演講人：日期:腦卒中細胞模型研究體系contents目錄常用建模技術方法疾病機制與模型構建基礎細胞類型選擇策略分子機制研究路徑模型驗證與效能評估應用領域與轉化研究020103040506contentscontents01疾病機制與模型構建基礎腦卒中的病理生理基礎6px6px6px缺血性腦卒中（腦缺血）和出血性腦卒中（腦出血）的病理機制。腦卒中類型血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間的相互作用。神經(jīng)血管單元缺血或出血引起的腦細胞死亡、炎癥反應、氧化應激等。腦組織損傷機制010302腦卒中后神經(jīng)元的再生、突觸重塑和神經(jīng)網(wǎng)絡重組。神經(jīng)可塑性04細胞模型選擇依據(jù)疾病相關性選擇能模擬腦卒中病理生理特征的細胞類型，如神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞等。01可操作性易于培養(yǎng)、轉染和實驗操作，適用于高通量篩選和藥物測試。02穩(wěn)定性細胞模型在體外長時間培養(yǎng)后，仍能保持其生物學特性和疾病相關性。03可重復性實驗結果在不同實驗室和研究者之間具有可重復性，確保數(shù)據(jù)的可靠性。04體外模擬關鍵參數(shù)設定模擬腦卒中的缺血環(huán)境，通過調(diào)整培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣和糖濃度來實現(xiàn)。缺氧/缺糖加入炎性因子如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）等，模擬腦卒中后的炎癥反應。模擬神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞之間的相互作用，研究其對腦卒中病理過程的影響。炎性因子刺激通過加入氧化劑或提高培養(yǎng)環(huán)境中的氧濃度，誘導細胞發(fā)生氧化應激反應。氧化應激01020403神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞相互作用02常用建模技術方法氧糖剝奪模型建立流程氧糖剝奪原理缺氧環(huán)境設置剝奪時間控制剝奪后恢復通過切斷細胞培養(yǎng)液中的氧氣和葡萄糖，模擬腦缺血缺氧狀態(tài)。將細胞置于低氧或無氧環(huán)境中，如使用氮氣或惰性氣體替代氧氣。根據(jù)實驗需求，設置適當?shù)膭儕Z時間，以模擬不同程度的腦缺血損傷。將細胞恢復至正常培養(yǎng)條件，觀察細胞恢復能力和損傷程度。細胞缺血再灌注實驗設計通過阻斷細胞血供一段時間，模擬腦缺血狀態(tài)。缺血處理通過細胞存活率、形態(tài)變化、代謝指標等評估缺血再灌注損傷程度。損傷評估在一定時間后恢復細胞血供，模擬臨床上的再灌注治療。再灌注操作010302在缺血前、缺血期間或再灌注后給予藥物干預，觀察藥物對細胞保護或修復作用。藥物干預04基因編輯技術應用方案基因編輯技術選擇根據(jù)實驗需求選擇適合的基因編輯技術，如CRISPR-Cas9、TALEN等。靶點設計與構建針對目的基因設計并構建基因編輯載體，確保靶點特異性和編輯效率。細胞轉染與篩選將基因編輯載體轉染至目標細胞中，通過特定方法篩選出成功編輯的細胞。功能驗證與后續(xù)實驗對編輯后的細胞進行功能驗證，確保其符合實驗要求，并開展后續(xù)實驗。03細胞類型選擇策略原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系原代培養(yǎng)的優(yōu)點01直接來源于生物體內(nèi)，生物學特性更接近在體細胞，適用于研究細胞生理功能、代謝、信號轉導等。原代培養(yǎng)的難點02細胞分離、純化、培養(yǎng)條件較為苛刻，細胞數(shù)量有限，且存在批次間差異。常用原代神經(jīng)細胞種類03神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等。原代神經(jīng)細胞在腦卒中研究中的應用04通過研究原代神經(jīng)細胞在缺血、缺氧、炎性刺激等條件下的反應，揭示腦卒中的病理機制。永生化細胞系特性比較永生化細胞系的優(yōu)點01具有無限增殖能力，易于培養(yǎng)、擴增和保存，便于進行大規(guī)模實驗。永生化細胞系的缺點02可能因基因突變或表觀遺傳改變而失去部分正常生物學特性，影響實驗結果的可靠性。常用永生化神經(jīng)細胞系03SH-SY5Y、PC12、N2a等。永生化細胞系在腦卒中研究中的應用04通過構建腦卒中細胞模型，研究細胞凋亡、自噬、炎性反應等病理過程。3D類器官模型應用場景3D類器官模型的優(yōu)勢01能夠模擬生物體內(nèi)組織結構和微環(huán)境，更準確地反映細胞間的相互作用和生理病理過程。3D類器官模型的構建方法02基于細胞自組裝、生物打印、微流控技術等。3D類器官模型在腦卒中研究中的應用03模擬腦缺血、腦出血等病理過程，揭示細胞在三維空間中的反應和遷移規(guī)律。3D類器官模型的局限性04目前尚不能完全替代動物模型，仍需與二維細胞培養(yǎng)、動物模型等相互補充。04分子機制研究路徑信號通路檢測方法蛋白印跡（Westernblot）免疫熒光染色基因表達分析報告基因系統(tǒng)用于檢測特定信號通路蛋白的表達水平，包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白。通過實時熒光定量PCR等技術，檢測信號通路相關基因的表達情況。利用特異性抗體對細胞內(nèi)的信號通路蛋白進行標記，觀察其在細胞內(nèi)的分布和變化。將信號通路蛋白與熒光素酶等報告基因融合，通過測定熒光強度來反映信號通路的活性。凋亡/自噬檢測指標細胞凋亡率檢測采用流式細胞術或熒光顯微鏡等方法，檢測細胞凋亡的比例。01凋亡相關蛋白表達通過Westernblot或免疫熒光染色等方法，檢測凋亡相關蛋白如Caspase家族蛋白的表達水平。02自噬流檢測利用熒光標記的自噬小體或溶酶體，觀察自噬小體的形成和降解過程。03自噬相關基因表達通過實時熒光定量PCR或Westernblot等方法，檢測自噬相關基因的表達情況。04炎癥因子表達分析炎癥因子mRNA水平檢測利用實時熒光定量PCR技術，檢測細胞或組織中炎癥因子的mRNA表達水平。炎癥因子蛋白水平檢測通過Westernblot或ELISA等方法，檢測細胞或組織中炎癥因子的蛋白表達水平。炎癥信號通路研究探討炎癥因子與信號通路之間的相互作用，以及其在疾病發(fā)生和發(fā)展過程中的作用機制?？寡姿幬锖Y選基于炎癥因子表達水平，篩選出具有抗炎作用的藥物或化合物，為疾病治療提供新的候選藥物。05模型驗證與效能評估細胞活性檢測標準通過細胞增殖實驗，檢測細胞模型的增殖能力，反映細胞在模型中的生長狀態(tài)。細胞增殖能力測定細胞模型的凋亡率，驗證細胞在模型中的穩(wěn)定性。細胞凋亡率通過細胞周期檢測，了解細胞在模型中的增殖和分裂情況。細胞周期分析屏障功能評價方法炎性因子跨膜運輸檢測炎性因子在模型中的跨膜運輸情況，評估屏障功能對炎性因子的選擇性通透性。03通過測定模型通透性，評估屏障功能是否正常。02通透性測定緊密連接蛋白表達檢測模型中緊密連接蛋白的表達情況，反映屏障功能的完整性。01表型驗證實驗設計特定標志物檢測通過檢測模型細胞表達的特定標志物，驗證模型是否具備目標細胞的表型特征。01特定基因表達檢測模型細胞中特定基因的表達情況，驗證模型是否具備目標細胞的基因特征。02功能驗證實驗設計實驗驗證模型細胞是否具備目標細胞的功能特征，如神經(jīng)元模型是否具有電信號傳導功能。0306應用領域與轉化研究藥物篩選平臺搭建利用高通量篩選技術，快速檢測藥物對腦卒中細胞模型的保護作用和治療效果。高通量藥物篩選技術藥物作用機制研究藥物安全性評估深入探究藥物對腦卒中細胞模型的作用機制，包括藥物作用的靶點、信號通路等。通過細胞模型評估藥物的安全性和毒性，為藥物研發(fā)提供可靠依據(jù)。深入探究腦卒中的病理機制，包括神經(jīng)細胞死亡、炎癥反應、氧化應激等關鍵環(huán)節(jié)。腦卒中病理機制研究腦血管病變在腦卒中發(fā)病過程中的作用，如血管破裂、堵塞等。腦血管病變研究探討遺傳因素在腦卒中發(fā)病中的影響，尋找相關基因及其功能。遺傳因素與腦卒中疾病機制探索方向再生醫(yī)學潛在應用疾病模型建立利用腦卒中細胞