2025年醫(yī)院PCR考核試題與答案一、單項選擇題（每題2分，共30分）1.以下關(guān)于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）基本原理的描述，正確的是：A.通過DNA解旋酶實現(xiàn)雙鏈DNA變性B.退火溫度需高于引物Tm值5-10℃C.延伸階段依賴TaqDNA聚合酶的5'-3'聚合活性D.每個循環(huán)僅需完成變性和退火兩個步驟答案：C（解析：PCR變性通過高溫實現(xiàn)，無需解旋酶；退火溫度應(yīng)低于引物Tm值5℃左右；完整循環(huán)包括變性、退火、延伸三步；Taq酶具有5'-3'聚合活性，無校正功能）2.臨床PCR實驗室檢測新型冠狀病毒核酸時，最常用的熒光標記方法是：A.分子信標法B.TaqMan探針法C.SYBRGreenⅠ染料法D.熒光引物法答案：B（解析：TaqMan探針法特異性強，通過探針水解產(chǎn)生熒光，適合病原體定量檢測；SYBRGreenⅠ易受非特異性擴增干擾；分子信標和熒光引物臨床應(yīng)用較少）3.關(guān)于PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度的描述，錯誤的是：A.過高可能導(dǎo)致非特異性擴增B.過低會降低Taq酶活性C.需與dNTP濃度匹配D.與引物退火無關(guān)答案：D（解析：Mg2+濃度影響引物退火效率，過高可增強引物與模板非特異性結(jié)合，過低則降低酶活性，通常需調(diào)整至dNTP濃度1.5-2倍）4.實時熒光PCR擴增曲線的"平臺期"形成的主要原因是：A.引物耗盡B.dNTP耗盡C.Taq酶失活D.反應(yīng)體系中抑制物積累答案：A（解析：平臺期主要因引物或dNTP消耗，其中引物分子量小、濃度低，通常先于dNTP耗盡；Taq酶在72℃可保持活性數(shù)小時；抑制物積累是次要因素）5.臨床PCR實驗室標本接收時，發(fā)現(xiàn)咽拭子保存液為生理鹽水，正確的處理方式是：A.直接進行核酸提取B.通知采樣人員重新采集C.加入病毒保存液后提取D.降低裂解溫度進行提取答案：B（解析：生理鹽水無病毒滅活和核酸保護作用，可能導(dǎo)致核酸降解或生物安全風(fēng)險，需使用含胍鹽的病毒保存液，故應(yīng)重新采樣）6.以下哪種物質(zhì)對PCR反應(yīng)抑制作用最強？A.血紅蛋白B.肝素C.免疫球蛋白D.尿素答案：B（解析：肝素通過與Taq酶結(jié)合抑制其活性，5U/mL即可完全抑制；血紅蛋白需>1mg/mL才顯著抑制；免疫球蛋白和尿素抑制作用較弱）7.PCR實驗室分區(qū)中，"產(chǎn)物分析區(qū)"的主要功能是：A.試劑準備B.標本處理C.擴增反應(yīng)D.擴增產(chǎn)物檢測答案：D（解析：產(chǎn)物分析區(qū)用于擴增后產(chǎn)物的檢測或電泳分析，需嚴格與前區(qū)物理隔離，避免氣溶膠污染）8.進行新冠病毒核酸檢測時，若弱陽性樣本Ct值為38，正確的處理措施是：A.直接報告陰性B.重復(fù)檢測并觀察擴增曲線C.增加模板量重新檢測D.稀釋模板后重新檢測答案：B（解析：Ct值38接近檢測限，需重復(fù)實驗確認是否存在擴增曲線的指數(shù)增長期，避免假陽性或假陰性）9.關(guān)于PCR實驗室空氣消毒，錯誤的做法是：A.每日工作結(jié)束后使用紫外線照射30分鐘B.紫外線燈距臺面高度不超過1.2米C.使用含氯消毒液噴灑地面D.采用移動空氣消毒機持續(xù)消毒答案：A（解析：紫外線需照射60分鐘以上才能有效滅活DNA/RNA氣溶膠；距臺面1米內(nèi)效果最佳；含氯消毒液可用于物體表面消毒；空氣消毒機可動態(tài)消毒）10.以下引物設(shè)計原則中，錯誤的是：A.長度18-25個核苷酸B.GC含量40-60%C.3'端避免連續(xù)3個G/CD.引物間互補序列不超過3個堿基答案：無錯誤選項（解析：引物長度通常18-25bp，GC含量40-60%可保證退火穩(wěn)定性；3'端連續(xù)G/C易導(dǎo)致非特異性結(jié)合；引物二聚體需避免，互補序列不超過3bp）11.核酸提取過程中，加入異丙醇的主要目的是：A.裂解細胞B.沉淀核酸C.洗滌雜質(zhì)D.中和pH答案：B（解析：異丙醇用于核酸沉淀，與核酸結(jié)合后形成沉淀；裂解用胍鹽或SDS；洗滌用75%乙醇；中和pH用Tris緩沖液）12.實時熒光PCR儀校準的關(guān)鍵指標不包括：A.溫度均勻性B.熒光通道靈敏度C.升降溫速率D.樣本孔數(shù)量答案：D（解析：校準需驗證溫度準確性（均勻性）、熒光檢測靈敏度（通道間一致性）、升降溫速率（影響擴增效率）；樣本孔數(shù)量為儀器固有參數(shù)）13.檢測HBVDNA時，若內(nèi)參基因Ct值明顯高于陽性對照，最可能的原因是：A.引物設(shè)計錯誤B.標本中存在PCR抑制物C.Taq酶活性過高D.擴增程序設(shè)置錯誤答案：B（解析：內(nèi)參基因用于監(jiān)測提取和擴增效率，其Ct值升高提示抑制物存在；引物錯誤會導(dǎo)致無擴增；Taq酶活性過高會降低Ct值；程序錯誤可能影響所有樣本）14.生物安全柜使用時，正確的操作是：A.雙臂快速進出操作區(qū)B.操作區(qū)放置過多物品C.紫外線消毒后立即使用D.操作結(jié)束后繼續(xù)運行5分鐘答案：D（解析：結(jié)束后需運行5分鐘凈化空氣；雙臂應(yīng)緩慢移動避免氣流擾動；物品應(yīng)限量放置保持氣流通暢；紫外線消毒后需通風(fēng)10分鐘去除臭氧）15.關(guān)于陰性質(zhì)控品的選擇，正確的是：A.使用無核酸酶水B.應(yīng)包含檢測靶標的同源序列C.需與臨床標本基質(zhì)一致D.濃度應(yīng)接近檢測限答案：C（解析：陰性質(zhì)控需使用與標本基質(zhì)相同的材料（如生理鹽水、咽拭子保存液），避免因基質(zhì)差異導(dǎo)致假陽性；無核酸酶水為空白對照，非基質(zhì)匹配質(zhì)控）二、多項選擇題（每題3分，共15分，少選得1分，錯選不得分）1.影響PCR擴增效率的因素包括：A.模板純度B.引物退火溫度C.Mg2+濃度D.擴增循環(huán)數(shù)答案：ABC（解析：擴增效率（E）=10^(-1/slope)-1，由模板質(zhì)量、引物退火效率、離子濃度等決定；循環(huán)數(shù)影響產(chǎn)物量，不影響效率）2.臨床PCR實驗室應(yīng)建立的質(zhì)量記錄包括：A.儀器校準記錄B.試劑驗收記錄C.陽性結(jié)果復(fù)核記錄D.人員培訓(xùn)記錄答案：ABCD（解析：質(zhì)量記錄涵蓋人員、設(shè)備、試劑、檢測全流程，需保存至少2年）3.核酸提取過程中，導(dǎo)致DNA損失的可能原因有：A.離心轉(zhuǎn)速不足B.洗滌次數(shù)過多C.裂解時間過短D.洗脫體積過大答案：ABC（解析：轉(zhuǎn)速不足導(dǎo)致沉淀不完全；洗滌過多可能洗脫核酸；裂解不充分影響釋放；洗脫體積過大稀釋核酸，不直接導(dǎo)致?lián)p失）4.以下屬于PCR實驗室一級生物安全事件的是：A.離心管破裂導(dǎo)致標本外濺B.實驗人員被污染的移液器扎傷C.擴增產(chǎn)物管未蓋緊產(chǎn)生氣溶膠D.冰箱溫度超出規(guī)定范圍2小時答案：AB（解析：一級事件指可能導(dǎo)致人員暴露或環(huán)境污染的意外；C為操作不規(guī)范但未造成暴露；D為設(shè)備異常事件）5.實時熒光PCR結(jié)果判讀時，需關(guān)注的參數(shù)有：A.Ct值B.擴增曲線形態(tài)C.基線范圍D.閾值設(shè)置答案：ABCD（解析：Ct值反映起始模板量；曲線需呈現(xiàn)典型S型；基線應(yīng)選擇指數(shù)期前的穩(wěn)定區(qū)域；閾值應(yīng)設(shè)置在指數(shù)期初始上升階段）三、判斷題（每題2分，共20分，正確√，錯誤×）1.PCR反應(yīng)中，dNTP濃度過高會導(dǎo)致錯配率增加。（√）（解析：dNTP濃度過高可降低Taq酶的選擇性，增加錯誤摻入概率）2.臨床標本應(yīng)在室溫下保存超過48小時后再進行檢測。（×）（解析：病毒核酸在室溫下易降解，應(yīng)2-8℃保存不超過48小時，-20℃可保存1個月）3.為提高檢測靈敏度，可將不同標本的核酸提取液混合后擴增。（×）（解析：混合樣本會導(dǎo)致稀釋，降低檢測靈敏度，且無法溯源單個標本結(jié)果）4.熒光定量PCR的標準曲線R2值應(yīng)≥0.99。（√）（解析：標準曲線相關(guān)性需≥0.99，斜率在-3.1~-3.6之間（對應(yīng)擴增效率90-110%））5.生物安全柜內(nèi)可以同時進行陽性和陰性標本處理。（×）（解析：需分區(qū)操作，避免交叉污染，陽性標本應(yīng)在獨立生物安全柜或負壓區(qū)域處理）6.移液器校準周期應(yīng)為每6個月一次。（√）（解析：臨床實驗室質(zhì)量管理要求精密儀器每6個月校準，使用頻繁時需縮短周期）7.擴增產(chǎn)物可直接倒入普通下水道。（×）（解析：需經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，30分鐘）或化學(xué)消毒（10%次氯酸鈉浸泡）后按醫(yī)療廢物處理）8.內(nèi)參基因應(yīng)選擇在所有檢測樣本中穩(wěn)定表達的基因。（√）（解析：如β-actin、GAPDH等管家基因，用于校正樣本量和提取效率）9.核酸提取儀故障時，可使用手工提取替代。（√）（解析：需驗證手工提取與儀器提取的一致性，確保檢測結(jié)果準確性）10.PCR實驗室各區(qū)域可使用同一臺冰箱存放試劑。（×）（解析：需分區(qū)存放，避免交叉污染，試劑準備區(qū)冰箱不得存放標本或擴增產(chǎn)物）四、簡答題（每題8分，共32分）1.簡述實時熒光PCR與普通PCR的主要區(qū)別。答案：①檢測原理：實時熒光PCR通過熒光信號實時監(jiān)測擴增過程（動力學(xué)檢測），普通PCR為終點檢測；②結(jié)果分析：實時熒光PCR可定量（通過Ct值），普通PCR僅定性（電泳觀察條帶）；③污染控制：實時熒光PCR閉管檢測，減少擴增產(chǎn)物污染風(fēng)險；普通PCR需開蓋電泳，易產(chǎn)生氣溶膠污染；④靈敏度：實時熒光PCR可檢測低至10拷貝/μL的模板，普通PCR通常需1000拷貝以上。2.列出PCR實驗室"試劑準備區(qū)"的主要操作內(nèi)容及環(huán)境要求。答案：操作內(nèi)容：①PCR反應(yīng)體系配制（包括引物、探針、dNTP、緩沖液、酶等）；②陽性對照、陰性對照、內(nèi)參的準備；③一次性消耗品（離心管、吸頭）的分裝。環(huán)境要求：①獨立空間，與其他區(qū)域物理隔離（緩沖間）；②空氣壓力為正壓（相對于其他區(qū)域）；③配備超凈工作臺或生物安全柜（一級）；④溫度18-25℃，濕度30-70%；⑤嚴格禁止帶入標本或擴增產(chǎn)物；⑥每日紫外消毒≥1小時，每月進行環(huán)境核酸污染監(jiān)測（擴增空白對照）。3.試述核酸提取過程中"洗滌"步驟的目的及注意事項。答案：目的：①去除結(jié)合在核酸吸附材料（磁珠/硅膠膜）上的雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、鹽離子、胍鹽等）；②減少PCR抑制物殘留。注意事項：①洗滌液應(yīng)完全覆蓋吸附材料（磁珠需充分懸浮）；②離心或磁吸后需徹底去除廢液（避免殘留乙醇抑制后續(xù)反應(yīng)）；③洗滌次數(shù)需嚴格按試劑盒說明書（過多可能導(dǎo)致核酸丟失）；④不同標本類型（全血/組織/拭子）可能需調(diào)整洗滌次數(shù)；⑤洗滌后需短暫離心（5秒）去除管壁液體，避免轉(zhuǎn)移時污染。4.當(dāng)出現(xiàn)"所有樣本Ct值均高于預(yù)期"的情況時，應(yīng)從哪些方面排查原因？答案：①模板因素：標本采集量不足（如咽拭子采樣不規(guī)范）、保存不當(dāng)（核酸降解）、提取效率低（裂解不充分、磁珠吸附失敗）；②試劑因素：引物/探針失效（反復(fù)凍融）、Taq酶活性下降（保存溫度不當(dāng)）、dNTP濃度不足（過期）；③儀器因素：熒光通道校準偏差（靈敏度下降）、熱蓋溫度不足（蒸發(fā)導(dǎo)致體積減少）、模塊溫度不均勻（部分孔擴增效率低）；④操作因素：加樣體積不準確（移液器未校準）、反應(yīng)體系配制錯誤（漏加酶或引物）、擴增程序設(shè)置錯誤（退火/延伸時間過短）；⑤質(zhì)控因素：陽性對照Ct值是否同步升高（判斷是系統(tǒng)誤差還是個別樣本問題）。五、案例分析題（13分）某實驗室進行新冠病毒核酸檢測時，出現(xiàn)以下情況：①陰性對照（NTC）擴增曲線出現(xiàn)明顯指數(shù)增長（Ct=32）；②弱陽性樣本（已知濃度100拷貝/mL）Ct值為35（預(yù)期Ct=30）；③陽性對照（10^5拷貝/mL）Ct值為18（正常范圍16-20）。問題：1.分析陰性對照異常的可能原因（4分）；2.弱陽性樣本Ct值偏高的可能原因（4分）；3.應(yīng)采取的糾正措施（5分）。答案：1.陰性對照異常原因：①擴增產(chǎn)物污染（上批實驗氣溶膠殘留，未徹底消毒）；②試劑污染（引物/探針或水被陽性模板污染）；③操作交叉污染（加樣時吸頭帶液或手套接觸陽性區(qū)物品后未更換）；④核酸提取過程污染（磁珠或離心管重復(fù)使用）。2.弱陽性樣本Ct值偏高原因：①提取效率低（標本保存液失效導(dǎo)致病毒裂解不充分）；②模板稀釋（加樣時體積不準確，實際加入模板量少于20μL）；③抑制物存在（樣本中含有血紅蛋白/黏液等抑制Taq酶活性）；④擴增程序設(shè)置