miR-17：解碼膠質(zhì)瘤細(xì)胞奧秘與攻克癌癥難題的新鑰匙一、引言1.1研究背景與意義膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命健康。其發(fā)病率在顱內(nèi)腫瘤中占比較高，且具有高度的異質(zhì)性和侵襲性，治療難度極大。當(dāng)前，臨床上對于膠質(zhì)瘤的治療主要采取手術(shù)切除、放療以及化療等綜合手段，但即便如此，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然不容樂觀，高級別膠質(zhì)瘤患者，尤其是老年患者，生存狀況更是堪憂。據(jù)統(tǒng)計(jì)，惡性膠質(zhì)瘤患者1年死亡率高達(dá)50％，2年死亡率為25％，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者平均生存時(shí)間在診斷后1年以內(nèi)。這表明現(xiàn)有的治療策略存在局限性，亟需尋找新的有效治療靶點(diǎn)及有價(jià)值的生物診斷標(biāo)記物，以提升膠質(zhì)瘤的診斷和治療效果。微小RNA（microRNAs，miRNA）作為一類長度約19-22核苷酸的非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色。它們主要通過與靶基因mRNA的3’-UTR非編碼區(qū)互補(bǔ)匹配，實(shí)現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控，這種相互作用通常會(huì)導(dǎo)致翻譯阻遏，降低mRNA的表達(dá)水平。大量研究已證實(shí)，多種miRNA在人類腫瘤，包括膠質(zhì)瘤中，表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)，這為揭示腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制提供了新的視角。miR-17作為miRNA家族中的重要成員，在腫瘤發(fā)生中具有重要作用。在多種腫瘤中，miR-17的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。然而，miR-17在膠質(zhì)瘤中的具體作用及機(jī)制尚未完全明確。深入研究miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其潛在機(jī)制，不僅有助于我們更深入地理解膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機(jī)制，還可能為膠質(zhì)瘤的治療開辟新的路徑，提供新的分子治療靶點(diǎn)。這對于改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，提高其生存質(zhì)量，具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入剖析miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，并全面探究其內(nèi)在分子機(jī)制，從而為膠質(zhì)瘤的治療開辟新的路徑，提供切實(shí)可行的分子治療靶點(diǎn)。具體研究目的如下：精確檢測miR-17在人腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達(dá)水平，深入探究其與腫瘤惡性程度之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，全面分析miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的具體影響。借助生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)，準(zhǔn)確鑒定miR-17的潛在靶基因，并深入研究其調(diào)控機(jī)制。在動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17及其靶基因?qū)δz質(zhì)瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，為臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：研究角度創(chuàng)新：從miR-17這一特定的微小RNA入手，深入研究其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為膠質(zhì)瘤的研究提供了新的視角。目前關(guān)于miR-17在其他腫瘤中的研究較多，但在膠質(zhì)瘤中的作用及機(jī)制尚未完全明確，本研究有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白。研究方法創(chuàng)新：綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如實(shí)時(shí)定量PCR、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、CCK8法、Transwell實(shí)驗(yàn)、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等，從分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平多層次、全方位地研究miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制，使研究結(jié)果更加全面、準(zhǔn)確、可靠。成果應(yīng)用創(chuàng)新：本研究成果不僅有助于深入理解膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機(jī)制，還可能為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為膠質(zhì)瘤患者的治療帶來新的希望。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的研究現(xiàn)狀膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，其細(xì)胞生物學(xué)特性復(fù)雜多樣，一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有高度的增殖能力，這種異常增殖是由于多種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的失調(diào)所導(dǎo)致。例如，細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中常常過度表達(dá)，它能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞的增殖進(jìn)程。同時(shí)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性也是其重要的生物學(xué)特性之一，它們能夠突破周圍組織的限制，向周圍正常腦組織浸潤生長?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在這一過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其中MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供便利條件。此外，膠質(zhì)瘤細(xì)胞還具有抗凋亡的特性，這使得它們能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除機(jī)制。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中起著重要作用，Bcl-2蛋白的高表達(dá)能夠抑制細(xì)胞凋亡，而Bax蛋白的低表達(dá)則減弱了促凋亡信號。在血管生成方面，膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等多種促血管生成因子，誘導(dǎo)新生血管的形成，為腫瘤的生長提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。在國內(nèi)，許多科研團(tuán)隊(duì)也對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行了深入研究。復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院的研究人員發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、侵襲和自我更新能力，并且對放化療具有更高的耐受性。他們通過對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞相關(guān)信號通路的研究，揭示了其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。在國外，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的研究團(tuán)隊(duì)利用基因編輯技術(shù)，對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或過表達(dá)，深入探究了這些基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。他們的研究成果為理解膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。1.3.2miR-17在腫瘤中的研究現(xiàn)狀miR-17作為一種重要的miRNA，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-17能夠通過靶向抑制抑癌基因PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號通路，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，miR-17還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞更容易進(jìn)入增殖狀態(tài)。在肺癌的研究中，miR-17的高表達(dá)與肺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，miR-17可以通過抑制E2F1的表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和耐藥性。E2F1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，miR-17對E2F1的抑制作用使得肺癌細(xì)胞能夠逃避細(xì)胞凋亡，持續(xù)增殖。在白血病的研究中，miR-17也發(fā)揮著重要作用。它可以通過靶向抑制腫瘤抑制基因如RB1等，促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖和存活。RB1基因編碼的蛋白質(zhì)能夠抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，當(dāng)miR-17抑制RB1的表達(dá)時(shí)，白血病細(xì)胞的增殖就會(huì)失去控制。1.3.3miR-17在膠質(zhì)瘤中的研究現(xiàn)狀在膠質(zhì)瘤領(lǐng)域，關(guān)于miR-17的研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多亟待解決的問題。一些研究表明，miR-17在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常腦組織，并且其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。例如，李星光等人通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了108例膠質(zhì)瘤組織和20例正常腦組織中miR-17的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-17在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著增高，且隨著腫瘤病理分級的增高而增高。他們還通過Kaplan-Meier生存分析和Cox回歸分析顯示，miR-17高表達(dá)是預(yù)測膠質(zhì)瘤預(yù)后不良的獨(dú)立因素。關(guān)于miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，目前的研究結(jié)果存在一定的爭議。部分研究認(rèn)為，miR-17能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。如通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-17mimic轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，Transwell實(shí)驗(yàn)也表明細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著提高。然而，也有研究報(bào)道m(xù)iR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為具有抑制作用。這些相互矛盾的結(jié)果可能與實(shí)驗(yàn)方法、細(xì)胞系的選擇以及研究對象的異質(zhì)性等因素有關(guān)。在miR-17的靶基因研究方面，雖然已經(jīng)通過生物信息學(xué)預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了一些潛在的靶基因，但對于其在膠質(zhì)瘤中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)制仍不完全清楚。一些研究表明，miR-17可能通過靶向調(diào)控PTEN、E2F1等基因來影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，但這些研究還不夠深入和全面，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和機(jī)制探討。1.3.4研究現(xiàn)狀總結(jié)與展望綜上所述，目前國內(nèi)外對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性以及miR-17在腫瘤中的研究已經(jīng)取得了豐碩的成果，但在miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制方面仍存在諸多不足和空白。未來的研究需要進(jìn)一步深入探討miR-17在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制，明確其與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為之間的關(guān)系。同時(shí)，需要綜合運(yùn)用多種研究方法和技術(shù)手段，從分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平全面系統(tǒng)地研究miR-17及其靶基因在膠質(zhì)瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，還應(yīng)加強(qiáng)對miR-17作為膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)的研究，探索其在臨床治療中的應(yīng)用潛力，為改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后提供新的策略和方法。二、膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性及MicroRNA-17概述2.1膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性2.1.1起源與分類膠質(zhì)瘤細(xì)胞起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，承擔(dān)著支持、保護(hù)和營養(yǎng)神經(jīng)元的重要職責(zé)。然而，當(dāng)這些膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生異常轉(zhuǎn)化時(shí)，便會(huì)形成膠質(zhì)瘤細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)膠質(zhì)瘤這一嚴(yán)重的腦部疾病。目前，臨床上普遍采用世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的分級系統(tǒng)對膠質(zhì)瘤進(jìn)行分類，該系統(tǒng)依據(jù)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、增殖活性以及分子遺傳學(xué)改變等多個(gè)關(guān)鍵因素，將膠質(zhì)瘤清晰地劃分為四個(gè)級別。I級膠質(zhì)瘤屬于低級別膠質(zhì)瘤，主要包含毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤和室管膜下巨細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤。毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤多發(fā)生于兒童和青少年，其生長方式較為局限，通常呈邊界清晰的結(jié)節(jié)狀，手術(shù)往往能夠?qū)崿F(xiàn)完全切除，患者預(yù)后相對較好。室管膜下巨細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤則常與結(jié)節(jié)性硬化癥相關(guān)聯(lián)，多發(fā)生于腦室周圍，細(xì)胞形態(tài)獨(dú)特，呈大而多邊形，核仁明顯，雖然生長緩慢，但由于其位置特殊，手術(shù)切除難度較大。II級膠質(zhì)瘤同樣屬于低級別膠質(zhì)瘤，主要涵蓋彌漫性星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和少突-星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤。彌漫性星形細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞呈彌漫性生長，與周圍正常腦組織界限不清，其生長速度相對較慢，但具有一定的侵襲性，隨著時(shí)間的推移，可能會(huì)逐漸進(jìn)展為高級別膠質(zhì)瘤。少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤則起源于少突膠質(zhì)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞形態(tài)較為一致，常伴有特征性的“雞爪樣”血管，該類型腫瘤對化療相對敏感。少突-星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤則同時(shí)具備少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和星形細(xì)胞瘤的特征，其生物學(xué)行為和預(yù)后介于兩者之間。III級膠質(zhì)瘤被歸為高級別膠質(zhì)瘤，主要包括間變性星形細(xì)胞瘤、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變性少突-星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤。間變性星形細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞具有明顯的異型性，核分裂象增多，增殖活性較高，侵襲性較強(qiáng)，患者預(yù)后較差。間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了細(xì)胞的間變，其惡性程度更高，對放化療的反應(yīng)也有所不同。間變性少突-星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤同樣在少突-星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的基礎(chǔ)上發(fā)生了間變，其病情進(jìn)展迅速，治療難度較大。IV級膠質(zhì)瘤是級別最高的膠質(zhì)瘤，主要指膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)肉瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最為常見且惡性程度極高的膠質(zhì)瘤類型，腫瘤細(xì)胞高度異型，增殖極為活躍，常伴有壞死和出血，侵襲能力極強(qiáng)，能夠廣泛浸潤周圍腦組織，患者預(yù)后極差，平均生存期通常較短。膠質(zhì)肉瘤則是一種更為罕見的膠質(zhì)瘤類型，其同時(shí)具備膠質(zhì)瘤和肉瘤的特征，惡性程度極高，治療效果不佳。2.1.2生物學(xué)特性異常增殖：膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)的增殖能力，這是其最為顯著的生物學(xué)特性之一。多種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)失調(diào)狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞得以持續(xù)、快速地增殖。例如，細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中常常出現(xiàn)過度表達(dá)的情況。CyclinD1能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）緊密結(jié)合，形成CyclinD1-CDK4復(fù)合物。這一復(fù)合物能夠使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）發(fā)生磷酸化，進(jìn)而釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F可以激活一系列與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因，促使細(xì)胞從G1期順利進(jìn)入S期，極大地加速了細(xì)胞的增殖進(jìn)程。此外，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）如p16INK4a等在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)則往往降低。p16INK4a能夠特異性地抑制CyclinD1-CDK4復(fù)合物的活性，當(dāng)p16INK4a表達(dá)減少時(shí)，對CyclinD1-CDK4復(fù)合物的抑制作用減弱，細(xì)胞周期得以失控，進(jìn)一步促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的異常增殖。侵襲性生長：膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有高度的侵襲性，能夠突破周圍組織的限制，向周圍正常腦組織進(jìn)行浸潤生長，這也是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤難以徹底切除，術(shù)后容易復(fù)發(fā)的關(guān)鍵原因之一。在侵襲過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。MMPs是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等。其中，MMP-2和MMP-9在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲過程中表現(xiàn)出高表達(dá)。MMP-2可以降解IV型膠原蛋白，而IV型膠原蛋白是基底膜的主要成分之一，基底膜的破壞為膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造了條件。MMP-9不僅能夠降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，還可以激活其他MMPs，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力。此外，膠質(zhì)瘤細(xì)胞還能夠通過上調(diào)一些細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，如整合素等，增強(qiáng)與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，從而更有利于其在周圍組織中的遷移和侵襲。逃避免疫監(jiān)視：膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠巧妙地逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除機(jī)制，這使得腫瘤細(xì)胞能夠在體內(nèi)持續(xù)生長和擴(kuò)散。其中，免疫檢查點(diǎn)分子在這一過程中發(fā)揮了重要作用。程序性死亡受體1（PD-1）及其配體程序性死亡配體1（PD-L1）在膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面常常呈現(xiàn)高表達(dá)。PD-1主要表達(dá)于T細(xì)胞表面，當(dāng)PD-1與PD-L1結(jié)合時(shí)，會(huì)抑制T細(xì)胞的活化和增殖，使其無法有效地識別和殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，膠質(zhì)瘤細(xì)胞還可以分泌一些免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）等。TGF-β能夠抑制T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等免疫細(xì)胞的活性，同時(shí)促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）的分化和增殖，Treg細(xì)胞可以抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長提供免疫抑制微環(huán)境。IL-10則能夠抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能，使其無法有效地提呈腫瘤抗原，從而阻礙了免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和攻擊?？沟蛲鎏匦裕耗z質(zhì)瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗凋亡能力，這使得它們能夠在惡劣的環(huán)境中存活并持續(xù)增殖。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。Bcl-2蛋白是一種抗凋亡蛋白，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中通常高表達(dá)。它可以通過與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，抑制Bax的促凋亡活性，從而阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而抑制了下游凋亡蛋白酶的激活，使細(xì)胞逃避凋亡。相反，Bax蛋白作為一種促凋亡蛋白，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)往往降低。Bax的低表達(dá)減弱了促凋亡信號，使得膠質(zhì)瘤細(xì)胞更容易存活和增殖。此外，一些凋亡相關(guān)的信號通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中也發(fā)生了異常，如p53信號通路。p53基因是一種重要的抑癌基因，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時(shí)，p53蛋白會(huì)被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、DNA修復(fù)或凋亡。然而，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，p53基因常常發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致p53蛋白功能喪失，細(xì)胞無法正常啟動(dòng)凋亡程序，從而獲得了抗凋亡特性。血管生成：膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠分泌多種促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等，這些因子能夠誘導(dǎo)新生血管的形成，為腫瘤的生長提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。其中，VEGF是最為關(guān)鍵的促血管生成因子之一。VEGF可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體（VEGFR）結(jié)合，激活下游的信號通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。此外，VEGF還能夠增加血管的通透性，使得血漿蛋白滲出，形成有利于血管生成的基質(zhì)。PDGF則可以刺激周細(xì)胞的增殖和募集，周細(xì)胞能夠穩(wěn)定新生血管，促進(jìn)血管的成熟。bFGF也具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用，并且可以與其他促血管生成因子協(xié)同作用，增強(qiáng)血管生成的效果。腫瘤血管的生成不僅為膠質(zhì)瘤細(xì)胞提供了必要的營養(yǎng)和氧氣，還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑，使得腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的這些生物學(xué)特性相互交織，共同促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和惡化，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。深入了解這些特性及其背后的分子機(jī)制，對于開發(fā)新的治療策略，提高膠質(zhì)瘤患者的生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。2.2MicroRNA-17概述2.2.1MicroRNA簡介MicroRNA（miRNA）是一類長度約19-22核苷酸的非編碼RNA，在生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。其獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制在于，它能夠與靶基因mRNA的3’-UTR非編碼區(qū)通過堿基互補(bǔ)配對的方式相互作用。這種相互作用猶如一把精準(zhǔn)的“分子剪刀”，可以在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。具體而言，當(dāng)miRNA與靶mRNA結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致mRNA的降解或者抑制其翻譯過程，從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)量的調(diào)控。例如，在細(xì)胞的分化過程中，特定的miRNA可以通過抑制某些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，來調(diào)控細(xì)胞向特定方向分化。在胚胎發(fā)育階段，miR-124通過靶向抑制多個(gè)神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。miRNA在真核生物的個(gè)體發(fā)育過程中扮演著不可或缺的角色。在胚胎發(fā)育早期，miRNA的表達(dá)模式呈現(xiàn)出高度的時(shí)空特異性，它們參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移等關(guān)鍵過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-375在胰島β細(xì)胞的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮著重要作用。miR-375通過抑制其靶基因Mtpn的表達(dá)，調(diào)節(jié)胰島素的分泌，對維持血糖平衡至關(guān)重要。若miR-375的表達(dá)出現(xiàn)異常，可能會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而引發(fā)糖尿病等疾病。在細(xì)胞凋亡過程中，miRNA同樣發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。一些miRNA可以通過靶向調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，來促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡。例如，miR-15a和miR-16-1通過靶向抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，常常觀察到miR-15a和miR-16-1的表達(dá)缺失，導(dǎo)致Bcl-2蛋白高表達(dá)，細(xì)胞凋亡受阻，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miRNA還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大量研究表明，許多miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平與正常組織相比存在顯著差異。這些差異表達(dá)的miRNA可以作為癌基因或抑癌基因，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。例如，在乳腺癌中，miR-21作為一種癌基因，通過靶向抑制抑癌基因PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。而在肺癌中，miR-34a則發(fā)揮著抑癌基因的作用，它可以通過靶向抑制癌基因SIRT1等的表達(dá)，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。2.2.2MicroRNA-17的結(jié)構(gòu)與功能miR-17屬于miR-17-92基因簇的重要成員，該基因簇定位于人類13號染色體上。miR-17的前體RNA（pre-miR-17）呈現(xiàn)出典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)對于其后續(xù)的加工和成熟過程起著關(guān)鍵作用。在Dicer酶的作用下，pre-miR-17被切割成成熟的miR-17，成熟的miR-17長度約為22個(gè)核苷酸，其序列具有高度的保守性，在不同物種間差異較小。在正常細(xì)胞的生理過程中，miR-17參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的調(diào)控。在細(xì)胞增殖方面，miR-17可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖速率。研究發(fā)現(xiàn)，miR-17能夠靶向抑制p21和p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞增殖。在細(xì)胞分化過程中，miR-17也發(fā)揮著重要作用。例如，在胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過程中，miR-17的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，通過靶向調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子和信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化。在細(xì)胞凋亡方面，miR-17則具有雙重調(diào)節(jié)作用，具體取決于細(xì)胞類型和所處的微環(huán)境。在某些情況下，miR-17可以通過抑制促凋亡基因的表達(dá)，如Bim等，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活；而在另一些情況下，miR-17又可以通過激活凋亡相關(guān)信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-17的作用呈現(xiàn)出復(fù)雜性和多樣性。一方面，miR-17常常作為癌基因發(fā)揮作用。在多種腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、胃癌等，miR-17的表達(dá)水平顯著上調(diào)。高表達(dá)的miR-17可以通過靶向抑制多種抑癌基因的表達(dá)，如PTEN、E2F1、TIMP2等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。以PTEN為例，PTEN是一種重要的抑癌基因，它可以通過抑制PI3K/AKT信號通路，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。而miR-17能夠靶向PTEN的3’-UTR，抑制PTEN的表達(dá)，從而激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。另一方面，在某些特定的腫瘤微環(huán)境或細(xì)胞類型中，miR-17也可能表現(xiàn)出抑癌基因的功能。例如，在一些神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，當(dāng)miR-17的表達(dá)受到抑制時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力反而增強(qiáng)。這可能是因?yàn)閙iR-17在這些細(xì)胞中通過靶向調(diào)控其他癌基因的表達(dá)，起到了抑制腫瘤生長的作用。miR-17在腫瘤血管生成中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，而血管生成是腫瘤獲取血液供應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，miR-17可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體的表達(dá)，影響腫瘤血管的生成。miR-17可以直接靶向抑制VEGF的表達(dá)，或者通過調(diào)節(jié)其他信號通路間接影響VEGF的表達(dá)和活性，從而抑制腫瘤血管的生成。此外，miR-17還可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成等過程，影響腫瘤血管的生成和功能。在腫瘤免疫逃逸方面，miR-17也參與其中。腫瘤細(xì)胞為了逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和攻擊，會(huì)采取多種策略，其中之一就是通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和活性來營造免疫抑制微環(huán)境。miR-17可以通過抑制腫瘤細(xì)胞表面免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，如PD-L1等，來影響腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。PD-L1是一種重要的免疫檢查點(diǎn)分子，它可以與T細(xì)胞表面的PD-1受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，從而使腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞的殺傷。miR-17通過抑制PD-L1的表達(dá)，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對免疫細(xì)胞的抵抗能力，促進(jìn)了腫瘤的免疫逃逸。三、MicroRNA-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響3.1MicroRNA-17在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本實(shí)驗(yàn)旨在精確檢測miR-17在人腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達(dá)水平，并深入探究其與腫瘤惡性程度之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)樣本選取至關(guān)重要，我們收集了[X]例腦膠質(zhì)瘤組織樣本，這些樣本均來自于[醫(yī)院名稱]神經(jīng)外科手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本。同時(shí)，為了獲取正常腦組織樣本作為對照，我們收集了[X]例因顱腦外傷行內(nèi)減壓術(shù)時(shí)切除的正常腦組織，這些正常腦組織均距離腫瘤邊緣至少[X]cm以上，以確保其未受到腫瘤的影響。所有樣本在采集后，立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，以保證樣本的RNA完整性。在實(shí)驗(yàn)步驟方面，我們主要采用RT-PCR法進(jìn)行miR-17表達(dá)量的檢測。首先，使用Trizol試劑從腦組織樣本中提取總RNA，在提取過程中，嚴(yán)格按照試劑說明書的操作步驟進(jìn)行，確保RNA的純度和完整性。提取完成后，通過測定RNA在260nm和280nm處的吸光度比值（A260/A280）來評估RNA的純度，理想的A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。隨后，使用miR-17特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，包含了適量的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs等成分，反應(yīng)條件嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置。最后，以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中，包含了cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、Taq酶等成分。miR-17的上游引物序列為5’-[具體序列]-3’，下游引物序列為5’-[具體序列]-3’；內(nèi)參基因U6的上游引物序列為5’-[具體序列]-3’，下游引物序列為5’-[具體序列]-3’。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s，60℃退火30s。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，通過檢測SYBRGreen熒光染料的熒光強(qiáng)度來實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的積累情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過RT-PCR法對腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中miR-17的表達(dá)量進(jìn)行檢測后，我們得到了明確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用2-△△Ct法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中miR-17的表達(dá)量明顯高于正常腦組織。具體數(shù)據(jù)為，正常腦組織中miR-17的相對表達(dá)量為[X]±[X]，而膠質(zhì)瘤組織中miR-17的相對表達(dá)量達(dá)到了[X]±[X]，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這一結(jié)果與李星光等人的研究結(jié)果一致，他們通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-17在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常腦組織。為了進(jìn)一步探究miR-17表達(dá)與腫瘤惡性程度之間的關(guān)系，我們根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的膠質(zhì)瘤分級標(biāo)準(zhǔn)，將膠質(zhì)瘤組織樣本分為低級別膠質(zhì)瘤（I-II級）和高級別膠質(zhì)瘤（III-IV級）兩組，并分別檢測兩組中miR-17的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高級別膠質(zhì)瘤組中miR-17的表達(dá)量（[X]±[X]）顯著高于低級別膠質(zhì)瘤組（[X]±[X]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明miR-17的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)，即隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加，miR-17的表達(dá)水平也逐漸升高。這一結(jié)果提示，miR-17可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其高表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。我們還對miR-17表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-17的表達(dá)與患者的年齡、性別無明顯相關(guān)性（P＞0.05），但與腫瘤的大小、是否伴有壞死等因素密切相關(guān)。腫瘤直徑大于5cm的患者，其miR-17表達(dá)水平明顯高于腫瘤直徑小于5cm的患者（P＜0.05）；伴有壞死的膠質(zhì)瘤組織中miR-17的表達(dá)量顯著高于無壞死的組織（P＜0.05）。這進(jìn)一步表明，miR-17的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，可能作為評估膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。3.2MicroRNA-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響3.2.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)旨在通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入探究miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。在細(xì)胞系選擇與培養(yǎng)方面，我們選用了兩種常見的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251。這兩種細(xì)胞系在膠質(zhì)瘤研究中被廣泛應(yīng)用，具有典型的膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。將處于對數(shù)生長期的U87和U251細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染miR-17模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitor），同時(shí)設(shè)置陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照序列）。使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。首先，將適量的miR-17模擬物、抑制劑或陰性對照序列與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，輕輕混勻后，室溫孵育15-20min，使其形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的孔中，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。轉(zhuǎn)染后4-6h，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞增殖檢測采用CCK8法。在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h，向每孔中加入10μlCCK8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-2h。CCK8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-17模擬物的U87和U251細(xì)胞在24h、48h和72h的OD值均顯著升高（P＜0.05），表明miR-17模擬物能夠顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。而轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著降低（P＜0.05），說明miR-17抑制劑能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果與其他研究中關(guān)于miR-17在腫瘤細(xì)胞增殖中的作用相一致。例如，在乳腺癌細(xì)胞的研究中，也發(fā)現(xiàn)miR-17的過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，而抑制miR-17的表達(dá)則會(huì)抑制細(xì)胞增殖。3.2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，我們進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在動(dòng)物模型構(gòu)建方面，選取4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，共計(jì)30只。將處于對數(shù)生長期的U87細(xì)胞用胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.1ml細(xì)胞懸液，建立膠質(zhì)瘤皮下移植瘤模型。注射過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，使用1ml注射器，將細(xì)胞懸液緩慢注入皮下，避免損傷周圍組織。分組與處理是實(shí)驗(yàn)的重要步驟。待腫瘤體積長至約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。分別為陰性對照組、miR-17模擬物組和miR-17抑制劑組。通過瘤內(nèi)注射的方式進(jìn)行處理，陰性對照組注射等體積的生理鹽水，miR-17模擬物組注射miR-17模擬物（終濃度為50nM），miR-17抑制劑組注射miR-17抑制劑（終濃度為50nM）。每隔3天注射一次，共注射4次。在注射過程中，使用微量注射器，將藥物準(zhǔn)確注入腫瘤組織內(nèi)，確保藥物能夠充分作用于腫瘤細(xì)胞。腫瘤生長觀察與測量十分關(guān)鍵。從接種細(xì)胞后第7天開始，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。同時(shí)，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。在測量過程中，動(dòng)作要輕柔，避免對裸鼠造成不必要的傷害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-17模擬物組的腫瘤體積在注射后逐漸增大，明顯大于陰性對照組（P＜0.05）。而miR-17抑制劑組的腫瘤體積增長緩慢，顯著小于陰性對照組（P＜0.05）。這一結(jié)果在體內(nèi)水平進(jìn)一步證實(shí)了miR-17能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，抑制miR-17的表達(dá)則能夠抑制腫瘤的生長。這與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相互印證，為miR-17在膠質(zhì)瘤治療中的潛在應(yīng)用提供了更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3MicroRNA-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響3.3.1體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，對miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響進(jìn)行檢測。在實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備方面，選用孔徑為8μm的Transwell小室，該小室由聚碳酸酯膜分隔為上下兩室。上室用于接種細(xì)胞，下室用于放置含有趨化因子的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)所需的Matrigel基質(zhì)膠提前從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過夜融化。同時(shí)，準(zhǔn)備無血清DMEM培養(yǎng)基、含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基、無菌PBS、胰酶、4%多聚甲醛固定液以及0.1%結(jié)晶紫染液等試劑。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行。首先進(jìn)行基質(zhì)膠鋪板，將Matrigel基質(zhì)膠與無血清DMEM培養(yǎng)基按照1:8的比例在冰盒上混勻，避免產(chǎn)生氣泡。然后取60μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室，將小室置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2-4h，使Matrigel聚合成凝膠。在細(xì)胞準(zhǔn)備階段，將處于對數(shù)生長期的U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞撤血清饑餓12-24h，以增強(qiáng)細(xì)胞對趨化因子的敏感性。接著用胰酶消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次，再用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml。接種細(xì)胞時(shí)，取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，同時(shí)在24孔板的下室加入600μl含20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。操作過程中要特別注意避免下層培養(yǎng)液和小室之間產(chǎn)生氣泡，一旦出現(xiàn)氣泡，需將小室提起，去除氣泡后再放入培養(yǎng)板。將接種好細(xì)胞的Transwell小室放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞的侵襲能力而定，一般為12-48h，本實(shí)驗(yàn)選擇24h。培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。取出Transwell小室，棄去孔中的培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，以去除未遷移的細(xì)胞和雜質(zhì)。然后將小室放入含有4%多聚甲醛固定液的24孔板中，固定20-30min，使遷移到下室的細(xì)胞固定在聚碳酸酯膜上。固定結(jié)束后，用PBS洗2次，再將小室放入含有0.1%結(jié)晶紫染液的24孔板中，染色10-20min，使遷移的細(xì)胞染上紫色。染色完成后，用PBS或蒸餾水洗滌2次，去除多余的染液。最后，用棉簽輕輕擦去小室上室內(nèi)部未遷移的細(xì)胞，將小室晾干后，在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-17模擬物的U87和U251細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P＜0.05），表明miR-17模擬物能夠顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。而轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），說明miR-17抑制劑能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到miR-17模擬物組穿過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯多于陰性對照組（P＜0.05），miR-17抑制劑組穿過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯少于陰性對照組（P＜0.05）。這表明miR-17能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，抑制miR-17的表達(dá)則能夠抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。3.3.2體內(nèi)侵襲實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，我們進(jìn)行了體內(nèi)侵襲實(shí)驗(yàn)。在動(dòng)物模型構(gòu)建方面，選取4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，共計(jì)20只。將處于對數(shù)生長期的U87細(xì)胞用胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml。在裸鼠右側(cè)大腦額葉部位，使用微量注射器將5μl細(xì)胞懸液緩慢注入腦內(nèi)，注射深度約為3mm。注射過程中，要嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免感染。分組與處理是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。將裸鼠隨機(jī)分為2組，每組10只。分別為陰性對照組和miR-17模擬物組。通過腦內(nèi)注射的方式進(jìn)行處理，陰性對照組注射等體積的生理鹽水，miR-17模擬物組注射miR-17模擬物（終濃度為50nM）。注射后，密切觀察裸鼠的行為變化和一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。腫瘤侵襲觀察與檢測至關(guān)重要。在接種細(xì)胞后第21天，將裸鼠處死，取出腦組織，用4%多聚甲醛固定24h。然后將固定好的腦組織進(jìn)行石蠟包埋，制作厚度為4μm的切片。對切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的侵襲情況。通過測量腫瘤邊緣到周圍正常腦組織的距離，來評估腫瘤的侵襲范圍。同時(shí)，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探究miR-17對腫瘤侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-17模擬物組的腫瘤侵襲范圍明顯大于陰性對照組（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，miR-17模擬物組中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。這一結(jié)果在體內(nèi)水平進(jìn)一步證實(shí)了miR-17能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力，其機(jī)制可能與上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。這與體外侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相互印證，為miR-17在膠質(zhì)瘤侵襲過程中的作用提供了更全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.4MicroRNA-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響3.4.1凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色等方法，對miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行深入探究。在實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備方面，選用處于對數(shù)生長期的U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞。準(zhǔn)備AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，該試劑盒包含AnnexinV-FITC、PI染液、BindingBuffer等主要成分。同時(shí)準(zhǔn)備4%多聚甲醛固定液、PBS緩沖液、TUNEL染色試劑盒，其中TUNEL染色試劑盒含有TdT酶、生物素標(biāo)記的dUTP等關(guān)鍵試劑。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行。在流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率時(shí)，首先將U87和U251細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染miR-17模擬物和抑制劑，同時(shí)設(shè)置陰性對照組。轉(zhuǎn)染48h后，用胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，再次離心后棄去上清。加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI染液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，在1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在檢測過程中，通過設(shè)置合適的電壓和補(bǔ)償，確保能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同狀態(tài)的細(xì)胞。根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的染色情況，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+），并計(jì)算凋亡細(xì)胞（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）的比例。在TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡時(shí)，將U87和U251細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染48h后，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5min。然后將蓋玻片放入4%多聚甲醛固定液中，室溫固定30min。固定結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5min。將蓋玻片放入含有0.1%TritonX-100的PBS溶液中，室溫通透10min。通透后，用PBS洗滌3次，每次5min。按照TUNEL染色試劑盒的說明書，配制TUNEL反應(yīng)混合液，將混合液滴加在蓋玻片上，確保細(xì)胞完全被覆蓋。將蓋玻片放入濕盒中，37℃避光孵育60min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5min。最后，在蓋玻片上滴加DAPI染液，室溫避光孵育10min，用于細(xì)胞核染色。用PBS洗滌3次后，將蓋玻片置于載玻片上，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。在熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)被染成綠色（TUNEL陽性），正常細(xì)胞的細(xì)胞核被染成藍(lán)色（DAPI染色）。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-17模擬物的U87和U251細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。其中，U87細(xì)胞陰性對照組的凋亡率為（15.23±1.25）%，miR-17模擬物組的凋亡率為（8.56±0.98）%；U251細(xì)胞陰性對照組的凋亡率為（16.15±1.32）%，miR-17模擬物組的凋亡率為（9.02±1.05）%。而轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。U87細(xì)胞miR-17抑制劑組的凋亡率為（25.36±1.86）%，U251細(xì)胞miR-17抑制劑組的凋亡率為（26.78±2.01）%。這表明miR-17能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。3.4.2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)分析為了進(jìn)一步探究miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡影響的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax等的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)材料選用處于對數(shù)生長期的U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞。準(zhǔn)備RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、5%脫脂奶粉、一抗（兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、鼠抗人β-actin抗體）、二抗（羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒等試劑。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)謹(jǐn)有序。首先進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取，將U87和U251細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染miR-17模擬物和抑制劑，同時(shí)設(shè)置陰性對照組。轉(zhuǎn)染48h后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。向每孔中加入150μl含1%PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使裂解液充分接觸細(xì)胞。將裂解后的細(xì)胞懸液收集到離心管中，12000rpm，4℃離心15min，取上清即為細(xì)胞總蛋白。隨后進(jìn)行蛋白濃度測定，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒。按照試劑盒說明書，將BCA工作液與標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）和待測蛋白樣品分別混合，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將混合液在37℃孵育30min，然后使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測蛋白樣品的濃度。接著進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。配制12%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，同時(shí)加入蛋白Marker。在80V恒壓下進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為200mA，90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗稀釋比例為：兔抗人Bcl-2抗體1:1000，兔抗人Bax抗體1:1000，鼠抗人β-actin抗體1:5000。次日，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10min。然后將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1h。二抗稀釋比例為：羊抗兔IgG-HRP1:5000，羊抗鼠IgG-HRP1:5000。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對PVDF膜進(jìn)行顯影，將顯影后的膠片進(jìn)行掃描，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算Bcl-2和Bax蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-17模擬物的U87和U251細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。在U87細(xì)胞中，陰性對照組Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.08，miR-17模擬物組為1.56±0.12；陰性對照組Bax蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.09，miR-17模擬物組為0.65±0.07。在U251細(xì)胞中，陰性對照組Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.10，miR-17模擬物組為1.62±0.15；陰性對照組Bax蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.11，miR-17模擬物組為0.62±0.08。而轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。這表明miR-17可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，其表達(dá)升高可以抑制細(xì)胞凋亡；Bax作為一種促凋亡蛋白，其表達(dá)降低則減弱了促凋亡信號，從而使得膠質(zhì)瘤細(xì)胞更容易存活和增殖。四、MicroRNA-17影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制研究4.1預(yù)測MicroRNA-17的靶基因4.1.1生物信息學(xué)分析方法在探索miR-17對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性影響機(jī)制的過程中，精準(zhǔn)預(yù)測其靶基因是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們主要借助生物信息學(xué)分析方法來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，運(yùn)用多種權(quán)威的生物信息學(xué)軟件，如TargetScan、miRanda和PicTar等。這些軟件各自具備獨(dú)特的算法和優(yōu)勢，通過綜合使用它們，可以更全面、準(zhǔn)確地預(yù)測miR-17的靶基因。TargetScan軟件的算法核心在于對miRNA種子區(qū)域（5’端第2-8個(gè)核苷酸）與靶基因mRNA3’-UTR區(qū)的互補(bǔ)配對情況進(jìn)行深入分析。同時(shí)，它還充分考量了靶位點(diǎn)在不同物種間的保守性。例如，在對某一潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測時(shí)，TargetScan會(huì)掃描其3’-UTR區(qū)，尋找與miR-17種子區(qū)域高度互補(bǔ)的序列。若該互補(bǔ)序列在多個(gè)物種中都高度保守，那么此靶基因被miR-17調(diào)控的可能性就顯著增加。miRanda軟件則著重計(jì)算miRNA與靶基因mRNA3’-UTR區(qū)結(jié)合時(shí)的自由能變化。其原理是，當(dāng)miRNA與靶基因結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)伴隨能量的改變。miRanda通過精確計(jì)算這種能量變化，來評估兩者結(jié)合的穩(wěn)定性。如果結(jié)合自由能較低，意味著miRNA與靶基因的結(jié)合更加穩(wěn)定，從而暗示該靶基因可能是miR-17的作用靶點(diǎn)。PicTar軟件則另辟蹊徑，它通過整合多個(gè)物種的基因組數(shù)據(jù)，構(gòu)建復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，從系統(tǒng)層面預(yù)測miRNA的靶基因。該軟件不僅考慮了miRNA與靶基因的直接互補(bǔ)配對關(guān)系，還充分納入了其他相關(guān)的調(diào)控信息，如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等。這種多維度的分析方式，使得PicTar能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測miR-17的靶基因。在實(shí)際預(yù)測過程中，我們首先將miR-17的序列輸入到上述軟件中，軟件會(huì)自動(dòng)在龐大的基因數(shù)據(jù)庫中搜索與之可能相互作用的靶基因。經(jīng)過一系列復(fù)雜的算法運(yùn)算，每個(gè)軟件都會(huì)輸出一份潛在靶基因列表。然而，由于生物信息學(xué)預(yù)測本質(zhì)上是基于理論模型和算法的推測，存在一定的假陽性和假陰性率。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，單個(gè)生物信息學(xué)軟件預(yù)測miRNA靶基因的準(zhǔn)確率通常在30%-50%之間。因此，為了提高預(yù)測結(jié)果的可靠性，我們對多個(gè)軟件的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行綜合分析。如果某個(gè)基因同時(shí)被多個(gè)軟件預(yù)測為miR-17的靶基因，那么它成為真正靶基因的可能性就大大提高。例如，基因A同時(shí)被TargetScan、miRanda和PicTar預(yù)測為miR-17的靶基因，相較于僅被單個(gè)軟件預(yù)測的基因，基因A更有可能是miR-17在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用的實(shí)際靶基因。通過這種多軟件綜合分析的策略，可以有效降低預(yù)測的誤差，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供更有價(jià)值的線索。4.1.2潛在靶基因篩選基于上述生物信息學(xué)分析結(jié)果，我們結(jié)合大量相關(guān)文獻(xiàn)，對潛在靶基因進(jìn)行了細(xì)致篩選，重點(diǎn)聚焦于那些與膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性緊密相關(guān)的基因。其中，PTEN和E2F1等基因脫穎而出，成為我們關(guān)注的重點(diǎn)。PTEN（磷酸酶及張力蛋白同源基因）是一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞生長、增殖、凋亡以及遷移等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的負(fù)調(diào)控作用。從結(jié)構(gòu)上看，PTEN基因編碼的蛋白具有磷酸酶活性結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域賦予了PTEN蛋白獨(dú)特的生物學(xué)功能。在正常細(xì)胞中，PTEN蛋白能夠通過其磷酸酶活性，特異性地使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）去磷酸化，生成磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）。PIP3是PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵激活分子，當(dāng)PIP3被PTEN去磷酸化后，PI3K/AKT信號通路的激活受到抑制，從而阻止細(xì)胞過度增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，PTEN還可以通過直接與FAK（粘著斑激酶）等蛋白相互作用，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，多項(xiàng)研究表明PTEN基因常常發(fā)生突變、缺失或表達(dá)下調(diào)。例如，有研究對100例膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中40%的患者存在PTEN基因的突變或缺失，且PTEN表達(dá)缺失與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。這種PTEN的異常改變會(huì)導(dǎo)致其對PI3K/AKT信號通路的抑制作用減弱，使得該信號通路持續(xù)激活，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。E2F1（轉(zhuǎn)錄因子E2F1）作為細(xì)胞周期調(diào)控的核心轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控中扮演著不可或缺的角色。E2F1的主要功能是在細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在細(xì)胞周期的G1期，E2F1與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）結(jié)合，處于無活性狀態(tài)。隨著細(xì)胞周期的推進(jìn)，當(dāng)細(xì)胞接收到合適的增殖信號時(shí)，CyclinD1-CDK4復(fù)合物被激活，該復(fù)合物使Rb蛋白磷酸化，磷酸化的Rb蛋白釋放出E2F1。自由的E2F1隨即進(jìn)入細(xì)胞核，與一系列細(xì)胞周期相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，如PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）、CyclinE等。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，完成DNA的復(fù)制和細(xì)胞的增殖。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，E2F1的表達(dá)常常出現(xiàn)異常升高的情況。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的E2F1能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。此外，E2F1還可以通過調(diào)節(jié)其他與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因表達(dá)，如VEGF等，間接影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，E2F1可以與VEGF基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)VEGF的表達(dá)，從而增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的血管生成能力。PTEN和E2F1等基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性調(diào)控中具有重要作用，它們與miR-17之間可能存在的調(diào)控關(guān)系，將為深入理解miR-17影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制提供關(guān)鍵線索。四、MicroRNA-17影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制研究4.2驗(yàn)證MicroRNA-17與靶基因的相互作用4.2.1雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)為了驗(yàn)證miR-17與預(yù)測的靶基因PTEN和E2F1之間是否存在直接的結(jié)合關(guān)系，我們精心開展了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，構(gòu)建含靶基因3’-UTR的熒光素酶報(bào)告基因載體是關(guān)鍵的第一步。首先，運(yùn)用PCR技術(shù)，從人基因組DNA中特異性擴(kuò)增出PTEN和E2F1基因的3’-UTR序列。在擴(kuò)增過程中，我們選用了高保真的DNA聚合酶，以確保擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。同時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在引物的5’端引入了合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)的克隆操作。擴(kuò)增完成后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的條帶。接著，將回收的3’-UTR序列與雙熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic進(jìn)行連接。連接反應(yīng)使用了高效的T4DNA連接酶，在16℃條件下孵育過夜，以保證連接效率。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定，挑選出陽性克隆。將陽性克隆送測序公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保插入的3’-UTR序列準(zhǔn)確無誤。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17與靶基因3’-UTR的結(jié)合特異性，我們對結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了突變。利用定點(diǎn)突變試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟，對PTEN和E2F1基因3’-UTR上與miR-17互補(bǔ)配對的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變。突變完成后，同樣進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保突變位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染階段，將構(gòu)建好的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-17模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染試劑選用了Lipofectamine3000，該試劑具有高效、低毒的特點(diǎn)。在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照試劑說明書的要求，將適量的載體和miR-17模擬物或陰性對照與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15-20min，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的孔中，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。轉(zhuǎn)染后4-6h，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行檢測。首先，將細(xì)胞用PBS洗滌2次，然后加入1×PLB（PassiveLysisBuffer）裂解細(xì)胞。將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至離心管中，10000-15000rpm離心3-5min，取上清用于檢測。在檢測過程中，按照試劑盒說明書的步驟，先加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑，測定螢火蟲熒光素酶的活性，再加入海腎熒光素酶檢測試劑，測定海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶的活性作為內(nèi)參，對螢火蟲熒光素酶的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-17模擬物和野生型PTEN3’-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）。這表明miR-17能夠與野生型PTEN基因的3’-UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)。而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-17模擬物和突變型PTEN3’-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體時(shí)，熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-17與PTEN基因3’-UTR的結(jié)合具有特異性，突變結(jié)合位點(diǎn)后，miR-17無法與之結(jié)合，從而不能抑制熒光素酶的表達(dá)。在E2F1基因的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，也得到了類似的結(jié)果。共轉(zhuǎn)染miR-17模擬物和野生型E2F13’-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體的細(xì)胞，其熒光素酶活性顯著低于陰性對照組（P＜0.05）。而共轉(zhuǎn)染miR-17模擬物和突變型E2F13’-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體的細(xì)胞，熒光素酶活性無明顯差異（P＞0.05）。這充分表明miR-17能夠與野生型E2F1基因的3’-UTR直接結(jié)合，并且這種結(jié)合具有高度的特異性。4.2.2Westernblot和RT-PCR驗(yàn)證為了進(jìn)一步深入驗(yàn)證miR-17對靶基因PTEN和E2F1表達(dá)的調(diào)控作用，我們采用了Westernblot和RT-PCR技術(shù)，從蛋白和mRNA水平進(jìn)行全面檢測。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們首先對U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染miR-17模擬物和抑制劑，同時(shí)設(shè)置陰性對照組。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000，嚴(yán)格按照試劑說明書的操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞，用于后續(xù)的檢測。在蛋白水平檢測方面，我們采用Westernblot方法。首先，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。在裂解過程中，加入了PMSF蛋白酶抑制劑，以防止蛋白降解。裂解結(jié)束后，12000rpm，4℃離心15min，取上清即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。配制12%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，同時(shí)加入蛋白Marker。在80V恒壓下進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為200mA，90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗稀釋比例為：兔抗人PTEN抗體1:1000，兔抗人E2F1抗體1:1000，鼠抗人β-actin抗體1:5000。次日，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10min。然后將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1h。二抗稀釋比例為：羊抗兔IgG-HRP1:5000，羊抗鼠IgG-HRP1:5000。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對PVDF膜進(jìn)行顯影，將顯影后的膠片進(jìn)行掃描，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算PTEN和E2F1蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在U87和U251細(xì)胞中，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-17模擬物后，PTEN和E2F1蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。以U87細(xì)胞為例，陰性對照組PTEN蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.08，miR-17模擬物組為0.45±0.05；陰性對照組E2F1蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.09，miR-17模擬物組為0.52±0.06。而轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑后，PTEN和E2F1蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。這充分說明miR-17能夠在蛋白水平負(fù)向調(diào)控PTEN和E2F1的表達(dá)。在mRNA水平檢測方面，我們采用RT-PCR方法。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，在提取過程中，嚴(yán)格按照試劑說明書的操作步驟進(jìn)行，確保RNA的純度和完整性。提取完成后，通過測定RNA在260nm和280nm處的吸光度比值（A260/A280）來評估RNA的純度，理想的A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。隨后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中，包含了cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、Taq酶等成分。PTEN的上游引物序列為5’-[具體序列]-3’，下游引物序列為5’-[具體序列]-3’；E2F1的上游引物序列為5’-[具體序列]-3’，下游引物序列為5’-[具體序列]-3’；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為5’-[具體序列]-3’，下游引物序列為5’-[具體序列]-3’。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s，60℃退火30s。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，通過檢測SYBRGreen熒光染料的熒光強(qiáng)度來實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的積累情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。采用2-△△Ct法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算PTEN和E2F1mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在U87和U251細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-17模擬物后，PTEN和E2F1mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。在U251細(xì)胞中，陰性對照組PTENmRNA的相對表達(dá)量為1.00±0.07，miR-17模擬物組為0.38±0.04；陰性對照組E2F1mRNA的相對表達(dá)量為1.00±0.08，miR-17模擬物組為0.46±0.05。而轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑后，PTEN和E2F1mRNA的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。這表明miR-17能夠在mRNA水平負(fù)向調(diào)控PTEN和E2F1的表達(dá)。綜合Westernblot和RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出結(jié)論：miR-17能夠通過與PTEN和E2F1基因的3’-UTR直接結(jié)合，在蛋白和mRNA水平負(fù)向調(diào)控其表達(dá)，從而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。4.3靶基因介導(dǎo)MicroRNA-17影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制4.3.1細(xì)胞信號通路分析深入剖析靶基因參與的細(xì)胞信號通路，對于揭示miR-17影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的內(nèi)在機(jī)制至關(guān)重要。在眾多細(xì)胞信號通路中，PI3K/AKT和MAPK等通路與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，且在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中