力，且在反義鏈上具有一3'-突出端的不對(duì)稱雙鏈體通常比在有義鏈上具有所述3'-突出端的不對(duì)稱雙鏈[0144]一雙鏈干擾RNA(例如，siRNA)的多個(gè)鏈可以連接以形成一發(fā)夾(hairpin)或莖環(huán)子也可以是一短發(fā)夾RNA(shRNA)。[0145]如本文中所使用，術(shù)語短發(fā)夾RNA(“shRNA”)是指括互補(bǔ)序列的一第一和第二區(qū)域，互補(bǔ)程度和所述多個(gè)區(qū)域的方向足以使得在所述多個(gè)區(qū)域之間發(fā)生堿基配對(duì)，所述第一和第二區(qū)域通過一環(huán)區(qū)域連接，所述環(huán)是由于所述環(huán)區(qū)域內(nèi)的多個(gè)核苷酸(或多個(gè)核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對(duì)而導(dǎo)致的。所述環(huán)中的多個(gè)核苷一些所述多個(gè)核苷酸可以參與所述環(huán)中的其他核苷酸的堿基配對(duì)交互作用?？梢杂糜谛纬伤霏h(huán)的多個(gè)寡核苷酸序列的實(shí)例包含5'-CAAGAGA-3'和5'-UUACAA-3'(一莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，包括能夠與所述RNAi機(jī)制相互作用的一雙鏈區(qū)。[0146]本發(fā)明的一些實(shí)施例的所述RNA沉默分子不必限于僅含有RNA的那些分子，而是進(jìn)一步包括多個(gè)化學(xué)修飾的核苷酸和非核苷酸。[0147]本發(fā)明考慮了各種類型的siRNA,包含反式作用siRNA(Ta-siRNA)、重復(fù)相關(guān)siRNA(repeat-associatedsiRNA,Ra-siRNA)以及自然反義轉(zhuǎn)錄衍生siRNA(natural-antisensetranscript-derived,Nat-s[0148]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，沉默RNA包含“piRNA”,其是一類Piwi相互作用RNA,長(zhǎng)度約為26和31個(gè)核苷酸。多個(gè)piRNA通常通過與多個(gè)Piwi蛋白質(zhì)相互作用形成多個(gè)RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合[0149]miRNA-根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述RNA沉默分子可以是—miRNA。[0151]最初，所述pre-miRNA是以一長(zhǎng)的非完全雙鏈莖環(huán)RNA的形式存在，進(jìn)一步通過Dicer將其加工成一siRNA樣雙鏈體，包括成熟的引導(dǎo)鏈(miRNA)和一大小相似的片段(稱為[0152]盡管最初以一雙鏈類型與miRNA*存在，但所述miRNA最終變成以一單鏈RNA的形式并入一核糖核蛋白復(fù)合物中，稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。各種蛋白質(zhì)可以形成所述RISC,其可以引起對(duì)miRNA/miRNA*雙鏈體的特異性、所述靶基因的結(jié)合位點(diǎn)、miRNA的活性(抑制或激活)以及所述miRNA/miRNA*雙鏈體的哪一條鏈加載至所述RISC的可變性。[0153]當(dāng)將所述miRNA:miRNA*雙鏈體的所述miRNA鏈加載至所述RISC中時(shí)，移除并降解可能具有基因沉默活性。[0155]許多研究已經(jīng)著眼于miRNA與其mRNA靶之間的所述堿基配對(duì)需求，用于實(shí)現(xiàn)有效個(gè)基因組上的結(jié)合，已表明在所述miRNA的5'端處的堿基2至8位(也稱為“種子序列”)在靶結(jié)合中的一特定作用，但發(fā)現(xiàn)通常為“A”的第一核苷酸的作用也被識(shí)別(Lewis等人，2005年，Cell,120至15)。同樣地，Krek等人使用核苷酸1至7位或2至8位來鑒定和驗(yàn)證多個(gè)靶多數(shù)遺傳識(shí)別的靶中存在多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可能表明多個(gè)RISC的協(xié)同作用提供了最有效的翻譯抑制。[0156]miRNA可能通過兩種機(jī)制之一引導(dǎo)所述RISC下調(diào)基因表達(dá)：mRNA剪切(cleavage)述多個(gè)核苷酸之間?；蛘撸绻鰉iRNA與所述miRNA不具有必要的互補(bǔ)程度，則所述miRNA可以抑制翻譯。由于動(dòng)物在所述miRNA和結(jié)合位點(diǎn)之間的互補(bǔ)性程度較低，因此翻譯抑制在動(dòng)物中可能更為普遍。[0157]應(yīng)注意的是，任何一對(duì)miRNA和miRNA*的所述5’和3'末端中可能存在可變性。變性可能是由于Drosha和Dicer的酶加工中相對(duì)于剪切位點(diǎn)的可變性所致。在miRNA和miRNA*的所述5'和3'末端處的可變性也可能是由于所述pri-miRNA和pre-miRNA的所述多個(gè)莖結(jié)構(gòu)中的不匹配所致。所述多個(gè)莖鏈的不匹配可能引起大量不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所述多個(gè)莖結(jié)構(gòu)中的可變性也可能引起通過Drosha和Dicer剪切多個(gè)產(chǎn)物中的可變性。[0158]應(yīng)理解的是，所述pre-miRNA序列可以包括45至90、60至80或60至70個(gè)核苷酸，而所述pri-miRNA序列可以包括45至30,000、50至25,000、100至20,000、1,000至1,500或80至100個(gè)核苷酸。[0161]反義-反義是一單鏈RNA,旨在通過與其mRNA特異性雜交來防止或抑制一基因的表達(dá)。一靶RNA的下調(diào)可以使用一反義多核苷酸來實(shí)現(xiàn)，所述反義多核苷酸能夠與用于編碼所[0162]如前所述，所述非編碼RNA分子可以不包括一典型(固有的)RNAi活性(例如，不是[0163]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子多個(gè)核酸的核苷酸序列與多個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間的物理連接的一RNA分子，以前稱述核糖體的RNA組成部分，即小核糖體亞基(subunit)或大核糖體亞[0165]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子是一小核RNA(snRNA或U-RNA)。術(shù)語“sRNA”或“U-RNA”是指在多個(gè)真核細(xì)胞中的細(xì)胞核的多個(gè)拼接斑點(diǎn)(splicingspeckle)和多個(gè)卡哈爾體(Cajalbody)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多個(gè)小RNA分子。snRNA的長(zhǎng)度通常約為150個(gè)核苷酸。[0166]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子是一小核仁RNA(smallnucleolarRNA,多個(gè)小RNA分子類別。snoRNA通常分為兩類：C/D盒snoRNA的長(zhǎng)度通常約為70至120個(gè)核苷酸，并與甲基化有關(guān)；且H/ACA盒snoRNA的長(zhǎng)度通常約為100至200核苷酸，并與假尿苷化[0167]與snoRNA相似的是scaRNA(即多個(gè)小卡哈爾體RNA基因(SmallCajalbodyRNAgene)),其在RNA成熟中的且它們對(duì)多個(gè)剪接體snRNA前體(在所述細(xì)胞核的所述多個(gè)卡哈爾體中)進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾。[0168]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子是一細(xì)胞外RNA(extracellularRNA,exRNA)。術(shù)語“exRNA”是指存在于轉(zhuǎn)錄它們的多個(gè)細(xì)胞外部的RNA種類(例如，外泌體RNA[0169]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述非編碼RNA分子是一長(zhǎng)的非編碼RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)。術(shù)語“l(fā)ncRNA”或“長(zhǎng)n物。[0170]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，多個(gè)非編碼RNA分子的非限制性實(shí)例包含但不限于微型RNA[0171]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，多個(gè)RNAi分子的非限制性實(shí)例包含但不限于小干擾RNA[0172]如上所述，本發(fā)明的一些實(shí)施例的方法用于將所述非編碼RNA分子的一沉默活性及/或特異性重定向(或者，如果所述非編碼RNA分子不具有一固有的沉默一RNA分子的能[0174]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，在一植物細(xì)胞中對(duì)用于編碼或被加工成一RNA沉默分子的一基因進(jìn)行修飾的方法包括將—DNA編輯劑引入至所述植物細(xì)胞中，所述DNA編輯劑將所述RNA沉默分子的一沉默活性及/或特異性重定向至針對(duì)一第二靶RNA,所述靶RNA和所述第二靶RNA是不同的，從而對(duì)用于編碼所述RNA沉默分子的所述基因進(jìn)行修飾。沉默分子)的一非自然靶重新編程所述非編碼RNA(例如，RNA沉默分子)的原始特異性。因此，消除了所述非編碼RNA的所述原始特異性(即功能喪失),且新的特異性是針對(duì)不同于所述自然靶(即感興趣的RNA)的一RNA靶，即功能獲得。應(yīng)理解的是，只有在所述非編碼RNA沒有沉默活性的情況下，才會(huì)發(fā)生功能獲得。[0176]如本文中所使用，術(shù)語“靶RNA”是指通過一非編碼RNA分子自然地結(jié)合的一RNA序[0177]如本文中所使用，術(shù)語“第[0178]如本文中所使用，術(shù)語“感[0179]如本文中所使用，短語“沉默一靶基因”是指來自所述靶基因的mRNA及/或蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平的不存在或可觀察到的降低(例如，由于共轉(zhuǎn)錄及/或轉(zhuǎn)錄后基因沉默)。因此，與本發(fā)明沒有通過所述設(shè)計(jì)的非編碼RNA分子靶向的一靶基因相比，一靶基因的沉默可以降低5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。[0180]沉默的結(jié)果可以通過檢查一植物細(xì)胞或整個(gè)植物或其他生物體(從所述植物提取所述設(shè)計(jì)的非編碼RNA分子)的多個(gè)外部特性或通過多種生物化學(xué)技術(shù)來證實(shí)(如下所述)。[0181]應(yīng)理解的是，本發(fā)明的一些實(shí)施例的所述設(shè)計(jì)的非編碼RNA分子可以具有一(些)脫靶(off-target)特異性作用，前提是其不影響農(nóng)業(yè)上有價(jià)值的性狀(例如，生物量、產(chǎn)量等)。[0182]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述第二靶RNA或感興趣的靶RNA對(duì)所述植物細(xì)胞是內(nèi)源性的。示例性內(nèi)源性第二靶RNA或感興趣的靶RNA包含但不限于，對(duì)脅迫、感染、除草劑具有敏感性的一基因產(chǎn)物，或與植物生長(zhǎng)速率、作物產(chǎn)量相關(guān)的一基因產(chǎn)物，如下文中進(jìn)一步討論的。[0183]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述第二靶RNA或感興趣的靶RNA對(duì)所述植物細(xì)胞是外源性的(在本文中也稱為異源性的)。在這種情況下，所述第二靶RNA或感興趣的靶RNA是所述植物基因組非自然部分的一基因產(chǎn)物。示例性外源性第二靶RNA包含但不限于，一植物病原體的一內(nèi)源性核酸序列部分同源)共享序列同一性的一核酸序列。[0184]一內(nèi)源性非編碼RNA分子與一靶RNA的所述特異性結(jié)合可以通過計(jì)算算法(例如，BLAST)來確定，且可以通過包含例如北方墨點(diǎn)法(Northernblot)、原位雜交(InSituhybridization)、QuantiGenePlex分析等方法來鑒定。[0185]通過使用術(shù)語“互補(bǔ)性(complementarity)”或“互補(bǔ)的(complementary)”是指所述非編碼RNA分子(或以所述加工的小RNA形式存在的至少一部分、或一雙鏈多核苷酸的至少一條鏈或其一部分、或一單鏈多核苷酸的一部分)在生理?xiàng)l件下與所述靶RNA或其一片段苷酸的一序列相比時(shí)，一非編碼RNA分子具有100%的序列同一性或至少約30%、40%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。[0186]如本文中所使用，當(dāng)從5'讀至3'的所述多個(gè)序列中的一個(gè)的每一個(gè)核苷酸與從3'讀至5'的另一個(gè)序列的每一個(gè)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，非編碼RNA分子或其加工的小RNA形式稱為顯示出“完全互補(bǔ)性”。與一參考核苷酸序列完全互補(bǔ)的一核苷酸序列將顯示出與所述參考核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列一相同的序列。[0187]確定序列互補(bǔ)性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且包含但不限于本領(lǐng)域眾所周知的[0188]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，如果所述非編碼RNA分子是一siRNA或被加工成一siRNA,則與其靶序列的互補(bǔ)性在90至100%(例如，100%)的范圍內(nèi)。[0189]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，如果所述非編碼RNA分子是一miRNA或piRNA、或被加工成一miRNA或piRNA,則與其靶序列的互補(bǔ)性在33至100%的范圍內(nèi)。[0190]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，如果所述非編碼RNA分子是一miRNA,則與其靶序列的種子序列互補(bǔ)性(即從所述5'的核苷酸2至8位)在85至100%(例如，100%)的范圍內(nèi)。[0191]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，可以將所述非編碼RNA進(jìn)一步加工成一小RNA形式(例如，將pre-的miRNA序列)來測(cè)量同源性。[0193]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，與所述靶序列的互補(bǔ)性至少是所述加工的小RNA形式的約33%[0194]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，與所述靶序列的互補(bǔ)性至少是所述加工的小RNA形式的約45%[0195]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，通常將所述非編碼RNA分子(即在修飾之前)選為針對(duì)所述第二靶RNA或感興趣的靶RNA的所述序列具有約10%、20%80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或高達(dá)99%互補(bǔ)性的分子。[0197]根據(jù)一具體的實(shí)施例，通常將所述非編碼RNA分子(即在修飾之前)選為針對(duì)所述[0198]根據(jù)一具體的實(shí)施例，通常將所述非編碼RNA分子(即在修飾之前)選為針對(duì)所述[0199]根據(jù)一具體的實(shí)施例，通常將所述非編碼RNA分子(即在修飾之前)選為針對(duì)所述[0201]根據(jù)一具體的實(shí)施例，通常將所述非編碼RNA分子(即在修飾之前)選為針對(duì)所述[0203]根據(jù)一具體的實(shí)施例，通常將所述非編碼RNA分子(即在修飾之前)選為針對(duì)所述[0205]根據(jù)一具體的實(shí)施例，通常將所述非編碼RNA分子(即在修飾之前)選為針對(duì)所述[0206]根據(jù)一具體的實(shí)施例，通常將所述非編碼RNA分子(即在修飾之前)選為針對(duì)所述[0208]根據(jù)一具體的實(shí)施例，通常將所述非編碼RNA分子(即在修飾之前)選為針對(duì)所述靶RNA或感興趣的靶RNA的所述序列包括至少約33%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%的互補(bǔ)[0230]為了誘導(dǎo)一非編碼RNA分子的沉默活性及/或特異性或?qū)⒁环蔷幋aRNA分子(例如，[0231]以下是用于將多個(gè)核酸改變引入至用于編碼一非編碼使用人工工程核酸酶在所述基因組中(多個(gè))所需的位置切割并產(chǎn)生多個(gè)特定雙鏈斷裂重組(homologousrecombination,HR)或非同源末端連接(non-homologousend-joining,HR利用一同源供體序列作為一模板(即S期形成的姐妹染色單體)用于在所述斷裂位點(diǎn)再而導(dǎo)致多次切割，而這些切割并不限于一所需的位置。為了克特定的(site-specific)單鏈或雙鏈斷裂(DSB),迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種不同類別的核酸具有多個(gè)非常長(zhǎng)的識(shí)別序列(>14bp),因此使其用于在一所需的位置處進(jìn)行切割自然地具[0235]這可以用來在基因組編輯中制造多個(gè)位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂(DSB)。本領(lǐng)域技術(shù)人克服這一挑戰(zhàn)，誘變(mutagenesis)和高通量篩選方法已用于產(chǎn)生識(shí)別多個(gè)獨(dú)特序列的多個(gè)兆核酸酶變體。例如，已經(jīng)融合了各種兆核酸酶以產(chǎn)生識(shí)別一新序列的多個(gè)雜化134、8,133,697、8,143,015、8,143,016、8,148,098或8,163,514中所述的方法設(shè)計(jì)兆核酸酶，每個(gè)內(nèi)容通過引用整體并入本文中?；蛘撸梢允褂蒙虡I(yè)上可獲得的技術(shù)(例如，PrecisionBiosciences的定向核酸酶編輯器TM(DirectedNucleaseEditorT)基因組編輯技術(shù))來獲得具有位點(diǎn)特異性切割特征的兆核酸酶。[0237]ZFNs和TALENs-兩種不同的工程核酸酶，鋅指核酸酶(ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)均被證明能有效地產(chǎn)生多個(gè)靶向雙鏈斷裂(DSB)(Christian等人，2010年；其DNA識(shí)別位點(diǎn)和剪切位點(diǎn)彼此分開的一限制性酶。分開所述剪切部分然后連接至一D合域，從而產(chǎn)生對(duì)一所需的序列具有非常高特異性的一核酸內(nèi)切酶。具有這種性質(zhì)的一示例性限制酶是Fok1。另外，F(xiàn)okl的優(yōu)點(diǎn)是需要二聚化(dimerization)才能具有核酸酶活性，這意味著隨著每個(gè)核酸酶伙伴識(shí)別一獨(dú)特的DNA序列，所述特異性會(huì)顯著地增加。為了增強(qiáng)此效果，已經(jīng)工程化了多個(gè)Fok1核酸酶，其僅可以作為多個(gè)異二聚體(heterodimer)起作用(homodimer)活性的可能性，因此增加了所述雙鏈斷裂(DSB)的特異性。[0239]因此，例