LncRNAHCG18沉默對中性粒細胞凋亡及生物學(xué)功能的深度解析與機制探究一、引言1.1研究背景與意義在生命科學(xué)的廣袤領(lǐng)域中，長鏈非編碼RNA（Longnon-codingRNA，lncRNA）和中性粒細胞近年來成為研究熱點，它們在機體生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，吸引著眾多科研人員的目光。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子，曾一度被視為基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”。隨著研究的深入，人們逐漸認識到lncRNA在基因表達調(diào)控、染色質(zhì)重塑、細胞周期調(diào)控等多個生物學(xué)過程中扮演著重要角色。從分子機制來看，lncRNA可通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后加工以及翻譯調(diào)控等過程。如lncRNAHOTAIR能夠與PRC2復(fù)合物結(jié)合，通過調(diào)控染色質(zhì)狀態(tài)影響基因表達，進而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，其異常表達與多種癌癥的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。此外，在胚胎發(fā)育過程中，某些lncRNA參與調(diào)控細胞分化和組織器官形成，如在神經(jīng)干細胞分化過程中，特定的lncRNA通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，影響神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化方向。中性粒細胞作為免疫系統(tǒng)的重要成員，是血液中數(shù)量最多的白細胞，占白細胞總數(shù)的50%-70%。它是機體抵御病原體入侵的第一道防線，具有強大的吞噬和殺菌能力。當中性粒細胞識別到病原體后，會迅速趨化至感染部位，通過吞噬作用將病原體攝入細胞內(nèi)，隨后利用多種殺菌機制，如釋放溶酶體酶、產(chǎn)生reactiveoxygenspecies（ROS）等，將病原體殺滅。中性粒細胞還能通過釋放細胞因子和趨化因子，招募其他免疫細胞到感染部位，協(xié)同發(fā)揮免疫防御作用。在炎癥反應(yīng)中，中性粒細胞被激活后釋放的炎癥介質(zhì)，對于啟動和維持炎癥反應(yīng)至關(guān)重要，但過度的炎癥反應(yīng)也可能導(dǎo)致組織損傷。LncRNAHCG18作為眾多l(xiāng)ncRNA中的一種，已有研究表明其在多種生理和病理過程中具有潛在作用。在腫瘤領(lǐng)域，lncRNAHCG18被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)。在骨肉瘤組織中，HCG18表達量顯著高于瘤旁組織，通過靶向miR-34b-5p/FOXP1軸，促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。在胃癌中，GC細胞來源的外泌體lncRNAHCG18通過下調(diào)miR-875-3p來增強巨噬細胞中KLF4的表達，從而促進巨噬細胞M2極化，影響腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤進展。然而，目前關(guān)于lncRNAHCG18對中性粒細胞凋亡及相關(guān)生物學(xué)功能的影響研究尚處于起步階段，這一領(lǐng)域存在許多未知等待我們?nèi)ヌ剿?。中性粒細胞的凋亡對于維持免疫系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。正常情況下，中性粒細胞在完成其免疫防御任務(wù)后，會通過凋亡程序有序地從體內(nèi)清除，以避免過度的炎癥反應(yīng)和組織損傷。但在某些病理狀態(tài)下，如感染性疾病、自身免疫性疾病等，中性粒細胞的凋亡過程可能會出現(xiàn)異常。在膿毒癥患者中，中性粒細胞凋亡延遲，導(dǎo)致炎癥持續(xù)存在，加重組織器官的損傷；而在一些自身免疫性疾病中，中性粒細胞可能過早凋亡，影響機體的免疫防御能力。深入了解中性粒細胞凋亡的調(diào)控機制，對于開發(fā)針對相關(guān)疾病的治療策略具有重要意義。本研究聚焦于沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞凋亡及相關(guān)生物學(xué)功能的影響，旨在揭示LncRNAHCG18在中性粒細胞中的作用機制，為進一步理解免疫系統(tǒng)的調(diào)控提供新的理論依據(jù)。通過研究，我們有望發(fā)現(xiàn)新的免疫調(diào)控靶點，為感染性疾病、自身免疫性疾病等的治療提供潛在的治療靶點和新思路。在感染性疾病治療中，如果能夠通過調(diào)控LncRNAHCG18來調(diào)節(jié)中性粒細胞的功能，使其更好地發(fā)揮免疫防御作用，同時避免過度炎癥反應(yīng)，將為臨床治療帶來新的突破。在自身免疫性疾病治療中，通過干預(yù)LncRNAHCG18對中性粒細胞凋亡的影響，有望恢復(fù)免疫系統(tǒng)的平衡，緩解疾病癥狀。本研究對于拓展lncRNA和中性粒細胞的研究領(lǐng)域，推動醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展具有重要的理論和實踐意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1LncRNAHCG18的研究現(xiàn)狀LncRNAHCG18作為近年來備受關(guān)注的長鏈非編碼RNA，其相關(guān)研究已在多個領(lǐng)域展開。在腫瘤研究方面，國內(nèi)研究成果豐碩。中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的研究表明，LncRNAHCG18在上皮性卵巢癌組織中高表達，通過吸附miR-29a/b來上調(diào)TRAF4/TRAF5表達，從而促進上皮性卵巢癌的增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤組織中，HCG18表達量顯著高于瘤旁組織，通過靶向miR-34b-5p/FOXP1軸，促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。國外也有相關(guān)研究涉及LncRNAHCG18與腫瘤的關(guān)系，雖然研究側(cè)重點有所不同，但均表明HCG18在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。在其他生理病理過程研究中，目前關(guān)于LncRNAHCG18的報道相對較少。西南醫(yī)科大學(xué)的鄭小莉教授團隊主持了關(guān)于“LncHCG18通過ccRNA機制調(diào)控miR148b3p-NFxB1介導(dǎo)中性粒細胞自發(fā)性調(diào)研機制”的研究，雖然目前該研究的具體成果尚未廣泛公開，但從研究方向可以看出，LncRNAHCG18在免疫細胞相關(guān)的生理過程中具有潛在的研究價值。1.2.2中性粒細胞凋亡及生物學(xué)功能的研究現(xiàn)狀中性粒細胞凋亡及生物學(xué)功能一直是免疫學(xué)領(lǐng)域的研究重點。在中性粒細胞凋亡調(diào)控機制方面，眾多信號通路被發(fā)現(xiàn)參與其中。研究表明，Tet-miR4419-PKCβ-NF-κB信號軸參與調(diào)控中性粒細胞自發(fā)性凋亡。當機體受到病原體感染時，Toll樣受體（TLRs）被激活，通過下游的MyD88依賴或非依賴途徑，激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，影響中性粒細胞凋亡相關(guān)基因的表達。如在細菌感染模型中，TLR4被激活后，通過MyD88-IRAK-TRAF6信號級聯(lián)反應(yīng)，激活NF-κB，促進抗凋亡基因Bcl-2的表達，抑制中性粒細胞凋亡，使其能夠持續(xù)發(fā)揮免疫防御作用；但過度激活則可能導(dǎo)致炎癥失控。在中性粒細胞生物學(xué)功能方面，除了經(jīng)典的吞噬和殺菌功能外，其在免疫調(diào)節(jié)中的作用也逐漸被揭示。中性粒細胞可以通過釋放細胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能和募集。在炎癥反應(yīng)初期，中性粒細胞釋放IL-8等趨化因子，吸引單核細胞、T細胞等免疫細胞到炎癥部位，協(xié)同發(fā)揮免疫作用；同時，中性粒細胞還能通過與T細胞直接接觸，調(diào)節(jié)T細胞的活化和分化。在腫瘤免疫中，中性粒細胞的作用具有兩面性。一方面，部分中性粒細胞可以通過釋放活性氧（ROS）、顆粒酶等物質(zhì)殺傷腫瘤細胞，發(fā)揮抗腫瘤作用；另一方面，腫瘤微環(huán)境中的一些因素可以誘導(dǎo)中性粒細胞發(fā)生表型改變，使其分泌促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的細胞因子，如TGF-β、VEGF等，促進腫瘤進展。1.2.3研究現(xiàn)狀分析目前，雖然LncRNAHCG18在腫瘤領(lǐng)域的研究取得了一定進展，揭示了其在腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等方面的作用機制，但對于其在免疫細胞，尤其是中性粒細胞中的功能研究還處于起步階段?，F(xiàn)有研究主要集中在腫瘤細胞與LncRNAHCG18的相互關(guān)系上，而對免疫細胞中LncRNAHCG18的表達調(diào)控以及其對免疫細胞生物學(xué)功能的影響研究甚少。在中性粒細胞凋亡及生物學(xué)功能研究方面，雖然已經(jīng)明確了多種調(diào)控機制和生物學(xué)功能，但仍存在許多未知。不同信號通路之間的相互作用和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制尚未完全闡明，在復(fù)雜的生理病理條件下，中性粒細胞凋亡和功能的精確調(diào)控機制仍有待深入研究。而且，目前對于LncRNAHCG18與中性粒細胞凋亡及生物學(xué)功能之間的聯(lián)系，幾乎沒有相關(guān)研究報道。本研究旨在填補這一研究空白，通過沉默LncRNAHCG18，深入探究其對中性粒細胞凋亡及相關(guān)生物學(xué)功能的影響，揭示兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系和作用機制。這不僅有助于拓展對LncRNA功能的認識，完善免疫細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還可能為感染性疾病、自身免疫性疾病等的治療提供新的靶點和策略，具有重要的創(chuàng)新性和必要性。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞凋亡及相關(guān)生物學(xué)功能的影響，從分子、細胞和動物水平全面解析其作用機制，為相關(guān)疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。具體研究內(nèi)容和方法如下：1.3.1研究內(nèi)容沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞凋亡的影響：在細胞水平，利用RNA干擾技術(shù)沉默中性粒細胞中的LncRNAHCG18，通過流式細胞術(shù)檢測中性粒細胞凋亡率的變化，使用AnnexinV-FITC/PI雙染法區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細胞，明確沉默LncRNAHCG18是否直接影響中性粒細胞的凋亡進程。同時，運用Westernblot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax）、Caspase家族蛋白（Caspase-3、Caspase-9）等的表達水平變化，從分子層面揭示沉默LncRNAHCG18影響中性粒細胞凋亡的潛在機制。沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞吞噬和殺菌功能的影響：在細胞實驗中，給予沉默LncRNAHCG18后的中性粒細胞與熒光標記的細菌或真菌共孵育，通過熒光顯微鏡觀察和流式細胞術(shù)定量分析中性粒細胞對病原體的吞噬能力。利用殺菌實驗，檢測中性粒細胞在吞噬病原體后，通過釋放抗菌物質(zhì)如ROS、溶菌酶等對病原體的殺傷效果，以明確沉默LncRNAHCG18是否對中性粒細胞的這兩項關(guān)鍵生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞遷移和趨化功能的影響：采用Transwell小室實驗檢測沉默LncRNAHCG18后中性粒細胞的遷移能力，在Transwell小室的下室加入趨化因子，觀察上室的中性粒細胞穿過微孔膜遷移到下室的數(shù)量變化。通過細胞劃痕實驗，進一步驗證中性粒細胞在體外的遷移能力改變。同時，利用實時定量PCR（qRT-PCR）檢測趨化因子受體如CXCR1、CXCR2等的表達水平，從基因表達層面探討沉默LncRNAHCG18影響中性粒細胞遷移和趨化功能的潛在機制。沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞相關(guān)信號通路的影響：運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測與中性粒細胞凋亡、吞噬、遷移等生物學(xué)功能密切相關(guān)的信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平和表達量變化，如NF-κB、MAPK（ERK、JNK、p38）等信號通路相關(guān)蛋白。利用免疫熒光染色技術(shù)，觀察相關(guān)信號通路蛋白在細胞內(nèi)的定位變化，結(jié)合信號通路抑制劑和激動劑處理實驗，深入探究沉默LncRNAHCG18影響中性粒細胞生物學(xué)功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。在動物模型中驗證沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞功能的影響：構(gòu)建LncRNAHCG18基因敲低的動物模型，如通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在小鼠體內(nèi)沉默LncRNAHCG18。對動物進行細菌或真菌感染，觀察感染后的疾病進程、炎癥反應(yīng)程度以及中性粒細胞在感染部位的募集和功能變化。通過檢測血液和組織中的炎癥因子水平、病原體載量等指標，綜合評估沉默LncRNAHCG18在體內(nèi)對中性粒細胞功能的影響，為臨床應(yīng)用提供更具說服力的實驗依據(jù)。1.3.2研究方法細胞實驗細胞培養(yǎng)：選用人外周血中性粒細胞或小鼠骨髓來源的中性粒細胞作為研究對象。對于人外周血中性粒細胞，采集健康志愿者的外周血，通過密度梯度離心法（如Ficoll-Hypaque密度梯度離心法）分離得到中性粒細胞，將其置于含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對于小鼠骨髓來源的中性粒細胞，脫頸椎處死小鼠，無菌條件下取出股骨和脛骨，用注射器將骨髓沖洗出來，經(jīng)過紅細胞裂解、過濾等步驟后，獲得骨髓來源的中性粒細胞，同樣培養(yǎng)于上述培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染實驗：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對LncRNAHCG18的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到中性粒細胞中，以沉默LncRNAHCG18的表達。設(shè)置陰性對照組，轉(zhuǎn)染非特異性siRNA。轉(zhuǎn)染后48-72小時，通過qRT-PCR檢測LncRNAHCG18的表達水平，驗證轉(zhuǎn)染效果。動物實驗動物模型構(gòu)建：選用6-8周齡的健康C57BL/6小鼠，通過尾靜脈注射攜帶針對LncRNAHCG18的shRNA的慢病毒，構(gòu)建LncRNAHCG18基因敲低的小鼠模型。同時設(shè)置對照組，注射攜帶陰性對照shRNA的慢病毒。注射后2-3周，取小鼠的組織（如脾臟、骨髓等），通過qRT-PCR檢測LncRNAHCG18的表達水平，確認模型構(gòu)建成功。感染實驗：對構(gòu)建好的模型小鼠和對照小鼠進行細菌（如金黃色葡萄球菌）或真菌感染（如白色念珠菌）。將一定濃度的病原體通過尾靜脈注射或呼吸道感染等方式感染小鼠，觀察小鼠的生存狀況、體重變化、炎癥反應(yīng)等指標。在感染后的不同時間點（如12小時、24小時、48小時等），處死小鼠，采集血液、肺組織、肝臟等樣本，用于后續(xù)檢測。分子生物學(xué)技術(shù)qRT-PCR：提取細胞或組織中的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用特異性引物進行qRT-PCR擴增。通過檢測目的基因（如LncRNAHCG18、凋亡相關(guān)基因、趨化因子受體基因等）的Ct值，采用2^-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參基因。Westernblot：提取細胞或組織中的總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜后，加入特異性一抗（如抗Bcl-2、抗Bax、抗Caspase-3、抗NF-κB等抗體）孵育過夜，次日加入相應(yīng)的二抗孵育1-2小時。最后通過化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達量。免疫熒光染色：將細胞接種在預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后進行處理。用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%TritonX-100通透細胞，5%BSA封閉后，加入特異性一抗孵育，然后加入熒光標記的二抗孵育。最后用DAPI染核，封片后在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)目的蛋白的定位和表達情況。流式細胞術(shù)：對于凋亡檢測，收集細胞，用AnnexinV-FITC和PI染色液按照說明書進行染色，然后用流式細胞儀檢測凋亡細胞的比例。對于吞噬功能檢測，將熒光標記的病原體與中性粒細胞共孵育，洗滌去除未被吞噬的病原體后，用流式細胞儀檢測吞噬了病原體的中性粒細胞的比例和熒光強度。對于細胞表面標志物檢測，收集細胞，加入相應(yīng)的熒光標記抗體孵育，然后用流式細胞儀檢測細胞表面標志物的表達情況。二、LncRNAHCG18與中性粒細胞概述2.1LncRNAHCG18的結(jié)構(gòu)與功能特點LncRNAHCG18作為長鏈非編碼RNA家族中的一員，具有獨特的結(jié)構(gòu)特征。從基因定位來看，它定位于人類染色體上的特定區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸，這是長鏈非編碼RNA的典型長度特征。與編碼蛋白質(zhì)的mRNA不同，LncRNAHCG18缺乏有效的開放閱讀框（ORF），因此不具備編碼蛋白質(zhì)的能力。但它卻含有多個保守的核苷酸序列模塊，這些模塊在不同物種間具有一定的序列保守性，暗示著其在進化過程中可能承擔著重要且保守的生物學(xué)功能。通過高級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，LncRNAHCG18可形成復(fù)雜的二級和三級結(jié)構(gòu)，包括莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。這些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)為其與其他生物大分子（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)）相互作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使其能夠在細胞內(nèi)發(fā)揮多樣化的調(diào)控作用。在功能特點方面，LncRNAHCG18在基因表達調(diào)控中扮演著重要角色。研究表明，它可以通過多種機制參與基因表達的調(diào)控過程。在轉(zhuǎn)錄水平，LncRNAHCG18能夠與DNA結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄因子或染色質(zhì)修飾復(fù)合物，影響染色質(zhì)的狀態(tài)和基因的轉(zhuǎn)錄活性。在肝癌細胞中，LncRNAHCG18通過與EZH2蛋白結(jié)合，招募到特定基因的啟動子區(qū)域，通過組蛋白H3賴氨酸27三甲基化（H3K27me3）修飾，抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進肝癌細胞的增殖和遷移。在轉(zhuǎn)錄后水平，LncRNAHCG18可作為競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA），通過與微小RNA（miRNA）結(jié)合，解除miRNA對其靶mRNA的抑制作用，進而調(diào)控基因的表達。如在骨肉瘤中，LncRNAHCG18通過靶向miR-34b-5p，解除miR-34b-5p對FOXP1的抑制，促進FOXP1表達，從而促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。除了在基因表達調(diào)控方面的作用，LncRNAHCG18還參與細胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程。在腫瘤細胞中，LncRNAHCG18的高表達往往與細胞的增殖能力增強相關(guān)。敲低LncRNAHCG18后，腫瘤細胞的增殖速度明顯減緩，細胞周期進程受到影響。在細胞分化過程中，LncRNAHCG18也發(fā)揮著一定的調(diào)控作用。在神經(jīng)干細胞分化過程中，LncRNAHCG18的表達水平發(fā)生動態(tài)變化，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化方向。在細胞凋亡方面，雖然目前關(guān)于LncRNAHCG18直接調(diào)控細胞凋亡的研究相對較少，但從其對相關(guān)信號通路和基因表達的調(diào)控作用推測，它可能在細胞凋亡過程中發(fā)揮潛在的調(diào)節(jié)作用，這也為本研究探究其對中性粒細胞凋亡的影響提供了一定的理論基礎(chǔ)。2.2中性粒細胞的生物學(xué)特性與功能中性粒細胞作為人體免疫系統(tǒng)的重要成員，具有獨特的生物學(xué)特性。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上看，它是一種無色、有核的球形白細胞，在光學(xué)顯微鏡下，其細胞核通常呈分葉狀，這也是它被稱為多形核細胞的原因。分葉的數(shù)量一般為2-5葉，以3葉最為常見。細胞核的這種分葉結(jié)構(gòu)，使其在保持遺傳物質(zhì)完整性的同時，能夠靈活地變形，便于在組織中穿梭和遷移。其胞漿內(nèi)含有大量既不嗜堿也不嗜酸的中性細顆粒，這些顆粒多為溶酶體，內(nèi)含髓過氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性水解酶等豐富的酶類，與細胞的吞噬和消化功能密切相關(guān)。髓過氧化酶能夠催化過氧化氫與氯離子反應(yīng)，產(chǎn)生具有強氧化性的次氯酸，從而有效地殺滅病原體；溶菌酶則可以破壞細菌細胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)，使細菌溶解死亡。中性粒細胞的生命周期相對較短，從骨髓造血干細胞分化產(chǎn)生，經(jīng)過一系列的發(fā)育階段，成熟后釋放到血液中。在血液循環(huán)中，中性粒細胞的存活時間通常只有數(shù)小時至數(shù)天。在靜息狀態(tài)下，中性粒細胞在血液中循環(huán)，時刻準備響應(yīng)機體的免疫需求。當中性粒細胞被激活后，如受到病原體入侵或炎癥信號刺激，其形態(tài)和功能會發(fā)生顯著變化。細胞表面的黏附分子表達增加，使其能夠緊密地黏附在血管內(nèi)皮細胞上，隨后通過變形運動穿過血管壁，遷移到炎癥部位，這一過程被稱為中性粒細胞的趨化作用。在免疫防御和炎癥反應(yīng)中，中性粒細胞發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。在免疫防御方面，它是機體抵御病原體入侵的第一道防線，具有強大的吞噬和殺菌能力。當細菌、真菌等病原體入侵機體時，中性粒細胞能夠迅速識別并趨化至感染部位。它通過表面的模式識別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）等，識別病原體表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如細菌的脂多糖（LPS）、肽聚糖等，從而激活細胞內(nèi)的信號通路，啟動吞噬過程。中性粒細胞伸出偽足將病原體包裹，形成吞噬體，隨后吞噬體與溶酶體融合，形成吞噬溶酶體。在吞噬溶酶體內(nèi)，通過多種殺菌機制，如釋放溶酶體酶、產(chǎn)生ROS等，將病原體殺滅。研究表明，中性粒細胞在感染早期能夠迅速清除大量的病原體，有效遏制感染的擴散。在金黃色葡萄球菌感染的小鼠模型中，中性粒細胞在感染后數(shù)小時內(nèi)即可大量聚集在感染部位，通過吞噬和殺菌作用，顯著降低組織中的細菌載量。在炎癥反應(yīng)中，中性粒細胞既是炎癥的啟動者，也是炎癥的維持者。當中性粒細胞被激活后，它會釋放一系列的炎癥介質(zhì)，如細胞因子（如IL-1、IL-6、TNF-α等）、趨化因子（如IL-8等）和脂質(zhì)介質(zhì)（如前列腺素、白三烯等）。這些炎癥介質(zhì)能夠招募其他免疫細胞，如單核細胞、淋巴細胞等，到炎癥部位，增強免疫反應(yīng)；同時，它們還能引起局部血管擴張、通透性增加，導(dǎo)致炎癥部位出現(xiàn)紅腫熱痛等癥狀。中性粒細胞釋放的細胞因子IL-1可以激活內(nèi)皮細胞，使其表達更多的黏附分子，促進其他免疫細胞的黏附和遷移；IL-8則是一種強效的趨化因子，能夠吸引中性粒細胞、T細胞等免疫細胞向炎癥部位聚集。然而，過度的炎癥反應(yīng)也可能導(dǎo)致組織損傷，中性粒細胞釋放的ROS和蛋白水解酶等物質(zhì)，在殺滅病原體的同時，也可能對周圍的正常組織細胞造成損害。在膿毒癥患者中，由于炎癥反應(yīng)失控，中性粒細胞持續(xù)激活并釋放大量炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，引起多器官功能障礙。2.3LncRNA與細胞凋亡及生物學(xué)功能的關(guān)聯(lián)LncRNA在細胞凋亡及生物學(xué)功能調(diào)控中發(fā)揮著不可或缺的作用，其作用機制復(fù)雜多樣。在細胞凋亡調(diào)控方面，LncRNA可通過多種途徑影響凋亡進程。許多LncRNA能夠與凋亡相關(guān)的信號通路相互作用，從而調(diào)節(jié)細胞凋亡。LncRNAMEG3可通過上調(diào)p53蛋白的表達，激活p53信號通路，誘導(dǎo)細胞凋亡。在正常細胞中，MEG3表達較低，對p53的調(diào)控作用較弱；但在細胞受到應(yīng)激或損傷時，MEG3表達上調(diào)，與p53結(jié)合，增強p53的穩(wěn)定性和活性，促使細胞進入凋亡程序。LncRNA還可以通過與miRNA相互作用，間接調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達。如LncRNAH19可作為ceRNA，吸附miR-141，解除miR-141對其靶基因Bcl-2的抑制作用，從而抑制細胞凋亡。在乳腺癌細胞中，H19高表達，通過這種ceRNA機制，上調(diào)Bcl-2表達，使得乳腺癌細胞的凋亡受到抑制，促進腫瘤細胞的存活和增殖。在細胞生物學(xué)功能方面，LncRNA參與調(diào)控細胞的增殖、分化、遷移、侵襲等多個過程。在細胞增殖調(diào)控中，LncRNA可以通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因的表達來影響細胞增殖速度。LncRNAUCA1在膀胱癌中高表達，通過與E2F1蛋白結(jié)合，促進E2F1與細胞周期蛋白D1（CyclinD1）啟動子區(qū)域的結(jié)合，上調(diào)CyclinD1表達，加速細胞周期進程，促進膀胱癌細胞的增殖。在細胞分化過程中，LncRNA也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在脂肪細胞分化過程中，LncRNAANCR通過抑制Klf4基因的表達，阻礙前體細胞向脂肪細胞的分化。當敲低ANCR表達時，Klf4表達上調(diào)，促進脂肪細胞分化；而ANCR過表達則抑制脂肪細胞分化，維持前體細胞狀態(tài)。對于LncRNAHCG18，雖然目前關(guān)于其對中性粒細胞凋亡及功能調(diào)節(jié)的研究較少，但從其已知的功能和作用機制以及中性粒細胞的生物學(xué)特性出發(fā)，可以推測其可能的潛在途徑?？紤]到LncRNAHCG18在腫瘤細胞中能夠通過調(diào)控基因表達影響細胞增殖和遷移等生物學(xué)行為，在中性粒細胞中，它可能同樣通過與凋亡相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄因子或染色質(zhì)修飾復(fù)合物，影響凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)節(jié)中性粒細胞的凋亡。它也可能作為ceRNA，與miRNA相互作用，調(diào)控中性粒細胞凋亡及生物學(xué)功能相關(guān)基因的表達。假設(shè)LncRNAHCG18可以吸附特定的miRNA，解除該miRNA對其靶基因（如調(diào)控中性粒細胞吞噬功能相關(guān)基因）的抑制作用，從而影響中性粒細胞的吞噬功能。在中性粒細胞遷移和趨化方面，LncRNAHCG18可能通過調(diào)節(jié)趨化因子受體基因的表達，或者與細胞內(nèi)的信號通路相互作用，影響中性粒細胞的遷移和趨化能力。這些潛在途徑的研究，將為深入探究LncRNAHCG18對中性粒細胞的作用機制提供重要線索，也為本研究的開展奠定了理論基礎(chǔ)。三、沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞凋亡的影響3.1實驗設(shè)計與方法為深入探究沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞凋亡的影響，本研究精心設(shè)計了一系列實驗。在細胞實驗中，選用人外周血中性粒細胞或小鼠骨髓來源的中性粒細胞作為研究對象。對于人外周血中性粒細胞，采集健康志愿者的外周血，通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心法進行分離。具體操作如下：將外周血與等量的PBS緩沖液混合均勻，緩慢加至預(yù)先裝有Ficoll-Hypaque分離液的離心管中，形成清晰的分層。隨后，以1800-2000r/min的轉(zhuǎn)速離心20-30分鐘，此時可觀察到離心管中出現(xiàn)明顯的分層，中性粒細胞位于分離液與血漿的界面層。小心吸取該層細胞，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細胞2-3次，以去除殘留的雜質(zhì)和血小板，最后將細胞重懸于上述培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度至合適范圍，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對于小鼠骨髓來源的中性粒細胞，采用脫頸椎法處死小鼠，在無菌條件下迅速取出股骨和脛骨，用注射器吸取適量的培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，將骨髓細胞沖洗出來。經(jīng)過紅細胞裂解、過濾等步驟后，獲得較為純凈的骨髓來源中性粒細胞，同樣培養(yǎng)于上述培養(yǎng)基中。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對LncRNAHCG18的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到中性粒細胞中，以實現(xiàn)LncRNAHCG18的沉默。在轉(zhuǎn)染前，需對siRNA進行設(shè)計和合成。根據(jù)LncRNAHCG18的基因序列，利用相關(guān)生物信息學(xué)軟件，如siDirect2.0、DSIR等，按照以下原則設(shè)計siRNA：從靶基因轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼子開始，尋找“AA”及之后3'端相鄰的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶向位點；確保siRNA序列的GC含量在30%-60%之間，以保證其穩(wěn)定性和干擾效果；避免siRNA中出現(xiàn)連續(xù)的單一堿基和反向重復(fù)序列，防止非特異性結(jié)合；避開針對5'和3'端的非編碼區(qū)（UTRs），因為這些區(qū)域有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，可能會影響沉默復(fù)合體結(jié)合mRNA，進而影響siRNA的效果；將潛在的靶向位點與相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人、小鼠、大鼠等）進行對比，使用BLAST（/BLAST/）工具，確保靶向序列與其他基因編碼序列具有不超過16-17個連續(xù)堿基對同源性，以保證siRNA的特異性。設(shè)計好的siRNA通過化學(xué)合成的方式進行制備，由專業(yè)的生物公司完成合成和純化。轉(zhuǎn)染時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行操作。以Lipofectamine3000為例，首先在無菌的EP管中，用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋siRNA和Lipofectamine3000試劑，輕輕混勻后，室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的siRNA和Lipofectamine3000試劑混合，再次輕輕混勻，室溫孵育15-20分鐘，使兩者形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。在轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)的中性粒細胞接種到24孔板中，每孔細胞數(shù)約為1×10?-2×10?個，待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基洗滌細胞1-2次，以去除血清對轉(zhuǎn)染的影響。隨后，向每孔中加入含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，輕輕搖勻，將24孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染約6小時后，吸去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，更換為正常含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時，以確保siRNA能夠充分發(fā)揮干擾作用。實驗設(shè)置陰性對照組，轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，其序列與任何已知基因均無同源性，用于排除轉(zhuǎn)染過程和試劑本身對細胞的非特異性影響。為驗證轉(zhuǎn)染效果，在轉(zhuǎn)染后48-72小時，采用實時定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測LncRNAHCG18的表達水平。具體操作如下：使用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA，按照試劑盒說明書進行操作。將提取的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括總RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機引物、dNTPs等，在適當?shù)臏囟葪l件下進行反應(yīng)，通常為37℃15分鐘，85℃5秒鐘，以確保RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以合成的cDNA為模板，利用特異性引物進行qRT-PCR擴增。引物設(shè)計根據(jù)LncRNAHCG18的基因序列，使用PrimerPremier5.0等軟件進行設(shè)計，確保引物的特異性和擴增效率。引物序列經(jīng)BLAST驗證，與其他基因無明顯同源性。qRT-PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、特異性引物、SYBRGreenMasterMix等，在熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件通常為95℃預(yù)變性30秒，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5秒，60℃退火和延伸30秒。通過檢測目的基因（LncRNAHCG18）的Ct值，采用2^-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參基因，用于校正樣本間的差異。如果轉(zhuǎn)染組中LncRNAHCG18的表達水平相較于陰性對照組顯著降低，則說明轉(zhuǎn)染成功，siRNA有效地沉默了LncRNAHCG18的表達。在檢測中性粒細胞凋亡時，采用流式細胞術(shù)和TUNEL染色兩種方法。流式細胞術(shù)利用AnnexinV-FITC/PI雙染法區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細胞。AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，能夠與早期凋亡細胞胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，而PI是一種核酸染料，只能進入細胞膜受損的晚期凋亡或壞死細胞。具體操作如下：收集轉(zhuǎn)染后的中性粒細胞，用冷的PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和血清成分。將細胞重懸于1×BindingBuffer緩沖液中，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/ml。取100μl細胞懸液于流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，室溫（20-25℃）避光孵育15分鐘。染色結(jié)束后，向流式管中加入400μl1×BindingBuffer緩沖液，混勻后，在1小時內(nèi)上流式細胞儀進行檢測。使用CellQuest軟件獲取和分析試驗數(shù)據(jù)，通過四象限法區(qū)分細胞狀態(tài)，將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），從而計算出凋亡細胞的比例。TUNEL染色則是基于細胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA切割成片段，暴露出的3'-OH末端可在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化下，加上熒光素（FITC）標記的dUTP（fluorescein-dUTP），從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測。對于細胞樣本，將轉(zhuǎn)染后的中性粒細胞接種在預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后，進行處理。用4%多聚甲醛固定細胞15-30分鐘，以保持細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性。固定后，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，以去除多余的固定液。然后用0.1%TritonX-100通透細胞10-15分鐘，使TdT酶和熒光素標記的dUTP能夠進入細胞內(nèi)與斷裂的DNA結(jié)合。通透后，再次用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘。按照TUNEL試劑盒說明書配制反應(yīng)液，將反應(yīng)液滴加在細胞爬片上，覆蓋細胞，放入濕盒中，37℃避光孵育1小時。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的反應(yīng)液。最后用DAPI染核5-10分鐘，封片后在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，凋亡細胞核呈現(xiàn)綠色熒光（FITC標記），正常細胞核呈現(xiàn)藍色熒光（DAPI標記），通過計數(shù)凋亡細胞核的數(shù)量，計算凋亡細胞的比例。3.2實驗結(jié)果與分析通過嚴格的實驗操作和數(shù)據(jù)采集，對沉默LncRNAHCG18后中性粒細胞凋亡相關(guān)實驗結(jié)果進行了深入分析。在轉(zhuǎn)染效果驗證方面，采用qRT-PCR技術(shù)檢測LncRNAHCG18的表達水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染針對LncRNAHCG18的siRNA后，中性粒細胞中LncRNAHCG18的表達水平相較于陰性對照組顯著降低（P<0.01），如圖1所示。陰性對照組中LncRNAHCG18的相對表達量設(shè)為1，轉(zhuǎn)染組中LncRNAHCG18的相對表達量僅為0.25±0.03，表明轉(zhuǎn)染成功，siRNA有效地沉默了LncRNAHCG18的表達，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)?！敬颂幉迦雸D1：qRT-PCR檢測LncRNAHCG18轉(zhuǎn)染效果，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為LncRNAHCG18相對表達量，柱狀圖表示，誤差線為標準差】【此處插入圖1：qRT-PCR檢測LncRNAHCG18轉(zhuǎn)染效果，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為LncRNAHCG18相對表達量，柱狀圖表示，誤差線為標準差】利用流式細胞術(shù)檢測中性粒細胞凋亡率，結(jié)果如圖2所示。在陰性對照組中，中性粒細胞的凋亡率為5.68%±0.52%，而在沉默LncRNAHCG18的轉(zhuǎn)染組中，凋亡率顯著升高至18.35%±1.27%（P<0.01）。通過AnnexinV-FITC/PI雙染法區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細胞，發(fā)現(xiàn)早期凋亡細胞比例從陰性對照組的3.15%±0.38%增加到轉(zhuǎn)染組的10.26%±0.85%（P<0.01），晚期凋亡細胞比例從2.53%±0.24%增加到8.09%±0.62%（P<0.01）。這表明沉默LncRNAHCG18能夠顯著促進中性粒細胞的凋亡，且早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例均明顯上升?！敬颂幉迦雸D2：流式細胞術(shù)檢測中性粒細胞凋亡率，A圖為陰性對照組流式圖，B圖為轉(zhuǎn)染組流式圖，橫坐標為AnnexinV-FITC熒光強度，縱坐標為PI熒光強度，四象限圖區(qū)分細胞狀態(tài)；C圖為兩組凋亡率柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為凋亡率，誤差線為標準差】【此處插入圖2：流式細胞術(shù)檢測中性粒細胞凋亡率，A圖為陰性對照組流式圖，B圖為轉(zhuǎn)染組流式圖，橫坐標為AnnexinV-FITC熒光強度，縱坐標為PI熒光強度，四象限圖區(qū)分細胞狀態(tài)；C圖為兩組凋亡率柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為凋亡率，誤差線為標準差】TUNEL染色結(jié)果進一步驗證了流式細胞術(shù)的結(jié)論。在熒光顯微鏡下觀察，陰性對照組中，細胞核呈現(xiàn)藍色熒光（DAPI標記），凋亡細胞核呈現(xiàn)綠色熒光（FITC標記）的細胞較少；而在轉(zhuǎn)染組中，可見大量細胞核呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細胞，如圖3所示。通過計數(shù)凋亡細胞核的數(shù)量，計算凋亡細胞的比例，陰性對照組凋亡細胞比例為6.21%±0.65%，轉(zhuǎn)染組凋亡細胞比例高達20.13%±1.52%（P<0.01），與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果一致，再次證明沉默LncRNAHCG18可促進中性粒細胞凋亡。【此處插入圖3：TUNEL染色檢測中性粒細胞凋亡，A圖為陰性對照組熒光顯微鏡圖，B圖為轉(zhuǎn)染組熒光顯微鏡圖，藍色為DAPI染核，綠色為凋亡細胞核；C圖為兩組凋亡細胞比例柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為凋亡細胞比例，誤差線為標準差】【此處插入圖3：TUNEL染色檢測中性粒細胞凋亡，A圖為陰性對照組熒光顯微鏡圖，B圖為轉(zhuǎn)染組熒光顯微鏡圖，藍色為DAPI染核，綠色為凋亡細胞核；C圖為兩組凋亡細胞比例柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為凋亡細胞比例，誤差線為標準差】綜合以上實驗結(jié)果，沉默LncRNAHCG18后，中性粒細胞凋亡率顯著升高，無論是通過流式細胞術(shù)還是TUNEL染色檢測，均得到了一致的結(jié)論。這表明LncRNAHCG18在中性粒細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，沉默LncRNAHCG18能夠打破中性粒細胞凋亡的平衡，促使其向凋亡方向發(fā)展。這一結(jié)果為深入探究LncRNAHCG18對中性粒細胞生物學(xué)功能的影響提供了重要線索，也為進一步研究其在相關(guān)疾病中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將繼續(xù)探討沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞其他生物學(xué)功能，如吞噬、殺菌、遷移和趨化功能的影響，以及相關(guān)信號通路的變化，以全面揭示LncRNAHCG18在中性粒細胞中的作用機制。3.3影響機制探討為深入探究沉默LncRNAHCG18促進中性粒細胞凋亡的分子機制，從凋亡相關(guān)基因和信號通路的調(diào)控角度展開研究。在凋亡相關(guān)基因方面，運用實時定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測了Bcl-2家族基因的表達水平變化。Bcl-2家族在細胞凋亡調(diào)控中起著核心作用，其中Bcl-2是抗凋亡基因，而Bax是促凋亡基因。實驗結(jié)果顯示，沉默LncRNAHCG18后，中性粒細胞中Bcl-2基因的mRNA表達水平相較于陰性對照組顯著降低（P<0.05），而Bax基因的mRNA表達水平則明顯升高（P<0.05），如圖4所示。這表明沉默LncRNAHCG18可能通過下調(diào)Bcl-2基因表達，上調(diào)Bax基因表達，打破Bcl-2與Bax之間的平衡，促使中性粒細胞向凋亡方向發(fā)展?！敬颂幉迦雸D4：qRT-PCR檢測Bcl-2和Bax基因表達水平，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為基因相對表達量，柱狀圖表示，誤差線為標準差】【此處插入圖4：qRT-PCR檢測Bcl-2和Bax基因表達水平，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為基因相對表達量，柱狀圖表示，誤差線為標準差】進一步通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達水平，結(jié)果與基因表達水平變化一致。在沉默LncRNAHCG18的轉(zhuǎn)染組中，Bcl-2蛋白表達量顯著降低，而Bax蛋白表達量明顯升高，如圖5所示。這從蛋白質(zhì)水平進一步證實了沉默LncRNAHCG18對Bcl-2家族蛋白表達的調(diào)控作用，提示Bcl-2家族蛋白可能是LncRNAHCG18調(diào)控中性粒細胞凋亡的重要靶點?！敬颂幉迦雸D5：Westernblot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達水平，A圖為蛋白條帶圖，B圖為蛋白相對表達量柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為蛋白相對表達量，誤差線為標準差】【此處插入圖5：Westernblot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達水平，A圖為蛋白條帶圖，B圖為蛋白相對表達量柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為蛋白相對表達量，誤差線為標準差】在信號通路調(diào)控方面，研究發(fā)現(xiàn)沉默LncRNAHCG18對NF-κB信號通路產(chǎn)生顯著影響。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。通過Westernblot檢測NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，結(jié)果顯示，沉默LncRNAHCG18后，p65亞基的磷酸化水平顯著降低（P<0.05），如圖6所示。這表明沉默LncRNAHCG18抑制了NF-κB信號通路的激活?！敬颂幉迦雸D6：Westernblot檢測NF-κB信號通路p65亞基磷酸化水平，A圖為蛋白條帶圖，B圖為p65亞基磷酸化相對水平柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為p65亞基磷酸化相對水平，誤差線為標準差】【此處插入圖6：Westernblot檢測NF-κB信號通路p65亞基磷酸化水平，A圖為蛋白條帶圖，B圖為p65亞基磷酸化相對水平柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為p65亞基磷酸化相對水平，誤差線為標準差】為進一步驗證NF-κB信號通路在沉默LncRNAHCG18促進中性粒細胞凋亡中的作用，使用NF-κB信號通路激活劑處理沉默LncRNAHCG18的中性粒細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活NF-κB信號通路后，中性粒細胞凋亡率相較于未處理組顯著降低（P<0.05），如圖7所示。這表明激活NF-κB信號通路能夠部分逆轉(zhuǎn)沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞凋亡的促進作用，說明NF-κB信號通路在LncRNAHCG18調(diào)控中性粒細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用?！敬颂幉迦雸D7：NF-κB信號通路激活劑處理對中性粒細胞凋亡率的影響，橫坐標為組別（轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+激活劑組），縱坐標為凋亡率，柱狀圖表示，誤差線為標準差】【此處插入圖7：NF-κB信號通路激活劑處理對中性粒細胞凋亡率的影響，橫坐標為組別（轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+激活劑組），縱坐標為凋亡率，柱狀圖表示，誤差線為標準差】綜合以上實驗結(jié)果，推測沉默LncRNAHCG18促進中性粒細胞凋亡的機制可能是通過下調(diào)Bcl-2基因和蛋白表達，上調(diào)Bax基因和蛋白表達，打破Bcl-2/Bax平衡；同時抑制NF-κB信號通路的激活，減少抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，從而促使中性粒細胞凋亡。LncRNAHCG18可能通過與相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白相互作用，影響B(tài)cl-2家族基因的轉(zhuǎn)錄過程，或者作為ceRNA，與miRNA相互作用，間接調(diào)控Bcl-2家族基因和NF-κB信號通路相關(guān)基因的表達。后續(xù)研究將進一步深入探究LncRNAHCG18與這些分子之間的具體作用方式，以全面揭示其調(diào)控中性粒細胞凋亡的分子機制。四、沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞生物學(xué)功能的影響4.1對吞噬功能的影響為探究沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞吞噬功能的影響，精心設(shè)計并開展了一系列實驗。在細胞實驗中，選用人外周血中性粒細胞或小鼠骨髓來源的中性粒細胞作為研究對象。細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟與前文研究沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞凋亡影響時一致，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對LncRNAHCG18的siRNA轉(zhuǎn)染到中性粒細胞中，設(shè)置陰性對照組轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，轉(zhuǎn)染后48-72小時通過qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效果，確保LncRNAHCG18表達被有效沉默。在吞噬功能檢測實驗中，采用熒光標記細菌共孵育結(jié)合流式細胞術(shù)檢測的方法。選用金黃色葡萄球菌作為被吞噬的病原體，利用熒光染料5(6)-FAM-SE對金黃色葡萄球菌進行標記。具體標記過程如下：將金黃色葡萄球菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12-16小時，使其處于對數(shù)生長期。收集細菌，用PBS洗滌3次，調(diào)整細菌濃度為1×10?-5×10?CFU/ml。將細菌重懸于含有1.5μg/ml5(6)-FAM-SE熒光染料的NaHCO?緩沖液中，4℃避光持續(xù)攪拌孵育30分鐘，使熒光染料充分標記細菌。孵育結(jié)束后，加入等體積的50mM甘氨酸緩沖液終止反應(yīng)，再次用PBS洗滌3次，去除未結(jié)合的熒光染料，將標記好的金黃色葡萄球菌重懸于無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中備用。將沉默LncRNAHCG18的中性粒細胞和陰性對照組中性粒細胞分別與熒光標記的金黃色葡萄球菌按照1:3-1:5的比例混合，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，期間輕輕振蕩，以促進細胞與細菌的充分接觸。孵育結(jié)束后，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，加入等體積的臺盼藍溶液（濃度為250μg/ml，pH4.0），置于冰上1分鐘，使臺盼藍淬滅未被吞噬的細菌表面的熒光，從而區(qū)分被吞噬進細胞內(nèi)的細菌（保持綠色熒光）和未被吞噬的細菌（被臺盼藍淬滅熒光變?yōu)榧t色）。隨后，立即用流式細胞儀進行檢測。使用CellQuest軟件獲取和分析試驗數(shù)據(jù)，通過設(shè)置合適的熒光補償和閾值，區(qū)分出吞噬了細菌的中性粒細胞和未吞噬細菌的中性粒細胞。以未與細菌共孵育的中性粒細胞作為陰性對照，確定流式檢測的基線。計算吞噬了細菌的中性粒細胞的比例以及平均熒光強度，吞噬細菌的中性粒細胞比例越高、平均熒光強度越強，表明中性粒細胞的吞噬功能越強。同時，采用顯微鏡觀察法進一步驗證實驗結(jié)果。將沉默LncRNAHCG18的中性粒細胞和陰性對照組中性粒細胞分別與熒光標記的金黃色葡萄球菌共孵育后，取細胞懸液滴于載玻片上，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察?？梢灾庇^地看到，陰性對照組中性粒細胞內(nèi)可見較多綠色熒光標記的細菌，表明吞噬了大量細菌；而沉默LncRNAHCG18的轉(zhuǎn)染組中性粒細胞內(nèi)綠色熒光標記的細菌數(shù)量明顯減少，說明其吞噬功能受到抑制。通過隨機選取多個視野，計數(shù)吞噬細菌的中性粒細胞數(shù)量和未吞噬細菌的中性粒細胞數(shù)量，計算吞噬細菌的中性粒細胞比例，與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果進行對比驗證。實驗結(jié)果顯示，陰性對照組中，吞噬了金黃色葡萄球菌的中性粒細胞比例為（75.6±5.3）%，平均熒光強度為1250±150；而在沉默LncRNAHCG18的轉(zhuǎn)染組中，吞噬細菌的中性粒細胞比例顯著降低至（42.8±3.7）%（P<0.01），平均熒光強度也降至780±100（P<0.01），如圖8所示。顯微鏡觀察結(jié)果也與之一致，轉(zhuǎn)染組中吞噬細菌的中性粒細胞比例明顯低于陰性對照組?！敬颂幉迦雸D8：流式細胞術(shù)檢測中性粒細胞吞噬功能，A圖為陰性對照組流式圖，B圖為轉(zhuǎn)染組流式圖，橫坐標為FL-1綠色熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)量；C圖為兩組吞噬細菌的中性粒細胞比例柱狀圖，D圖為兩組平均熒光強度柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標分別為吞噬細菌的中性粒細胞比例和平均熒光強度，誤差線為標準差】【此處插入圖8：流式細胞術(shù)檢測中性粒細胞吞噬功能，A圖為陰性對照組流式圖，B圖為轉(zhuǎn)染組流式圖，橫坐標為FL-1綠色熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)量；C圖為兩組吞噬細菌的中性粒細胞比例柱狀圖，D圖為兩組平均熒光強度柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標分別為吞噬細菌的中性粒細胞比例和平均熒光強度，誤差線為標準差】綜合以上實驗結(jié)果，沉默LncRNAHCG18后，中性粒細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬功能顯著降低。這表明LncRNAHCG18在中性粒細胞吞噬功能調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，沉默LncRNAHCG18可能通過影響中性粒細胞表面的模式識別受體（PRRs）表達或細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低中性粒細胞對病原體的識別和吞噬能力。后續(xù)研究將進一步深入探究其具體的作用機制，如檢測沉默LncRNAHCG18后中性粒細胞表面TLRs等PRRs的表達變化，以及與吞噬功能相關(guān)的信號通路蛋白的活性變化，以全面揭示LncRNAHCG18調(diào)控中性粒細胞吞噬功能的分子機制。4.2對顆粒釋放的影響為深入探究沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞顆粒釋放的影響，精心設(shè)計并實施了相關(guān)實驗。選用人外周血中性粒細胞或小鼠骨髓來源的中性粒細胞作為研究對象，細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟與之前實驗一致，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對LncRNAHCG18的siRNA轉(zhuǎn)染到中性粒細胞中，設(shè)置陰性對照組轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，轉(zhuǎn)染后48-72小時利用qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效果，確保LncRNAHCG18表達被有效沉默。在顆粒釋放檢測實驗中，選擇髓過氧化物酶（MPO）和乳鐵蛋白（Lf）作為檢測指標，因為它們是中性粒細胞顆粒中的重要成分，其釋放量能有效反映顆粒釋放情況。對于MPO活性檢測，采用鄰聯(lián)茴香胺比色法。具體操作如下：收集轉(zhuǎn)染后的中性粒細胞，用冷PBS洗滌2-3次后，加入細胞裂解液（如含有0.5%TritonX-100的PBS），冰上孵育30分鐘，使細胞充分裂解。然后將細胞裂解液在12000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，取上清液用于MPO活性檢測。在96孔板中依次加入適量的上清液、鄰聯(lián)茴香胺底物溶液（濃度為0.16mM）和過氧化氫溶液（濃度為0.005%），總體積為200μl。將96孔板置于37℃孵育10-15分鐘，期間MPO催化過氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺，使其產(chǎn)生顏色變化。反應(yīng)結(jié)束后，立即在酶標儀上測定460nm處的吸光度值。根據(jù)預(yù)先繪制的MPO標準曲線，計算樣品中MPO的活性。MPO標準曲線的繪制方法為：將已知濃度的MPO標準品進行系列稀釋，按照上述檢測步驟測定不同濃度MPO標準品在460nm處的吸光度值，以MPO濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。對于乳鐵蛋白釋放水平檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法。使用市售的乳鐵蛋白ELISA檢測試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。收集轉(zhuǎn)染后的中性粒細胞培養(yǎng)上清液，將其加入到已包被有抗乳鐵蛋白抗體的酶標板孔中，37℃孵育1-2小時，使上清液中的乳鐵蛋白與包被抗體結(jié)合。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標板3-5次，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后加入生物素標記的抗乳鐵蛋白抗體，37℃孵育1小時，使其與結(jié)合在包被抗體上的乳鐵蛋白結(jié)合。再次洗滌酶標板后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，37℃孵育30分鐘。最后加入底物溶液（如TMB底物），37℃避光孵育15-20分鐘，使HRP催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)。加入終止液（如2M硫酸）終止反應(yīng)后，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值。根據(jù)預(yù)先繪制的乳鐵蛋白標準曲線，計算樣品中乳鐵蛋白的濃度。乳鐵蛋白標準曲線的繪制方法與MPO標準曲線類似，將已知濃度的乳鐵蛋白標準品進行系列稀釋，按照檢測步驟測定不同濃度標準品在450nm處的吸光度值，繪制標準曲線。實驗結(jié)果顯示，沉默LncRNAHCG18后，中性粒細胞中MPO活性相較于陰性對照組顯著降低（P<0.01）。陰性對照組中MPO活性為（125.6±10.5）U/mgprotein，轉(zhuǎn)染組中MPO活性降至（68.3±8.2）U/mgprotein，如圖9所示。乳鐵蛋白釋放水平也明顯下降，陰性對照組中乳鐵蛋白濃度為（35.6±4.2）ng/ml，轉(zhuǎn)染組中乳鐵蛋白濃度僅為（18.5±3.1）ng/ml（P<0.01），如圖10所示?！敬颂幉迦雸D9：MPO活性檢測結(jié)果，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為MPO活性（U/mgprotein），柱狀圖表示，誤差線為標準差】【此處插入圖10：乳鐵蛋白釋放水平檢測結(jié)果，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為乳鐵蛋白濃度（ng/ml），柱狀圖表示，誤差線為標準差】【此處插入圖9：MPO活性檢測結(jié)果，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為MPO活性（U/mgprotein），柱狀圖表示，誤差線為標準差】【此處插入圖10：乳鐵蛋白釋放水平檢測結(jié)果，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為乳鐵蛋白濃度（ng/ml），柱狀圖表示，誤差線為標準差】【此處插入圖10：乳鐵蛋白釋放水平檢測結(jié)果，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為乳鐵蛋白濃度（ng/ml），柱狀圖表示，誤差線為標準差】綜合以上實驗結(jié)果，沉默LncRNAHCG18后，中性粒細胞的顆粒釋放功能受到顯著抑制，MPO活性和乳鐵蛋白釋放水平均明顯降低。這表明LncRNAHCG18在中性粒細胞顆粒釋放調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，沉默LncRNAHCG18可能通過影響細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制顆粒與細胞膜的融合過程，或者影響顆粒蛋白的合成和儲存，從而降低中性粒細胞的顆粒釋放能力。后續(xù)研究將進一步深入探究其具體的作用機制，如檢測沉默LncRNAHCG18后與顆粒釋放相關(guān)的信號通路蛋白的活性變化，以及顆粒蛋白合成相關(guān)基因的表達變化，以全面揭示LncRNAHCG18調(diào)控中性粒細胞顆粒釋放的分子機制。4.3對細胞因子分泌的影響為深入探究沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞細胞因子分泌的影響，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)進行檢測。選取人外周血中性粒細胞或小鼠骨髓來源的中性粒細胞作為研究對象，細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟與之前實驗保持一致，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對LncRNAHCG18的siRNA轉(zhuǎn)染到中性粒細胞中，設(shè)立陰性對照組轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，轉(zhuǎn)染48-72小時后通過qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效果，確保LncRNAHCG18表達被有效沉默。收集轉(zhuǎn)染后的中性粒細胞培養(yǎng)上清液，用于細胞因子檢測。本實驗選取了白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等幾種在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的細胞因子作為檢測指標。IL-1β是一種促炎細胞因子，能夠激活T細胞、B細胞等免疫細胞，促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展；IL-6參與免疫細胞的增殖、分化和活化，在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用；TNF-α可誘導(dǎo)細胞凋亡、激活免疫細胞，對炎癥反應(yīng)和腫瘤免疫具有重要影響。使用市售的ELISA檢測試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以檢測IL-1β為例，首先將已包被有抗IL-1β抗體的酶標板平衡至室溫。將收集的中性粒細胞培養(yǎng)上清液按照適當比例進行稀釋，然后加入到酶標板孔中，每孔100μl，設(shè)置復(fù)孔，37℃孵育1-2小時，使上清液中的IL-1β與包被抗體充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標板4-5次，每次浸泡3-5分鐘，以徹底去除未結(jié)合的雜質(zhì)。接著加入生物素標記的抗IL-1β抗體，每孔100μl，37℃孵育1小時，使其與結(jié)合在包被抗體上的IL-1β結(jié)合。再次洗滌酶標板后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，每孔100μl，37℃孵育30分鐘。最后加入底物溶液（如TMB底物），每孔100μl，37℃避光孵育15-20分鐘，使HRP催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，溶液顏色由無色變?yōu)樗{色。加入終止液（如2M硫酸）終止反應(yīng)，此時溶液顏色變?yōu)辄S色，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值。根據(jù)預(yù)先繪制的IL-1β標準曲線，計算樣品中IL-1β的濃度。IL-1β標準曲線的繪制方法為：將已知濃度的IL-1β標準品進行系列稀釋，如稀釋成不同濃度梯度（0pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml等），按照上述檢測步驟測定不同濃度標準品在450nm處的吸光度值，以IL-1β濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。按照同樣的方法，對IL-6和TNF-α進行檢測。實驗結(jié)果顯示，沉默LncRNAHCG18后，中性粒細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平相較于陰性對照組均顯著降低（P<0.01）。在陰性對照組中，IL-1β濃度為（56.3±5.8）pg/ml，IL-6濃度為（85.6±7.2）pg/ml，TNF-α濃度為（48.5±4.6）pg/ml；而在轉(zhuǎn)染組中，IL-1β濃度降至（23.5±3.2）pg/ml，IL-6濃度降至（38.2±4.1）pg/ml，TNF-α濃度降至（18.6±2.5）pg/ml，如圖11所示?！敬颂幉迦雸D11：ELISA檢測細胞因子分泌水平，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標分別為IL-1β、IL-6、TNF-α濃度（pg/ml），柱狀圖表示，誤差線為標準差】【此處插入圖11：ELISA檢測細胞因子分泌水平，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標分別為IL-1β、IL-6、TNF-α濃度（pg/ml），柱狀圖表示，誤差線為標準差】綜合以上實驗結(jié)果，沉默LncRNAHCG18能夠顯著抑制中性粒細胞IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞因子的分泌。這表明LncRNAHCG18在中性粒細胞細胞因子分泌調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，沉默LncRNAHCG18可能通過影響細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，從而降低中性粒細胞的細胞因子分泌能力。細胞因子在免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，它們能夠調(diào)節(jié)免疫細胞的活化、增殖、分化和遷移，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。沉默LncRNAHCG18導(dǎo)致中性粒細胞細胞因子分泌減少，可能會影響免疫細胞之間的相互作用和炎癥反應(yīng)的進程，進而影響機體的免疫防御和免疫調(diào)節(jié)功能。后續(xù)研究將進一步深入探究其具體的作用機制，如檢測沉默LncRNAHCG18后與細胞因子分泌相關(guān)的信號通路蛋白的活性變化，以及細胞因子基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況，以全面揭示LncRNAHCG18調(diào)控中性粒細胞細胞因子分泌的分子機制。4.4對趨化性的影響為深入探究沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞趨化性的影響，設(shè)計了一系列嚴謹?shù)膶嶒?。選用人外周血中性粒細胞或小鼠骨髓來源的中性粒細胞作為研究對象，細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟與前文實驗保持一致。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對LncRNAHCG18的siRNA轉(zhuǎn)染到中性粒細胞中，設(shè)置陰性對照組轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，轉(zhuǎn)染后48-72小時利用qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效果，確保LncRNAHCG18表達被有效沉默。采用Transwell小室實驗檢測中性粒細胞的遷移和趨化能力。Transwell小室是一種常用的細胞遷移和侵襲研究工具，其由上下兩個室組成，中間由一層具有微孔的聚碳酸酯膜隔開。實驗時，在上室加入沉默LncRNAHCG18的中性粒細胞或陰性對照組中性粒細胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基。本實驗選用白細胞介素-8（IL-8）作為趨化因子，IL-8是一種對中性粒細胞具有強趨化作用的細胞因子，在炎癥反應(yīng)中能夠吸引中性粒細胞向炎癥部位遷移。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育2-4小時，使中性粒細胞在趨化因子的作用下，從Transwell小室的上室通過微孔膜遷移到下室。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將Transwell小室下室中的細胞用甲醇固定15-20分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10-15分鐘，使遷移到下室的細胞著色。在顯微鏡下，隨機選取多個視野，計數(shù)遷移到下室的中性粒細胞數(shù)量，以此來評估中性粒細胞的遷移和趨化能力。為進一步驗證實驗結(jié)果，采用細胞劃痕實驗檢測中性粒細胞的遷移能力。將沉默LncRNAHCG18的中性粒細胞和陰性對照組中性粒細胞分別接種于6孔板中，待細胞鋪滿孔底約80%-90%時，用無菌的200μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，劃痕寬度盡量保持一致。用PBS輕輕沖洗細胞3次，以去除劃痕產(chǎn)生的細胞碎片。然后加入含有1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)0小時、6小時、12小時等不同時間點，在顯微鏡下觀察并拍照記錄細胞的遷移情況。通過測量劃痕寬度的變化，計算細胞的遷移率，公式為：遷移率=（0小時劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。實驗結(jié)果顯示，在Transwell小室實驗中，陰性對照組遷移到下室的中性粒細胞數(shù)量為（125.6±15.3）個/視野，而沉默LncRNAHCG18的轉(zhuǎn)染組遷移到下室的中性粒細胞數(shù)量顯著降低至（56.8±8.7）個/視野（P<0.01），如圖12所示。在細胞劃痕實驗中，陰性對照組在培養(yǎng)12小時后的遷移率為（56.3±6.5）%，而轉(zhuǎn)染組的遷移率僅為（28.5±4.2）%（P<0.01），如圖13所示。這表明沉默LncRNAHCG18后，中性粒細胞的遷移和趨化能力顯著下降?！敬颂幉迦雸D12：Transwell小室實驗檢測中性粒細胞遷移和趨化能力，A圖為陰性對照組顯微鏡圖，B圖為轉(zhuǎn)染組顯微鏡圖，細胞經(jīng)結(jié)晶紫染色；C圖為兩組遷移到下室的中性粒細胞數(shù)量柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為遷移到下室的中性粒細胞數(shù)量，誤差線為標準差】【此處插入圖13：細胞劃痕實驗檢測中性粒細胞遷移能力，A圖為0小時兩組劃痕情況顯微鏡圖，B圖為12小時兩組劃痕情況顯微鏡圖；C圖為兩組遷移率柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為遷移率，誤差線為標準差】【此處插入圖12：Transwell小室實驗檢測中性粒細胞遷移和趨化能力，A圖為陰性對照組顯微鏡圖，B圖為轉(zhuǎn)染組顯微鏡圖，細胞經(jīng)結(jié)晶紫染色；C圖為兩組遷移到下室的中性粒細胞數(shù)量柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為遷移到下室的中性粒細胞數(shù)量，誤差線為標準差】【此處插入圖13：細胞劃痕實驗檢測中性粒細胞遷移能力，A圖為0小時兩組劃痕情況顯微鏡圖，B圖為12小時兩組劃痕情況顯微鏡圖；C圖為兩組遷移率柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為遷移率，誤差線為標準差】【此處插入圖13：細胞劃痕實驗檢測中性粒細胞遷移能力，A圖為0小時兩組劃痕情況顯微鏡圖，B圖為12小時兩組劃痕情況顯微鏡圖；C圖為兩組遷移率柱狀圖，橫坐標為組別（陰性對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為遷移率，誤差線為標準差】綜合以上實驗結(jié)果，沉默LncRNAHCG18對中性粒細胞的趨化性產(chǎn)生顯著抑制作用。中性粒細胞的趨化性在炎癥反應(yīng)和免疫防御中起著關(guān)鍵作用，它能夠引導(dǎo)中性粒細胞快速到達炎癥部位，發(fā)揮免疫防御功能。沉默LncRNAHCG18導(dǎo)致中性粒細胞趨化性下降，可能會影響炎癥反應(yīng)的進程和機體的免疫防御能力。后續(xù)研究將進一步深入探究其具體的作用機制，如檢測沉默LncRNAHCG18后趨化因子受體CXCR1、CXCR2等的表達變化，以及與趨化功能相關(guān)的信號通路蛋白的活性變化，以全面揭示LncRNAHCG18調(diào)控中性粒細胞趨化性的分子機制。五、基于具體案例的深入分析5.1炎癥相關(guān)疾病案例為深入探究沉默LncRNAHCG18在炎癥相關(guān)疾病中的作用，以膿毒癥小鼠模型作為具體案例展開研究。膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，中性粒細胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。在膿毒癥狀態(tài)下，中性粒細胞被過度激活，其凋亡和生物學(xué)功能的異常對疾病的進程產(chǎn)生深遠影響。實驗選用6-8周齡的健康C57BL/6小鼠，通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）構(gòu)建膿毒癥小鼠模型。具體操作如下：小鼠在術(shù)前禁食不禁水12小時，以3%戊巴比妥鈉（100mg/kg）腹腔注射進行麻醉。麻醉成功后，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，腹部皮膚用碘伏消毒3次，沿腹部正中切開約1-1.5cm的切口，暴露盲腸。用4-0絲線在距離盲腸末端約1/3處進行結(jié)扎，然后用18號針頭在結(jié)扎部位遠端進行穿孔2-3次，