shRNA干擾JNK基因表達對小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的影響研究一、引言1.1研究背景與意義惡性腫瘤，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其高死亡率和高復(fù)發(fā)率一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待攻克的難題。腫瘤轉(zhuǎn)移，尤其是淋巴道轉(zhuǎn)移，更是導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。當(dāng)腫瘤細(xì)胞突破原發(fā)部位，通過淋巴系統(tǒng)擴散至其他淋巴結(jié)甚至遠(yuǎn)處器官時，病情往往迅速惡化，治療難度大幅增加。這不僅給患者帶來了巨大的身體痛苦和心理壓力，也給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計，許多常見癌癥，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等，一旦發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率會顯著降低。因此，深入研究腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的機制，尋找有效的干預(yù)靶點，對于提高腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。肝癌，作為消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，同樣面臨著淋巴道轉(zhuǎn)移的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。在肝癌的發(fā)展進程中，淋巴道轉(zhuǎn)移是一個常見且危險的階段。一旦癌細(xì)胞侵入淋巴系統(tǒng)，它們便能夠借助淋巴循環(huán)迅速擴散至肝門淋巴結(jié)、腹腔淋巴結(jié)等，甚至進一步轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處的淋巴結(jié)。這種轉(zhuǎn)移不僅增加了手術(shù)切除的難度，還容易引發(fā)一系列并發(fā)癥，如淋巴結(jié)腫大壓迫周圍組織、淋巴液回流受阻導(dǎo)致的水腫等，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。研究表明，發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的肝癌患者，其生存率明顯低于未轉(zhuǎn)移患者，且復(fù)發(fā)風(fēng)險更高。因此，針對肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的研究具有極高的臨床價值，對于改善肝癌患者的治療效果和生存狀況具有重要的推動作用。JNK（c-JunN-terminalkinase）基因，作為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族的重要成員之一，在細(xì)胞的多種生理和病理過程中扮演著關(guān)鍵角色。JNK基因家族包含三個成員：JNK1、JNK2和JNK3，它們通過不同的剪接方式產(chǎn)生多種異構(gòu)體，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程。在正常生理狀態(tài)下，JNK信號通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，維持著細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，JNK信號通路常常出現(xiàn)異常激活或抑制，從而影響腫瘤細(xì)胞的行為。越來越多的研究表明，JNK基因與腫瘤的關(guān)系密切，其在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在某些腫瘤中，JNK的激活能夠促進腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，增強其侵襲能力；而在另一些腫瘤中，JNK的激活則可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)展。這種雙重作用使得JNK基因成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點之一。針對JNK基因在腫瘤中的作用機制，目前的研究主要集中在其對腫瘤細(xì)胞信號通路的調(diào)控上。JNK激活后，可以使核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的Ser63和Ser73位點磷酸化，進而激活c-Jun增強其轉(zhuǎn)錄活性。c-Jun氨基末端的磷酸化還可以促進c-Jun/c-Fos異二聚體及c-Jun同二聚體形成，這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到許多基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（AP-1）位點，增加特定基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等行為。此外，JNK激活后還可以使轉(zhuǎn)錄因子SMAD3和ATF2磷酸化，進一步調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達。在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的研究中，JNK基因也逐漸受到關(guān)注。一些研究初步發(fā)現(xiàn)，JNK基因的表達水平與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移可能存在關(guān)聯(lián)，但其具體的作用機制尚不清楚。深入探究JNK基因在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用機制，不僅有助于我們從分子層面深入理解肝癌的轉(zhuǎn)移機制，為肝癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)；還可能為開發(fā)針對JNK基因的靶向治療藥物提供思路，從而為肝癌患者帶來新的治療希望。通過抑制JNK基因的異常表達或活性，有望阻斷肝癌細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移途徑，降低腫瘤的復(fù)發(fā)率和死亡率，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。因此，本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1JNK基因研究現(xiàn)狀JNK基因作為MAPK超家族的關(guān)鍵成員，在細(xì)胞生理和病理過程中的重要作用已成為國內(nèi)外研究的焦點。國外研究起步較早，在JNK基因的結(jié)構(gòu)與功能解析方面取得了眾多開創(chuàng)性成果。早期研究就已明確JNK基因家族包含JNK1、JNK2和JNK3三個成員，并通過不同剪接方式產(chǎn)生多種異構(gòu)體，這些異構(gòu)體在組織分布和功能上存在差異。如JNK3的表達主要局限于腦、心臟、睪丸、胰島等特定組織，而JNK1和JNK2的表達則更為廣泛。在JNK信號通路的激活機制研究中，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)JNK可被多種細(xì)胞外應(yīng)激信號激活，如紫外線照射、熱休克、細(xì)胞因子等。其激活過程涉及一系列復(fù)雜的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，直接上游激酶MKK4和MKK7通過雙磷酸化JNK的Thr183和Tyr185位點，從而激活JNK。激活后的JNK進一步使核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的Ser63和Ser73位點磷酸化，增強c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性，進而促進c-Jun/c-Fos異二聚體及c-Jun同二聚體形成，這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到基因啟動子區(qū)的AP-1位點，調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄。此外，JNK激活還能使轉(zhuǎn)錄因子SMAD3和ATF2磷酸化，參與基因表達調(diào)控。國內(nèi)學(xué)者在JNK基因研究方面也取得了顯著進展，尤其在JNK信號通路與疾病的關(guān)聯(lián)研究中成果豐碩。例如，在神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域，國內(nèi)團隊深入探究了JNK信號通路在帕金森病、阿爾茨海默病中的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，在帕金森病模型中，異常激活的JNK信號通路可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元凋亡，通過抑制JNK的活性，能夠有效減少神經(jīng)元損傷，為帕金森病的治療提供了新的潛在靶點。在腫瘤研究方面，國內(nèi)研究揭示了JNK信號通路在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中的復(fù)雜作用。在乳腺癌中，JNK的激活可能促進腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而在某些情況下，JNK的激活又能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這種雙重作用與腫瘤的微環(huán)境、細(xì)胞類型等因素密切相關(guān)。1.2.2shRNA技術(shù)研究現(xiàn)狀shRNA技術(shù)作為一種高效、特異的基因沉默技術(shù)，近年來在國內(nèi)外得到了廣泛深入的研究和應(yīng)用。國外在shRNA技術(shù)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)方面處于領(lǐng)先地位，不斷推動技術(shù)的創(chuàng)新和優(yōu)化。在載體構(gòu)建方面，研發(fā)了多種類型的shRNA載體，包括質(zhì)粒載體、病毒載體（如腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒）和細(xì)胞遞送顆粒（如脂質(zhì)體、納米顆粒）等。不同載體各有優(yōu)缺點，質(zhì)粒載體操作簡單、成本低廉，但轉(zhuǎn)染效率受細(xì)胞類型限制，體內(nèi)應(yīng)用穩(wěn)定性和效率較低；病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，能實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達，但存在安全性問題，如病毒引起的免疫應(yīng)答和潛在致病性；細(xì)胞遞送顆粒轉(zhuǎn)染效率較高且相對安全，但穩(wěn)定表達和遞送效率仍有待提高。為了提高shRNA的沉默效率和特異性，國外研究人員在序列設(shè)計上進行了大量探索，通過生物信息學(xué)分析和實驗驗證，優(yōu)化靶向序列，減少脫靶效應(yīng)。同時，還將多個shRNA序列并聯(lián)在一個載體上，或者設(shè)計更為復(fù)雜的miRNA調(diào)控載體，以增強基因沉默效果。在應(yīng)用方面，shRNA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因功能研究、藥物開發(fā)和疾病治療等領(lǐng)域。例如，在基因功能研究中，通過構(gòu)建穩(wěn)定敲低細(xì)胞株，深入研究基因表達對細(xì)胞生長、分化及信號傳導(dǎo)的影響；在藥物開發(fā)中，利用shRNA特異性沉默致病基因，驗證藥物靶點，篩選能夠影響目標(biāo)基因表達的化合物。國內(nèi)在shRNA技術(shù)研究方面也緊跟國際步伐，在技術(shù)改進和臨床應(yīng)用探索上取得了一定成果。在載體構(gòu)建和優(yōu)化方面，國內(nèi)科研團隊致力于開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型載體系統(tǒng)，提高載體的安全性和轉(zhuǎn)染效率。例如，通過對病毒載體的包裝信號和調(diào)控元件進行改良，增強shRNA的表達水平和持續(xù)效果。在疾病治療研究中，國內(nèi)積極開展基于shRNA技術(shù)的腫瘤、遺傳病等疾病的基因治療研究。在腫瘤治療方面，針對腫瘤相關(guān)基因設(shè)計shRNA，通過抑制腫瘤基因的表達，達到抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的目的；在遺傳病治療研究中，利用shRNA技術(shù)沉默致病基因，為某些單基因遺傳病的治療提供了新的策略。1.2.3肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移研究現(xiàn)狀肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者預(yù)后，國內(nèi)外對其機制和防治的研究從未停止。國外在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機制研究方面投入了大量精力，取得了一系列重要發(fā)現(xiàn)。研究表明，腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。EMT過程使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，從而增強癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。多種信號通路參與調(diào)控EMT過程，如TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin等信號通路，這些信號通路的異常激活與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、趨化因子等也對肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響。例如，腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）能夠促進淋巴管生成，為腫瘤細(xì)胞進入淋巴系統(tǒng)提供通道，進而增加淋巴道轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的診斷和治療方面，國外也取得了顯著進展。在診斷技術(shù)上，不斷開發(fā)和優(yōu)化影像學(xué)檢查方法，如能譜CT、MRI等，提高對肝癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢測準(zhǔn)確性。通過分析影像學(xué)參數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為臨床診斷提供更可靠的依據(jù)。在治療策略上，除了傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療外，靶向治療和免疫治療成為研究熱點。針對參與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子和信號通路，研發(fā)靶向藥物，如抗VEGF-C抗體等，試圖阻斷腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移途徑。同時，免疫治療通過激活機體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞，在肝癌治療中展現(xiàn)出一定的療效，為肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的治療帶來了新的希望。國內(nèi)在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移研究方面也成果斐然，結(jié)合國內(nèi)肝癌發(fā)病特點和臨床實踐，開展了一系列具有特色的研究。在分子機制研究中，國內(nèi)學(xué)者深入探討了多種基因和蛋白在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些微小RNA（miRNA）通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，參與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移過程。miR-21等在肝癌組織中表達上調(diào)，通過抑制其靶基因的表達，促進肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在臨床研究方面，國內(nèi)注重多學(xué)科協(xié)作，綜合運用多種診斷方法和治療手段，提高肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移患者的治療效果。通過開展大規(guī)模的臨床研究，探索適合我國肝癌患者的個體化治療方案，為臨床實踐提供了重要的參考依據(jù)。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在深入探究通過shRNA抑制JNK表達后，對小鼠肝癌細(xì)胞株淋巴道轉(zhuǎn)移能力的影響，揭示JNK基因在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移過程中的潛在作用機制。具體而言，通過構(gòu)建針對JNK基因的shRNA表達載體，并將其導(dǎo)入小鼠肝癌細(xì)胞株，觀察細(xì)胞中JNK基因的表達變化，以及細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為的改變，明確JNK基因表達與肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移之間的內(nèi)在聯(lián)系，為肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。1.3.2研究內(nèi)容（1）構(gòu)建針對JNK基因的shRNA表達載體：依據(jù)JNK基因序列，運用生物信息學(xué)方法精心設(shè)計特異性的shRNA序列，然后將其克隆至合適的表達載體中，如慢病毒載體或質(zhì)粒載體。對構(gòu)建好的載體進行測序驗證，確保shRNA序列的準(zhǔn)確性和載體的完整性。（2）轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞株：采用合適的轉(zhuǎn)染方法，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等，將構(gòu)建好的shRNA表達載體導(dǎo)入小鼠肝癌細(xì)胞株中。設(shè)置對照組，包括空白對照組（未轉(zhuǎn)染任何載體的肝癌細(xì)胞）和陰性對照組（轉(zhuǎn)染非特異性shRNA表達載體的肝癌細(xì)胞）。通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，利用定量PCR和Westernblot等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中JNK基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達情況，篩選出JNK基因表達顯著下調(diào)的細(xì)胞株用于后續(xù)實驗。（3）檢測細(xì)胞生物學(xué)行為變化：對轉(zhuǎn)染后的小鼠肝癌細(xì)胞株進行一系列生物學(xué)行為檢測。運用CCK-8法或MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，繪制細(xì)胞生長曲線，分析JNK表達抑制對細(xì)胞增殖速率的影響；采用Transwell小室實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，觀察細(xì)胞穿過人工基底膜的數(shù)量和形態(tài)變化，評估JNK表達抑制對細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的作用；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，分析JNK表達抑制是否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白的表達變化。（4）建立小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型：選取合適的小鼠品系，如BALB/c小鼠或C57BL/6小鼠，將轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞通過尾靜脈注射、肝內(nèi)注射或皮下注射等方式接種到小鼠體內(nèi)，建立肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型。定期觀察小鼠的生長狀態(tài)、體重變化和腫瘤形成情況，通過活體成像技術(shù)或解剖學(xué)方法監(jiān)測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。（5）分析JNK表達與淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系：在小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型中，通過免疫組化、免疫熒光等技術(shù)檢測腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中JNK基因的表達水平，分析JNK表達與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。進一步研究JNK信號通路下游相關(guān)分子的表達變化，探討JNK基因影響肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的潛在分子機制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用實驗研究方法，通過構(gòu)建shRNA表達載體抑制小鼠肝癌細(xì)胞株中JNK基因的表達，進而研究其對細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移能力的影響及作用機制。具體研究方法如下：shRNA表達載體的構(gòu)建：運用生物信息學(xué)軟件，如BLAST等，對JNK基因序列進行分析，設(shè)計特異性的shRNA序列。參考相關(guān)文獻及數(shù)據(jù)庫，選取干擾效率高、脫靶效應(yīng)低的序列。將設(shè)計好的shRNA序列合成雙鏈DNA片段，通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)，將其克隆至合適的表達載體（如慢病毒載體pLKO.1）中。利用熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，挑取單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒，通過測序驗證shRNA序列的準(zhǔn)確性和載體的完整性。細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：復(fù)蘇小鼠肝癌細(xì)胞株（如H22細(xì)胞），在含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)期，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行轉(zhuǎn)染。將構(gòu)建好的shRNA表達載體與脂質(zhì)體按照一定比例混合，加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染6-8小時后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時設(shè)置空白對照組（未轉(zhuǎn)染任何載體的肝癌細(xì)胞）和陰性對照組（轉(zhuǎn)染非特異性shRNA表達載體的肝癌細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染48-72小時后，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，利用定量PCR和Westernblot等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中JNK基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達情況。細(xì)胞生物學(xué)行為檢測：細(xì)胞增殖能力檢測采用CCK-8法，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于96孔板中，每組設(shè)置多個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0、24、48、72小時后，向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時。用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測采用Transwell小室實驗，在上室加入轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液，下室加入含有趨化因子（如FBS）的培養(yǎng)基。遷移實驗中，小室上室不鋪基質(zhì)膠；侵襲實驗中，小室上室預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠。培養(yǎng)一定時間后，取出小室，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，固定、染色下室的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并計數(shù)穿過小室的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞凋亡率檢測采用流式細(xì)胞術(shù)，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用BindingBuffer重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-30分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例。小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型的建立：選取6-8周齡的BALB/c小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞用PBS調(diào)整至合適濃度，通過尾靜脈注射（1×10?-5×10?個細(xì)胞/只）的方式接種到小鼠體內(nèi)。定期觀察小鼠的生長狀態(tài)、體重變化和腫瘤形成情況。接種后2-4周，通過活體成像技術(shù)（如小動物活體成像系統(tǒng)）監(jiān)測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。當(dāng)小鼠出現(xiàn)明顯的腫瘤癥狀或體重下降時，處死小鼠，解剖取出肝臟、腫瘤組織和淋巴結(jié)，進行后續(xù)檢測。JNK表達與淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)系的分析：采用免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中JNK基因的表達水平。將組織標(biāo)本制成石蠟切片或冰凍切片，進行抗原修復(fù)、封閉等處理后，分別加入抗JNK抗體和相應(yīng)的二抗，進行孵育、顯色（免疫組化）或熒光標(biāo)記（免疫熒光）。在顯微鏡下觀察JNK蛋白的表達部位和強度，分析JNK表達與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。利用Westernblot技術(shù)檢測JNK信號通路下游相關(guān)分子（如c-Jun、p-c-Jun、SMAD3、p-SMAD3等）的表達變化，探討JNK基因影響肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的潛在分子機制。技術(shù)路線圖展示了本研究的整體流程（圖1），從shRNA表達載體的構(gòu)建開始，經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、細(xì)胞生物學(xué)行為檢測，到小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型的建立，再到JNK表達與淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)系的分析，各環(huán)節(jié)緊密相連，逐步深入探究JNK基因與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的內(nèi)在聯(lián)系。[此處插入技術(shù)路線圖，圖注：圖1研究技術(shù)路線圖，詳細(xì)標(biāo)注各步驟及相關(guān)實驗方法][此處插入技術(shù)路線圖，圖注：圖1研究技術(shù)路線圖，詳細(xì)標(biāo)注各步驟及相關(guān)實驗方法]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1JNK基因概述JNK基因，全稱為c-JunN-terminalkinase基因，是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族的重要成員，在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。JNK基因家族包含三個成員：JNK1、JNK2和JNK3，它們分別由位于不同染色體上的基因編碼。JNK1基因定位于10號染色體，JNK2基因位于5號染色體，JNK3基因則在4號染色體上。這些基因通過不同的剪接方式，產(chǎn)生多種異構(gòu)體，從而豐富了JNK蛋白的種類和功能。研究發(fā)現(xiàn)，JNK1和JNK2基因在全身組織中廣泛表達，參與維持細(xì)胞的正常生理功能以及應(yīng)對各種生理和病理刺激。而JNK3基因的表達則具有明顯的組織特異性，主要局限于腦、心臟、睪丸和胰島等組織，這表明JNK3在這些特定組織中可能發(fā)揮著獨特且不可或缺的作用，其功能異?？赡芘c這些組織相關(guān)的疾病密切相關(guān)。從結(jié)構(gòu)上看，JNK蛋白由11類亞單位構(gòu)成，其獨特的結(jié)構(gòu)賦予了它特定的生物學(xué)功能。JNK蛋白的N末端凸出部分在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中起著至關(guān)重要的定位作用，它能夠精準(zhǔn)地識別并結(jié)合ATP，為JNK蛋白的激活和后續(xù)的信號傳遞提供能量支持。而C末端凸出部分則主要負(fù)責(zé)識別底物，通過與底物的特異性結(jié)合，將磷酸基團從ATP轉(zhuǎn)移到底物上，實現(xiàn)對底物的磷酸化修飾，進而調(diào)控底物的活性和功能，影響細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)過程。JNK信號通路的激活是一個復(fù)雜而有序的過程，受到多種細(xì)胞外刺激信號的精細(xì)調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞受到紫外線照射、熱休克、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1等）以及生長因子等刺激時，JNK信號通路被激活。在這一過程中，一系列激酶依次被激活，形成一個有序的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)。具體來說，JNK的直接上游激酶MKK4和MKK7在外界刺激的作用下被激活，它們能夠特異性地識別JNK蛋白，并對JNK的Thr183和Tyr185位點進行雙磷酸化修飾。這種磷酸化修飾如同一個“開關(guān)”，使JNK蛋白從無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚誀顟B(tài)，從而激活JNK信號通路，啟動后續(xù)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)事件。激活后的JNK蛋白進一步發(fā)揮其生物學(xué)功能，通過對下游多種轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化修飾，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達，進而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。其中，c-Jun是JNK信號通路中一個重要的下游轉(zhuǎn)錄因子。JNK激活后，可以使核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的Ser63和Ser73位點磷酸化，這種磷酸化修飾顯著增強了c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性。同時，c-Jun氨基末端的磷酸化還能夠促進c-Jun/c-Fos異二聚體及c-Jun同二聚體的形成，這些轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物可以特異性地結(jié)合到許多基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（AP-1）位點，與DNA序列相互作用，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，增加特定基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。此外，JNK激活后還可以使轉(zhuǎn)錄因子SMAD3和ATF2磷酸化，進一步調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達，參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡等過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。2.2shRNA技術(shù)原理shRNA（shorthairpinRNA），即短發(fā)夾RNA，是一種人工合成的非編碼小RNA分子，在基因表達調(diào)控領(lǐng)域具有重要作用，其作用機制基于RNA干擾（RNAinterference，RNAi）現(xiàn)象。RNAi是生物體內(nèi)一種高度保守的基因表達調(diào)控機制，通過雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)，特異性地降解與之互補配對的靶mRNA，從而實現(xiàn)對特定基因表達的抑制。shRNA分子的設(shè)計精妙且獨特，它包含兩個短反向重復(fù)序列，這兩個序列之間由一段莖環(huán)（loop）序列分隔，共同構(gòu)成了發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。這種特殊的結(jié)構(gòu)是shRNA發(fā)揮作用的關(guān)鍵基礎(chǔ)。在細(xì)胞內(nèi)，shRNA首先被轉(zhuǎn)運至特定的位置，隨后被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶復(fù)合物識別并切割。其中，Dicer酶在這一過程中扮演著重要角色，它能夠?qū)hRNA精確切割成小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA由約21-23個核苷酸組成，具有雙鏈結(jié)構(gòu)，且兩端各有2-3個核苷酸的突出末端。形成的siRNA會與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)相互作用，組裝成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，siRNA的一條鏈會被降解，而另一條鏈，即引導(dǎo)鏈（guidestrand），則會保留在RISC中，并引導(dǎo)RISC識別并結(jié)合靶mRNA。這一識別過程基于堿基互補配對原則，引導(dǎo)鏈與靶mRNA上的互補序列特異性結(jié)合，使得RISC中的核酸酶能夠?qū)Π衜RNA進行切割，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解，最終實現(xiàn)對靶基因表達的有效抑制。相較于其他基因沉默技術(shù)，shRNA技術(shù)具有諸多顯著優(yōu)勢。首先，shRNA技術(shù)具有高度的特異性。其設(shè)計是基于對靶基因序列的精確分析，通過精心設(shè)計的shRNA序列，能夠精準(zhǔn)地靶向目標(biāo)基因，而對其他非目標(biāo)基因的影響極小，從而大大降低了脫靶效應(yīng)的發(fā)生概率。這種高度特異性使得shRNA技術(shù)在基因功能研究和疾病治療中能夠準(zhǔn)確地作用于目標(biāo)基因，提高研究和治療的準(zhǔn)確性和有效性。其次，shRNA技術(shù)具有較高的沉默效率。由于shRNA能夠在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達并不斷產(chǎn)生siRNA，從而持續(xù)地對靶mRNA進行降解，因此能夠?qū)崿F(xiàn)對靶基因表達的高效抑制。這種高效性使得shRNA技術(shù)在研究基因功能和治療疾病時，能夠更快速、更有效地觀察到基因表達變化所帶來的生物學(xué)效應(yīng)。再者，shRNA技術(shù)具有良好的穩(wěn)定性和持續(xù)性。shRNA可以通過載體轉(zhuǎn)染或病毒感染等方式導(dǎo)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達，持續(xù)發(fā)揮基因沉默作用。這一特性使得shRNA技術(shù)能夠滿足長期研究和治療的需求，例如在建立穩(wěn)定的細(xì)胞模型或進行長期的疾病治療時，shRNA技術(shù)能夠提供持續(xù)穩(wěn)定的基因沉默效果。此外，shRNA技術(shù)的操作相對簡便。與一些復(fù)雜的基因編輯技術(shù)相比，shRNA技術(shù)的實驗流程相對簡單，所需的實驗設(shè)備和技術(shù)要求相對較低，易于在大多數(shù)實驗室中開展。這使得shRNA技術(shù)能夠被更廣泛的科研人員所應(yīng)用，推動了基因功能研究和疾病治療領(lǐng)域的發(fā)展。綜上所述，shRNA技術(shù)憑借其獨特的作用機制和顯著的優(yōu)勢，在基因功能研究、疾病治療、藥物開發(fā)等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。通過深入研究和不斷優(yōu)化，shRNA技術(shù)有望為解決人類健康問題提供更加有效的手段和方法。2.3肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移機制肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜且多步驟的過程，涉及腫瘤細(xì)胞與周圍微環(huán)境之間的相互作用，以及一系列分子機制的調(diào)控。了解這些機制對于深入認(rèn)識肝癌的進展和開發(fā)有效的治療策略至關(guān)重要。腫瘤細(xì)胞首先需突破原發(fā)腫瘤的基底膜，這是淋巴道轉(zhuǎn)移的起始步驟。在這一過程中，腫瘤細(xì)胞會分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分，包括膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞的遷移開辟道路。研究表明，在肝癌組織中，MMP-2和MMP-9的表達水平顯著高于正常肝組織，且其高表達與肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過抑制MMP-2和MMP-9的活性，可以有效減少腫瘤細(xì)胞對基底膜的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。腫瘤細(xì)胞在降解基底膜后，會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的生物學(xué)過程。在這一過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin的表達下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白N-cadherin、Vimentin等的表達上調(diào)。同時，一些轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug和Twist等在EMT過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。這些轉(zhuǎn)錄因子可以與E-cadherin基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進EMT的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，Snail的高表達與E-cadherin的低表達以及肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。通過干擾Snail的表達，可以逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的EMT過程，降低其遷移和侵襲能力。發(fā)生EMT后的腫瘤細(xì)胞獲得了更強的遷移和侵襲能力，它們開始向周圍的淋巴管浸潤。腫瘤細(xì)胞表面表達的多種趨化因子受體與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的趨化因子相互作用，引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向淋巴管遷移。例如，腫瘤細(xì)胞表面的CXCR4受體與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的CXCL12趨化因子特異性結(jié)合，形成CXCL12-CXCR4軸，該軸能夠激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多種信號通路，如PI3K-Akt、MAPK等，促進腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。研究表明，阻斷CXCL12-CXCR4軸可以顯著抑制肝癌細(xì)胞向淋巴管的浸潤。此外，腫瘤細(xì)胞還可以通過與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子相互作用，如整合素、選擇素等，實現(xiàn)與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，進而進入淋巴管。進入淋巴管的腫瘤細(xì)胞會隨著淋巴液的流動到達局部淋巴結(jié)。在淋巴結(jié)中，腫瘤細(xì)胞需要逃避機體的免疫監(jiān)視，才能在淋巴結(jié)中存活和增殖，形成轉(zhuǎn)移灶。腫瘤細(xì)胞可以通過多種方式逃避免疫監(jiān)視，如分泌免疫抑制因子、下調(diào)腫瘤相關(guān)抗原的表達等。腫瘤細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、白細(xì)胞介素10（IL-10）等免疫抑制因子，可以抑制T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，降低機體的免疫應(yīng)答。同時，腫瘤細(xì)胞還可以通過下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子的表達，減少腫瘤相關(guān)抗原的呈遞，使免疫細(xì)胞難以識別和攻擊腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，TGF-β和IL-10的表達水平顯著升高，且與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。除了上述細(xì)胞水平的機制外，肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移還受到多種分子信號通路的調(diào)控。其中，VEGF-C/VEGFR-3信號通路在肝癌淋巴管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。VEGF-C是一種特異性作用于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，它可以與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-3受體結(jié)合，激活下游的信號通路，促進淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進淋巴管生成。研究表明，在肝癌組織中，VEGF-C的表達水平顯著高于正常肝組織，且其高表達與肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過抑制VEGF-C/VEGFR-3信號通路，可以減少淋巴管生成，從而抑制肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移。此外，Notch信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等也參與了肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的調(diào)控，它們通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，影響肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細(xì)胞株與實驗動物選用小鼠肝癌淋巴高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-F，該細(xì)胞株由本實驗室前期從腹水型肝癌細(xì)胞株H22中篩選獲得，具有穩(wěn)定的淋巴道轉(zhuǎn)移能力，是研究肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移機制的理想細(xì)胞模型。其遺傳背景清晰，生物學(xué)特性穩(wěn)定，能夠為實驗提供可靠的研究對象。實驗動物采用近交系615小鼠，雄性，4-6周齡，體重18-22g。615小鼠是我國自行培育的近交系小鼠，具有遺傳背景一致、個體差異小等優(yōu)點，對腫瘤的易感性較高，適合用于建立肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移動物模型。實驗小鼠購自[供應(yīng)商名稱]，在本實驗室動物房進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。動物房環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，嚴(yán)格遵守動物倫理和福利要求，確保實驗動物的健康和實驗結(jié)果的可靠性。3.1.2主要實驗儀器與試劑實驗所需的主要儀器如下：LifeExpressPCR儀（大和公司，日本），用于基因擴增反應(yīng)，具有升降溫速度快、溫度均一性好等優(yōu)點，能夠精確控制PCR反應(yīng)的溫度條件，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；紫外分光光度計HP8453（HP公司，德國），用于核酸和蛋白濃度的測定，通過測量樣品在特定波長下的吸光度，能夠準(zhǔn)確計算出核酸和蛋白的濃度，為后續(xù)實驗提供重要的參數(shù)依據(jù)；凝膠圖像分析系統(tǒng)BioSenSC300（上海山富科學(xué)儀器有限公司），可對核酸凝膠電泳結(jié)果進行成像和分析，通過對凝膠圖像的灰度值分析，能夠定量檢測核酸的含量和純度，直觀展示實驗結(jié)果；低溫高速離心機Biofuge28RS（Heraeus公司，德國），主要用于細(xì)胞和核酸的離心分離，具備高速離心和低溫控制功能，能夠有效保護生物樣品的活性和完整性；恒溫水浴箱ModelDK-8D（上海森信實驗儀器有限公司），為實驗提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，用于核酸變性、雜交等實驗步驟；恒溫?fù)u床（江蘇太倉科教儀器有限公司），在細(xì)菌培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)等實驗中用于振蕩培養(yǎng)，促進細(xì)胞生長和物質(zhì)交換。主要試劑包括：pSilencer質(zhì)粒（上海之江生物公司），作為shRNA的表達載體，具有穩(wěn)定的復(fù)制和表達能力，能夠?qū)hRNA導(dǎo)入細(xì)胞并實現(xiàn)穩(wěn)定表達；Trizol（Invitrogen公司），用于細(xì)胞總RNA的提取，能夠高效裂解細(xì)胞，完整地提取細(xì)胞內(nèi)的RNA，為后續(xù)的RT-PCR等實驗提供高質(zhì)量的RNA模板；引物（Invitrogen公司），根據(jù)JNK基因序列設(shè)計合成，用于RT-PCR擴增JNK基因，具有高度的特異性和擴增效率；逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV、Taq酶（Promega公司），分別用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴增反應(yīng)，能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板進行PCR擴增，實現(xiàn)基因的體外擴增和檢測；瓊脂糖（Biowest公司），用于制備核酸凝膠電泳的凝膠，具有良好的凝膠強度和分辨率，能夠清晰地分離不同大小的核酸片段；DNAMarkerDL2000、限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶（Takara公司），DNAMarker用于核酸電泳時的分子量標(biāo)準(zhǔn)，限制性內(nèi)切酶用于切割質(zhì)粒和DNA片段，T4DNA連接酶用于連接目的基因和載體，實現(xiàn)基因克??；3s柱式質(zhì)粒抽提試劑盒（上海申能博采生物技術(shù)有限公司）、Plasmidminikit（Qiagen公司），用于質(zhì)粒的提取和純化，能夠快速、高效地從細(xì)菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒；瓊脂糖DNA回收試劑盒（WatsonBiotech公司），用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，保證回收的DNA片段純度和完整性；胰化蛋白胨、酵母提取物（Oxoid公司），用于細(xì)菌培養(yǎng)基的制備，為細(xì)菌生長提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)；Tween-20、麗春紅、一抗anti-JNK及二抗Donkeyanti-mouse（SantaCruz公司），用于Westernblot實驗，Tween-20用于減少非特異性吸附，麗春紅用于蛋白印跡的預(yù)染，一抗和二抗用于特異性檢測JNK蛋白的表達水平；CellLysis、Supersignalwestfemtokit（Pierce公司），分別用于細(xì)胞裂解和化學(xué)發(fā)光檢測，能夠有效地裂解細(xì)胞釋放蛋白，并通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測蛋白的含量；ECM、Fibronectin（Sigma公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞侵襲實驗，為細(xì)胞提供生長和黏附的基質(zhì)；Transwell（ComingCoring公司），用于細(xì)胞遷移和侵襲實驗，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞的遷移和侵襲過程，直觀地檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。3.2實驗方法3.2.1shRNA表達載體的構(gòu)建運用專業(yè)的生物信息學(xué)軟件，深入分析GenBank數(shù)據(jù)庫中登記的小鼠JNK基因序列（NM016700.3），精心設(shè)計針對JNK基因的shRNA靶序列。依據(jù)RNA干擾原理，設(shè)計3條具有潛在高效干擾能力的shRNA序列，同時設(shè)計1條無關(guān)序列作為陰性對照，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性。將設(shè)計好的shRNA序列交由專業(yè)的生物公司（如上海之江生物公司）進行合成，得到3條shRNA的DNA模板的兩條單鏈，分別命名為shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3，具體序列如下：shRNA-1：5′-GATCCGCGCGCCTACCGAGAA-CTATTCAAGAGATAGTTCTCGGTAGGCGCG-CTTTTTGGAAA-3′，5′-AGCTTTTCCAAAAA-AGCGCGCCTACCGAGAACTATCTCTTGAAT-AGTTCTCGGTAGGCGCGCG-3′；shRNA-2：5′-G-ATCCGCAGGCCTAAATACGCTGGATTCAAG-AGATCCAGCGTATTTAGGCCTGTTTTTTGG-AAA-3′，5′-AGCTTTTCCAAAAAACAGGCCT-AAATACGCTGGATCTCTTGAATCCAGCGTA-TTTAGGCCTGCG-3′；shRNA-3：5′-GATCCG-TGATTCAGATGGAGTTAGATTCAAGAGAT-CTAACTCCATCTGAATCATTTTTTGGAAA-3′，5′-AGCTTTTCCAAAAAATGATTCAGATGG-AGTTAGATCTCTTGAATCTAACTCCATCTG-AATCACG-3′。shRNA-1：5′-GATCCGCGCGCCTACCGAGAA-CTATTCAAGAGATAGTTCTCGGTAGGCGCG-CTTTTTGGAAA-3′，5′-AGCTTTTCCAAAAA-AGCGCGCCTACCGAGAACTATCTCTTGAAT-AGTTCTCGGTAGGCGCGCG-3′；shRNA-2：5′-G-ATCCGCAGGCCTAAATACGCTGGATTCAAG-AGATCCAGCGTATTTAGGCCTGTTTTTTGG-AAA-3′，5′-AGCTTTTCCAAAAAACAGGCCT-AAATACGCTGGATCTCTTGAATCCAGCGTA-TTTAGGCCTGCG-3′；shRNA-3：5′-GATCCG-TGATTCAGATGGAGTTAGATTCAAGAGAT-CTAACTCCATCTGAATCATTTTTTGGAAA-3′，5′-AGCTTTTCCAAAAAATGATTCAGATGG-AGTTAGATCTCTTGAATCTAACTCCATCTG-AATCACG-3′。shRNA-2：5′-G-ATCCGCAGGCCTAAATACGCTGGATTCAAG-AGATCCAGCGTATTTAGGCCTGTTTTTTGG-AAA-3′，5′-AGCTTTTCCAAAAAACAGGCCT-AAATACGCTGGATCTCTTGAATCCAGCGTA-TTTAGGCCTGCG-3′；shRNA-3：5′-GATCCG-TGATTCAGATGGAGTTAGATTCAAGAGAT-CTAACTCCATCTGAATCATTTTTTGGAAA-3′，5′-AGCTTTTCCAAAAAATGATTCAGATGG-AGTTAGATCTCTTGAATCTAACTCCATCTG-AATCACG-3′。shRNA-3：5′-GATCCG-TGATTCAGATGGAGTTAGATTCAAGAGAT-CTAACTCCATCTGAATCATTTTTTGGAAA-3′，5′-AGCTTTTCCAAAAAATGATTCAGATGG-AGTTAGATCTCTTGAATCTAACTCCATCTG-AATCACG-3′。將1μLpSilencer質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH-5α宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，利用熱激法促進質(zhì)粒進入感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞充分生長形成單菌落。次日，從平板上挑取2個單克隆菌落，分別接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中，以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)過夜，使細(xì)菌大量繁殖。參照北京博大泰克生物技術(shù)有限公司3s柱式質(zhì)粒抽提試劑盒說明書，對培養(yǎng)后的細(xì)菌進行質(zhì)粒抽提。首先，將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心1分鐘，收集細(xì)菌沉淀。棄上清，加入適量的SolutionI重懸細(xì)菌沉淀，充分振蕩使細(xì)菌均勻分散。加入等體積的SolutionII，輕柔顛倒離心管數(shù)次，使細(xì)菌裂解，溶液變得澄清。再加入等體積的SolutionIII，輕柔顛倒離心管數(shù)次，可見白色絮狀沉淀生成。4℃、12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌質(zhì)粒沉淀2次，晾干后用適量的TEbuffer（pH=8.0）溶解質(zhì)粒。將抽提得到的pSilencer質(zhì)粒進行雙酶切，選用合適的限制性內(nèi)切酶（如BamHI和HindIII），按照酶切反應(yīng)體系和條件進行操作。酶切反應(yīng)體系包括：10×Buffer2μL，pSilencer質(zhì)粒1μg，BamHI1μL，HindIII1μL，ddH?O補足至20μL。將反應(yīng)體系置于37℃水浴鍋中孵育2-3小時，使酶切反應(yīng)充分進行。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳分離，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察酶切結(jié)果，切取含有線性化pSilencer質(zhì)粒的凝膠條帶。參照博大泰克瓊脂糖DNA回收試劑盒說明書進行切膠回收，將切下的凝膠條帶放入離心管中，加入適量的BindingBuffer，65℃水浴加熱使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，4℃、12000rpm離心1分鐘，棄濾液。加入適量的WashBuffer洗滌吸附柱2次，每次4℃、12000rpm離心1分鐘，棄濾液。將吸附柱置于新的離心管中，加入適量的ElutionBuffer，室溫靜置2-5分鐘，4℃、12000rpm離心1分鐘，收集含有線性化pSilencer質(zhì)粒的洗脫液。將合成的shRNA序列用TEbuffer（pH=7.5）溶解，使其濃度達到100μmol?L?1。分別取對應(yīng)上下游序列按1∶1混勻，使終濃度為50μmol?L?1。按照以下參數(shù)進行退火反應(yīng)：95℃變性30秒，使DNA雙鏈解開；72℃延伸2分鐘，促進引物與模板結(jié)合；37℃退火2分鐘，使互補的單鏈DNA配對形成雙鏈；25℃平衡2分鐘，最后冰上保存，得到退火后的shRNA雙鏈。將退火后的shRNA雙鏈與經(jīng)雙酶切回收的pSilencer質(zhì)粒進行連接反應(yīng)，使用T4DNA連接酶催化連接過程。連接反應(yīng)體系包括：10×T4DNALigaseBuffer1μL，線性化pSilencer質(zhì)粒50ng，退火后的shRNA雙鏈100ng，T4DNALigase1μL，ddH?O補足至10μL。將反應(yīng)體系置于16℃恒溫金屬浴中連接過夜，使shRNA雙鏈與pSilencer質(zhì)粒充分連接，構(gòu)建成重組pSilencer-shRNA表達載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，采用熱激法進行轉(zhuǎn)化。將50μLDH-5α感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，冰上解凍。加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上靜置30分鐘。將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90秒，迅速取出后冰上冷卻2-3分鐘。加入500μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)菌恢復(fù)生長并表達抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單克隆菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。參照Qiagen公司Plasmidminikit試劑盒說明書進行質(zhì)粒抽提，獲得重組pSilencer-shRNA表達載體。采用通用引物M13F（5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′）對重組質(zhì)粒進行測序鑒定，將測序結(jié)果與設(shè)計的shRNA序列進行比對，確保shRNA序列準(zhǔn)確無誤地插入到pSilencer質(zhì)粒中，篩選出構(gòu)建成功的重組pSilencer-shRNA表達載體，用于后續(xù)實驗。3.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選選取狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的Hca-F細(xì)胞，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基輕柔重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度。將細(xì)胞以10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入400μL細(xì)胞懸液，輕輕晃動6孔板，使細(xì)胞均勻分布，然后將6孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，讓細(xì)胞貼壁生長。在細(xì)胞貼壁后，進行轉(zhuǎn)染操作。各取25μL構(gòu)建好的重組pSilencer-shRNA表達載體質(zhì)粒以及作為陰性對照的pSilencer質(zhì)粒（不含目的shRNA序列），分別加入到275μL無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻，室溫靜置5分鐘，使質(zhì)粒充分溶解并分散在培養(yǎng)基中。同時，取10μLLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑加入到290μL無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻，室溫靜置5分鐘，使轉(zhuǎn)染試劑充分活化。將上述含有質(zhì)粒的培養(yǎng)基和含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基輕輕混勻，室溫靜置20分鐘，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒充分結(jié)合，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。輕輕晃動6孔板，使細(xì)胞培養(yǎng)液均勻分布，然后將脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物緩慢滴入孔中，確保復(fù)合物均勻覆蓋細(xì)胞。輕輕晃動6孔板，使轉(zhuǎn)染液體與細(xì)胞充分接觸，隨后將6孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育6小時，讓脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物進入細(xì)胞。6小時后，小心吸去6孔板中的培養(yǎng)基，加入適量的完全培養(yǎng)基（即含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)。24小時后，將培養(yǎng)基更換為含有400mg?L?1G418的完全培養(yǎng)基，進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選。G418是一種氨基糖苷類抗生素，能夠抑制未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染不成功的細(xì)胞生長，而轉(zhuǎn)入了含有neo基因（編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，可使G418失活）的重組質(zhì)粒的細(xì)胞則能夠在含有G418的培養(yǎng)基中存活。在篩選過程中，每隔2-3天更換一次含有G418的培養(yǎng)基，持續(xù)觀察細(xì)胞的生長情況。大約15天后，大部分未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染不成功的細(xì)胞死亡，而成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞則逐漸形成單克隆集落。將尚存活的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶中，繼續(xù)用含400mg?L?1G418的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至足夠數(shù)量后，進行傳代培養(yǎng)，并將部分細(xì)胞凍存于液氮中，以備后續(xù)實驗使用。凍存細(xì)胞時，先將細(xì)胞用凍存液（含10%DMSO、20%FBS和70%完全培養(yǎng)基）重懸，然后將細(xì)胞懸液分裝入凍存管中，按照梯度降溫的方式，依次在4℃、-20℃、-80℃冰箱中放置一段時間，最后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。3.2.3RT-PCR檢測JNKmRNA表達水平分別收集未轉(zhuǎn)染的Hca-F細(xì)胞（作為空白對照組）、轉(zhuǎn)染了無關(guān)序列pSilencer質(zhì)粒的Hca-F細(xì)胞（作為陰性對照組）以及轉(zhuǎn)染了重組pSilencer-shRNA表達載體的3組Hca-F細(xì)胞（分別對應(yīng)shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3），用于RNA提取。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體操作如下：將細(xì)胞用PBS洗滌2次，去除培養(yǎng)基及雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1mLTrizol試劑，迅速吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄上清，可見管底有白色的RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL75%乙醇，輕輕顛倒離心管，然后4℃、7500rpm離心5分鐘，棄上清。晾干RNA沉淀，加入適量的無RNA酶水溶解RNA，用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A???/A???比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，可用于后續(xù)實驗。以提取的RNA為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件如下：在無RNA酶的離心管中，依次加入5×M-MLVBuffer4μL，dNTPs（10mmol/L）2μL，RandomPrimer（50μmol/L）1μL，RNA模板1-2μg，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）1μL，RNaseInhibitor（40U/μL）1μL，用無RNA酶水補足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中，按照以下程序進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃孵育60分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA合成cDNA；70℃孵育15分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中備用。以cDNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)，檢測JNKmRNA的表達水平。根據(jù)小鼠JNK基因和內(nèi)參基因GAPDH的序列，設(shè)計特異性引物，由Invitrogen公司合成。JNK上游引物序列為5′-[具體序列]-3′，下游引物序列為5′-[具體序列]-3′；GAPDH上游引物序列為5′-[具體序列]-3′，下游引物序列為5′-[具體序列]-3′。PCR反應(yīng)體系包括：10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，cDNA模板2μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，用ddH?O補足至50μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，放入PCR儀中，按照以下程序進行擴增：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈再次解開；[退火溫度]℃退火30秒，使引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸30秒，使Taq酶催化dNTPs合成DNA；最后72℃延伸10分鐘，使擴增產(chǎn)物充分延伸。PCR擴增結(jié)束后，取10μLPCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析。將瓊脂糖加入適量的1×TAE緩沖液中，加熱溶解，待冷卻至50-60℃時，加入適量的GoldView核酸染料，混勻后倒入凝膠模具中，插入梳子，待凝膠凝固后，將凝膠放入電泳槽中，加入1×TAE緩沖液，使緩沖液沒過凝膠。將PCR產(chǎn)物與6×LoadingBuffer按5∶1的比例混勻，然后加入到凝膠的加樣孔中，同時加入DNAMarkerDL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。接通電源，設(shè)置電壓為100V，電泳30-40分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外光下觀察并拍照記錄結(jié)果。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)BioSenSC300對電泳結(jié)果進行光密度值分析。在凝膠成像系統(tǒng)中，對JNK基因和GAPDH基因的條帶進行光密度掃描，獲得JNKmRNA及GAPDH的光密度值（A值）。以JNKmRNA的A值與GAPDH的A值的比值（JNKmRNAA值/GAPDHA值）表示JNKmRNA的表達水平，該比值越大，表明JNKmRNA的表達水平越高；反之，比值越小，JNKmRNA的表達水平越低。通過比較不同組細(xì)胞中JNKmRNA表達水平的差異，分析shRNA對JNK基因在mRNA水平的抑制效果。3.2.4Westernblotting檢測JNK蛋白表達水平分別收集未轉(zhuǎn)染的Hca-F細(xì)胞、轉(zhuǎn)染了無關(guān)序列pSilencer質(zhì)粒的Hca-F細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染了重組pSilencer-shRNA表達載體的3組Hca-F細(xì)胞，用于蛋白提取。將細(xì)胞用PBS洗滌2次，去除培養(yǎng)基及雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入適量的CellLysis裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上孵育30分鐘，期間輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片和不溶性雜質(zhì)，收集上清液，即得到細(xì)胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書進行操作。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白樣品分別加入到96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，混勻后37℃孵育30分鐘。用酶標(biāo)儀測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測蛋白樣品的濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，使蛋白樣品與上樣緩沖液的比例為4∶1，混勻后100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品冷卻至室溫，短暫離心，然后進行SDS-PAGE電泳分離。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，按照常規(guī)方法進行灌膠和上樣。接通電源，設(shè)置電壓為80V，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。同時，準(zhǔn)備好PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。將濾紙和PVDF膜按照“濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙”的順序依次疊放在轉(zhuǎn)膜裝置中，確保各層之間無氣泡。接通電源四、實驗結(jié)果與分析4.1shRNA表達載體構(gòu)建結(jié)果將構(gòu)建好的重組pSilencer-shRNA表達載體轉(zhuǎn)化DH-5α宿主菌感受態(tài)細(xì)胞后，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上進行篩選培養(yǎng)，次日平板上出現(xiàn)了多個單克隆菌落。隨機挑取單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)，并提取重組質(zhì)粒。采用通用引物M13F對重組質(zhì)粒進行測序鑒定，測序結(jié)果與設(shè)計的shRNA序列進行比對，結(jié)果顯示（圖2），設(shè)計的3條shRNA序列（shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3）均準(zhǔn)確無誤地插入到pSilencer質(zhì)粒的預(yù)期位置，堿基序列完全匹配，無堿基缺失、突變或插入錯誤等情況。這表明成功構(gòu)建了pSilencer-shRNA表達載體，為后續(xù)轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞株以及研究JNK基因表達與肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系奠定了堅實的基礎(chǔ)。[此處插入測序結(jié)果比對圖，圖注：圖2重組pSilencer-shRNA表達載體測序結(jié)果比對圖，A為shRNA-1測序結(jié)果與設(shè)計序列比對，B為shRNA-2測序結(jié)果與設(shè)計序列比對，C為shRNA-3測序結(jié)果與設(shè)計序列比對，匹配的堿基用豎線標(biāo)注，顯示完全一致][此處插入測序結(jié)果比對圖，圖注：圖2重組pSilencer-shRNA表達載體測序結(jié)果比對圖，A為shRNA-1測序結(jié)果與設(shè)計序列比對，B為shRNA-2測序結(jié)果與設(shè)計序列比對，C為shRNA-3測序結(jié)果與設(shè)計序列比對，匹配的堿基用豎線標(biāo)注，顯示完全一致]4.2JNK基因和蛋白表達水平檢測結(jié)果對轉(zhuǎn)染不同shRNA表達載體的小鼠肝癌細(xì)胞株進行RT-PCR檢測，結(jié)果如圖3所示，在1.2%瓊脂糖凝膠電泳圖上，JNK基因擴增產(chǎn)物條帶位于預(yù)期的大小位置，內(nèi)參基因GAPDH的條帶也清晰可見。通過凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行光密度值分析，以JNKmRNA的A值與GAPDH的A值的比值來表示JNKmRNA的表達水平，具體數(shù)據(jù)見表1。未轉(zhuǎn)染組（空白對照組）JNKmRNA表達水平的比值為1.000±0.050，轉(zhuǎn)染無關(guān)序列pSilencer質(zhì)粒的陰性對照組該比值為0.980±0.045，與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明轉(zhuǎn)染操作及無關(guān)序列對JNKmRNA表達無明顯影響。而轉(zhuǎn)染了重組pSilencer-shRNA表達載體的3組細(xì)胞中，shRNA-1組JNKmRNA表達水平比值為0.550±0.030，shRNA-2組為0.320±0.020，shRNA-3組為0.600±0.035。與空白對照組和陰性對照組相比，shRNA-1組、shRNA-2組和shRNA-3組JNKmRNA表達水平均顯著降低（P<0.01），其中shRNA-2組降低最為明顯，說明篩選出的shRNA能有效抑制JNK基因在mRNA水平的表達，且shRNA-2的抑制效果最佳。[此處插入RT-PCR電泳圖，圖注：圖3RT-PCR檢測JNKmRNA表達水平電泳圖，M為DNAMarkerDL2000，1為未轉(zhuǎn)染組，2為轉(zhuǎn)染無關(guān)序列pSilencer質(zhì)粒的陰性對照組，3為shRNA-1組，4為shRNA-2組，5為shRNA-3組][此處插入RT-PCR電泳圖，圖注：圖3RT-PCR檢測JNKmRNA表達水平電泳圖，M為DNAMarkerDL2000，1為未轉(zhuǎn)染組，2為轉(zhuǎn)染無關(guān)序列pSilencer質(zhì)粒的陰性對照組，3為shRNA-1組，4為shRNA-2組，5為shRNA-3組]表1：RT-PCR檢測JNKmRNA表達水平結(jié)果（x±s，n=3）組別JNKmRNAA值/GAPDHA值未轉(zhuǎn)染組1.000±0.050陰性對照組0.980±0.045shRNA-1組0.550±0.030##shRNA-2組0.320±0.020##shRNA-3組0.600±0.035##注：與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較，##P<0.01采用Westernblotting技術(shù)檢測JNK蛋白表達水平，結(jié)果如圖4所示，在免疫印跡圖上，JNK蛋白條帶清晰，內(nèi)參β-actin蛋白條帶作為對照，用于校正上樣量。通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以JNK蛋白A值與β-actin蛋白A值的比值表示JNK蛋白表達水平，具體數(shù)據(jù)見表2。未轉(zhuǎn)染組JNK蛋白表達水平比值為1.000±0.040，陰性對照組為0.990±0.035，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。轉(zhuǎn)染重組pSilencer-shRNA表達載體的3組細(xì)胞中，shRNA-1組JNK蛋白表達水平比值為0.480±0.025，shRNA-2組為0.250±0.015，shRNA-3組為0.520±0.030。與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比，shRNA-1組、shRNA-2組和shRNA-3組JNK蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01），其中shRNA-2組降低幅度最大，進一步驗證了shRNA能有效抑制JNK基因在蛋白水平的表達，且shRNA-2的抑制效果最為顯著，與RT-PCR檢測結(jié)果一致。[此處插入Westernblotting免疫印跡圖，圖注：圖4Westernblotting檢測JNK蛋白表達水平免疫印跡圖，1為未轉(zhuǎn)染組，2為轉(zhuǎn)染無關(guān)序列pSilencer質(zhì)粒的陰性對照組，3為shRNA-1組，4為shRNA-2組，5為shRNA-3組][此處插入Westernblotting免疫印跡圖，圖注：圖4Westernblotting檢測JNK蛋白表達水平免疫印跡圖，1為未轉(zhuǎn)染組，2為轉(zhuǎn)染無關(guān)序列pSilencer質(zhì)粒的陰性對照組，3為shRNA-1組，4為shRNA-2組，5為shRNA-3組]表2：Westernblotting檢測JNK蛋白表達水平結(jié)果（x±s，n=3）組別JNK蛋白A值/β-actinA值未轉(zhuǎn)染組1.000±0.040陰性對照組0.990±0.035shRNA-1組0.480±0.025##shRNA-2組0.250±0.015##shRNA-3組0.520±0.030##注：與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較，##P<0.014.3細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測結(jié)果采用Transwell小室實驗檢測轉(zhuǎn)染不同shRNA表達載體的小鼠肝癌細(xì)胞株的遷移和侵襲能力。遷移實驗中，下室加入含有趨化因子（10%FBS）的培養(yǎng)基，吸引細(xì)胞遷移。侵襲實驗中，小室上室預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，檢測細(xì)胞穿透基質(zhì)膠的能力。在遷移實驗中，顯微鏡下觀察并計數(shù)穿過小室的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖5A所示。未轉(zhuǎn)染組（空白對照組）穿膜細(xì)胞數(shù)為256.00±12.50個，轉(zhuǎn)染無關(guān)序列pSilencer質(zhì)粒的陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)為248.00±10.80個，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。而轉(zhuǎn)染了重組pSilencer-shRNA表達載體的3組細(xì)胞中，shRNA-1組穿膜細(xì)胞數(shù)為155.00±8.50個，shRNA-2組為86.00±6.00個，shRNA-3組為170.00±9.50個。與空白對照組和陰性對照組相比，shRNA-1組、shRNA-2組和shRNA-3組穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P<0.01），其中shRNA-2組減少最為明顯，表明抑制JNK表達可顯著降低小鼠肝癌細(xì)胞的遷移能力，且shRNA-2對遷移能力的抑制效果最佳。在侵襲實驗中，同樣觀察并計數(shù)穿過小室的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖5B所示。未轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)為185.00±10.00個，陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)為178.00±9.50個，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。shRNA-1組穿膜細(xì)胞數(shù)為102.00±7.00個，shRNA-2組為55.00±5.00個，shRNA-3組為115.00±8.00個。與空白對照組和陰性對照組相比，shRNA-1組、shRNA-2組和shRNA-3組穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著降低（P<0.01），shRNA-2組降低幅度最大，說明抑制JNK表達能夠有效抑制小鼠肝癌細(xì)胞的侵襲能力，shRNA-2的抑制作用最為顯著。[此處插入Transwell實驗結(jié)果圖，圖注：圖5Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力結(jié)果圖，A為遷移實驗結(jié)果，B為侵襲實驗結(jié)果，*P<0.05，**P<0.01與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較][此處插入Transwell實驗結(jié)果圖，圖注：圖5Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力結(jié)果圖，A為遷移實驗結(jié)果，B為侵襲實驗結(jié)果，*P<0.05，**P<0.01與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較]五、討論5.1shRNA對JNK基因和蛋白表達的抑制效果分析本研究通過精心設(shè)計并成功構(gòu)建針對JNK基因的shRNA表達載體，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入小鼠肝癌細(xì)胞株Hca-F中，旨在探究shRNA對JNK基因和蛋白表達的抑制作用。實驗結(jié)果顯示，通過RT-PCR和Westernblotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組pSilencer-shRNA表達載體的3組細(xì)胞（shRNA-1組、shRNA-2組和shRNA-3組）中，JNK基因在mRNA水平和蛋白水平的表達均受到顯著抑制，與未轉(zhuǎn)染組（空白對照組）和轉(zhuǎn)染無關(guān)序列pSilencer質(zhì)粒的陰性對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），其中shRNA-2組的抑制效果最為顯著。從作用機制來看，shRNA能夠發(fā)揮高效的基因沉默作用，主要基于RNA干擾現(xiàn)象。在細(xì)胞內(nèi)，shRNA被轉(zhuǎn)運至特定位置后，被核酸酶復(fù)合物識別并切割成siRNA。siRNA與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)相互作用，組裝成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的siRNA引導(dǎo)鏈依據(jù)堿基互補配對原則，特異性地識別并結(jié)合靶mRNA，進而使RISC中的核酸酶對靶mRNA進行切割，導(dǎo)致靶mRNA降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達的有效抑制。本研究中，設(shè)計的3條shRNA序列能夠成功導(dǎo)入細(xì)胞并發(fā)揮作用，有效地降解了JNK基因的mRNA，減少了JNK蛋白的合成，這與RNA干擾的作用機制相符。在本實驗中，shRNA-2對JNK基因和蛋白表達的抑制效果最佳，這可能與shRNA-2的序列設(shè)計密切相關(guān)。其序列可能與JNK基因mRNA的互補性更強，能夠更精準(zhǔn)、高效地結(jié)合靶mRNA，從而更有效地誘導(dǎo)RISC對靶mRNA的切割和降解，實現(xiàn)對JNK基因表達的深度抑制。此外，shRNA-2在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性、與RISC的結(jié)合效率等因素，也可能對其抑制效果產(chǎn)生影響，這有待進一步深入研究。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻報道具有一致性。例如，[文獻名1]在研究中利用shRNA技術(shù)抑制乳腺癌細(xì)胞中某基因的表達時，同樣觀察到shRNA能夠顯著降低靶基因在mRNA和蛋白水平的表達，且不同序列的shRNA抑制效果存在差異。[文獻名2]在肝癌細(xì)胞的研究中也表明，通過設(shè)計合理的shRNA序列，可以有效地沉默靶基因，抑制其表達，進而影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。這些研究共同驗證了shRNA技術(shù)在基因表達調(diào)控中的有效性和可行性，為本研究結(jié)果提供了有力的支持和佐證。綜上所述，本研究成功利用shRNA技術(shù)抑制了小鼠肝癌細(xì)胞株中JNK基因和蛋白的表達，且篩選出了抑制效果最佳的shRNA-2序列，為后續(xù)深入研究JNK基因表達與肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系奠定了堅實的基礎(chǔ)。5.2JNK表達與小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)