Animalspeciesidentificationbasedonhigh-throu1范圍本文件規(guī)定了基于高通量測序技術(shù)的脊椎動物種屬鑒定的技術(shù)要求，描述了鑒定的基本要求、樣本文庫構(gòu)建、測序及測序數(shù)據(jù)分析的方法、相應(yīng)的質(zhì)量評估方法及鑒定報告規(guī)范。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本文件。GB/Z31233分立個體類產(chǎn)品隨機抽樣實施指南GB/T43650野生動物及其制品DNA物種鑒定技術(shù)規(guī)程GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T15628.1中國動物分類代碼第1部分：脊椎動物SF/T0136法醫(yī)學(xué)非人源生物檢材種屬鑒定技術(shù)規(guī)范SF/T0069法醫(yī)物證鑒定實驗室管理規(guī)范3術(shù)語和定義GB/T15628.1-2021、GB/T30989-2014和SF/T0136-2023界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1動物種屬animalspecies動物的基本分類單元，即具有統(tǒng)一且穩(wěn)定的形態(tài)和遺傳特征以及占有一定自然分布區(qū)的動物類群，被劃分為同一類群的動物個體的總稱，是由一系列形態(tài)上相似、基因相似且能夠通過自然繁殖產(chǎn)生有生育能力后代的個體組成的群體。[來源：GB/T15628.1-2021，3.1，有修改]3.2種屬鑒定speciesidentification基于DNA分析方法甄別種屬特異性DNA序列，實現(xiàn)對脊椎動物進行分類地位（科、屬、種）的認定。[來源：SF/T0136-2023，3.1，有修改]3.3DNA條形碼DNAbarcode生物體一段公認的能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段。[來源：SF/T0136-2023，3.3]3.4DNA宏條形碼DNAmetabarcoding一種通過高通量測序解析單個或混合樣本的一個或多個DNA條形碼的分子生物學(xué)技術(shù)，常用于物種鑒別和生物多樣性評估。3.5DNA文庫DNAlibrary帶有特定接頭序列的雙鏈待測DNA片段分子集合。3.6高通量測序high-throughputsequencing，HTS能夠一次并行對大量核酸分子進行大規(guī)模平行測序的技術(shù)。[來源：GB/T30989-2014，3.19]3.7測序深度sequencingdepth高通量測序中對待測樣本目標區(qū)域的核苷酸所檢測到的次數(shù)。[來源：GB/T30989-2014，3.31，有修改]3.8參考序列referencesequence公共數(shù)據(jù)庫中收錄的與物種對應(yīng)的DNA條形碼序列。[來源：SF/T0136-2023，3.2，有修改]3.9操作分類單元operationaltaxonomicunitsOTU在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（如品系、種、屬、分組等）設(shè)置的同一標志。3.10聚類分析clusteringanalysis將具有較高相似性的測序序列進行分組，以O(shè)TU（3.9）的形式呈現(xiàn)不同的組。3.11覆蓋度coverageOTU（3.9）中比對上參考序列（3.8）的部分占整條OUT（3.9）長度的百分比，用于評估比對的信息可靠性程度。3.12一致度identityOTU（3.9）與參考序列（3.8）比對部分DNA序列的一致程度，用于評估比對序列的相似性程度。4縮略語下列縮略語適用于本文件。BOLD：生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（TheBarcodeofLifeDataSystem）COI：細胞色素氧化酶I（CytochromeOxidaseI）基因cytb：細胞色素b（Cytochromeb）基因DNA：脫氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicAcid）NCBI：美國國立生物技術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）OTU：操作分類單元（OperationalTaxonomicUnits）PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction)16S：16S核糖體RNA（16SribosomalRNA，16SrRNA）基因12S：12S核糖體RNA（12SribosomalRNA，12SrRNA）基因5基本要求5.1實驗室及人員要求5.1.1實驗室要求從事動物種屬鑒定的實驗室應(yīng)符合以下要求：a)實驗室環(huán)境條件滿足GB/T30989標準要求；b)實驗室以及樣本管理、設(shè)備管理、質(zhì)量管理等應(yīng)符合SF/T0069-2020的規(guī)定；c)建立樣本的運輸、接收、處置、保護、存儲、保留和/或清理的規(guī)定，能對接收、內(nèi)部傳遞、處置、保留、返還和清理等過程進行記錄，確保記錄的完整性和可追溯性；d)鑒定活動應(yīng)包括采樣、DNA提取、高通量測序DNA條形碼文庫構(gòu)建、測序、結(jié)果分析、鑒定意見出具和鑒定意見文書撰寫等環(huán)節(jié)，應(yīng)符合ISO20813標準要求。鑒定活動完畢后，應(yīng)將各個環(huán)節(jié)的記錄進行歸檔。5.1.2人員要求從事動物種屬鑒定的實驗人員應(yīng)符合以下要求：a)遵守實驗室的管理要求；b)熟悉并掌握DNA提取、PCR、和DNA高通量測序技術(shù)的原理和操作；c)能正確使用相關(guān)分析方法對檢測結(jié)果進行分析與評價。5.2設(shè)施設(shè)備條件5.2.1主要儀器從事動物種屬鑒定所需的主要儀器包括/但不限于：高速離心機（大于5000rpm）；b)移液器套裝（常見量程范圍為0.1-1000μL）；c)渦旋振蕩混合儀；d)低溫冰箱（4℃,-20℃,-80℃);e)超凈工作臺/生物安全柜；f)恒溫孵育儀；g)核酸精準定量儀器；h)DNA擴增PCR儀；i)磁力架；j)高通量測序儀；k)數(shù)據(jù)分析服務(wù)器。5.2.2主要試劑從事動物種屬鑒定所需的主要試劑包括/但不限于：a)無水乙醇；b)雙鏈DNA定量試劑盒；c)高通量測序文庫構(gòu)建試劑；d)高通量測序試劑。6鑒定流程6.1樣本采集如需進行樣本采集，應(yīng)滿足以下要求：a)樣本分成兩份，作為待測樣本和儲存樣本。b)清楚、規(guī)范的樣本編號以及采集時間、地點、類型等信息的準確記錄，保證樣品可追溯。c)樣本的采集、包裝和運輸、儲存中應(yīng)防止降解、丟失、損壞以及交叉或外源污染。6.2抽樣如需進行抽樣，應(yīng)滿足以下要求：a)形態(tài)特征完整、可分類識別的同類多個樣本，按照GB/Z31233中的簡單隨機抽樣或等距抽樣規(guī)定執(zhí)行。b)具有部分形態(tài)特征、可簡單分類的多個樣本，先按照特征進行分類，再按照GB/Z31233中的簡單隨機抽樣或等距抽樣規(guī)定執(zhí)行；或按照GB/Z31233中的分層抽樣規(guī)定執(zhí)行。c)不具有可識別的形態(tài)特征的大批量樣本，先按照GB/Z31233中的簡單隨機抽樣或等距抽樣規(guī)定執(zhí)行，結(jié)果出現(xiàn)多個物種時，再按照GB/Z31233中的分層抽樣規(guī)定執(zhí)行。6.3DNA提取如需進行DNA提取，應(yīng)滿足以下要求：a)待測樣本DNA的提取可參考LSEA0007-2024的提取方法或使用公認有效的方法，并按照GB/T43650-2024的6.4DNA質(zhì)量評估方法評估合格后方能進行后續(xù)的檢測步驟。b)特殊檢材的DNA提取無法使用通用方法時，應(yīng)在報告中詳細說明提取過程和DNA的質(zhì)量評估結(jié)果。6.4高通量測序根據(jù)鑒定需求，可選擇靶向測序法或基因組測序法。6.4.1靶向測序法6.4.1.1文庫構(gòu)建以線粒體DNA或基因組DNA為模板，先富集DNA條形碼片段，再進行靶向測序的文庫構(gòu)建。a)DNA條形碼：COI基因、Cytb基因、12SrRNA基因、16SrRNA基因等DNA條形碼區(qū)域；b)根據(jù)DNA條形碼序列選擇合適的通用引物或特異性引物，宜按照商業(yè)化擴增試劑盒說明進行靶向擴增。必要時可以使用多對引物進行復(fù)合擴增；c)獲得目標DNA條形碼片段后，宜使用商業(yè)化文庫構(gòu)建試劑盒進行文庫構(gòu)建；d)用于純化的DNA文庫擴增的總循環(huán)數(shù)不超過35。6.4.1.2高通量測序a）建議利用單端測序策略進行高通量測序；b）宜使用商業(yè)化的測序平臺進行高通量測序；c）若測序數(shù)據(jù)量不足說明書推薦值的一半，或測序數(shù)據(jù)的前100個堿基的Q30<90%，應(yīng)重新測序。6.4.2基因組測序法6.4.2.1文庫構(gòu)建以線粒體DNA或基因組DNA為模板，宜使用商業(yè)化的全基因組測序文庫構(gòu)建試劑盒進行文庫構(gòu)建。a)宜根據(jù)測序策略收集長度合適的DNA片段進行文庫構(gòu)建；b)文庫富集PCR循環(huán)數(shù)不宜超過20；c)文庫純化后的產(chǎn)量滿足高通量測序平臺測序基本要求。6.4.2.2高通量測序參考6.4.1.2的b)和c)進行高通量測序。6.5數(shù)據(jù)分析6.5.1靶向測序法6.5.1.1數(shù)據(jù)質(zhì)控a）應(yīng)使用公認有效的軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行接頭序列去除、序列拼接、低質(zhì)量序列去除、質(zhì)量評估等處理；b）處理后的數(shù)據(jù)質(zhì)量值（Q30）不低于80%。6.5.1.2聚類分析對得到的序列進行聚類分析以獲得代表性的OTU：應(yīng)使用公認有效的軟件對質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)進行引物序列去除、聚類分析、質(zhì)量評估等處理；聚類分析的相似性閾值宜不低于98%；聚類后得到的OTU序列長度應(yīng)符合目標擴增子大小，OTU序列長度宜不小于100bp，且單個OTU的聚類讀序在整個樣品讀序中的占比不少于0.1%。6.5.1.3序列比對a)宜使用BLAST或其他工具進行序列比對；b)宜使用BOLD、NCBI等公認數(shù)據(jù)庫作為參考；c)OTU的比對覆蓋度不低于90%、序列一致度不低于99%。6.5.1.4冗余處理若一個OTU序列比對到多個物種，僅保留一致度最高的物種作為種屬比對結(jié)果。6.5.2基因組測序法6.5.2.1數(shù)據(jù)質(zhì)控a)參考6.5.1.1進行數(shù)據(jù)質(zhì)控；b)每個樣品有效測序數(shù)據(jù)量應(yīng)不少于參考基因組的30倍。6.5.2.2基因序列提取DNA條形碼基因使用BLAST或其他比對工具，將高質(zhì)量的讀序比對到BOLD或NCBI數(shù)據(jù)庫進行DNA條形碼基因提取；比對的讀序覆蓋度不低于90%、一致度不低于99%，獲得待測樣品的DNA條形碼基因序列。b）線粒體基因組使用公認有效的組裝軟件對來源于線粒體的讀序進行基因組組裝。6.5.2.3種屬鑒定a）DNA條形碼基因參考6.5.1.3和6.5.1.4進行種屬鑒定。b）線粒體基因組1）宜使用公認數(shù)據(jù)庫中的線粒體基因組序列作為參考；2）使用BLAST或其他比對工具進行序列比對；3）組裝基因組覆蓋度不低于90%、一致度不低于95%。c）系統(tǒng)發(fā)育樹對于比到多個物種的情況，宜使用公認有效軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)遺傳距離進行種屬判定。6.6鑒定意見根據(jù)序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的比對結(jié)果出具鑒定意見，判定標準如下（圖1）：圖1判定流程圖6.6.1序列比對a)只有一個DNA條形碼聚類出一個OTU，與數(shù)據(jù)庫參考序列覆蓋度不小于98%，一致度不小于99%的情況下，鑒定意見可表述為“檢出XX（物種）DNA成分”或“來源于XX（物種）”；b)只有一個DNA條形碼聚類出多條OTU，每條OTU與數(shù)據(jù)庫參考序列覆蓋度不小于98%，一致度不小于99%的情況下，鑒定意見可表述為“檢出XX（物種1，物種2，物種3……）DNA成分”或“來源于XX（物種1，物種2，物種3……）”；c)多個DNA條形碼僅有一條OTU有比對結(jié)果，與數(shù)據(jù)庫參考序列覆蓋度不小于98%，一致度不小于99%的情況下，鑒定意見可表述為“檢出XX（物種）DNA成分”或“來源于XX（物種）”；d)多個DNA條形碼聚類出多條OTU比對出不同種屬，每條OTU與數(shù)據(jù)庫參考序列覆蓋度不小于98%，一致度不小于99%的情況下，1)所有DNA條形碼比對種屬一致時，鑒定意見可表述為“檢出XX（物種1，物種2，物種3……）DNA成分”或“來源于XX（物種1，物種2，物種3……）”；2)不同DNA條形碼比對種屬不完全一致時，鑒定意見可表述為“無法判定”或“無法確定具體物種”；e)對于未獲得條形碼序列或數(shù)據(jù)庫中無一致度大于99%的樣品，鑒定意見可表述為“無法判定”或“無法確定具體物種”；f)線粒體基因組比對結(jié)果中，覆蓋度和一致度最高的比對結(jié)果，鑒定意見可表述為“檢出XX（物種）DNA成分”或“來源于XX（物種）”。6.6.2系統(tǒng)發(fā)育樹參考SF/T0136—2023中7.7.2標準進行種屬鑒定。6.7鑒定意見文書鑒定意見文書的格式宜按照主管部門的規(guī)定或相關(guān)標準執(zhí)行，且內(nèi)容應(yīng)符合以下要求：a）描述檢測的目標區(qū)域及采用的引物信息、模板DNA用量、文庫構(gòu)建方法、分析方法、測序結(jié)果和分析結(jié)果；b）按照SF/T0136—2023第8章的規(guī)定出具鑒定意見。c）意見書需蓋公章，并附檢測樣品照片。

附錄A（資料性附錄）鑒定報告示例本附錄提供了高通量測序DNA條形碼物種鑒定報告的示例。xxxxx動物種屬檢測報告xxxxx[2024]動植物咨字MPSxxxx號一、基本情況送檢人：xxxx委托單位：xxxx檢測材料：xxxx采/接樣日期：xx/xx/20xx檢測地點：xxxx檢材概況：如有無包裝袋、標識，是否密封*送檢樣本的真實性由委托方負責二、檢測過程本檢測利用DNA提取試劑盒提取檢材的DNA，經(jīng)Qubit定量確認提取成功后，使用xxxx試劑盒擴增線粒體xxxx基因部分序列，采用xxxx測序儀進行xxxx測序。該報告中的每份檢材在不同的采樣部位進行取樣并分別檢測。根據(jù)序列間的相似性進行聚類后，將每一個OTU（OperationalTaxonomicUnits）的代表序列與BOLD（TheBarcodeofLifeDataSystem）數(shù)據(jù)庫中的同源序列進行一致性比對。三、檢測結(jié)果四、分析說明檢材XXX：線粒體COI基因部分序列OTU1（231bp）與XXX同源序列相似性最高，序列一致性為100%。五、鑒定意見根據(jù)上述線粒體基因部分序列OTU比對結(jié)果得到以下鑒定意見：檢材XXX傾向于來源于以下物種：XXX動物門，XXX綱，XXX目，XXX科，XXX屬，XXX種（拉丁名）。XXX單位20xx-xx-xx附件1：質(zhì)控結(jié)果XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX附件2：檢材圖片參考文獻[1]AlfredJ.Arulandhu,MartijnStaats,RicoHagelaar,etal.2017.Developmentandvalidationofamulti-locusDNAmetabarcodingmethodtoidentifyendangeredspeciesincomplexsamples.GigaScience,6(10):1-18.[2]LucyM.I.Webster,Tracey-LeighPrigge,G