演講人：日期:細胞實驗檢測方法CATALOGUE目錄01細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)02細胞活性檢測03細胞增殖檢測04細胞凋亡分析05細胞遷移與侵襲檢測06分子水平檢測01細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇與制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型根據(jù)細胞類型選擇合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如DMEM適用于貼壁細胞培養(yǎng)，RPMI-1640適用于懸浮細胞培養(yǎng)，需考慮營養(yǎng)成分和滲透壓的匹配性。01血清添加比例胎牛血清（FBS）是常用補充物，添加比例通常為10%-20%，需通過預(yù)實驗驗證血清批次對細胞生長的影響，避免細胞毒性或生長抑制?？股嘏c添加劑常規(guī)添加青霉素-鏈霉素雙抗（100U/mL）防止污染，特殊細胞需補充L-谷氨酰胺、非必需氨基酸或生長因子（如EGF、bFGF）以維持細胞功能。pH與緩沖系統(tǒng)采用HEPES或碳酸氫鈉緩沖體系維持pH7.2-7.4，CO2培養(yǎng)箱環(huán)境下需確保碳酸氫鈉濃度與CO2分壓（通常5%）匹配。020304細胞傳代技術(shù)消化酶選擇與濃度貼壁細胞傳代需使用胰蛋白酶（0.05%-0.25%）或膠原酶，消化時間控制在室溫下2-5分鐘，通過顯微鏡觀察細胞回縮變圓后立即終止反應(yīng)。細胞計數(shù)與接種密度采用血球計數(shù)板或自動計數(shù)儀測定活細胞數(shù)，常規(guī)接種密度為1×10^4至5×10^4cells/cm2，原代細胞需適當提高密度促進貼壁。傳代比例優(yōu)化快速增殖細胞（如HEK293）可按1:3至1:6傳代，原代細胞或生長緩慢細胞（如神經(jīng)元）建議1:1至1:2傳代，避免過度稀釋導(dǎo)致生長停滯。凍存與復(fù)蘇要點傳代后多余細胞用含10%DMSO的凍存液梯度降溫保存，復(fù)蘇時采用37℃水浴快速融化，離心去除凍存液后重懸于新鮮培養(yǎng)基。無菌操作規(guī)范金屬器械需高壓蒸汽滅菌（121℃,15psi,20分鐘），塑料耗材選用γ射線輻照滅菌，液體試劑通過0.22μm濾膜過濾除菌。器材滅菌管理

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操作者需穿戴無菌手套、口罩及實驗服，接觸細胞前用乙醇消毒手套，不同細胞系操作間更換手套并消毒工作臺面。人員防護措施使用前紫外線消毒30分鐘，工作區(qū)表面用75%乙醇擦拭，操作時保持前窗在安全高度（通常18-20cm），避免快速移動造成氣流紊亂。生物安全柜操作定期顯微鏡檢查培養(yǎng)液渾濁度、pH異常變化及細胞形態(tài)變異，采用革蘭氏染色或PCR檢測支原體污染，污染樣本需立即隔離并滅菌處理。細胞污染監(jiān)測02細胞活性檢測MTT/CCK-8法檢測原理通過線粒體脫氫酶還原MTT或CCK-8試劑生成水溶性甲瓚，其吸光度值與活細胞數(shù)量成正比，適用于高通量篩選和藥物毒性評估。操作流程細胞接種于96孔板，加入MTT/CCK-8孵育后，用酶標儀測定450-490nm吸光度值，需注意避光孵育以避免背景干擾。應(yīng)用場景廣泛用于抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖抑制率計算及細胞代謝活性分析，但需排除酚紅培養(yǎng)基對結(jié)果的干擾。局限性無法區(qū)分凋亡與壞死細胞，且檢測時間過長可能導(dǎo)致甲瓚結(jié)晶沉淀影響準確性。乳酸脫氫酶釋放試驗需設(shè)置最大LDH釋放對照組（裂解細胞）和背景對照組，計算細胞毒性百分比時需扣除自發(fā)釋放值。關(guān)鍵步驟優(yōu)勢干擾因素細胞膜損傷后釋放乳酸脫氫酶（LDH）至培養(yǎng)液，催化底物生成紅色甲瓚，通過吸光度值量化細胞毒性程度。適用于懸浮細胞和貼壁細胞，能快速反映細胞膜完整性破壞，常用于免疫治療和納米材料安全性評估。血清中含LDH可能干擾結(jié)果，建議采用無血清培養(yǎng)基或離心去除血清后再檢測。檢測原理臺盼藍染色排除法基本原理適用領(lǐng)域操作要點注意事項活細胞膜完整拒染臺盼藍，死細胞膜通透性增加被染成藍色，通過顯微鏡或細胞計數(shù)儀統(tǒng)計活細胞比例。染色時間需控制在3分鐘內(nèi)，避免假陽性；細胞懸液濃度應(yīng)調(diào)整至200-500個/視野以保證計數(shù)準確性。原代細胞培養(yǎng)質(zhì)量監(jiān)控、細胞凍存復(fù)蘇后存活率評估及流式細胞術(shù)前樣本篩選。無法檢測早期凋亡細胞，且高濃度臺盼藍可能抑制某些細胞活性，建議染色終濃度不超過0.4%。03細胞增殖檢測BrdU標記法原理與應(yīng)用BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）是一種胸腺嘧啶類似物，可整合到增殖細胞的DNA中，通過特異性抗體檢測標記細胞，適用于體外和體內(nèi)細胞增殖研究。實驗步驟需先孵育細胞與BrdU，固定后通過酸或酶處理暴露DNA，再使用抗BrdU抗體和熒光/酶標二抗進行可視化分析。優(yōu)勢與局限靈敏度高且兼容多種樣本，但需DNA變性處理，可能影響細胞形態(tài)完整性。CFSE染色法熒光標記機制CFSE（羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯）通過酯酶活性水解后與胞內(nèi)蛋白共價結(jié)合，隨細胞分裂熒光信號均分，可追蹤多代增殖。數(shù)據(jù)分析流式細胞術(shù)檢測熒光強度衰減，通過峰群分布計算增殖指數(shù)和分裂代數(shù)，適用于免疫細胞功能研究。注意事項需優(yōu)化染色濃度以避免毒性，長時間培養(yǎng)可能導(dǎo)致熒光淬滅。EdU檢測法點擊化學(xué)反應(yīng)EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）含乙炔基團，可與熒光標記的疊氮化合物通過點擊化學(xué)高效偶聯(lián)，無需DNA變性，保留細胞結(jié)構(gòu)。01高通量兼容性適用于微孔板檢測和自動化成像系統(tǒng)，比BrdU法操作更簡便，尤其適合大規(guī)模藥物篩選實驗。02多色標記擴展可與其他熒光探針聯(lián)用，實現(xiàn)增殖與細胞周期、凋亡等多參數(shù)同步分析。0304細胞凋亡分析利用AnnexinV與凋亡細胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，同時結(jié)合碘化丙啶（PI）區(qū)分早期凋亡（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡或壞死細胞（AnnexinV+/PI+）。檢測原理適用于懸浮細胞和貼壁細胞，可定量分析藥物誘導(dǎo)或基因調(diào)控下的凋亡水平，廣泛用于腫瘤治療研究。應(yīng)用范圍細胞懸液經(jīng)離心后重懸于緩沖液，加入AnnexinV-FITC和PI避光孵育，流式細胞儀檢測熒光信號并分析凋亡比例。實驗步驟010302AnnexinV/PI雙染法需嚴格控制孵育時間（避免過度染色）和細胞處理條件（避免機械損傷導(dǎo)致假陽性）。注意事項04Caspase活性檢測檢測原理通過熒光底物（如DEVD-pNA）被Caspase家族蛋白酶切割后釋放顯色或熒光信號，反映Caspase-3/7等關(guān)鍵凋亡執(zhí)行酶的活性。實驗方法裂解細胞后加入底物孵育，分光光度計或熒光酶標儀測定吸光度/熒光值，活性單位以標準曲線換算。優(yōu)勢與局限靈敏度高且可動態(tài)監(jiān)測酶活變化，但需注意樣本處理速度（Caspase活性易降解）和底物特異性（避免其他蛋白酶干擾）。擴展應(yīng)用結(jié)合抑制劑或激活劑可研究凋亡通路調(diào)控機制，如線粒體途徑與死亡受體途徑的交叉作用。DNA片段化分析經(jīng)典方法瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡細胞DNA斷裂形成的“梯狀條帶”（180-200bp倍數(shù)片段），需提取基因組DNA后電泳并EB染色觀察。01高通量替代TUNEL法（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記）通過熒光標記斷裂DNA，流式或熒光顯微鏡定量凋亡細胞比例。技術(shù)要點樣本固定需避免過度交聯(lián)（影響DNA提?。?，TUNEL實驗需設(shè)置陽性和陰性對照以排除假信號。研究意義直接證明凋亡特征性DNA損傷，適用于體內(nèi)外模型評估組織或細胞群的凋亡程度。02030405細胞遷移與侵襲檢測劃痕愈合試驗原理與應(yīng)用通過物理劃痕模擬細胞遷移過程，觀察劃痕區(qū)域細胞隨時間推移的遷移覆蓋能力，常用于評估細胞集體遷移能力、藥物對遷移的抑制效果或生長因子對遷移的促進作用。局限性僅適用于貼壁細胞，無法模擬三維微環(huán)境；劃痕邊緣細胞可能因機械損傷影響遷移行為，需設(shè)置重復(fù)實驗以減少誤差。操作要點需使用無菌槍頭或劃痕器在單層細胞上制造均一劃痕，定期顯微鏡拍照記錄，通過圖像分析軟件（如ImageJ）量化劃痕閉合率。注意控制細胞密度和培養(yǎng)條件的一致性。Transwell遷移試驗核心機制利用帶有微孔濾膜的Transwell小室，將細胞接種于上室，下室添加趨化因子（如血清或特定細胞因子），通過計數(shù)穿過微孔到達下室的細胞數(shù)評估遷移能力。濾膜孔徑通常為8-12μm（遷移）或5-8μm（侵襲）。關(guān)鍵步驟優(yōu)勢與擴展細胞需饑餓處理以降低基礎(chǔ)遷移率；遷移結(jié)束后用棉簽擦除上室未遷移細胞，下室細胞需固定（如甲醇）和染色（如結(jié)晶紫）后顯微鏡計數(shù)。侵襲試驗需預(yù)先在膜上鋪Matrigel模擬基底膜屏障?？蓞^(qū)分趨化性遷移與隨機運動，結(jié)合熒光標記或流式細胞術(shù)可提高檢測靈敏度；適用于高通量藥物篩選或基因功能研究。123基質(zhì)侵襲試驗三維環(huán)境模擬在Transwell小室濾膜上覆蓋層粘連蛋白或膠原基質(zhì)（如Matrigel），模擬體內(nèi)細胞穿越基底膜侵襲的過程，常用于腫瘤細胞侵襲能力評估或抗轉(zhuǎn)移藥物開發(fā)。實驗優(yōu)化基質(zhì)濃度和固化時間需標準化，避免批次差異；可聯(lián)合熒光標記細胞或基質(zhì)降解酶（如MMP）活性檢測，多維度分析侵襲機制。數(shù)據(jù)解讀侵襲率需與遷移試驗對照，排除單純遷移的影響；需考慮基質(zhì)成分（如纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸）對細胞行為的特異性調(diào)控作用。06分子水平檢測PCR技術(shù)應(yīng)用通過實時定量PCR（qPCR）檢測特定基因的mRNA表達水平，用于研究細胞分化、疾病機制或藥物作用靶點，具有高靈敏度和特異性?；虮磉_分析利用多重PCR技術(shù)同時篩查多種病毒或細菌核酸，適用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查，如新冠病毒、HPV分型檢測等。病原體檢測通過PCR擴增靶向區(qū)域并結(jié)合測序，驗證CRISPR-Cas9等基因編輯工具的敲除或插入效率，確保實驗準確性?；蚓庉嬺炞C采用甲基化特異性PCR（MSP）或亞硫酸鹽測序PCR（BSP），研究表觀遺傳修飾與癌癥、衰老等過程的關(guān)聯(lián)。甲基化分析Westernblot分析蛋白定量與定性通過SDS分離蛋白，利用抗體檢測目標蛋白的表達量及分子量，廣泛應(yīng)用于信號通路研究（如MAPK、PI3K/AKT通路）。翻譯后修飾檢測使用磷酸化、泛素化等特異性抗體，分析蛋白的磷酸化、乙?；刃揎棤顟B(tài)，揭示細胞調(diào)控機制。疾病標志物篩查在腫瘤研究中，檢測HER2、p53等標志蛋白的表達水平，輔助臨床診斷和治療方案制定。實驗條件優(yōu)化需注意抗體特異性驗證、封閉劑選擇（如BSA或脫脂奶粉）及曝光時間控制，以減少假陽性或背景噪聲。免疫熒光染色通過共聚焦顯微鏡觀察目標蛋白在細胞核、線粒體等細胞