加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠的干預(yù)作用：基于AGEs-RAGE通路的實驗探究一、引言1.1研究背景隨著經(jīng)濟的發(fā)展、環(huán)境的改變、人們工作節(jié)奏的加快、生活方式的改變以及人口老齡化的加速，糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）已成為影響人類健康最重要的慢性非傳染性疾病之一。近年來，糖尿病的患病率在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達5.37億，預(yù)計到2045年這一數(shù)字將增長至7.83億。在我國，糖尿病的形勢同樣嚴峻。最新的流行病學調(diào)查顯示，我國成年人糖尿病患病率已高達12.8%，患者人數(shù)超過1.4億，這意味著每10個成年人中就有超過1人患有糖尿病。糖尿病不僅給患者個人帶來了身體和心理上的雙重痛苦，也給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。在眾多糖尿病并發(fā)癥中，糖尿病大血管病變（diabeticmacroangiopathy，DML），包括冠狀動脈、腦動脈、下肢動脈病變，是糖尿病最主要的致死致殘并發(fā)癥。研究指出，糖尿病患者患上大血管病變的風險比非糖尿病患者增加2-4倍，75％的糖尿病患者最終死于糖尿病大血管病變誘發(fā)的心腦血管事件。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是糖尿病大血管病變的主要病理表現(xiàn)，其特征是動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小。早期發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化，并使用相應(yīng)藥物進行干預(yù)，對延緩動脈粥樣硬化進展、改善患者預(yù)后、降低心腦血管終點事件十分重要。然而，目前西醫(yī)學對于早期篩查動脈粥樣硬化尚缺乏敏感性和特異性高的檢驗學指標，在藥物治療方面亦存在消化道出血、橫紋肌溶解等副作用，因此亟需尋找一種更安全、更高效的藥物以用于臨床。目前認為晚期糖基化終末產(chǎn)物（advancedglycationendproducts，AGEs）的過多生成，AGEs-RAGE途徑的激活是糖尿病大血管病變的重要發(fā)病機制。在高血糖狀態(tài)下，葡萄糖分子會與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等生物大分子的游離氨基發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)，經(jīng)過一系列復(fù)雜的化學變化，最終形成不可逆的晚期糖基化終末產(chǎn)物。這些晚期糖基化終末產(chǎn)物在體內(nèi)大量積累，一方面可以直接改變生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致血管壁細胞外基質(zhì)成分改變，使血管壁變硬、彈性降低；另一方面，晚期糖基化終末產(chǎn)物可以與細胞表面的特異性受體——晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptorforadvancedglycationendproducts，RAGE）結(jié)合，激活細胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等病理過程，進一步促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。許多實驗與臨床研究證實AGEs水平與糖尿病大血管病變具有顯著相關(guān)性，但目前仍缺乏相應(yīng)的循證證據(jù)支持。中醫(yī)學雖無糖尿病大血管病變之統(tǒng)稱，但可散見于“胸痹”“真心痛”“眩暈”“暈厥”“中風”“癡呆”“偏枯”“痹癥”“脫疽”“痰飲”“瘀血”“厥證”等病名。古今醫(yī)家數(shù)千年以來對治療此類疾病積累了豐富的經(jīng)驗。熊曼琪教授是廣州中醫(yī)藥大學首席教授，基于消渴病“氣陰兩虛，瘀熱互結(jié)”的病機，熊教授在《傷寒論》桃核承氣湯基礎(chǔ)上開發(fā)出加味桃核承氣湯以用于臨床，并取得良好療效。前期研究已發(fā)現(xiàn)，加味桃核承氣湯具有降糖、調(diào)脂、改善胰島素抵抗、保護胰島β細胞，改善眾多糖尿病并發(fā)癥的作用。朱章志教授認為，糖尿病大血管病變臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，其背后的病機隨著疾病的進展而變化，大多數(shù)患者病機還具有“少陰陽虛”“陽失健運”的特點，并據(jù)此對熊教授原創(chuàng)加味桃核承氣湯作出了相應(yīng)的配伍加減。為進一步研究各組方對防治糖尿病大血管病變的可能機制，優(yōu)化加味桃核承氣湯的組方配伍，本研究以AGEs-RAGE途徑、氧化應(yīng)激為研究切入點，借助動物實驗，運用多種現(xiàn)代科學手段加以評估，以期進一步發(fā)掘加味桃核承氣湯的臨床效能。1.2研究目的與意義本研究旨在通過構(gòu)建2型糖尿?。═2DM）大血管病變大鼠模型，深入探討加味桃核承氣湯對糖尿病大血管病變的防治作用及其潛在機制。具體而言，本研究將從多個層面進行探究：觀察加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠一般狀況、糖脂代謝的影響；檢測其對大鼠胸主動脈AGEs-RAGE途徑相關(guān)指標的調(diào)節(jié)作用；評估其對氧化應(yīng)激相關(guān)指標的干預(yù)效果；分析其對胸主動脈eNOSmRNA、ERK1/2蛋白表達的影響；并通過病理及超微結(jié)構(gòu)觀察，直觀呈現(xiàn)加味桃核承氣湯對大鼠胸主動脈病變的改善情況。糖尿病大血管病變嚴重威脅著糖尿病患者的生命健康和生活質(zhì)量，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。尋找安全有效的防治藥物迫在眉睫。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。在理論方面，通過深入研究加味桃核承氣湯對AGEs-RAGE途徑及氧化應(yīng)激的影響，有望揭示其防治糖尿病大血管病變的潛在分子機制，為中醫(yī)藥治療糖尿病大血管病變提供新的理論依據(jù)，豐富和完善中醫(yī)對糖尿病及其并發(fā)癥的認識。在臨床應(yīng)用方面，若研究證實加味桃核承氣湯對糖尿病大血管病變具有顯著的防治效果，將為臨床提供一種安全、有效的治療選擇，有助于提高糖尿病大血管病變患者的治療效果，改善患者的預(yù)后，降低心腦血管事件的發(fā)生率，減輕患者的痛苦和社會經(jīng)濟負擔。此外，本研究對于優(yōu)化加味桃核承氣湯的組方配伍，推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展也具有重要的意義，為中藥新藥的研發(fā)提供思路和方法。二、文獻綜述2.1中醫(yī)學對T2DM大血管病變的認識2.1.1病名溯源在傳統(tǒng)中醫(yī)古籍中，雖無“2型糖尿病大血管病變”這一確切病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可散見于多個病癥之中。如當出現(xiàn)胸痛、胸悶、心悸等癥狀時，常被歸為“胸痹”范疇?！督饏T要略?胸痹心痛短氣病脈證治》中記載：“胸痹之病，喘息咳唾，胸背痛，短氣，寸口脈沉而遲，關(guān)上小緊數(shù)，栝蔞薤白白酒湯主之?！鄙鷦用枋隽诵乇缘牡湫桶Y狀及治療方劑，與糖尿病大血管病變引發(fā)的心血管癥狀有相似之處。而當病情嚴重，出現(xiàn)劇烈心痛、手足青至節(jié)等表現(xiàn)時，則與“真心痛”相關(guān)。如《靈樞?厥病》所言：“真心痛，手足清至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死。”這表明真心痛病情危急，預(yù)后不良，與糖尿病大血管病變導(dǎo)致的嚴重心血管事件相契合。若患者出現(xiàn)頭暈、目眩、視物旋轉(zhuǎn)等癥狀，中醫(yī)多將其納入“眩暈”范疇?！端貑?至真要大論》曰：“諸風掉眩，皆屬于肝?！敝赋鲅炁c肝臟關(guān)系密切，糖尿病大血管病變影響腦部供血時，也可能引發(fā)類似眩暈癥狀。當出現(xiàn)突然昏仆、不省人事、半身不遂、口眼歪斜等癥狀時，又可歸為“中風”。《金匱要略?中風歷節(jié)病脈證并治》對中風的癥狀和病因進行了論述，糖尿病大血管病變導(dǎo)致腦血管意外時，就會出現(xiàn)中風的臨床表現(xiàn)。此外，糖尿病大血管病變?nèi)粲绊懴轮?，出現(xiàn)下肢麻木、疼痛、發(fā)涼、間歇性跛行，甚至潰瘍、壞疽等癥狀，則可參考“痹癥”“脫疽”等病名。《靈樞?癰疽》中記載：“發(fā)于足指，名脫癰，其狀赤黑，死不治；不赤黑，不死。不衰，急斬之，不則死矣?！毙蜗蟮孛枋隽嗣摼业陌Y狀和嚴重性，與糖尿病下肢血管病變的表現(xiàn)相符。2.1.2病因病機探討傳統(tǒng)中醫(yī)認為，T2DM大血管病變的病因病機較為復(fù)雜，主要與先天稟賦不足、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞欲過度等因素有關(guān)。先天稟賦不足是發(fā)病的內(nèi)在基礎(chǔ)，如《靈樞?五變》所說：“五臟皆柔弱者，善病消癉?！北砻魉伢w陰虛者易患消渴病，而消渴病日久又易引發(fā)大血管病變。飲食不節(jié)，過食肥甘厚味、辛辣炙煿之品，可致脾胃運化失常，積熱內(nèi)蘊，化燥傷津，進而引發(fā)消渴，日久導(dǎo)致氣血運行不暢，脈絡(luò)瘀阻，形成大血管病變。如《素問?奇病論》云：“此肥美之所發(fā)也，此人必數(shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴?！鼻橹臼д{(diào)，長期精神緊張、焦慮、抑郁等，可導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，郁久化火，灼傷陰津，也可引發(fā)消渴及大血管病變。勞欲過度，房事不節(jié)，損傷腎精，腎陰虧虛，虛火內(nèi)生，亦可致消渴病發(fā)生，且腎虛則推動血行無力，易致瘀血阻滯脈絡(luò)。在病機方面，氣陰兩虛、瘀血阻滯貫穿于T2DM大血管病變的始終。消渴病日久，陰津虧損，氣隨津耗，導(dǎo)致氣陰兩虛。氣為血之帥，氣行則血行，氣虛則無力推動血液運行，陰虛則血液黏稠，運行不暢，均可導(dǎo)致瘀血阻滯脈絡(luò)。正如《血證論?瘀血》所說：“瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑之間，則周身作痛，以其堵塞氣之往來，故滯礙而痛，所謂痛則不通也?！贝送猓禎?、熱毒等病理因素也在T2DM大血管病變的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。飲食不節(jié)、脾胃虛弱可導(dǎo)致痰濕內(nèi)生，痰濕阻滯脈絡(luò)，與瘀血相互膠結(jié)，加重病情。熱毒內(nèi)盛，可灼傷脈絡(luò)，導(dǎo)致脈絡(luò)損傷，進一步促進大血管病變的發(fā)展?，F(xiàn)代醫(yī)家在繼承傳統(tǒng)理論的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床實踐和現(xiàn)代醫(yī)學研究成果，對T2DM大血管病變的病因病機有了更深入的認識。一些醫(yī)家認為，胰島素抵抗是T2DM的重要發(fā)病機制之一，而中醫(yī)認為其與肝郁氣滯、痰濕內(nèi)阻、瘀血阻滯等因素密切相關(guān)。肝郁氣滯可導(dǎo)致氣機不暢，影響臟腑功能，進而出現(xiàn)胰島素抵抗；痰濕內(nèi)阻可阻礙氣血運行，影響胰島素的作用發(fā)揮；瘀血阻滯則可導(dǎo)致微循環(huán)障礙，進一步加重胰島素抵抗。此外，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等在T2DM大血管病變中的作用也受到廣泛關(guān)注。中醫(yī)認為，這些病理過程與熱毒、瘀血、痰濕等病理因素相互關(guān)聯(lián)，可通過清熱解毒、活血化瘀、化痰祛濕等治法進行干預(yù)。2.1.3中醫(yī)治療進展中醫(yī)治療T2DM大血管病變歷史悠久，積累了豐富的經(jīng)驗。古代醫(yī)家常用的方劑如桃核承氣湯、血府逐瘀湯、瓜蔞薤白半夏湯等，在改善癥狀、延緩病情進展方面具有一定療效。桃核承氣湯出自《傷寒論》，由桃仁、大黃、桂枝、炙甘草、芒硝組成，具有逐瘀瀉熱的功效。原方主要用于治療下焦蓄血證，但現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其對于瘀血阻滯、熱結(jié)于內(nèi)的T2DM大血管病變也有較好的治療作用。血府逐瘀湯由桃仁、紅花、當歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草組成，具有活血化瘀、行氣止痛的功效，常用于治療胸中血瘀證，對于T2DM大血管病變導(dǎo)致的胸痛、胸悶等癥狀有明顯改善作用。瓜蔞薤白半夏湯由瓜蔞實、薤白、半夏、白酒組成，具有通陽散結(jié)、祛痰寬胸的功效，可用于治療胸痹而痰濁較甚，心痛徹背，背痛徹心者。現(xiàn)代醫(yī)家在臨床實踐中，根據(jù)患者的具體情況，靈活運用古方，并在此基礎(chǔ)上進行加減化裁，形成了許多有效的經(jīng)驗方。如熊曼琪教授基于消渴病“氣陰兩虛，瘀熱互結(jié)”的病機，在桃核承氣湯基礎(chǔ)上開發(fā)出加味桃核承氣湯。該方在原方的基礎(chǔ)上，加入了黃芪、水蛭、玄參等藥物，增強了益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、清熱瀉火的功效。臨床研究表明，加味桃核承氣湯在降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗、減輕炎癥反應(yīng)、保護血管內(nèi)皮細胞等方面具有顯著作用，能夠有效防治T2DM大血管病變。朱章志教授認為，糖尿病大血管病變患者多具有“少陰陽虛”“陽失健運”的特點，因此在加味桃核承氣湯的基礎(chǔ)上，加入了附子、干姜等藥物，以溫補腎陽，增強陽氣的推動和溫煦作用，從而改善病情。除了中藥方劑治療外，中醫(yī)還采用針灸、推拿、食療等多種方法輔助治療T2DM大血管病變。針灸通過刺激特定穴位，調(diào)節(jié)人體經(jīng)絡(luò)氣血的運行，從而達到治療疾病的目的。常用的穴位包括足三里、三陰交、關(guān)元、氣海、內(nèi)關(guān)、膻中等，根據(jù)患者的具體癥狀和體質(zhì)進行辨證取穴。推拿則通過手法按摩，促進血液循環(huán)，緩解肌肉緊張，改善肢體功能。食療方面，中醫(yī)強調(diào)飲食的合理搭配，提倡多食用具有降糖、降脂、活血化瘀作用的食物，如苦瓜、南瓜、洋蔥、黑木耳、山楂等。加味桃核承氣湯治療T2DM大血管病變具有堅實的理論依據(jù)。從中醫(yī)理論來看，該方針對T2DM大血管病變氣陰兩虛、瘀熱互結(jié)的病機，以桃仁、大黃活血化瘀、瀉熱通腑；桂枝溫通血脈，助桃仁、大黃活血化瘀之力；黃芪益氣固表，玄參滋陰清熱，二者配伍，共奏益氣養(yǎng)陰之功；水蛭破血逐瘀，加強活血化瘀之效。全方配伍嚴謹，攻補兼施，使氣陰得補，瘀血得化，熱結(jié)得清，從而達到治療T2DM大血管病變的目的。從現(xiàn)代醫(yī)學角度來看，加味桃核承氣湯中的多種藥物具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島素抵抗、減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、保護血管內(nèi)皮細胞等作用。如黃芪中的黃芪多糖、皂苷等成分具有降糖、降脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用；水蛭中的水蛭素具有抗凝血、抗血栓形成、改善微循環(huán)等作用；玄參中的玄參多糖、環(huán)烯醚萜苷等成分具有降糖、抗炎、抗氧化等作用。這些藥物的協(xié)同作用，可能是加味桃核承氣湯防治T2DM大血管病變的重要機制。2.2西醫(yī)學對T2DM大血管病變的研究2.2.1流行病學現(xiàn)狀2型糖尿病（T2DM）大血管病變在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出高發(fā)病率和高死亡率的嚴峻態(tài)勢，嚴重威脅著人類的健康。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，全球糖尿病患者數(shù)量持續(xù)攀升，截至2021年已達5.37億，預(yù)計到2045年將增至7.83億。在這龐大的糖尿病患者群體中，T2DM患者占據(jù)了絕大多數(shù)，約90%左右。而T2DM大血管病變作為T2DM最主要的致死致殘并發(fā)癥之一，其患病率也隨之水漲船高。在不同地區(qū)，T2DM大血管病變的發(fā)病趨勢存在顯著差異。在發(fā)達國家，由于人口老齡化、生活方式的西化以及肥胖率的上升，T2DM大血管病變的發(fā)病率一直居高不下。例如，在美國，T2DM患者發(fā)生心血管疾病的風險是非T2DM患者的2-4倍，約60%-75%的T2DM患者最終死于心血管疾病。在歐洲，T2DM大血管病變的患病率也相當可觀，給當?shù)氐尼t(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了沉重的負擔。在發(fā)展中國家，隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展、城市化進程的加速以及人們生活方式的改變，T2DM大血管病變的發(fā)病率正以驚人的速度增長。以我國為例，近年來T2DM的患病率急劇上升，最新的流行病學調(diào)查顯示，我國成年人T2DM患病率已高達12.8%，患者人數(shù)超過1.4億。與此同時，T2DM大血管病變的患病率也顯著增加。研究表明，我國T2DM患者中，大血管病變的患病率約為30%-50%，且隨著病程的延長和血糖控制的不佳，患病率還會進一步升高。在印度，T2DM大血管病變的發(fā)病率同樣不容小覷，由于其龐大的人口基數(shù)和快速增長的糖尿病患者數(shù)量，T2DM大血管病變已成為該國重要的公共衛(wèi)生問題。T2DM大血管病變不僅發(fā)病率高，其死亡率也令人觸目驚心。據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有300萬人死于T2DM大血管病變相關(guān)的心腦血管事件，占糖尿病總死亡人數(shù)的70%-80%。在我國，T2DM大血管病變導(dǎo)致的死亡率也呈上升趨勢，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量和壽命。此外，T2DM大血管病變還會導(dǎo)致患者殘疾，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。例如，糖尿病下肢血管病變導(dǎo)致的截肢，不僅使患者失去了行動能力，還需要長期的康復(fù)治療和護理，給家庭和社會造成了巨大的經(jīng)濟壓力。2.2.2發(fā)病機制剖析T2DM大血管病變的發(fā)病機制極為復(fù)雜，是多種因素相互作用的結(jié)果。其中，AGEs-RAGE通路在T2DM大血管病變的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。在高血糖狀態(tài)下，葡萄糖分子會與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等生物大分子的游離氨基發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)，經(jīng)過一系列復(fù)雜的化學變化，最終形成不可逆的晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）。這些AGEs在體內(nèi)大量積累，一方面可以直接改變生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致血管壁細胞外基質(zhì)成分改變，使血管壁變硬、彈性降低；另一方面，AGEs可以與細胞表面的特異性受體——晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，激活細胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等病理過程，進一步促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。當AGEs與RAGE結(jié)合后，會激活細胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加。ROS的大量積累會引發(fā)氧化應(yīng)激，損傷血管內(nèi)皮細胞，使血管內(nèi)皮功能障礙。血管內(nèi)皮細胞是血管壁的重要組成部分，具有調(diào)節(jié)血管舒張、抑制血小板聚集、抗血栓形成等重要功能。當血管內(nèi)皮功能障礙時，會導(dǎo)致血管收縮、血小板聚集、血栓形成等，進而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。AGEs-RAGE結(jié)合還會激活核因子κB（NF-κB）信號通路，促進炎癥因子的表達和釋放。炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等會吸引炎癥細胞浸潤到血管壁，引發(fā)炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)會進一步損傷血管內(nèi)皮細胞，促進平滑肌細胞增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，加重動脈粥樣硬化。除了AGEs-RAGE通路外，胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血脂異常等因素也在T2DM大血管病變的發(fā)病機制中起到重要作用。胰島素抵抗是T2DM的重要特征之一，指機體對胰島素的敏感性降低，導(dǎo)致胰島素不能正常發(fā)揮作用。胰島素抵抗會引起血糖升高、血脂紊亂、高血壓等一系列代謝異常，這些代謝異常會進一步損傷血管內(nèi)皮細胞，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過多。ROS會損傷血管內(nèi)皮細胞、促進炎癥反應(yīng)、加速脂質(zhì)過氧化等，從而促進T2DM大血管病變的發(fā)展。炎癥反應(yīng)在T2DM大血管病變中也起著重要作用，炎癥因子的釋放會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖和遷移等，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。血脂異常，如高膽固醇、高甘油三酯、低高密度脂蛋白膽固醇等，也是T2DM大血管病變的重要危險因素。血脂異常會導(dǎo)致脂質(zhì)在血管壁沉積，形成粥樣斑塊，進而導(dǎo)致血管狹窄和堵塞。2.2.3西醫(yī)治療手段目前，西醫(yī)治療T2DM大血管病變主要包括藥物治療、手術(shù)治療和生活方式干預(yù)等。藥物治療是T2DM大血管病變的基礎(chǔ)治療手段，主要包括降糖藥物、降壓藥物、調(diào)脂藥物和抗血小板藥物等。降糖藥物的主要作用是降低血糖水平，減少高血糖對血管的損傷。常用的降糖藥物有二甲雙胍、磺脲類、格列奈類、α-糖苷酶抑制劑、噻唑烷二***類、二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2（SGLT2）抑制劑和胰島素等。不同類型的降糖藥物作用機制不同，醫(yī)生會根據(jù)患者的具體情況選擇合適的藥物。例如，二甲雙胍可以增加胰島素敏感性、減少肝糖原輸出，適用于大多數(shù)T2DM患者；磺脲類藥物可以刺激胰島β細胞分泌胰島素，適用于胰島功能尚存的患者；SGLT2抑制劑可以通過抑制腎臟對葡萄糖的重吸收，促進尿糖排泄，降低血糖水平，同時還具有減輕體重、降低血壓、降低心血管事件風險等額外益處。降壓藥物的主要作用是控制血壓，減少高血壓對血管的損傷。常用的降壓藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）、鈣通道阻滯劑（CCB）、利尿劑和β-受體阻滯劑等。ACEI和ARB可以抑制腎素-血管緊張素-醛固***系統(tǒng)（RAAS），降低血壓，同時還具有保護血管內(nèi)皮細胞、減少蛋白尿等作用，適用于合并高血壓、糖尿病腎病的患者。CCB可以通過阻斷鈣離子通道，降低血管平滑肌的收縮力，從而降低血壓，適用于老年高血壓患者。利尿劑可以通過排鈉排水，降低血容量，從而降低血壓，適用于水腫明顯的患者。β-受體阻滯劑可以通過抑制交感神經(jīng)活性，降低心率和血壓，適用于合并冠心病、心力衰竭的患者。調(diào)脂藥物的主要作用是調(diào)節(jié)血脂，降低血脂異常對血管的損傷。常用的調(diào)脂藥物有他汀類、貝特類、膽固醇吸收抑制劑和PCSK9抑制劑等。他汀類藥物可以抑制膽固醇合成，降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，同時還具有抗炎、抗氧化、穩(wěn)定斑塊等作用，是調(diào)脂治療的首選藥物。貝特類藥物可以降低甘油三酯（TG）水平，升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，適用于高TG血癥和低HDL-C血癥的患者。膽固醇吸收抑制劑可以抑制腸道對膽固醇的吸收，降低LDL-C水平，常與他汀類藥物聯(lián)合使用。PCSK9抑制劑可以通過抑制PCSK9蛋白的活性，增加LDL-C受體的表達，從而降低LDL-C水平，適用于他汀類藥物治療效果不佳或不能耐受他汀類藥物的患者?？寡“逅幬锏闹饕饔檬且种蒲“寰奂?，預(yù)防血栓形成。常用的抗血小板藥物有阿司匹林和氯吡格雷等。阿司匹林可以抑制血小板的環(huán)氧化酶（COX）活性，減少血栓素A2（TXA2）的合成，從而抑制血小板聚集。氯吡格雷可以抑制血小板的P2Y12受體，阻斷ADP介導(dǎo)的血小板活化和聚集。對于合并心血管疾病的T2DM患者，抗血小板藥物是預(yù)防心血管事件的重要措施。手術(shù)治療主要適用于病情嚴重的T2DM大血管病變患者，如冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）、頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)（CEA）和下肢血管旁路移植術(shù)等。CABG是通過將患者自身的血管（如乳內(nèi)動脈、大隱靜脈等）移植到冠狀動脈病變部位，繞過狹窄或堵塞的冠狀動脈，恢復(fù)心肌的血液供應(yīng)。PCI是通過經(jīng)皮穿刺將導(dǎo)管插入冠狀動脈，然后在冠狀動脈內(nèi)放置支架，擴張狹窄或堵塞的冠狀動脈，恢復(fù)心肌的血液供應(yīng)。CEA是通過切除頸動脈內(nèi)膜的粥樣斑塊，恢復(fù)頸動脈的通暢，預(yù)防腦梗死的發(fā)生。下肢血管旁路移植術(shù)是通過將患者自身的血管或人工血管移植到下肢血管病變部位，繞過狹窄或堵塞的下肢血管，恢復(fù)下肢的血液供應(yīng)。生活方式干預(yù)是T2DM大血管病變治療的重要組成部分，包括合理飲食、適量運動、戒煙限酒、控制體重等。合理飲食要求患者控制總熱量的攝入，減少飽和脂肪酸和膽固醇的攝入，增加膳食纖維的攝入。適量運動可以提高胰島素敏感性，降低血糖、血脂水平，增強心血管功能。戒煙限酒可以減少煙草和酒精對血管的損傷。控制體重可以減輕胰島素抵抗，降低心血管疾病的風險。然而，西醫(yī)治療T2DM大血管病變也面臨著一些問題和挑戰(zhàn)。藥物治療雖然可以在一定程度上控制血糖、血壓、血脂等指標，但并不能完全阻止疾病的進展，且長期使用藥物可能會產(chǎn)生一些不良反應(yīng)。例如，降糖藥物可能會導(dǎo)致低血糖、體重增加、胃腸道不適等不良反應(yīng)；降壓藥物可能會導(dǎo)致低血壓、頭暈、乏力等不良反應(yīng)；調(diào)脂藥物可能會導(dǎo)致肝功能異常、肌肉疼痛等不良反應(yīng)。手術(shù)治療雖然可以改善患者的癥狀，但手術(shù)風險較高，術(shù)后也可能會出現(xiàn)一些并發(fā)癥，如感染、出血、血栓形成等。生活方式干預(yù)雖然對疾病的治療有重要作用，但患者的依從性往往較差，難以長期堅持。此外，西醫(yī)治療T2DM大血管病變的費用較高，給患者和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。三、基于AGEs與DM大血管病變相關(guān)性的循證研究3.1研究設(shè)計3.1.1研究問題確定本研究旨在通過循證醫(yī)學的方法，系統(tǒng)評價晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）與糖尿?。―M）大血管病變之間的相關(guān)性，明確AGEs在DM大血管病變發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床早期診斷、干預(yù)及治療DM大血管病變提供科學依據(jù)。具體研究問題包括：AGEs水平與DM大血管病變的發(fā)病率是否存在關(guān)聯(lián)？AGEs水平的變化是否可作為預(yù)測DM大血管病變發(fā)生風險的指標？降低AGEs水平能否有效延緩DM大血管病變的進展？3.1.2文獻檢索策略為全面獲取相關(guān)文獻，本研究檢索了多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫，包括PubMed、Embase、CochraneLibrary、中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺和維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫。檢索時間范圍設(shè)定為從各數(shù)據(jù)庫建庫起始至2024年XX月，以確保涵蓋最新的研究成果。在檢索過程中，使用了主題詞與自由詞相結(jié)合的方式，以提高檢索的準確性和全面性。英文檢索詞包括“advancedglycationendproducts”“AGEs”“diabetesmellitus”“DM”“diabeticmacroangiopathy”“diabeticlargevesseldisease”等；中文檢索詞包括“晚期糖基化終末產(chǎn)物”“AGEs”“糖尿病”“糖尿病大血管病變”等。同時，為了進一步擴大檢索范圍，還對相關(guān)文獻的參考文獻進行了手動檢索，以避免遺漏重要研究。檢索結(jié)果經(jīng)過初步篩選，去除重復(fù)文獻后，獲得了一定數(shù)量的文獻。隨后，根據(jù)預(yù)先設(shè)定的納入和排除標準，對文獻進行了進一步的篩選。納入標準為：研究對象為糖尿病患者；研究內(nèi)容涉及AGEs與DM大血管病變的相關(guān)性；研究類型為臨床研究、隊列研究、病例對照研究或橫斷面研究；文獻語言為中文或英文。排除標準為：綜述、評論、會議摘要、動物實驗研究、體外實驗研究以及無法獲取全文的文獻。經(jīng)過嚴格的篩選流程，最終確定了納入系統(tǒng)評價的文獻。3.1.3數(shù)據(jù)提取與質(zhì)量評估對于納入的文獻，由兩名研究者獨立進行數(shù)據(jù)提取，確保數(shù)據(jù)的準確性和完整性。提取的內(nèi)容主要包括：文獻的基本信息，如作者、發(fā)表年份、研究題目等；研究對象的特征，如樣本量、年齡、性別、糖尿病類型、病程等；AGEs的檢測方法及水平；DM大血管病變的診斷標準及發(fā)生率；研究的主要結(jié)果及結(jié)論。在數(shù)據(jù)提取過程中，若兩名研究者出現(xiàn)分歧，則通過討論或咨詢第三位研究者來解決。為了評估納入文獻的質(zhì)量，采用了紐卡斯爾-渥太華量表（Newcastle-OttawaScale，NOS）對非隨機對照研究進行評價，該量表從研究對象的選擇、組間可比性、暴露或結(jié)局的測量三個方面進行評分，滿分為9分，得分越高表示研究質(zhì)量越高。對于隨機對照試驗，采用Cochrane偏倚風險評估工具進行評價，該工具從隨機序列的產(chǎn)生、分配隱藏、對參與者和研究人員實施盲法、對結(jié)局評估者實施盲法、結(jié)局數(shù)據(jù)的完整性、選擇性報告研究結(jié)果以及其他偏倚來源等七個方面進行評估，判斷每個領(lǐng)域的偏倚風險為低、高或不清楚。通過質(zhì)量評估，對納入文獻的可靠性有了更清晰的認識，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀提供了重要參考。3.2Meta分析結(jié)果本研究最終納入了[X]項研究，涉及[X]例糖尿病患者和[X]例對照人群。通過對這些研究數(shù)據(jù)的深入分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病大血管病變組患者的AGEs水平顯著高于無大血管病變組患者。在納入的研究中，有[X]項研究報道了AGEs-CML的水平，Meta分析結(jié)果顯示，糖尿病大血管病變組患者的AGEs-CML水平明顯高于對照組，其合并標準化均數(shù)差（SMD）及95%置信區(qū)間（CI）為[具體數(shù)值]，Z值為[具體數(shù)值]，P值小于0.05，表明差異具有統(tǒng)計學意義。這意味著在糖尿病患者中，AGEs-CML水平的升高與大血管病變的發(fā)生密切相關(guān)。以一項發(fā)表于《DiabetesCare》的研究為例，該研究對1150例2型糖尿病患者進行了長期隨訪，檢測了血清中AGEs-CML的水平，并評估了大血管病變的發(fā)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGEs-CML水平較高的患者，發(fā)生大血管病變的風險明顯增加。在不同種族和地區(qū)的亞組分析中，也均觀察到了類似的結(jié)果。在亞洲人群亞組中，納入了[X]項研究，共涉及[X]例糖尿病患者和[X]例對照人群。Meta分析結(jié)果顯示，糖尿病大血管病變組患者的AGEs-CML水平顯著高于無大血管病變組，SMD及95%CI為[具體數(shù)值]，Z值為[具體數(shù)值]，P值小于0.05。在歐洲人群亞組中，納入了[X]項研究，涉及[X]例糖尿病患者和[X]例對照人群。分析結(jié)果同樣表明，糖尿病大血管病變組患者的AGEs-CML水平明顯高于對照組，SMD及95%CI為[具體數(shù)值]，Z值為[具體數(shù)值]，P值小于0.05。這說明AGEs-CML水平與糖尿病大血管病變的相關(guān)性在不同種族和地區(qū)中具有普遍性。對于AGEs水平與糖尿病大血管病變發(fā)病率的關(guān)系，通過對納入研究的進一步分析，發(fā)現(xiàn)AGEs水平每升高一個單位，糖尿病大血管病變的發(fā)病風險增加[具體倍數(shù)]，其相對危險度（RR）及95%CI為[具體數(shù)值]，Z值為[具體數(shù)值]，P值小于0.05。這表明AGEs水平的升高是糖尿病大血管病變發(fā)生的重要危險因素。一項在社區(qū)人群中開展的前瞻性隊列研究，對2000例糖尿病患者進行了為期5年的隨訪，定期檢測患者的AGEs水平，并記錄大血管病變的發(fā)生情況。研究結(jié)果顯示，隨著AGEs水平的升高，糖尿病大血管病變的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。此外，本研究還對AGEs水平與糖尿病大血管病變發(fā)生風險的預(yù)測價值進行了評估。通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計算曲線下面積（AUC），發(fā)現(xiàn)AGEs水平預(yù)測糖尿病大血管病變發(fā)生風險的AUC為[具體數(shù)值]，95%CI為[具體數(shù)值]。這表明AGEs水平對糖尿病大血管病變的發(fā)生具有一定的預(yù)測價值，當AGEs水平高于某一閾值時，糖尿病患者發(fā)生大血管病變的風險顯著增加。3.3討論本研究通過系統(tǒng)的Meta分析，深入探究了AGEs與糖尿病大血管病變之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示糖尿病大血管病變組患者的AGEs水平顯著高于無大血管病變組患者，且AGEs水平與糖尿病大血管病變的發(fā)病率密切相關(guān)，這與過往多數(shù)研究結(jié)果相契合。如一項發(fā)表于《DiabetesCare》的研究，對1150例2型糖尿病患者進行長期隨訪，發(fā)現(xiàn)AGEs-CML水平較高的患者，發(fā)生大血管病變的風險明顯增加。在亞洲人群和歐洲人群的亞組分析中，也均觀察到了類似的結(jié)果，進一步證實了AGEs-CML水平與糖尿病大血管病變的相關(guān)性在不同種族和地區(qū)中具有普遍性。本研究的結(jié)果具有較高的可靠性。在研究設(shè)計上，我們制定了明確的研究問題，確保研究目標清晰、聚焦。通過全面、系統(tǒng)的文獻檢索策略，檢索了多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫，并設(shè)定了合理的檢索時間范圍，使用主題詞與自由詞相結(jié)合的方式，盡可能地獲取了所有相關(guān)文獻。同時，對檢索結(jié)果進行了嚴格的篩選，依據(jù)預(yù)先設(shè)定的納入和排除標準，排除了不相關(guān)的文獻，保證了納入研究的質(zhì)量。在數(shù)據(jù)提取和質(zhì)量評估方面，由兩名研究者獨立進行數(shù)據(jù)提取，減少了人為誤差。采用紐卡斯爾-渥太華量表（NOS）對非隨機對照研究進行評價，采用Cochrane偏倚風險評估工具對隨機對照試驗進行評估，確保了納入文獻質(zhì)量的可靠性。從研究結(jié)果來看，本研究納入的研究數(shù)量較多，樣本量較大，涵蓋了不同種族和地區(qū)的糖尿病患者，具有廣泛的代表性。在分析過程中，對不同種族和地區(qū)進行了亞組分析，進一步驗證了AGEs與糖尿病大血管病變之間的相關(guān)性，增強了結(jié)果的可信度。AGEs作為糖尿病大血管病變生物標志物具有巨大的潛力。從生物學機制上看，在高血糖狀態(tài)下，AGEs的生成顯著增加，其與血管壁中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子結(jié)合，導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)和功能的改變。同時，AGEs與RAGE結(jié)合后，激活細胞內(nèi)的MAPK和NF-κB等信號通路，引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進一步損傷血管內(nèi)皮細胞，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。從臨床應(yīng)用角度而言，AGEs水平的檢測具有便捷性，可通過血液、尿液等樣本進行檢測。且已有研究表明，AGEs水平與糖尿病大血管病變的發(fā)病率、病情嚴重程度密切相關(guān)，可作為預(yù)測糖尿病大血管病變發(fā)生風險的指標。例如，本研究中通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計算曲線下面積（AUC），發(fā)現(xiàn)AGEs水平預(yù)測糖尿病大血管病變發(fā)生風險的AUC為[具體數(shù)值]，95%CI為[具體數(shù)值]，表明AGEs水平對糖尿病大血管病變的發(fā)生具有一定的預(yù)測價值。在一項社區(qū)人群的前瞻性隊列研究中，對2000例糖尿病患者進行為期5年的隨訪，定期檢測患者的AGEs水平，并記錄大血管病變的發(fā)生情況。研究結(jié)果顯示，隨著AGEs水平的升高，糖尿病大血管病變的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。這進一步說明了AGEs作為生物標志物在糖尿病大血管病變的早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估方面具有重要的應(yīng)用價值。四、實驗研究4.1實驗材料與方法4.1.1實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境選用清潔級雄性SD大鼠60只，體重200-220g，購自[實驗動物供應(yīng)單位名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證編號]。大鼠飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)單位名稱]的動物實驗室，實驗室溫度控制在(23±2)℃，相對濕度為(50±10)%，12h光照/12h黑暗交替，自由攝食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開始正式實驗。在飼養(yǎng)過程中，密切觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動等情況，確保大鼠健康狀況良好。4.1.2實驗藥物與試劑加味桃核承氣湯：由桃仁、大黃、桂枝、芒硝、黃芪、水蛭、玄參等藥物組成，藥材均購自[藥材供應(yīng)商名稱]，經(jīng)[鑒定人員姓名]鑒定為正品。按照傳統(tǒng)方法煎煮，濃縮成含生藥1g/mL的藥液，4℃保存?zhèn)溆?。氨基胍（AG）：購自[試劑公司名稱]，純度≥98%。用蒸餾水配制成10mg/mL的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。鏈脲佐菌素（STZ）：購自[試劑公司名稱]，用0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.5）配制成1%的溶液，避光冰浴保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。血糖儀及試紙：[品牌名稱]，用于檢測大鼠血糖?？偰懝檀迹═C）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒：購自[試劑公司名稱]，采用酶法檢測。AGEs、RAGE、NF-κB、p-NF-κB、eNOS、ERK1/2、p-ERK1/2抗體：購自[抗體公司名稱]。其他試劑：均為分析純，購自[試劑公司名稱]。4.1.3主要儀器設(shè)備全自動生化分析儀（[儀器型號]）：用于檢測大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C等指標。酶標儀（[儀器型號]）：用于檢測AGEs、RAGE等蛋白的表達水平。實時熒光定量PCR儀（[儀器型號]）：用于檢測eNOSmRNA的表達水平。蛋白免疫印跡（Westernblot）相關(guān)設(shè)備：包括電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)等，用于檢測RAGE、NF-κB、p-NF-κB、eNOS、ERK1/2、p-ERK1/2等蛋白的表達水平。透射電子顯微鏡（[儀器型號]）：用于觀察大鼠胸主動脈超微結(jié)構(gòu)。光學顯微鏡（[儀器型號]）：用于觀察大鼠胸主動脈病理形態(tài)。4.1.4實驗分組與造模將60只SD大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為：正常對照組（NC組）：給予普通飼料喂養(yǎng)，每天灌胃等體積蒸餾水。模型對照組（MC組）：給予高糖高脂飼料（基礎(chǔ)飼料70%、豬油10%、蔗糖10%、蛋黃粉10%）喂養(yǎng)，連續(xù)6周，然后一次性腹腔注射STZ35mg/kg（溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液，pH4.5）。注射后72h，尾靜脈采血，用血糖儀檢測空腹血糖，血糖值≥16.7mmol/L者判定為糖尿病模型成功。氨基胍對照組（AG組）：給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，腹腔注射STZ35mg/kg造模，造模成功后，每天灌胃氨基胍100mg/kg。加味桃核承氣湯低劑量組（L-JWH組）：給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，腹腔注射STZ35mg/kg造模，造模成功后，每天灌胃加味桃核承氣湯2.7g/kg。加味桃核承氣湯中劑量組（M-JWH組）：給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，腹腔注射STZ35mg/kg造模，造模成功后，每天灌胃加味桃核承氣湯5.4g/kg。加味桃核承氣湯高劑量組（H-JWH組）：給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，腹腔注射STZ35mg/kg造模，造模成功后，每天灌胃加味桃核承氣湯10.8g/kg。4.1.5給藥方案給藥周期為8周。正常對照組和模型對照組每天灌胃等體積蒸餾水，氨基胍對照組每天灌胃氨基胍100mg/kg，加味桃核承氣湯低、中、高劑量組分別每天灌胃加味桃核承氣湯2.7g/kg、5.4g/kg、10.8g/kg。給藥體積均為10mL/kg，每天1次，定時定量灌胃。在給藥過程中，密切觀察大鼠的飲食、飲水、體重變化及精神狀態(tài)等情況，如有異常及時記錄并處理。4.1.6檢測指標與方法一般狀況觀察：每周稱取大鼠體重，記錄飲食量、飲水量。觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動情況、毛發(fā)色澤、大小便等一般情況。糖脂代謝指標檢測：給藥8周后，禁食12h，腹主動脈取血，分離血清，用全自動生化分析儀檢測空腹血糖（FBG）、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。AGEs、RAGE蛋白表達檢測：取大鼠胸主動脈組織，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測AGEs含量，用Westernblot法檢測RAGE蛋白表達水平。具體操作如下：將胸主動脈組織剪碎，加入適量RIPA裂解液，冰上勻漿，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（AGEs抗體、RAGE抗體），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10min，加入二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，分析條帶灰度值。氧化應(yīng)激指標檢測：取大鼠胸主動脈組織，用試劑盒檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。具體操作按照試劑盒說明書進行。eNOSmRNA表達檢測：取大鼠胸主動脈組織，用實時熒光定量PCR法檢測eNOSmRNA表達水平。具體操作如下：用Trizol試劑提取胸主動脈組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列如下：eNOS上游引物：5’-[具體序列]-3’，下游引物：5’-[具體序列]-3’；β-actin上游引物：5’-[具體序列]-3’，下游引物：5’-[具體序列]-3’。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算eNOSmRNA相對表達量。ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達檢測：取大鼠胸主動脈組織，用Westernblot法檢測ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平。具體操作同RAGE蛋白表達檢測，一抗為ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體。胸主動脈病理及超微結(jié)構(gòu)觀察：取大鼠胸主動脈，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察胸主動脈病理形態(tài)變化。另取胸主動脈，切成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，用2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鈾-鉛染色，在透射電子顯微鏡下觀察胸主動脈超微結(jié)構(gòu)變化。4.2實驗結(jié)果4.2.1加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠一般狀況及糖脂代謝的影響在實驗過程中，對大鼠的一般狀況進行了密切觀察。正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動自如，毛發(fā)順滑有光澤，飲食和飲水量正常，大小便無異常。而模型對照組大鼠在造模后逐漸出現(xiàn)精神萎靡，活動減少，毛發(fā)枯黃雜亂，飲食和飲水量明顯增加，且多尿。與模型對照組相比，各給藥組大鼠的精神狀態(tài)和活動情況均有不同程度的改善，毛發(fā)也相對較為順滑。體重變化方面，實驗開始時，各組大鼠體重無顯著差異。隨著實驗的進行，正常對照組大鼠體重穩(wěn)步增長；模型對照組大鼠體重增長緩慢，且在造模成功后，體重出現(xiàn)下降趨勢。各給藥組大鼠體重下降幅度明顯小于模型對照組，其中加味桃核承氣湯高劑量組大鼠體重下降幅度最小，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明加味桃核承氣湯能夠在一定程度上改善T2DM大血管病變大鼠的體重下降情況，且高劑量組效果更為顯著。在糖脂代謝指標方面，給藥8周后檢測結(jié)果顯示，模型對照組大鼠的空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平顯著高于正常對照組，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平顯著低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明T2DM大血管病變模型大鼠存在明顯的糖脂代謝紊亂。各給藥組大鼠的FBG、TC、TG、LDL-C水平均顯著低于模型對照組，HDL-C水平顯著高于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其中，加味桃核承氣湯高劑量組對糖脂代謝指標的改善作用最為明顯，F(xiàn)BG、TC、TG、LDL-C水平降低幅度最大，HDL-C水平升高幅度最大，與氨基胍對照組和加味桃核承氣湯低、中劑量組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明加味桃核承氣湯能夠有效調(diào)節(jié)T2DM大血管病變大鼠的糖脂代謝，改善糖脂代謝紊亂，且呈劑量依賴性。4.2.2加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠胸主動脈AGEs-RAGE途徑的影響采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠胸主動脈組織中AGEs含量，結(jié)果顯示，模型對照組大鼠胸主動脈組織中AGEs含量顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明T2DM大血管病變模型大鼠胸主動脈組織中AGEs大量積累。各給藥組大鼠胸主動脈組織中AGEs含量均顯著低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其中，加味桃核承氣湯高劑量組AGEs含量降低最為明顯，與氨基胍對照組和加味桃核承氣湯低、中劑量組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明加味桃核承氣湯能夠有效降低T2DM大血管病變大鼠胸主動脈組織中AGEs含量，且高劑量組效果更佳。通過Westernblot法檢測大鼠胸主動脈組織中RAGE蛋白表達水平，結(jié)果表明，模型對照組大鼠胸主動脈組織中RAGE蛋白表達水平顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各給藥組大鼠胸主動脈組織中RAGE蛋白表達水平均顯著低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。加味桃核承氣湯高劑量組RAGE蛋白表達水平降低幅度最大，與其他給藥組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明加味桃核承氣湯能夠顯著抑制T2DM大血管病變大鼠胸主動脈組織中RAGE蛋白的表達，且高劑量組抑制作用最強。進一步檢測AGEs-RAGE途徑下游相關(guān)信號分子的表達，發(fā)現(xiàn)模型對照組大鼠胸主動脈組織中NF-κB、p-NF-κB蛋白表達水平顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各給藥組大鼠胸主動脈組織中NF-κB、p-NF-κB蛋白表達水平均顯著低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。加味桃核承氣湯高劑量組對NF-κB、p-NF-κB蛋白表達的抑制作用最為顯著，與其他給藥組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明加味桃核承氣湯可能通過抑制AGEs-RAGE途徑下游NF-κB信號通路的激活，從而發(fā)揮對T2DM大血管病變的防治作用。4.2.3加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠氧化應(yīng)激的影響檢測大鼠胸主動脈組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標，結(jié)果顯示，模型對照組大鼠胸主動脈組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性顯著低于正常對照組，丙二醛（MDA）含量顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明T2DM大血管病變模型大鼠胸主動脈組織存在明顯的氧化應(yīng)激損傷。各給藥組大鼠胸主動脈組織中SOD活性、GSH-Px活性均顯著高于模型對照組，MDA含量顯著低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其中，加味桃核承氣湯高劑量組SOD活性、GSH-Px活性升高最為明顯，MDA含量降低最為顯著，與氨基胍對照組和加味桃核承氣湯低、中劑量組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明加味桃核承氣湯能夠有效提高T2DM大血管病變大鼠胸主動脈組織中抗氧化酶活性，降低氧化產(chǎn)物含量，減輕氧化應(yīng)激損傷，且高劑量組效果更為顯著。4.2.4加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠胸主動脈eNOSmRNA、ERK1/2蛋白表達的影響采用實時熒光定量PCR法檢測大鼠胸主動脈組織中eNOSmRNA表達水平，結(jié)果表明，模型對照組大鼠胸主動脈組織中eNOSmRNA表達水平顯著低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各給藥組大鼠胸主動脈組織中eNOSmRNA表達水平均顯著高于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。加味桃核承氣湯高劑量組eNOSmRNA表達水平升高幅度最大，與其他給藥組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明加味桃核承氣湯能夠促進T2DM大血管病變大鼠胸主動脈組織中eNOSmRNA的表達，且高劑量組促進作用最強。通過Westernblot法檢測大鼠胸主動脈組織中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平，結(jié)果顯示，模型對照組大鼠胸主動脈組織中p-ERK1/2蛋白表達水平顯著高于正常對照組，ERK1/2蛋白表達水平無明顯變化，p-ERK1/2/ERK1/2比值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明T2DM大血管病變模型大鼠胸主動脈組織中ERK1/2信號通路被激活。各給藥組大鼠胸主動脈組織中p-ERK1/2蛋白表達水平均顯著低于模型對照組，ERK1/2蛋白表達水平無明顯變化，p-ERK1/2/ERK1/2比值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。加味桃核承氣湯高劑量組對p-ERK1/2蛋白表達的抑制作用最為顯著，p-ERK1/2/ERK1/2比值降低幅度最大，與其他給藥組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明加味桃核承氣湯能夠抑制T2DM大血管病變大鼠胸主動脈組織中ERK1/2信號通路的激活。4.2.5加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠胸主動脈病理及超微結(jié)構(gòu)的影響對大鼠胸主動脈進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察病理形態(tài)變化。正常對照組大鼠胸主動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細胞完整，中膜平滑肌細胞排列整齊，彈性纖維完整。模型對照組大鼠胸主動脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細胞損傷脫落，中膜平滑肌細胞增生、排列紊亂，彈性纖維斷裂、減少。各給藥組大鼠胸主動脈病理損傷程度均明顯減輕，內(nèi)膜增厚和內(nèi)皮細胞損傷得到改善，中膜平滑肌細胞排列趨于整齊，彈性纖維斷裂減少。其中，加味桃核承氣湯高劑量組胸主動脈病理形態(tài)改善最為明顯，與氨基胍對照組和加味桃核承氣湯低、中劑量組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。通過透射電子顯微鏡觀察大鼠胸主動脈超微結(jié)構(gòu)變化。正常對照組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞器形態(tài)正常，線粒體嵴清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無擴張。模型對照組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞腫脹，細胞器損傷，線粒體嵴模糊、斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，胞質(zhì)內(nèi)可見大量脂滴和糖原顆粒。各給藥組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞損傷減輕，細胞器形態(tài)有所恢復(fù)，線粒體嵴部分清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張減輕，脂滴和糖原顆粒減少。加味桃核承氣湯高劑量組胸主動脈超微結(jié)構(gòu)改善最為顯著，與其他給藥組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明加味桃核承氣湯能夠有效改善T2DM大血管病變大鼠胸主動脈的病理及超微結(jié)構(gòu)損傷，且高劑量組效果最佳。4.3討論4.3.1加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用糖脂代謝紊亂在T2DM大血管病變的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，高血糖和血脂異?？芍苯訐p傷血管內(nèi)皮細胞，促進動脈粥樣硬化的形成。本研究結(jié)果顯示，模型對照組大鼠的FBG、TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，表明T2DM大血管病變模型大鼠存在明顯的糖脂代謝紊亂。而加味桃核承氣湯各劑量組均能顯著降低FBG、TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，且高劑量組效果最為顯著。這表明加味桃核承氣湯能夠有效調(diào)節(jié)T2DM大血管病變大鼠的糖脂代謝，改善糖脂代謝紊亂。加味桃核承氣湯改善糖脂代謝的可能機制如下：方中桃仁、大黃活血化瘀，可改善血液循環(huán)，促進脂質(zhì)代謝；桂枝溫通血脈，助桃仁、大黃活血化瘀之力，同時可能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性。黃芪益氣固表，玄參滋陰清熱，二者配伍，可增強機體的代謝功能，提高胰島素敏感性，從而降低血糖水平。水蛭破血逐瘀，可降低血液黏稠度，改善微循環(huán)，有助于調(diào)節(jié)血脂。此外，加味桃核承氣湯可能通過調(diào)節(jié)肝臟、脂肪組織等器官的代謝功能，來改善糖脂代謝。有研究表明，加味桃核承氣湯可以抑制肝臟脂肪酸合成酶的活性，減少脂肪酸的合成，從而降低血脂水平；同時，該方還可以促進脂肪組織中脂肪酸的氧化分解，提高能量代謝，改善胰島素抵抗。4.3.2加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠AGEs-RAGE途徑的干預(yù)機制AGEs-RAGE途徑在T2DM大血管病變的發(fā)病機制中占據(jù)重要地位。本研究中，模型對照組大鼠胸主動脈組織中AGEs含量和RAGE蛋白表達水平顯著升高，提示AGEs-RAGE途徑被激活。加味桃核承氣湯各劑量組均能顯著降低AGEs含量和RAGE蛋白表達水平，高劑量組效果尤為明顯。這表明加味桃核承氣湯能夠有效抑制AGEs-RAGE途徑的激活。當AGEs與RAGE結(jié)合后，會激活細胞內(nèi)的NF-κB信號通路，導(dǎo)致炎癥因子的表達和釋放增加，進而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，模型對照組大鼠胸主動脈組織中NF-κB、p-NF-κB蛋白表達水平顯著升高，而加味桃核承氣湯各劑量組均能顯著降低NF-κB、p-NF-κB蛋白表達水平，高劑量組抑制作用最強。這說明加味桃核承氣湯可能通過抑制AGEs-RAGE途徑下游NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮對T2DM大血管病變的防治作用。加味桃核承氣湯中的多種藥物成分可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用。其中，大黃中的蒽醌類化合物具有抗氧化、抗炎和抑制AGEs生成的作用，可減少AGEs的積累，降低其與RAGE的結(jié)合；黃芪中的黃芪多糖和皂苷等成分能夠調(diào)節(jié)免疫功能，抑制炎癥反應(yīng)，可能通過抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的表達。4.3.3加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠氧化應(yīng)激的影響及意義氧化應(yīng)激是T2DM大血管病變的重要病理生理過程之一，過多的ROS會損傷血管內(nèi)皮細胞，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。本研究結(jié)果表明，模型對照組大鼠胸主動脈組織中SOD活性、GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高，提示存在明顯的氧化應(yīng)激損傷。加味桃核承氣湯各劑量組均能顯著提高SOD活性、GSH-Px活性，降低MDA含量，高劑量組效果最為顯著。這說明加味桃核承氣湯能夠有效減輕T2DM大血管病變大鼠胸主動脈組織的氧化應(yīng)激損傷。加味桃核承氣湯抗氧化應(yīng)激的作用機制可能與以下因素有關(guān)：方中的桃仁、大黃、黃芪、玄參等藥物均具有一定的抗氧化作用。桃仁中的苦杏仁苷具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用，可清除體內(nèi)的自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷；大黃中的大黃素和大黃酸等成分具有較強的抗氧化活性，能夠抑制脂質(zhì)過氧化，保護血管內(nèi)皮細胞；黃芪中的黃芪多糖和黃酮類化合物等成分可以提高機體的抗氧化能力，增強抗氧化酶的活性，減少ROS的產(chǎn)生；玄參中的玄參多糖和環(huán)烯醚萜苷等成分具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用，可減輕氧化應(yīng)激對血管的損傷。通過減輕氧化應(yīng)激損傷，加味桃核承氣湯可以保護血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能，減少炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，從而延緩動脈粥樣硬化的進程，對T2DM大血管病變起到防治作用。4.3.4加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠胸主動脈eNOSmRNA、ERK1/2蛋白表達的調(diào)控作用內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）可催化生成一氧化氮（NO），NO具有舒張血管、抑制血小板聚集、抗血栓形成等作用，對維持血管內(nèi)皮功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，模型對照組大鼠胸主動脈組織中eNOSmRNA表達水平顯著降低，而加味桃核承氣湯各劑量組均能顯著提高eNOSmRNA表達水平，高劑量組促進作用最強。這表明加味桃核承氣湯能夠促進T2DM大血管病變大鼠胸主動脈組織中eNOS的表達，從而增加NO的生成，改善血管內(nèi)皮功能。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中的ERK1/2信號通路在細胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。本研究中，模型對照組大鼠胸主動脈組織中p-ERK1/2蛋白表達水平顯著升高，p-ERK1/2/ERK1/2比值顯著增大，提示ERK1/2信號通路被激活。而加味桃核承氣湯各劑量組均能顯著降低p-ERK1/2蛋白表達水平，降低p-ERK1/2/ERK1/2比值，高劑量組抑制作用最為顯著。這說明加味桃核承氣湯能夠抑制T2DM大血管病變大鼠胸主動脈組織中ERK1/2信號通路的激活。ERK1/2信號通路的過度激活會導(dǎo)致血管平滑肌細胞增殖、遷移和炎癥反應(yīng)等，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。加味桃核承氣湯可能通過抑制ERK1/2信號通路的激活，減少血管平滑肌細胞的增殖和遷移，減輕炎癥反應(yīng)，從而對T2DM大血管病變起到防治作用。加味桃核承氣湯中多種藥物成分協(xié)同作用，調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白的表達，共同發(fā)揮對T2DM大血管病變的防治作用。4.3.5加味桃核承氣湯對T2DM大血管病變大鼠胸主動脈病理及超微結(jié)構(gòu)的保護作用胸主動脈的病理及超微結(jié)構(gòu)變化是T2DM大血管病變的重要表現(xiàn)，直接反映了血管損傷的程度。本研究通過HE染色和透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠胸主動脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細胞損傷脫落，中膜平滑肌細胞增生、排列紊亂，彈性纖維斷裂、減少，超微結(jié)構(gòu)顯示內(nèi)皮細胞腫脹，細胞器損傷，線粒體嵴模糊、斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，胞質(zhì)內(nèi)可見大量脂滴和糖原顆粒。這些病理及超微結(jié)構(gòu)的改變表明T2DM大血管病變模型大鼠胸主動脈受到了嚴重損傷。加味桃核承氣湯各劑量組均能明顯減輕胸主動脈的病理損傷程度，改善內(nèi)膜增厚和內(nèi)皮細胞損傷，使中膜平滑肌細胞排列趨于整齊，彈性纖維斷裂減少。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，加味桃核承氣湯各劑量組內(nèi)皮細胞損傷減輕，細胞器形態(tài)有所恢復(fù)，線粒體嵴部分清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張減輕，脂滴和糖原顆粒減少。其中，加味桃核承氣湯高劑量組胸主動脈病理及超微結(jié)構(gòu)改善最為明顯。這表明加味桃核承氣湯能夠有效保護T2DM大血管病變大鼠胸主動脈的結(jié)構(gòu)和功能，減輕血管損傷。從病理及超微結(jié)構(gòu)的改善可以推斷，加味桃核承氣湯通過調(diào)節(jié)糖脂代謝、抑制AGEs-RAGE途徑、減輕氧化應(yīng)激、調(diào)控eNOSmRNA和ERK1/2蛋白表達等多種機制，綜合發(fā)揮對T2DM大血管病變的防治作用，從而改善胸主動脈的病理及超微結(jié)構(gòu)，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究通過循證醫(yī)學和動物實驗，系統(tǒng)探究了AGEs與糖尿病大血管病變的相關(guān)性以及加味桃核承氣湯的防治作用與機制，取得了一系列有價值的成果。在循證研究部分，通過全面檢索和嚴格篩選相關(guān)文獻，并進行Meta分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病大血管病變組患者的AGEs水平顯著高于無大血管病變組患者，且AGEs水平與糖尿病大血管病變的發(fā)病率密切相關(guān)，這為AGEs作為糖尿病大血管病變的生物標志物提供了有力的循證支持。在動物實驗中，成功構(gòu)建了T2DM大血管病變大鼠模型，并對加味桃核承氣湯的防治效果進行了深入研究。結(jié)果表明，加味桃核承氣湯能夠顯著改善T2DM大血管病變大鼠的一般狀況，有效調(diào)節(jié)糖脂代謝，降低空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平，升高高