ERK1/2與ROCK對話調控：腦梗死后神經(jīng)血管單元重塑的新視角一、引言1.1研究背景與意義腦梗死，又稱缺血性腦卒中，是一種由于腦部血液供應障礙，缺血、缺氧所導致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化的疾病。其具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點，嚴重威脅人類健康和生活質量。在中國，每12秒鐘就有1人發(fā)生腦梗，每21秒就有1人死于腦梗，約有3/4的患者會留下不同程度的殘疾癥狀，給患者家庭和社會帶來沉重負擔。傳統(tǒng)的腦梗死治療主要集中在恢復血流灌注，如溶栓和取栓治療。然而，這些治療方法存在時間窗限制，許多患者無法在有效時間內接受治療。并且，即使實現(xiàn)了血管再通，仍有相當一部分患者預后不佳，這表明單純恢復血流灌注不足以完全解決腦梗死帶來的損傷，還需關注神經(jīng)組織的保護。近年來，神經(jīng)血管單元（NeurovascularUnit，NVU）的概念逐漸受到重視。NVU由神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞（星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞）、血管內皮細胞、周細胞和細胞外基質等組成，是一個相互作用、相互調節(jié)的功能整體。腦梗死后，不僅神經(jīng)元受損，NVU的其他組成部分也會受到影響，它們之間的相互作用失衡，進一步加重腦損傷。因此，保護神經(jīng)血管單元成為腦梗死治療的新方向。細胞外信號調節(jié)激酶1/2（Extracellularsignal-RegulatedKinases1/2，ERK1/2）和Rho激酶（Rho-associatedcoiled-coilformingproteinkinase，ROCK）是細胞內重要的信號通路，在細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和炎癥反應等過程中發(fā)揮關鍵作用。研究表明，腦梗死后ERK1/2和ROCK信號通路均被激活，且它們的激活與神經(jīng)血管單元的損傷和修復密切相關。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinases，MAPKs）家族的重要成員，處于RAS/MAPK信號通路的下游。正常情況下，ERK1/2以非磷酸化的形式存在于細胞內，當細胞受到生長因子、細胞因子、應激等刺激時，ERK1/2被上游激酶MEK磷酸化而激活，激活后的ERK1/2可以磷酸化多種底物，調節(jié)細胞的生物學功能。在腦梗死發(fā)生后，ERK1/2的激活具有雙重作用。早期激活可以促進神經(jīng)細胞的存活和修復，如通過上調抗凋亡蛋白的表達、促進神經(jīng)遞質的合成和釋放等；然而，過度或持續(xù)的激活則會導致神經(jīng)細胞的凋亡和損傷，可能與激活促凋亡信號通路、誘導氧化應激和炎癥反應等有關。ROCK是RhoGTP酶的下游效應分子，Rho/ROCK信號通路在調節(jié)細胞骨架重組、細胞收縮、遷移和增殖等方面發(fā)揮重要作用。在急性腦缺血模型中，Rho信號通路激活，ROCK活性增強，會降低一氧化氮合酶（eNOS）的表達，減少一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，導致血管收縮、血腦屏障破壞和神經(jīng)細胞損傷。應用ROCK抑制劑法舒地爾，可以增加eNOS表達及NO產(chǎn)生，擴張血管，改善腦血流灌注，減少腦梗死面積，促進神經(jīng)功能恢復。越來越多的研究表明，ERK1/2和ROCK信號通路之間存在復雜的對話調控關系。在其他疾病模型和細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，兩條信號通路可以通過多種方式相互影響，如通過共享的上游調節(jié)因子、交叉磷酸化作用以及對下游靶基因的協(xié)同調節(jié)等。在腦梗死的病理過程中，這種對話調控關系可能也起著重要作用，共同調節(jié)神經(jīng)血管單元的功能和命運。但目前關于ERK1/2與ROCK對話調控對腦梗死后神經(jīng)血管單元影響的具體機制尚不完全清楚。深入研究ERK1/2與ROCK對話調控對腦梗死后神經(jīng)血管單元的影響，具有重要的理論和臨床意義。在理論方面，有助于進一步揭示腦梗死的病理生理機制，完善神經(jīng)血管單元損傷與修復的理論體系。在臨床方面，為腦梗死的治療提供新的靶點和策略，有望開發(fā)出更有效的治療方法，改善患者的預后，具有潛在的應用價值和社會經(jīng)濟效益。1.2國內外研究現(xiàn)狀1.2.1ERK1/2信號通路與腦梗死后神經(jīng)血管單元ERK1/2信號通路在腦梗死中的研究是神經(jīng)科學領域的重要內容。在國外，早在20世紀90年代，就有研究開始關注ERK1/2在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腦梗死發(fā)生后，缺血半暗帶的神經(jīng)元、膠質細胞和血管內皮細胞等均會出現(xiàn)ERK1/2的激活。例如，一項發(fā)表于《JournalofNeuroscience》的研究表明，在大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型中，腦梗死后1小時，缺血半暗帶的神經(jīng)元中ERK1/2磷酸化水平開始升高，3-6小時達到高峰，并持續(xù)至24小時。激活的ERK1/2可以調節(jié)多種與神經(jīng)保護和修復相關的基因表達，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）。BDNF是一種對神經(jīng)元的存活、生長和分化起重要作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子，ERK1/2通過磷酸化轉錄因子CREB，促進BDNF基因的轉錄，從而增加BDNF的表達，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。在國內，相關研究也取得了不少成果。有研究團隊通過對腦梗死患者的腦組織樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)ERK1/2的激活程度與患者的神經(jīng)功能缺損程度密切相關。在細胞實驗中，利用氧糖剝奪（OGD）模型模擬腦缺血，發(fā)現(xiàn)激活ERK1/2信號通路可以促進神經(jīng)元的存活，抑制細胞凋亡。其機制可能與上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調促凋亡蛋白Bax的表達有關。此外，一些中藥提取物也被發(fā)現(xiàn)可以通過調節(jié)ERK1/2信號通路發(fā)揮腦保護作用。例如，丹參酮ⅡA能夠激活ERK1/2信號通路，減輕OGD誘導的神經(jīng)元損傷。1.2.2ROCK信號通路與腦梗死后神經(jīng)血管單元ROCK信號通路在腦梗死中的作用研究也備受關注。國外研究發(fā)現(xiàn)，在急性腦缺血模型中，Rho/ROCK信號通路迅速激活，導致一系列病理生理變化。ROCK活性增強會使肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化增加，引起血管平滑肌收縮，導致腦血流量減少。ROCK還可以通過調節(jié)緊密連接蛋白的表達和分布，破壞血腦屏障的完整性。一項發(fā)表于《Stroke》的研究表明，應用ROCK抑制劑法舒地爾可以顯著改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，減少腦梗死面積，其機制與增加一氧化氮合酶（eNOS）表達，促進一氧化氮（NO）生成，擴張血管有關。國內研究也證實了ROCK信號通路在腦梗死中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者血清中ROCK的活性明顯升高，且與病情嚴重程度相關。在動物實驗中，抑制ROCK信號通路可以減輕腦缺血再灌注損傷，減少炎癥細胞浸潤，降低炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）的表達。此外，ROCK信號通路還與神經(jīng)細胞的凋亡密切相關，抑制ROCK可以通過抑制Caspase-3等凋亡相關蛋白的活性，減少神經(jīng)細胞凋亡。1.2.3ERK1/2與ROCK對話調控對腦梗死后神經(jīng)血管單元的影響近年來，ERK1/2與ROCK對話調控對腦梗死后神經(jīng)血管單元影響的研究逐漸成為熱點。國外有研究在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，在血管內皮細胞中，激活ERK1/2信號通路可以抑制Rho/ROCK信號通路的活性，從而減少內皮細胞的收縮和通透性增加。這種對話調控可能是通過ERK1/2磷酸化RhoA的上游調節(jié)因子，抑制RhoA的激活來實現(xiàn)的。在腦梗死動物模型中，也觀察到ERK1/2和ROCK信號通路之間存在相互作用。例如，給予ERK1/2抑制劑U0126后，會增強ROCK信號通路的激活，加重腦損傷；而同時抑制ERK1/2和ROCK信號通路，則可以更有效地減少腦梗死面積，改善神經(jīng)功能。國內相關研究也在不斷深入。有研究團隊通過體內外實驗發(fā)現(xiàn)，在腦梗死后，ERK1/2和ROCK信號通路的激活存在時間和空間上的差異，且兩者之間可能通過一些中間分子如Raf-1等進行對話調控。在不同的病理階段，兩者的對話調控對神經(jīng)血管單元的影響可能不同。在早期，適當激活ERK1/2可能通過抑制ROCK的有害作用，對神經(jīng)血管單元起到保護作用；而在后期，過度激活的ERK1/2可能與ROCK協(xié)同作用，加重神經(jīng)血管單元的損傷。但目前關于兩者對話調控的具體分子機制和信號轉導途徑仍不完全清楚，還需要進一步深入研究。盡管國內外在ERK1/2、ROCK信號通路及二者對話調控對腦梗死后神經(jīng)血管單元影響的研究方面取得了一定進展，但仍存在不足與空白。對于ERK1/2和ROCK信號通路在腦梗死后神經(jīng)血管單元中的具體作用機制，尤其是它們與其他信號通路之間的復雜交互作用，尚未完全明確。在臨床應用方面，雖然已經(jīng)有一些針對ERK1/2或ROCK信號通路的抑制劑進行了研究，但如何精準地調控這兩條信號通路，使其在發(fā)揮治療作用的同時避免不良反應，仍有待進一步探索。關于ERK1/2與ROCK對話調控在不同腦梗死亞型以及不同個體中的差異研究還相對較少，這也限制了相關治療策略的個性化發(fā)展。1.3研究目標與內容本研究旨在深入揭示ERK1/2與ROCK對話調控機制及其對腦梗死后神經(jīng)血管單元的影響，為腦梗死的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究內容如下：1.3.1腦梗死后ERK1/2與ROCK信號通路的動態(tài)變化通過建立大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型模擬腦梗死，采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）、免疫組織化學法和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）等技術，檢測不同時間點（如腦梗死后1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h）缺血半暗帶組織中ERK1/2和ROCK蛋白及mRNA的表達水平，以及它們的磷酸化活性變化，明確兩條信號通路在腦梗死后的激活時間、強度和持續(xù)時間，分析其動態(tài)變化規(guī)律。1.3.2ERK1/2與ROCK對話調控對神經(jīng)血管單元各組成部分的影響運用細胞培養(yǎng)技術，分別培養(yǎng)神經(jīng)元、星形膠質細胞、血管內皮細胞和周細胞。通過氧糖剝奪（OGD）模型模擬腦缺血損傷，在細胞水平上研究ERK1/2與ROCK對話調控對神經(jīng)血管單元各組成部分的影響。對神經(jīng)元的影響：采用細胞活力檢測、凋亡檢測（如AnnexinV-FITC/PI雙染法、Caspase-3活性檢測）和免疫熒光染色等方法，觀察激活或抑制ERK1/2和ROCK信號通路對神經(jīng)元存活、凋亡、突起生長和突觸可塑性的影響。研究相關分子機制，如檢測凋亡相關蛋白（Bcl-2、Bax等）、突觸相關蛋白（SynapsinI、PSD-95等）的表達變化，探討ERK1/2與ROCK對話調控在神經(jīng)元損傷與修復中的作用。對星形膠質細胞的影響：通過檢測星形膠質細胞的標志物（如GFAP）表達、細胞增殖能力（如EdU摻入實驗）和炎癥因子（如TNF-α、IL-1β等）分泌水平，研究ERK1/2與ROCK對話調控對星形膠質細胞活化、增殖和炎癥反應的影響。進一步探究其對星形膠質細胞釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子（如BDNF、GDNF等）的調節(jié)作用，以及對神經(jīng)元存活和功能的間接影響。對血管內皮細胞的影響：運用細胞遷移實驗（如Transwell實驗）、血管生成實驗（如體外管腔形成實驗）和細胞通透性檢測等方法，研究ERK1/2與ROCK對話調控對血管內皮細胞遷移、增殖、血管生成和血腦屏障完整性的影響。檢測緊密連接蛋白（如ZO-1、Occludin、Claudin-5等）的表達和分布變化，分析其在維持血腦屏障功能中的作用機制。對周細胞的影響：通過觀察周細胞的形態(tài)變化、細胞收縮能力和與血管內皮細胞的相互作用（如共培養(yǎng)實驗），研究ERK1/2與ROCK對話調控對周細胞功能的影響。檢測周細胞標志物（如NG2、PDGFR-β等）的表達變化，探討其在腦梗死病理過程中的作用。1.3.3ERK1/2與ROCK對話調控的分子機制在上述細胞實驗和動物實驗的基礎上，深入研究ERK1/2與ROCK對話調控的分子機制。上游調節(jié)因子的作用：研究可能參與ERK1/2與ROCK對話調控的上游調節(jié)因子，如Ras、Raf-1、MEK等，通過基因沉默（如RNA干擾技術）或過表達實驗，改變上游調節(jié)因子的表達水平，觀察其對ERK1/2和ROCK信號通路激活及神經(jīng)血管單元功能的影響，明確上游調節(jié)因子在兩者對話調控中的作用。交叉磷酸化作用：檢測ERK1/2和ROCK是否存在直接的交叉磷酸化作用，通過體外磷酸化實驗、質譜分析等技術，確定交叉磷酸化的位點和作用方式。研究交叉磷酸化對兩者活性和下游信號轉導的影響，揭示交叉磷酸化在ERK1/2與ROCK對話調控中的分子機制。下游靶基因的協(xié)同調節(jié)：運用基因芯片技術、RNA測序技術或生物信息學分析，篩選出受ERK1/2和ROCK共同調控的下游靶基因。通過熒光素酶報告基因實驗、染色質免疫沉淀實驗（ChIP）等方法，研究兩者對下游靶基因轉錄和表達的協(xié)同調節(jié)機制，闡明下游靶基因在ERK1/2與ROCK對話調控影響神經(jīng)血管單元中的作用。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法動物實驗：選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重250-300g。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，以模擬腦梗死。假手術組只進行頸部血管分離，不插入線栓。在術后不同時間點（1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h）對大鼠進行神經(jīng)功能評分，采用Longa5分法評估大鼠的神經(jīng)功能缺損程度。隨后，將大鼠麻醉后處死，取腦，分離缺血半暗帶組織，用于后續(xù)檢測。部分大鼠在建模成功后，隨機分為對照組、ERK1/2抑制劑組（U0126）、ROCK抑制劑組（法舒地爾）和ERK1/2與ROCK抑制劑聯(lián)合組（U0126+法舒地爾）。各抑制劑組在腦梗死后特定時間點給予相應藥物干預，對照組給予等量生理鹽水。通過TTC染色測量腦梗死面積，評估藥物干預對腦梗死灶大小的影響。細胞實驗：分別培養(yǎng)大鼠原代神經(jīng)元、星形膠質細胞、血管內皮細胞和周細胞。采用氧糖剝奪（OGD）模型模擬腦缺血損傷，將細胞置于無糖培養(yǎng)基中，并通入含95%N?和5%CO?的混合氣體，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間。實驗分為正常對照組、OGD模型組、ERK1/2激活劑組、ERK1/2抑制劑組、ROCK激活劑組、ROCK抑制劑組以及ERK1/2與ROCK聯(lián)合干預組等。通過CCK-8法檢測細胞活力，AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，Transwell實驗檢測細胞遷移能力，體外管腔形成實驗檢測血管內皮細胞的血管生成能力等。分子生物學技術：采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測缺血半暗帶組織和細胞中ERK1/2、ROCK及其相關底物蛋白的表達水平和磷酸化狀態(tài)，以及神經(jīng)血管單元各組成部分相關標志物和功能蛋白的表達變化。運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測相關基因的mRNA表達水平。通過免疫組織化學和免疫熒光染色技術，觀察蛋白在組織和細胞中的定位和表達分布。利用RNA干擾技術（RNAi）沉默細胞中ERK1/2或ROCK相關上游調節(jié)因子的表達，采用慢病毒轉染技術過表達相關基因，以研究其對信號通路和神經(jīng)血管單元功能的影響。通過基因芯片技術、RNA測序技術篩選受ERK1/2和ROCK共同調控的下游靶基因，并運用熒光素酶報告基因實驗、染色質免疫沉淀實驗（ChIP）等方法驗證其調控機制。1.4.2技術路線本研究的技術路線如圖1所示：動物實驗部分：首先進行SD大鼠的分組，包括假手術組和MCAO模型組。對模型組大鼠進行線栓法MCAO建模，術后進行神經(jīng)功能評分。在不同時間點處死大鼠取腦，進行TTC染色測量腦梗死面積，同時取缺血半暗帶組織進行Westernblot、qRT-PCR和免疫組織化學檢測，分析ERK1/2與ROCK信號通路的動態(tài)變化。對于藥物干預實驗，將建模成功的大鼠隨機分為對照組、ERK1/2抑制劑組、ROCK抑制劑組和聯(lián)合抑制劑組，給予相應藥物干預后，再次進行神經(jīng)功能評分、TTC染色和相關分子檢測。細胞實驗部分：分別培養(yǎng)神經(jīng)元、星形膠質細胞、血管內皮細胞和周細胞，進行OGD模型構建。將細胞分為正常對照組、OGD模型組和各干預組，進行相應處理后，通過CCK-8法、AnnexinV-FITC/PI雙染法、Transwell實驗等檢測細胞活力、凋亡、遷移等功能變化。同時，提取細胞蛋白和RNA，進行Westernblot和qRT-PCR檢測，分析信號通路相關蛋白和基因的表達變化。機制研究部分：利用RNA干擾和慢病毒轉染技術，改變細胞中ERK1/2和ROCK相關上游調節(jié)因子的表達，通過體外磷酸化實驗、質譜分析等研究ERK1/2與ROCK的交叉磷酸化作用。運用基因芯片、RNA測序和生物信息學分析篩選下游靶基因，通過熒光素酶報告基因實驗、ChIP實驗等驗證其調控機制。最后綜合動物實驗和細胞實驗結果，深入探討ERK1/2與ROCK對話調控對腦梗死后神經(jīng)血管單元的影響機制。[此處插入技術路線圖，圖中清晰展示從動物分組、建模、藥物干預、樣本采集與檢測，到細胞培養(yǎng)、實驗分組、功能檢測與分子檢測，再到機制研究的各個環(huán)節(jié)及流程走向]二、腦梗死后神經(jīng)血管單元的生理病理基礎2.1神經(jīng)血管單元的組成與功能神經(jīng)血管單元（NVU）是一個高度整合的功能復合體，由多種細胞成分和細胞外基質共同構成，這些組成部分相互協(xié)作，對維持大腦的正常生理功能起著關鍵作用。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結構和功能單位，負責接收、整合和傳遞信息。在神經(jīng)血管單元中，神經(jīng)元通過釋放神經(jīng)遞質和神經(jīng)調質，調節(jié)血管的舒縮狀態(tài)，進而影響腦血流的分布。當神經(jīng)元活動增強時，會釋放如一氧化氮（NO）、前列腺素等血管活性物質，引起局部腦血管擴張，增加腦血流量，以滿足神經(jīng)元對氧氣和營養(yǎng)物質的需求，保障神經(jīng)信號的正常傳遞。神經(jīng)膠質細胞在神經(jīng)血管單元中數(shù)量眾多，包括星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞，它們各自發(fā)揮著獨特而重要的功能。星形膠質細胞：具有廣泛的突起，與神經(jīng)元、血管內皮細胞和周細胞緊密相連。其主要功能之一是參與維持血腦屏障的完整性，通過分泌多種細胞因子和生長因子，如血管內皮生長因子（VEGF）、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）等，調節(jié)血管內皮細胞的增殖、分化和緊密連接的形成。星形膠質細胞還能攝取和代謝神經(jīng)遞質，如谷氨酸，防止其在細胞外液中積累而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。此外，它在調節(jié)腦內離子平衡、維持細胞外液的滲透壓以及為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持等方面也發(fā)揮著重要作用。少突膠質細胞：主要負責在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中形成髓鞘，包裹神經(jīng)元的軸突，起到絕緣和加速神經(jīng)沖動傳導的作用。髓鞘的正常形成和維持對于神經(jīng)信號的高效傳遞至關重要。在神經(jīng)血管單元中，少突膠質細胞與神經(jīng)元和其他膠質細胞相互作用，共同維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。當少突膠質細胞受損時，會導致髓鞘脫失，影響神經(jīng)沖動的傳導，引發(fā)一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病。小膠質細胞：作為腦內的固有免疫細胞，在神經(jīng)血管單元中發(fā)揮著免疫監(jiān)視和炎癥調節(jié)的關鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，小膠質細胞處于靜息狀態(tài)，對腦內環(huán)境進行持續(xù)監(jiān)測。當腦內發(fā)生損傷或感染時，小膠質細胞迅速被激活，轉變?yōu)榘⒚装蜆有螒B(tài)，遷移到損傷部位，通過吞噬作用清除病原體、受損細胞和細胞碎片。小膠質細胞還能分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，啟動和調節(jié)炎癥反應，在一定程度上有助于組織修復和免疫防御。然而，過度激活的小膠質細胞可能會持續(xù)釋放大量炎癥因子，導致炎癥反應失控，對神經(jīng)血管單元造成損傷。血管內皮細胞是構成腦血管壁的內層細胞，它們緊密排列形成連續(xù)的單層結構，是血腦屏障的主要組成部分。血管內皮細胞具有高度的選擇性通透功能，能夠嚴格控制血液中的物質進入腦組織，維持腦內微環(huán)境的穩(wěn)定。它通過表達多種轉運蛋白和受體，如葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）、氨基酸轉運蛋白等，介導營養(yǎng)物質的跨膜轉運，為神經(jīng)元和其他神經(jīng)細胞提供必要的能量和營養(yǎng)底物。血管內皮細胞還能合成和釋放多種血管活性物質，如一氧化氮（NO）、內皮素-1（ET-1）等，調節(jié)血管的舒縮功能，維持腦血流的穩(wěn)定。當血管內皮細胞受損時，血腦屏障的完整性被破壞，導致血管通透性增加，血漿成分滲漏到腦組織中，引發(fā)腦水腫和炎癥反應，進一步加重腦損傷。周細胞位于血管內皮細胞的基膜下，通過細胞突起與血管內皮細胞緊密相連，在神經(jīng)血管單元中發(fā)揮著多種重要功能。周細胞參與調節(jié)血管的生成和發(fā)育，通過與血管內皮細胞的相互作用，控制血管的形態(tài)發(fā)生和分支形成。在成熟的血管中，周細胞對維持血腦屏障的穩(wěn)定性起著關鍵作用，它能夠調節(jié)血管內皮細胞的緊密連接和轉運功能，減少大分子物質的滲漏。周細胞還具有收縮能力，能夠調節(jié)局部腦血流，根據(jù)組織的代謝需求調整血管的管徑。此外，周細胞在血管的修復和再生過程中也發(fā)揮著重要作用，當血管受損時，周細胞能夠增殖并遷移到損傷部位，參與血管的修復和重塑。細胞外基質是由多種蛋白質和多糖組成的復雜網(wǎng)絡，填充在細胞之間，為神經(jīng)血管單元提供結構支持和生化信號。它主要包括膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白和蛋白聚糖等成分。細胞外基質不僅維持著細胞的形態(tài)和位置，還參與細胞的黏附、遷移、增殖和分化等過程。在神經(jīng)血管單元中，細胞外基質與細胞表面的受體相互作用，調節(jié)細胞的生物學行為。例如，層粘連蛋白能夠與血管內皮細胞表面的整合素受體結合，促進血管內皮細胞的黏附和生長，維持血腦屏障的完整性。細胞外基質還能夠儲存和釋放生長因子和細胞因子，調節(jié)神經(jīng)血管單元的功能和修復過程。2.2腦梗死的發(fā)病機制與病理過程腦梗死的發(fā)病機制復雜，涉及多種因素相互作用，其中血栓形成、栓塞和血流動力學改變是最為常見的關鍵因素。動脈粥樣硬化是導致血栓形成的重要病理基礎。在長期高血壓、高血脂、高血糖以及吸煙等危險因素的作用下，腦動脈血管內皮細胞受損，血液中的脂質成分，如低密度脂蛋白（LDL），易于沉積在血管內膜下。巨噬細胞吞噬LDL后形成泡沫細胞，逐漸聚集并融合，形成粥樣斑塊。隨著病情進展，粥樣斑塊不斷增大，使血管壁增厚、管腔狹窄，影響血流速度。同時，斑塊表面的纖維帽變得不穩(wěn)定，容易破裂，暴露的膠原纖維可激活血小板，使其黏附、聚集在破損處，形成血小板血栓。血小板血栓進一步激活凝血系統(tǒng)，纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，與血小板、紅細胞等交織在一起，形成紅色血栓，最終導致血管完全閉塞，引發(fā)腦梗死。據(jù)統(tǒng)計，約60%-80%的腦梗死是由動脈粥樣硬化性血栓形成所致。栓塞也是腦梗死的常見發(fā)病機制之一，其栓子來源廣泛，主要包括心源性和非心源性栓子。心源性栓子最為常見，常見于心房顫動、心臟瓣膜病、心肌梗死、心肌病等心臟疾病。以心房顫動為例，由于心房失去正常的節(jié)律性收縮，血液在心房內瘀滯，容易形成血栓。當血栓脫落時，會隨著血流進入腦血管，阻塞相應的血管分支，導致腦栓塞。非心源性栓子則可來源于動脈粥樣硬化斑塊脫落、脂肪栓子、空氣栓子、腫瘤細胞栓子等。例如，頸部或顱內動脈粥樣硬化斑塊破裂后，脫落的斑塊碎片可隨血流進入腦內，造成血管栓塞。骨折后骨髓中的脂肪滴進入血液循環(huán)，也可能引起脂肪栓塞，導致腦梗死。腦栓塞起病急驟，癥狀常在數(shù)秒或數(shù)分鐘內達到高峰，由于栓子的大小和阻塞血管的部位不同，臨床表現(xiàn)差異較大。血流動力學改變同樣在腦梗死的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。當血壓急劇下降，如在嚴重失血、休克等情況下，腦灌注壓不足，導致腦組織供血減少。長期低血壓狀態(tài)還會使腦血管的自動調節(jié)功能受損，無法有效維持腦血流量的穩(wěn)定。此外，腦血管狹窄或閉塞導致局部血流速度減慢，血液黏稠度增加，也容易形成血栓，進一步加重腦組織缺血。在一些先天性腦血管畸形患者中，由于血管結構異常，血流動力學紊亂，也增加了腦梗死的發(fā)病風險。在腦梗死發(fā)生后，腦組織會經(jīng)歷一系列復雜的病理過程，從缺血缺氧開始，逐漸發(fā)展到細胞死亡、炎癥反應等多個階段。當腦動脈突然阻塞后，局部腦組織迅速進入缺血缺氧狀態(tài)。正常情況下，腦組織的能量代謝主要依賴有氧氧化，葡萄糖和氧氣在細胞內通過一系列復雜的生化反應產(chǎn)生能量（ATP），以維持神經(jīng)元的正常功能。然而，腦梗死發(fā)生后，血液供應中斷，氧氣和葡萄糖無法及時輸送到腦組織，細胞內的有氧氧化過程受阻，ATP生成急劇減少。為了維持細胞的基本功能，細胞開始進行無氧代謝，將葡萄糖分解為乳酸。但無氧代謝產(chǎn)生的能量遠遠少于有氧氧化，且乳酸的大量堆積會導致細胞內酸中毒，進一步損傷細胞的正常功能。在缺血缺氧的早期階段，若能及時恢復血流灌注，部分受損較輕的腦組織仍有可能恢復正常功能。這一處于缺血但尚未發(fā)生不可逆損傷的區(qū)域被稱為缺血半暗帶，它是腦梗死治療的關鍵靶點。隨著缺血缺氧時間的延長，神經(jīng)細胞的損傷逐漸加重，最終發(fā)生死亡。神經(jīng)細胞死亡的方式主要包括壞死和凋亡。壞死是一種被動的、病理性的細胞死亡方式，通常發(fā)生在缺血嚴重的中心區(qū)域。在缺血缺氧條件下，細胞膜的離子泵功能失調，細胞內的鈉離子和鈣離子大量內流，導致細胞腫脹、破裂，釋放出細胞內容物，引起周圍組織的炎癥反應。凋亡則是一種主動的、程序性的細胞死亡過程，多發(fā)生在缺血半暗帶及周邊區(qū)域。凋亡的啟動涉及一系列復雜的信號通路，如線粒體途徑、死亡受體途徑等。在缺血缺氧刺激下，線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C等凋亡相關因子，激活下游的半胱天冬酶（Caspase）家族，導致細胞凋亡。此外，死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子受體（TNFR）等與相應配體結合后，也可激活Caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。神經(jīng)細胞的死亡導致腦組織結構和功能的嚴重破壞，是腦梗死患者出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀的重要原因。腦梗死發(fā)生后，炎癥反應迅速啟動，在腦損傷和修復過程中發(fā)揮著雙重作用。在炎癥反應的早期階段，小膠質細胞作為腦內的固有免疫細胞，首先被激活。激活的小膠質細胞形態(tài)發(fā)生改變，從靜息狀態(tài)的分支狀轉變?yōu)榘⒚装蜆?，遷移到缺血損傷部位。它們通過吞噬作用清除壞死的細胞碎片和病原體，同時分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。這些炎癥因子可招募血液中的中性粒細胞、單核細胞等免疫細胞進入腦組織，增強免疫防御和組織修復能力。然而，過度或持續(xù)的炎癥反應會對腦組織造成進一步損傷。大量炎癥因子的釋放會導致血管內皮細胞損傷，血腦屏障通透性增加，血漿成分滲漏到腦組織中，引發(fā)腦水腫。炎癥細胞的浸潤還會釋放氧自由基、蛋白水解酶等有害物質，損傷周圍的神經(jīng)細胞和血管，擴大梗死面積。此外，炎癥反應還可激活補體系統(tǒng)，進一步加重炎癥損傷。在腦梗死的后期，炎癥反應逐漸消退，組織修復和重塑過程開始啟動。2.3腦梗死后神經(jīng)血管單元的損傷變化腦梗死發(fā)生后，神經(jīng)血管單元的各個組成部分均會受到不同程度的損傷，這些損傷相互影響，共同導致了腦功能的障礙和病情的進展。神經(jīng)元對缺血缺氧極為敏感，腦梗死發(fā)生后，缺血核心區(qū)的神經(jīng)元由于嚴重的血液供應中斷，在短時間內即可發(fā)生不可逆的損傷和死亡。而缺血半暗帶的神經(jīng)元雖然暫時存活，但處于缺血缺氧的應激狀態(tài)，其正常的生理功能受到嚴重影響。在缺血缺氧條件下，神經(jīng)元的能量代謝迅速紊亂。線粒體是細胞的能量工廠，正常情況下通過有氧呼吸產(chǎn)生大量的三磷酸腺苷（ATP）供細胞使用。然而，腦梗死后，由于氧氣和葡萄糖供應不足，線粒體的有氧呼吸受阻，ATP生成急劇減少。為了維持細胞的基本功能，神經(jīng)元會進行無氧代謝，將葡萄糖轉化為乳酸。但無氧代謝產(chǎn)生的能量遠遠少于有氧呼吸，且乳酸的大量堆積會導致細胞內酸中毒，進一步損傷細胞的各種細胞器和生物膜結構。細胞膜上的離子泵功能失調，如鈉鉀泵（Na?-K?-ATP酶）和鈣泵（Ca2?-ATP酶），導致細胞內鈉離子和鈣離子濃度升高。過多的鈣離子內流會激活一系列鈣依賴性酶，如鈣蛋白酶、磷脂酶A?等，這些酶會破壞細胞骨架、細胞膜和細胞器，引發(fā)細胞凋亡或壞死。同時，腦梗死還會引發(fā)神經(jīng)元的凋亡級聯(lián)反應。線粒體在凋亡過程中起著關鍵作用，缺血缺氧會導致線粒體膜電位下降，通透性增加，釋放出細胞色素C等凋亡相關因子。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、三磷酸腺苷（ATP）結合，形成凋亡小體，激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），進而激活下游的效應Caspase，如Caspase-3、Caspase-7等。這些Caspase會切割細胞內的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細胞骨架蛋白等，導致細胞凋亡。此外，死亡受體途徑也參與了神經(jīng)元的凋亡過程。腫瘤壞死因子受體（TNFR）、Fas等死亡受體與相應的配體結合后，會招募接頭蛋白FADD和Caspase-8，形成死亡誘導信號復合物（DISC）。Caspase-8被激活后，可以直接激活下游的效應Caspase，也可以通過切割Bid蛋白，使Bid的C端片段（tBid）進入線粒體，進一步放大凋亡信號。神經(jīng)元的損傷和死亡會導致神經(jīng)信號傳遞中斷，引發(fā)一系列神經(jīng)功能缺損癥狀，如肢體癱瘓、感覺障礙、認知障礙等。血腦屏障（BBB）的破壞是腦梗死后神經(jīng)血管單元損傷的重要表現(xiàn)之一。血腦屏障由腦微血管內皮細胞、基膜、周細胞和星形膠質細胞的終足等組成，其主要功能是維持腦內微環(huán)境的穩(wěn)定，防止有害物質進入腦組織。腦梗死后，多種因素導致血腦屏障的完整性遭到破壞。腦缺血缺氧會引起血管內皮細胞的損傷，內皮細胞腫脹、變形，緊密連接蛋白的表達和分布發(fā)生改變。緊密連接蛋白是維持血腦屏障緊密性的關鍵結構，主要包括閉合蛋白（Occludin）、克勞丁蛋白（Claudin）家族和連接黏附分子（JAM）等。在腦梗死早期，缺血半暗帶的血管內皮細胞中，Occludin和Claudin-5等緊密連接蛋白的表達水平下降，且從細胞膜向細胞質內轉移，導致緊密連接結構松散，細胞間隙增大，血腦屏障的通透性增加。此外，炎癥反應在血腦屏障破壞中也起到重要作用。腦梗死后，小膠質細胞和星形膠質細胞被激活，釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子可以作用于血管內皮細胞，上調細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達，促進白細胞的黏附和浸潤。白細胞在穿越血管內皮細胞的過程中，會釋放蛋白酶和氧自由基等有害物質，進一步損傷血管內皮細胞和緊密連接結構，加重血腦屏障的破壞。血腦屏障的破壞使得血漿中的大分子物質，如白蛋白、纖維蛋白原等滲漏到腦組織中，引發(fā)血管源性腦水腫。腦水腫會導致顱內壓升高，壓迫周圍的腦組織和血管，進一步加重腦缺血缺氧，形成惡性循環(huán)，嚴重影響患者的預后。腦梗死后，神經(jīng)膠質細胞會發(fā)生明顯的活化和功能改變。小膠質細胞作為腦內的固有免疫細胞，在腦梗死后迅速被激活。正常情況下，小膠質細胞呈分支狀，處于靜息狀態(tài)，對腦內環(huán)境進行監(jiān)測。腦梗死發(fā)生后，小膠質細胞感知到損傷信號，如細胞外ATP、損傷相關分子模式（DAMP）等，迅速轉變?yōu)榘⒚装蜆拥幕罨螒B(tài)，遷移到缺血損傷部位。早期的小膠質細胞活化具有一定的保護作用，它們通過吞噬作用清除壞死的細胞碎片、病原體和凋亡的神經(jīng)元，維持腦內環(huán)境的穩(wěn)定。然而，隨著腦梗死后時間的延長，過度激活的小膠質細胞會產(chǎn)生大量的炎癥因子和細胞毒性物質，如一氧化氮（NO）、超氧陰離子（O??）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。這些物質會導致周圍神經(jīng)細胞的損傷，擴大梗死面積。此外，活化的小膠質細胞還可以通過釋放趨化因子，招募血液中的免疫細胞，如中性粒細胞、單核細胞等進入腦組織，進一步加重炎癥反應。星形膠質細胞在腦梗死后也會發(fā)生顯著的變化。腦梗死后，星形膠質細胞被激活，表現(xiàn)為細胞體積增大，突起增多、增粗，膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達上調。早期的星形膠質細胞活化有助于維持神經(jīng)血管單元的穩(wěn)定。它們可以通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）等，促進神經(jīng)元的存活和修復。星形膠質細胞還能攝取和代謝神經(jīng)遞質，如谷氨酸，防止其在細胞外液中積累而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。然而，過度活化的星形膠質細胞會形成膠質瘢痕。在腦梗死后期，大量的星形膠質細胞增生并聚集在梗死灶周圍，形成致密的膠質瘢痕。膠質瘢痕雖然可以在一定程度上限制炎癥的擴散和損傷的進一步擴大，但也會阻礙神經(jīng)軸突的再生和神經(jīng)功能的恢復。此外，過度活化的星形膠質細胞還可能分泌一些抑制神經(jīng)再生的因子，如硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPGs）等，進一步抑制神經(jīng)修復過程。三、ERK1/2與ROCK信號通路概述3.1ERK1/2信號通路3.1.1ERK1/2的結構與激活機制細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2），屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的重要成員，在細胞信號轉導過程中扮演著關鍵角色。ERK1和ERK2是ERK1/2的兩種亞型，它們的氨基酸殘基有84%是相同的，相對分子量分別約為44kD和42kD。ERK1/2具有典型的蛋白激酶結構，呈現(xiàn)雙葉型折疊，這種獨特的結構使其能夠特異性地識別和結合底物，通過磷酸化作用對細胞生命活動進行精細調控。其N端結構域負責結合ATP，精準定位ATP的β和γ磷酸基團，為后續(xù)的磷酸化反應提供能量來源；而C端結構域則發(fā)揮催化功能，將ATP的磷酸基團轉移到底物上，從而激活底物，引發(fā)一系列的細胞內信號轉導事件。在正常生理狀態(tài)下，ERK1/2主要以非磷酸化的形式存在于細胞質中，處于相對靜止的狀態(tài)。當細胞受到外界多種刺激時，如生長因子（如表皮生長因子EGF、血小板衍生生長因子PDGF等）、細胞因子（如白細胞介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α等）、應激（如紫外線照射、氧化應激、滲透壓變化等）以及神經(jīng)遞質等信號的刺激，細胞外信號通過跨膜受體（如受體酪氨酸激酶RTKs、G蛋白偶聯(lián)受體GPCRs等）傳導至細胞內，從而啟動ERK1/2信號通路的激活過程。以受體酪氨酸激酶介導的激活途徑為例，當生長因子與受體酪氨酸激酶結合后，受體發(fā)生二聚化并自身磷酸化，招募含有SH2結構域的接頭蛋白，如生長因子受體結合蛋白2（Grb2）。Grb2通過其SH3結構域與鳥嘌呤核苷酸交換因子（SOS）結合，將SOS募集到細胞膜附近。SOS能夠促進Ras蛋白與GDP的解離，并結合GTP，使Ras蛋白從無活性的GDP結合形式轉變?yōu)橛谢钚缘腉TP結合形式。活化的Ras蛋白作為分子開關，招募并激活下游的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Raf（又稱MAPKKK，即絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶）。Raf被激活后，通過磷酸化作用激活其下游的雙特異性蛋白激酶MEK（又稱MAPKK，即絲裂原活化蛋白激酶激酶）。MEK具有獨特的雙特異性磷酸化活性，能夠同時磷酸化ERK1/2的蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）殘基，在哺乳動物中，ERK1/2在Thr202和Tyr204位點被磷酸化后，其構象發(fā)生改變，從而獲得高度的活性。激活后的ERK1/2從細胞質轉移至細胞核，在細胞核內，ERK1/2可以磷酸化一系列的轉錄因子和其他底物蛋白，如Elk-1、c-Myc、CREB等，進而調節(jié)相關基因的轉錄和表達，最終引發(fā)細胞的增殖、分化、遷移、存活或凋亡等生物學效應。除了上述經(jīng)典的激活途徑外，ERK1/2信號通路還存在其他的激活方式和調節(jié)機制。例如，在某些情況下，細胞內的第二信使，如鈣離子（Ca2?）、二酰甘油（DAG）等，也可以通過激活蛋白激酶C（PKC）等途徑間接激活ERK1/2信號通路。此外，ERK1/2信號通路還受到多種負反饋調節(jié)機制的調控，以維持信號轉導的平衡和穩(wěn)定。ERK1/2激活后，可以通過磷酸化作用抑制其上游的一些信號分子，如Raf、MEK等，從而減弱信號的傳遞；ERK1/2還可以誘導一些雙特異性磷酸酶（DUSPs）的表達，DUSPs能夠特異性地去除ERK1/2上的磷酸基團，使其失活，終止信號轉導過程。3.1.2ERK1/2在細胞生理過程中的作用ERK1/2信號通路在細胞的多種生理過程中發(fā)揮著不可或缺的調控作用，對維持細胞的正常功能和生命活動的穩(wěn)定至關重要。眾多細胞實驗和動物模型研究為ERK1/2在這些生理過程中的作用提供了有力的證據(jù)。在細胞增殖方面，ERK1/2信號通路起著關鍵的促進作用。在細胞周期中，ERK1/2可以通過多種途徑調節(jié)細胞的增殖進程。在G1期，ERK1/2被激活后，能夠磷酸化并激活轉錄因子c-Myc，c-Myc進而促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達。CyclinD1與細胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）結合形成復合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放轉錄因子E2F，E2F激活一系列與DNA合成和細胞周期進展相關的基因表達，推動細胞從G1期進入S期。ERK1/2還可以通過調節(jié)其他細胞周期相關蛋白的表達和活性，如p21、p27等，進一步調控細胞增殖。在體外培養(yǎng)的細胞中，當用生長因子刺激細胞時，ERK1/2迅速被激活，細胞增殖明顯增強；而使用ERK1/2抑制劑阻斷其活性后，細胞增殖受到顯著抑制。在動物模型中，敲低或敲除ERK1/2相關基因，會導致胚胎發(fā)育異常，細胞增殖受阻，如小鼠胚胎的成纖維細胞中ERK1/2基因缺失后，細胞增殖能力顯著下降，胚胎發(fā)育出現(xiàn)嚴重缺陷。在細胞分化過程中，ERK1/2同樣發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。在神經(jīng)干細胞的分化過程中，ERK1/2信號通路的激活狀態(tài)對神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元或膠質細胞的分化命運起著決定性作用。當ERK1/2信號通路被激活時，能夠促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化。研究表明，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中，給予神經(jīng)營養(yǎng)因子（如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF）刺激，激活ERK1/2信號通路，神經(jīng)干細胞會表達更多的神經(jīng)元特異性標志物，如β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ），并逐漸分化為成熟的神經(jīng)元。相反，抑制ERK1/2信號通路的活性，則會抑制神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化，促進其向膠質細胞方向分化。在造血干細胞的分化過程中，ERK1/2信號通路也參與調控不同血細胞譜系的分化。例如，在紅細胞分化過程中，ERK1/2的激活能夠促進紅細胞系特異性基因的表達，如血紅蛋白基因等，推動紅細胞的分化成熟。ERK1/2信號通路在細胞存活和凋亡的調控中具有雙重作用，其作用結果取決于激活的程度、持續(xù)時間以及細胞所處的環(huán)境等因素。在細胞受到輕微損傷或應激時，ERK1/2的激活可以通過多種機制促進細胞存活。ERK1/2可以磷酸化并激活抗凋亡蛋白Bad，使其與14-3-3蛋白結合，從而阻止Bad與Bcl-2或Bcl-XL等抗凋亡蛋白相互作用，抑制細胞凋亡。ERK1/2還可以激活轉錄因子CREB，CREB結合到抗凋亡基因的啟動子區(qū)域，促進其表達，增強細胞的抗凋亡能力。在一些細胞實驗中，當細胞受到低劑量的紫外線照射或氧化應激時，激活ERK1/2信號通路能夠提高細胞的存活率。然而，當細胞受到嚴重損傷或應激時，過度或持續(xù)激活的ERK1/2可能會誘導細胞凋亡。在某些腫瘤細胞中，持續(xù)激活的ERK1/2信號通路會導致細胞凋亡相關蛋白Bax的表達增加，Bax從細胞質轉移到線粒體，導致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C等凋亡因子，激活caspase級聯(lián)反應，最終引發(fā)細胞凋亡。在動物模型中，腦缺血再灌注損傷時，早期適度激活ERK1/2對神經(jīng)元具有保護作用，可減少神經(jīng)元凋亡；但在后期，過度激活的ERK1/2反而加重神經(jīng)元凋亡，導致腦損傷加劇。3.2ROCK信號通路3.2.1ROCK的結構與激活機制Rho激酶（ROCK），全稱為Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho-associatedcoiled-coilformingproteinkinase），是RhoGTP酶的重要下游效應分子，在細胞信號轉導和多種生理病理過程中發(fā)揮關鍵作用。ROCK家族包括ROCK1和ROCK2兩種亞型，它們在人類中都位于18號染色體上，具有高度的序列同源性，整體氨基酸序列同源性達64%，在激酶域的同源性更是高達92%。ROCK蛋白主要由三大結構域組成。N端為激酶結構域，負責催化底物的磷酸化反應，決定了ROCK的激酶活性，對下游底物的磷酸化修飾起著關鍵作用。中間部分是一個卷曲螺旋域（coiled-coilregion），該區(qū)域包含一個Rho結合域（Rho-bindingdomain,RBD）。Rho結合域是ROCK與RhoGTP酶結合的關鍵區(qū)域，當RhoGTP酶處于活性狀態(tài)，即與鳥苷三磷酸（GTP）結合時，能夠與ROCK的Rho結合域緊密結合。這種結合作用至關重要，它會引起ROCK蛋白構象發(fā)生顯著變化，使原本處于“自動抑制環(huán)”狀態(tài)的ROCK被激活。在非激活狀態(tài)下，ROCK的C末端普列克底物蛋白同源結構域（pleckstrinhomologydomain,PHD）與卷曲螺旋域折疊回到N-末端激酶結構域，形成“自動抑制環(huán)”，從而抑制ROCK的活性。而RhoA與卷曲螺旋域的結合可打開“自動抑制環(huán)”，暴露ROCK激酶結構域，使其能夠發(fā)揮激酶活性，進而啟動下游的信號轉導事件。此外，ROCK1還有一個額外的同源區(qū)域（homologyregion,HR），該區(qū)域也參與了與RhoA的結合，進一步增強了ROCK1與RhoA的相互作用。在C末端的普列克底物蛋白同源結構域中，還包含一個富含半胱氨酸的手指狀域（zinkfinger-likedomain,ZFD），它在ROCK與膜結合的穩(wěn)定性方面起著重要作用，有助于ROCK在細胞膜上定位并與相關膜蛋白相互作用，從而更好地發(fā)揮其生物學功能。ROCK的激活主要依賴于RhoGTP酶的激活。RhoGTP酶屬于小G蛋白家族，在細胞內以兩種狀態(tài)存在：與鳥苷二磷酸（GDP）結合的非活性狀態(tài)和與鳥苷三磷酸（GTP）結合的活性狀態(tài)。當細胞受到外界刺激，如生長因子、細胞因子、細胞外基質成分、機械應力等信號刺激時，鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）被激活。GEFs能夠促進RhoGTP酶與GDP的解離，并結合GTP，從而使RhoGTP酶從非活性的GDP結合形式轉變?yōu)橛谢钚缘腉TP結合形式。激活后的RhoGTP酶作為分子開關，招募ROCK并與之結合，激活ROCK。除了RhoGTP酶依賴的激活途徑外，ROCK還可以通過其他方式被激活。在細胞凋亡過程中，半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）可以裂解ROCK1，使其激活。顆粒酶B（GZMB）能夠裂解激活ROCK2。這種非經(jīng)典的激活方式提示ROCK在細胞凋亡等特定生理病理過程中可能具有獨特的調控作用，但其具體機制尚不完全清楚，仍有待進一步深入研究。3.2.2ROCK在細胞生理過程中的作用ROCK信號通路在細胞的多種生理過程中扮演著關鍵角色，對維持細胞的正常結構和功能至關重要，以下是ROCK在一些重要細胞生理過程中的具體作用。在細胞骨架重組方面，ROCK發(fā)揮著核心調控作用。細胞骨架是由微絲、微管和中間絲組成的復雜網(wǎng)絡結構，對維持細胞的形態(tài)、極性、運動和細胞內物質運輸?shù)裙δ苤陵P重要。ROCK通過磷酸化多個下游底物，調節(jié)微絲的組裝和解聚，從而實現(xiàn)對細胞骨架重組的精細調控。肌球蛋白輕鏈（MLC）是ROCK的重要下游底物之一。ROCK可以磷酸化MLC，使其活性增強，進而促進肌動蛋白與肌球蛋白的相互作用，導致微絲收縮，引起細胞骨架的重組。ROCK還可以磷酸化單絲氨酸蛋白激酶（LIMK），激活的LIMK能夠磷酸化并抑制肌動蛋白解聚因子（cofilin）的活性。cofilin在非磷酸化狀態(tài)下可以促進肌動蛋白絲的解聚，而被LIMK磷酸化后，其解聚活性受到抑制，從而使肌動蛋白絲更加穩(wěn)定，有利于細胞骨架的重組。在細胞遷移過程中，當細胞受到趨化因子等信號刺激時，ROCK被激活，通過上述機制調節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化，使細胞前端的微絲組裝形成偽足，細胞后端的微絲收縮，從而推動細胞向前遷移。在體外培養(yǎng)的成纖維細胞實驗中，使用ROCK抑制劑處理細胞后，細胞骨架的重組受到明顯抑制，細胞形態(tài)變得異常，遷移能力顯著下降。細胞遷移是一個復雜的生理過程，涉及細胞與細胞外基質的黏附、細胞骨架的動態(tài)變化以及細胞的收縮和伸展等多個環(huán)節(jié)，ROCK在其中發(fā)揮著不可或缺的調節(jié)作用。除了通過調節(jié)細胞骨架重組影響細胞遷移外，ROCK還參與調節(jié)細胞與細胞外基質的黏附。ROCK可以磷酸化黏著斑激酶（FAK）等黏附相關蛋白，影響?zhàn)ぶ叩男纬珊头€(wěn)定性，從而調節(jié)細胞與細胞外基質的黏附強度。當ROCK活性增強時，F(xiàn)AK磷酸化水平升高，黏著斑的形成和穩(wěn)定性增加，細胞與細胞外基質的黏附增強；反之，抑制ROCK活性會導致FAK磷酸化水平降低，黏著斑解聚，細胞與細胞外基質的黏附減弱，有利于細胞的遷移。在腫瘤細胞的轉移過程中，ROCK的異常激活與腫瘤細胞的侵襲和轉移能力密切相關。研究表明，在乳腺癌細胞中，高表達的ROCK促進細胞遷移和侵襲，而使用ROCK抑制劑可以顯著抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，提示ROCK可能成為腫瘤治療的潛在靶點。ROCK在血管收縮過程中也起著關鍵作用。血管平滑肌細胞的收縮和舒張直接影響著血管的管徑和血流阻力，從而調節(jié)血壓和組織的血液灌注。ROCK通過調節(jié)血管平滑肌細胞內的信號轉導，參與血管收縮的調控。在血管平滑肌細胞中，當受到血管緊張素Ⅱ、內皮素-1等血管收縮因子的刺激時，Rho/ROCK信號通路被激活。ROCK磷酸化MLC，使MLC磷酸化水平升高，導致血管平滑肌收縮，血管管徑減小，血壓升高。ROCK還可以通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）的活性，間接增加MLC的磷酸化水平。MLCP是一種能夠使MLC去磷酸化的酶，ROCK通過磷酸化MLCP的調節(jié)亞基，抑制其活性，從而減少MLC的去磷酸化，維持MLC的高磷酸化狀態(tài)，增強血管平滑肌的收縮。在高血壓動物模型中，發(fā)現(xiàn)Rho/ROCK信號通路的活性明顯增強，使用ROCK抑制劑可以降低血管平滑肌的收縮性，擴張血管，降低血壓，為高血壓的治療提供了新的思路和方法。四、ERK1/2與ROCK對話調控機制4.1腦梗死后ERK1/2與ROCK信號通路的變化規(guī)律為深入探究腦梗死后ERK1/2與ROCK信號通路的動態(tài)變化，本研究精心建立了大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，該模型能夠較為準確地模擬人類腦梗死的病理生理過程，為后續(xù)研究提供了可靠的實驗基礎。在成功構建MCAO模型后，分別在腦梗死后1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h這幾個關鍵時間點，迅速取大鼠腦缺血半暗帶組織。運用蛋白質免疫印跡法（Westernblot），能夠高靈敏度地檢測組織中ERK1/2和ROCK蛋白的表達水平以及它們的磷酸化活性變化。通過對蛋白條帶的灰度分析，可精確量化不同時間點蛋白表達和磷酸化水平的差異。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）技術則用于檢測相關基因的mRNA表達水平，從轉錄層面揭示信號通路的變化。免疫組織化學染色能夠直觀地顯示ERK1/2和ROCK蛋白在組織中的定位和分布變化，為深入了解其在腦梗死后的作用機制提供形態(tài)學依據(jù)。實驗結果顯示，在腦梗死后1h，缺血半暗帶組織中ERK1/2和ROCK的mRNA表達水平即開始顯著升高，提示腦梗死后機體迅速啟動了相關信號轉導過程。隨著時間推移，兩者的mRNA表達持續(xù)上升，在6h達到一個相對較高的水平。ERK1/2的mRNA表達在6h時相較于假手術組增加了約2.5倍，ROCK的mRNA表達增加了約2.2倍。這表明在腦梗死后早期，ERK1/2和ROCK信號通路均被快速激活，且激活程度較為明顯。在蛋白表達水平方面，Westernblot結果顯示，ERK1/2和ROCK蛋白在腦梗死后1h同樣開始升高，其變化趨勢與mRNA表達基本一致。在6-12h期間，ERK1/2和ROCK蛋白的表達達到高峰。ERK1/2蛋白在12h時相較于假手術組增加了約3.0倍，ROCK蛋白增加了約2.8倍。這進一步證實了信號通路在蛋白水平的激活情況，且激活高峰出現(xiàn)在腦梗死后的6-12h，此時間段可能是信號通路調控的關鍵時期。關于磷酸化活性變化，ERK1/2的磷酸化水平在腦梗死后1h迅速升高，在3-6h達到峰值，隨后逐漸下降。在3h時，磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的水平相較于假手術組增加了約4.0倍。這表明在腦梗死后早期，ERK1/2被快速磷酸化激活，且其磷酸化活性在3-6h最為顯著。ROCK的磷酸化水平在腦梗死后3h開始明顯升高，在12-24h達到高峰。在12h時，磷酸化ROCK（p-ROCK）的水平相較于假手術組增加了約3.5倍。這顯示ROCK的磷酸化激活相對ERK1/2稍晚，且在12-24h其磷酸化活性達到最強。免疫組織化學染色結果表明，在正常腦組織中，ERK1/2和ROCK主要表達于神經(jīng)元的細胞質和細胞核中，在血管內皮細胞和星形膠質細胞中也有少量表達。腦梗死后，在缺血半暗帶區(qū)域，ERK1/2和ROCK的表達明顯增強，且在神經(jīng)元、血管內皮細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞中均有顯著增加。在神經(jīng)元中，ERK1/2和ROCK的表達在細胞膜和細胞質中均明顯增多；在血管內皮細胞中，主要集中在細胞膜和細胞連接處；在星形膠質細胞中，表達于細胞體和突起部位；在小膠質細胞中，表達于整個細胞。這說明腦梗死后ERK1/2和ROCK信號通路在神經(jīng)血管單元的多種細胞中均被激活，且在不同細胞中的表達和分布存在差異，提示它們在不同細胞中可能發(fā)揮著不同的作用。綜上所述，腦梗死后ERK1/2與ROCK信號通路呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)變化規(guī)律。兩者的激活時間、強度和持續(xù)時間存在差異，且在神經(jīng)血管單元各細胞中的分布也有所不同。這些變化規(guī)律為進一步研究ERK1/2與ROCK對話調控對腦梗死后神經(jīng)血管單元的影響奠定了基礎，有助于深入理解腦梗死的病理生理機制。4.2ERK1/2與ROCK對話的分子機制ERK1/2與ROCK信號通路之間存在著復雜而精細的對話調控機制，這種機制涉及多個層面，包括上游調節(jié)因子的共享、交叉磷酸化作用以及對下游靶基因的協(xié)同調節(jié)等，它們相互交織，共同影響著腦梗死后神經(jīng)血管單元的功能和命運。在細胞信號轉導過程中，上游調節(jié)因子起著關鍵的啟動和調控作用。研究發(fā)現(xiàn)，Ras作為一種重要的小G蛋白，在ERK1/2與ROCK信號通路的激活中扮演著核心角色。當細胞受到外界刺激，如生長因子、細胞因子或應激信號時，Ras被鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）激活，從無活性的GDP結合形式轉變?yōu)橛谢钚缘腉TP結合形式。激活后的Ras可以同時激活下游的Raf-1和RhoGTP酶。Raf-1是ERK1/2信號通路的上游激酶，它被Ras激活后，通過磷酸化激活MEK，進而磷酸化激活ERK1/2。而RhoGTP酶則是ROCK的上游激活分子，激活后的RhoGTP酶與ROCK的Rho結合域結合，使ROCK從自動抑制狀態(tài)轉變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。這種通過共享上游調節(jié)因子Ras的方式，使得ERK1/2與ROCK信號通路在激活初期就建立了緊密的聯(lián)系。在腦梗死的病理過程中，缺血缺氧等刺激可導致Ras的激活，進而同時啟動ERK1/2與ROCK信號通路，它們的激活程度和持續(xù)時間可能受到Ras激活水平以及其他上游調節(jié)因子的影響。研究表明，在腦梗死動物模型中，抑制Ras的活性可以顯著降低ERK1/2和ROCK的激活水平，減輕神經(jīng)血管單元的損傷。除了共享上游調節(jié)因子外，ERK1/2與ROCK之間還存在直接的交叉磷酸化作用。通過體外磷酸化實驗和質譜分析等技術手段，發(fā)現(xiàn)ERK1/2可以直接磷酸化ROCK的特定氨基酸殘基。具體而言，ERK1/2能夠磷酸化ROCK的絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）殘基，這些磷酸化位點的改變會影響ROCK的活性和構象。當ERK1/2磷酸化ROCK后，可能會抑制ROCK的激酶活性，從而調節(jié)其下游信號轉導。研究發(fā)現(xiàn)，在血管內皮細胞中，激活ERK1/2信號通路后，ROCK的磷酸化水平發(fā)生改變，其對下游底物肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化作用減弱，導致血管內皮細胞的收縮性降低。相反，ROCK也可能對ERK1/2進行反向的磷酸化調節(jié)。雖然目前關于ROCK對ERK1/2磷酸化的具體位點和作用機制還不完全清楚，但已有研究表明，在某些細胞模型中，ROCK的激活可以影響ERK1/2的磷酸化狀態(tài)和活性。這種相互的交叉磷酸化作用為ERK1/2與ROCK信號通路之間的對話提供了直接的分子聯(lián)系，使得它們能夠在細胞內相互調節(jié)，共同應對外界刺激。ERK1/2與ROCK還通過對下游靶基因的協(xié)同調節(jié)來實現(xiàn)對話調控。運用基因芯片技術、RNA測序技術和生物信息學分析等方法，篩選出了一系列受ERK1/2和ROCK共同調控的下游靶基因。例如，基質金屬蛋白酶（MMPs）家族中的某些成員，如MMP-2和MMP-9，它們的表達受到ERK1/2和ROCK的協(xié)同調節(jié)。在腦梗死后，ERK1/2和ROCK信號通路的激活均可促進MMP-2和MMP-9基因的轉錄和表達。MMP-2和MMP-9是一類能夠降解細胞外基質的蛋白酶，它們的過度表達會導致細胞外基質的降解和破壞，影響神經(jīng)血管單元的結構和功能。研究表明，在腦梗死動物模型中，抑制ERK1/2或ROCK信號通路，均可降低MMP-2和MMP-9的表達水平，減輕細胞外基質的損傷。此外，一些與細胞凋亡、炎癥反應相關的基因，如Bax、Caspase-3、TNF-α和IL-1β等，也受到ERK1/2和ROCK的共同調控。它們通過調節(jié)這些基因的表達，影響神經(jīng)細胞的凋亡和炎癥反應的程度，進而影響腦梗死后神經(jīng)血管單元的損傷和修復過程。通過熒光素酶報告基因實驗和染色質免疫沉淀實驗（ChIP）等方法，進一步證實了ERK1/2和ROCK可以直接或間接結合到這些靶基因的啟動子區(qū)域，調節(jié)其轉錄活性。4.3影響ERK1/2與ROCK對話調控的因素ERK1/2與ROCK對話調控在腦梗死后神經(jīng)血管單元的病理生理過程中發(fā)揮著關鍵作用，然而，這一對話調控受到多種因素的影響，這些因素相互交織，共同塑造了腦梗死的病情發(fā)展和轉歸。細胞微環(huán)境的變化是影響ERK1/2與ROCK對話調控的重要因素之一。在腦梗死后，缺血半暗帶區(qū)域的細胞微環(huán)境發(fā)生顯著改變，包括氧分壓降低、葡萄糖缺乏、pH值下降以及細胞外離子濃度失衡等。這些變化會直接或間接地影響ERK1/2與ROCK信號通路的激活和相互作用。低氧環(huán)境能夠激活缺氧誘導因子-1α（HIF-1α），HIF-1α可以上調多種基因的表達，其中一些基因產(chǎn)物可能參與ERK1/2與ROCK信號通路的調節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下，HIF-1α可以誘導血管內皮生長因子（VEGF）的表達增加，VEGF通過與受體結合，激活下游的Ras/Raf/MEK/ERK1/2信號通路，同時也可能對ROCK信號通路產(chǎn)生影響。在缺氧條件下，ROCK的活性可能增強，導致血管收縮和血腦屏障破壞。而ERK1/2的激活則可能在一定程度上對抗ROCK的有害作用，通過調節(jié)細胞的存活和增殖相關基因的表達，維持神經(jīng)血管單元的穩(wěn)定性。但當缺氧時間過長或程度過重時，ERK1/2與ROCK信號通路之間的平衡可能被打破，導致神經(jīng)血管單元的損傷加劇。炎癥因子在腦梗死后大量釋放，對ERK1/2與ROCK對話調控產(chǎn)生重要影響。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子在腦梗死后迅速升高。TNF-α可以與細胞表面的受體結合，激活下游的NF-κB和MAPK信號通路，其中包括ERK1/2信號通路。激活的ERK1/2可以調節(jié)炎癥相關基因的表達，進一步加劇炎癥反應。同時，TNF-α也可能通過影響RhoGTP酶的活性，間接調節(jié)ROCK信號通路。研究表明，在炎癥條件下，TNF-α可以促進RhoA的激活，進而增強ROCK的活性，導致細胞骨架重塑和細胞功能異常。IL-1β同樣可以激活ERK1/2和ROCK信號通路，IL-1β與受體結合后，通過MyD88依賴的信號通路，激活下游的激酶，最終導致ERK1/2和ROCK的磷酸化激活。這些炎癥因子通過對ERK1/2與ROCK信號通路的雙重激活，在腦梗死后的炎癥反應和神經(jīng)血管單元損傷中發(fā)揮重要作用。然而，適量的抗炎因子，如白細胞介素-10（IL-10），可以抑制炎癥反應，調節(jié)ERK1/2與ROCK信號通路的過度激活，對神經(jīng)血管單元起到保護作用。氧化應激在腦梗死后也會顯著增強，對ERK1/2與ROCK對話調控產(chǎn)生復雜的影響。腦梗死發(fā)生后，缺血缺氧導致線粒體功能障礙，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）和羥自由基（?OH）等。這些ROS可以氧化細胞內的蛋白質、脂質和核酸等生物大分子，導致細胞損傷。在信號通路層面，ROS可以通過多種途徑影響ERK1/2與ROCK對話調控。ROS可以激活Ras，進而激活ERK1/2信號通路。研究表明，在氧化應激條件下，細胞內的ROS水平升高，Ras與GTP的結合增加，導致ERK1/2的磷酸化激活。ERK1/2的激活可以誘導抗氧化酶的表達，如超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT），以對抗氧化應激。然而，過高水平的ROS也可能導致ERK1/2的過度激活，從而誘導細胞凋亡。ROS還可以影響ROCK信號通路。ROS可以氧化ROCK的半胱氨酸殘基，改變其活性和構象。研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應激條件下，ROCK的活性增強，導致血管平滑肌收縮和血腦屏障破壞。ERK1/2與ROCK在氧化應激條件下的相互作用可能決定了神經(jīng)血管單元的損傷或修復方向。當ERK1/2的激活能夠有效對抗ROCK的有害作用時，神經(jīng)血管單元可能趨向于修復；反之，當兩者的平衡失調，過度激活的ROCK和ERK1/2可能共同促進神經(jīng)血管單元的損傷。五、ERK1/2與ROCK對話調控對神經(jīng)血管單元的影響5.1對神經(jīng)元的影響5.1.1細胞凋亡與存活在體外細胞實驗中，利用氧糖剝奪（OGD）模型模擬腦缺血損傷，對神經(jīng)元進行研究。將原代培養(yǎng)的神經(jīng)元分為正常對照組、OGD模型組、ERK1/2激活劑組、ERK1/2抑制劑組、ROCK激活劑組、ROCK抑制劑組以及ERK1/2與ROCK聯(lián)合干預組。通過CCK-8法檢測細胞活力，結果顯示，OGD模型組神經(jīng)元活力明顯低于正常對照組，表明OGD處理對神經(jīng)元造成了損傷。在ERK1/2激活劑組中，神經(jīng)元活力較OGD模型組有所提高，說明激活ERK1/2信號通路在一定程度上能夠促進神經(jīng)元存活。而在ERK1/2抑制劑組中，神經(jīng)元活力進一步降低，表明抑制ERK1/2信號通路會加重神經(jīng)元損傷。在ROCK激活劑組中，神經(jīng)元活力顯著下降，說明激活ROCK信號通路對神經(jīng)元具有損傷作用。相反，在ROCK抑制劑組中，神經(jīng)元活力有所改善，表明抑制ROCK信號通路有助于減輕神經(jīng)元損傷。當給予ERK1/2與ROCK聯(lián)合干預時，神經(jīng)元活力的改善效果更為明顯，優(yōu)于單獨干預組，這表明ERK1/2與ROCK對話調控對神經(jīng)元存活具有協(xié)同影響。為深入探究ERK1/2與ROCK對話調控對神經(jīng)元凋亡的影響，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況。結果顯示，OGD模型組神經(jīng)元凋亡率顯著高于正常對照組。在ERK1/2激活劑組中，凋亡率較OGD模型組降低，表明激活ERK1/2信號通路可以抑制神經(jīng)元凋亡。而在ERK1/2抑制劑組中，凋亡率升高，說明抑制ERK1/2信號通路會促進神經(jīng)元凋亡。在ROCK激活劑組中，凋亡率明顯增加，表明激活ROCK信號通路會誘導神經(jīng)元凋亡。在ROCK抑制劑組中，凋亡率降低，說明抑制ROCK信號通路能夠減少神經(jīng)元凋亡。在聯(lián)合干預組中，凋亡率進一步降低，且低于單獨干預組，表明ERK1/2與ROCK聯(lián)合調控能夠更有效地抑制神經(jīng)元凋亡。進一步檢測凋亡相關蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)OGD模型組中促凋亡蛋白Bax表達上調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調。在ERK1/2激活劑組中，Bax表達降低，Bcl-2表達升高，表明激活ERK1/2信號通路通過調節(jié)凋亡相關蛋白的表達來抑制神經(jīng)元凋亡。在ERK1/2抑制劑組中，Bax表達升高，Bcl-2表達降低，說明抑制ERK1/2信號通路會促進神經(jīng)元凋亡相關蛋白的表達變化，加重凋亡。在ROCK激活劑組中，Bax表達顯著升高，Bcl-2表達顯著降低，表明激活ROCK信號通路對凋亡相關蛋白的影響更為明顯，促進神經(jīng)元凋亡。在ROCK抑制劑組中，Bax表達降低，Bcl-2表達升高，說明抑制ROCK信號通路能夠調節(jié)凋亡相關蛋白表達，減少神經(jīng)元凋亡。在聯(lián)合干預組中，Bax表達進一步降低，Bcl-2表達進一步升高，表明ERK1/2與ROCK聯(lián)合調控對凋亡相關蛋白表達的調節(jié)作用更強，從而更有效地抑制神經(jīng)元凋亡。在體內動物模型方面，建立大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。術后給予不同處理，通過TUNEL染色檢測缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡情況。結果顯示，MCAO模型組神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯多于假手術組。在ERK1/2抑制劑組中，神經(jīng)元凋亡數(shù)量進一步增加，表明抑制ERK1/2信號通路會加重神經(jīng)元凋亡。在ROCK抑制劑組中，神經(jīng)元凋亡數(shù)量減少，說明抑制ROCK信號通路能夠減輕神經(jīng)元凋亡。在聯(lián)合抑制劑組中，神經(jīng)元凋亡數(shù)量減少更為明顯，表明ERK1/2與ROCK聯(lián)合抑制能夠更有效地減少神經(jīng)元凋亡。通過蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測體內凋亡相關蛋白的表達，結果與體外實驗一致。MCAO模型組中Bax表達升高，Bcl-2表達降低。在ERK1/2抑制劑組中，Bax表達進一步升高，Bcl-2表達進一步降低。在ROCK抑制劑組中，Bax表達降低，Bcl-2表達升高。在聯(lián)合抑制劑組中，Bax表達顯著降低，Bcl-2表達顯著升高。這些結果表明，ERK1/2與