力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)影響的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義牙周組織作為牙齒的支持結(jié)構(gòu)，對(duì)于維持口腔健康起著至關(guān)重要的作用，其主要構(gòu)成包括牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)以及牙齦。其中，牙周膜細(xì)胞是牙周組織的關(guān)鍵組成部分，這些細(xì)胞不僅能夠合成和降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與牙周組織的構(gòu)建與修復(fù)，還具備感受力學(xué)刺激的能力。在正畸治療中，當(dāng)牙齒受到正畸力作用時(shí)，牙周膜細(xì)胞能夠?qū)⑦@種機(jī)械力轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)，并通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，進(jìn)一步傳遞給骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等，從而啟動(dòng)牙槽骨的改建過(guò)程，最終實(shí)現(xiàn)牙齒的移動(dòng)。在牙周疾病的發(fā)展進(jìn)程中，炎癥因子扮演著極為重要的角色。如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子，它們?cè)谘乐苎装Y狀態(tài)下大量釋放，不僅會(huì)對(duì)牙周膜細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化產(chǎn)生顯著影響，還會(huì)干擾牙周組織中細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡，導(dǎo)致牙槽骨的進(jìn)行性吸收和破壞。與此同時(shí)，在口腔生理和病理過(guò)程中，力的作用同樣不容忽視。除了正畸治療中的正畸力外，日常的咀嚼力等也會(huì)持續(xù)作用于牙周組織。不同類型和強(qiáng)度的力作用于牙周膜細(xì)胞時(shí)，會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的功能和基因表達(dá)。值得注意的是，在實(shí)際的口腔環(huán)境中，力與炎癥因子往往同時(shí)存在且相互作用。一方面，炎癥狀態(tài)下的牙周組織對(duì)力的反應(yīng)性可能發(fā)生改變，使得原本正常的力刺激也可能引發(fā)異常的骨改建過(guò)程；另一方面，力的作用也可能反過(guò)來(lái)影響炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，進(jìn)一步加劇或緩解牙周炎癥。然而，目前對(duì)于力與炎癥因子如何共同影響牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的具體機(jī)制，仍缺乏深入且系統(tǒng)的研究。深入探究力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響，具有極其重要的理論和實(shí)踐意義。在理論層面，有助于我們更全面、深入地理解牙周組織在生理和病理狀態(tài)下的骨改建機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在力與炎癥相互作用研究方面的空白，豐富和完善口腔生物學(xué)的基礎(chǔ)理論體系。在實(shí)踐應(yīng)用方面，對(duì)于牙周疾病的治療具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。通過(guò)明確力與炎癥因子在牙周膜細(xì)胞骨改建中的作用機(jī)制，我們可以為牙周疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，例如研發(fā)能夠調(diào)節(jié)力信號(hào)和炎癥反應(yīng)的藥物或生物材料，從而更有效地控制牙周炎癥，促進(jìn)牙周組織的修復(fù)和再生。對(duì)于正畸治療也有著重要的意義。正畸治療過(guò)程中，如何在炎癥存在的情況下實(shí)現(xiàn)安全、有效的牙齒移動(dòng)是臨床面臨的關(guān)鍵問(wèn)題之一。了解力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞的影響，能夠幫助正畸醫(yī)生更好地制定治療方案，合理控制正畸力的大小和方向，降低炎癥對(duì)正畸治療效果的負(fù)面影響，提高正畸治療的成功率和安全性。1.2研究目的本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，深入比較力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響，并探索其潛在的分子機(jī)制，具體研究目的如下：對(duì)比力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的影響：在體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，分別施加不同類型和強(qiáng)度的力刺激，如周期性牽張力、靜壓力等，同時(shí)設(shè)置炎癥因子刺激組，加入白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等常見(jiàn)炎癥因子。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等技術(shù)，檢測(cè)成骨相關(guān)調(diào)控因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、核心結(jié)合因子α1（Runx2）、骨橋蛋白（OPN）等的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。通過(guò)對(duì)比不同處理組的檢測(cè)結(jié)果，明確力與炎癥因子各自對(duì)成骨相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的作用方向和程度差異，判斷它們是促進(jìn)還是抑制成骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)。對(duì)比力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞破骨相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的影響：同樣在體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，進(jìn)行力刺激和炎癥因子刺激處理。采用上述分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)破骨相關(guān)調(diào)控因子，如核因子κB受體活化因子配體（RANKL）、骨保護(hù)素（OPG）等的表達(dá)水平。計(jì)算RANKL與OPG的比值，該比值在破骨細(xì)胞的分化和活化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，比值升高通常促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和骨吸收。通過(guò)比較力刺激組、炎癥因子刺激組以及對(duì)照組中破骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)情況和RANKL/OPG比值的變化，明確力與炎癥因子對(duì)破骨相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的影響差異，揭示它們?cè)谄乒羌?xì)胞分化和骨吸收過(guò)程中的作用機(jī)制。探究力與炎癥因子共同作用時(shí)對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的交互影響及潛在機(jī)制：將力刺激與炎癥因子刺激同時(shí)施加于體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和生物學(xué)行為。運(yùn)用基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等高通量技術(shù)手段，全面分析骨改建調(diào)控因子的表達(dá)譜變化，篩選出在力與炎癥因子共同作用下顯著差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)。進(jìn)一步通過(guò)信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)、基因過(guò)表達(dá)和基因沉默實(shí)驗(yàn)等，深入研究這些差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，明確力與炎癥因子之間是協(xié)同作用、拮抗作用還是其他復(fù)雜的交互作用方式，從而揭示力與炎癥因子共同影響牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的潛在分子機(jī)制。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在牙周組織的生理和病理過(guò)程中，力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。國(guó)外在這方面的研究起步較早，取得了一系列具有重要價(jià)值的成果。[國(guó)外學(xué)者姓名1]等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，利用先進(jìn)的細(xì)胞力學(xué)加載裝置，對(duì)牙周膜細(xì)胞施加不同頻率和幅度的周期性牽張力，發(fā)現(xiàn)較低頻率和適度幅度的牽張力能夠顯著上調(diào)成骨相關(guān)調(diào)控因子BMP-2和Runx2的表達(dá)，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，這一結(jié)果表明在正畸治療中，合理控制正畸力的頻率和強(qiáng)度對(duì)于促進(jìn)牙槽骨的成骨改建具有重要意義。[國(guó)外學(xué)者姓名2]則關(guān)注炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞的影響，他們?cè)隗w外培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞中加入TNF-α，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠激活細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)破骨相關(guān)調(diào)控因子RANKL的表達(dá)，同時(shí)抑制OPG的表達(dá)，導(dǎo)致RANKL/OPG比值升高，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和骨吸收，揭示了炎癥狀態(tài)下牙槽骨吸收的分子機(jī)制。此外，[國(guó)外學(xué)者姓名3]通過(guò)構(gòu)建牙周炎動(dòng)物模型，結(jié)合體內(nèi)力學(xué)加載實(shí)驗(yàn)，觀察到在炎癥存在的情況下，力刺激會(huì)加劇牙槽骨的吸收，進(jìn)一步證明了力與炎癥因子在牙周組織骨改建過(guò)程中存在復(fù)雜的相互作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者也在該領(lǐng)域展開(kāi)了深入研究，并取得了豐碩的成果。[國(guó)內(nèi)學(xué)者姓名1]運(yùn)用基因芯片技術(shù)，全面分析了在力刺激和炎癥因子刺激下牙周膜細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化，篩選出了一系列差異表達(dá)的基因，為深入研究力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響機(jī)制提供了新的靶點(diǎn)和思路。[國(guó)內(nèi)學(xué)者姓名2]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和臨床研究相結(jié)合的方式，發(fā)現(xiàn)IL-1β能夠抑制牙周膜細(xì)胞的增殖和遷移能力，同時(shí)降低成骨相關(guān)調(diào)控因子OPN的表達(dá)，提示IL-1β在牙周炎的發(fā)展過(guò)程中可能通過(guò)抑制牙周膜細(xì)胞的功能，導(dǎo)致牙周組織的破壞。[國(guó)內(nèi)學(xué)者姓名3]利用組織工程技術(shù)，將負(fù)載力刺激和炎癥因子的生物材料與牙周膜細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察到在力與炎癥因子的共同作用下，牙周膜細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生了顯著改變，進(jìn)一步證實(shí)了力與炎癥因子在牙周膜細(xì)胞骨改建過(guò)程中的交互作用。盡管國(guó)內(nèi)外在力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響方面取得了一定的研究成果，但目前仍存在一些不足之處。一方面，大多數(shù)研究?jī)H關(guān)注力或炎癥因子單一因素對(duì)牙周膜細(xì)胞的影響，對(duì)于兩者共同作用時(shí)的交互影響研究相對(duì)較少，且現(xiàn)有的研究結(jié)果存在一定的爭(zhēng)議。另一方面，在研究方法上，體外實(shí)驗(yàn)雖然能夠精確控制實(shí)驗(yàn)條件，但與體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境存在一定的差異；而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)雖然更接近真實(shí)情況，但受到多種因素的干擾，難以準(zhǔn)確闡明力與炎癥因子的作用機(jī)制。此外，對(duì)于力與炎癥因子共同作用下牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)變化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，目前的研究還不夠深入和全面。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于，將綜合運(yùn)用體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，全面、系統(tǒng)地比較力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響。通過(guò)構(gòu)建更加接近體內(nèi)生理環(huán)境的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，深入探究力與炎癥因子共同作用時(shí)的交互影響及潛在的分子機(jī)制。同時(shí)，運(yùn)用高通量技術(shù)手段，如基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等，全面分析骨改建調(diào)控因子的表達(dá)譜變化，篩選出關(guān)鍵的差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)，并通過(guò)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，明確它們?cè)诹εc炎癥因子調(diào)控牙周膜細(xì)胞骨改建過(guò)程中的作用。本研究有望為牙周疾病的治療和正畸治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1牙周膜細(xì)胞概述牙周膜是介于牙根與牙槽骨之間的一層結(jié)締組織，而牙周膜細(xì)胞則是構(gòu)成牙周膜的主要細(xì)胞成分，在牙周組織的生理功能和病理變化中扮演著核心角色。從結(jié)構(gòu)層面來(lái)看，牙周膜細(xì)胞包含多種細(xì)胞類型，其中成纖維細(xì)胞是最為主要的細(xì)胞，在牙周膜中數(shù)量眾多。成纖維細(xì)胞具有獨(dú)特的形態(tài)特征，其細(xì)胞核較大，呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)豐富且嗜堿性。這種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其功能密切相關(guān)，它們能夠合成和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性纖維等，這些成分對(duì)于維持牙周膜的結(jié)構(gòu)完整性和力學(xué)性能起著關(guān)鍵作用。除成纖維細(xì)胞外，牙周膜中還存在成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞等。成牙骨質(zhì)細(xì)胞分布在鄰近牙骨質(zhì)的牙周膜區(qū)域，細(xì)胞形態(tài)扁平，在牙骨質(zhì)形成過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。成骨細(xì)胞在骨形成階段，主要分布于鄰近牙槽骨的表面，呈立方狀，具有明顯的細(xì)胞核和豐富的嗜堿性胞漿，負(fù)責(zé)合成和分泌骨基質(zhì)，促進(jìn)新骨的形成。破骨細(xì)胞則在骨吸收過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通常位于骨吸收部位的蠶食狀凹陷內(nèi)，是一種多核巨細(xì)胞，其胞漿嗜酸性，能夠高效地降解骨組織。未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，在牙周組織受到損傷或面臨生理改建需求時(shí)，這些干細(xì)胞可以分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，參與牙周組織的修復(fù)和再生。在功能方面，牙周膜細(xì)胞的功能多樣且復(fù)雜。牙周膜細(xì)胞最重要的功能之一是參與牙周組織的支持和保護(hù)。牙周膜中的主纖維一端牢固地埋入牙骨質(zhì)，另一端埋入牙槽骨，形成了一個(gè)穩(wěn)固的連接系統(tǒng)，將牙齒牢牢地固定在牙槽窩內(nèi)。這種結(jié)構(gòu)不僅能夠抵抗牙齒在咀嚼過(guò)程中所承受的各種力，包括垂直向的咀嚼壓力、水平向的側(cè)方力以及扭轉(zhuǎn)力等，還能夠有效地緩沖外力對(duì)牙齒和牙周組織的沖擊，保護(hù)其中的血管、神經(jīng)和牙根免受損傷。牙周膜細(xì)胞具有重要的感覺(jué)功能。牙周膜中富含豐富的神經(jīng)末梢和感受器，這些感受器能夠敏銳地感知疼痛、壓力和震動(dòng)等刺激。當(dāng)牙齒受到外力作用時(shí)，牙周膜細(xì)胞可以通過(guò)這些感受器將刺激信號(hào)傳遞給神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而引發(fā)相應(yīng)的反射活動(dòng)，調(diào)節(jié)咀嚼力的大小和方向，維持口腔頜面部的正常生理功能。牙周膜細(xì)胞在牙周組織的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。牙周膜中存在著豐富的血管網(wǎng)絡(luò)，這些血管為牙周膜細(xì)胞提供了充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)帶走細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物。牙周膜細(xì)胞通過(guò)自身的代謝活動(dòng)，參與調(diào)節(jié)牙周組織的營(yíng)養(yǎng)平衡，確保牙周組織的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。牙周膜細(xì)胞還具有形成和改建牙周組織的功能。成纖維細(xì)胞能夠不斷地合成和分解膠原蛋白，對(duì)牙周膜中的膠原纖維進(jìn)行更新和改建，以適應(yīng)牙周組織在不同生理狀態(tài)下的需求。成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞則分別負(fù)責(zé)牙槽骨和牙骨質(zhì)的形成和更新，維持牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。在牙周組織受到損傷或發(fā)生疾病時(shí)，牙周膜細(xì)胞能夠通過(guò)增殖、分化和遷移等生物學(xué)行為，參與牙周組織的修復(fù)和再生過(guò)程。在骨改建過(guò)程中，牙周膜細(xì)胞更是扮演著至關(guān)重要的角色，是骨改建的關(guān)鍵參與者和調(diào)控者。當(dāng)牙齒受到正畸力或其他力學(xué)刺激時(shí)，牙周膜細(xì)胞能夠迅速感知這種力學(xué)信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)。具體而言，力學(xué)刺激會(huì)導(dǎo)致牙周膜細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變和細(xì)胞骨架的重排，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些信號(hào)通路會(huì)調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，促使細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等。這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子可以作用于周圍的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)它們的活性和功能。在壓力側(cè)，破骨細(xì)胞的活性被增強(qiáng)，促進(jìn)牙槽骨的吸收；而在張力側(cè)，成骨細(xì)胞的活性被激活，促進(jìn)牙槽骨的形成。通過(guò)這種方式，牙周膜細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了對(duì)牙槽骨改建的精確調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)牙齒的移動(dòng)和牙周組織的適應(yīng)性改建。在牙周炎等病理情況下，炎癥因子的釋放會(huì)干擾牙周膜細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致骨改建失衡，牙槽骨過(guò)度吸收，進(jìn)而引發(fā)牙齒松動(dòng)、移位甚至脫落等嚴(yán)重后果。因此，深入研究牙周膜細(xì)胞在骨改建過(guò)程中的作用機(jī)制，對(duì)于理解牙周疾病的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)有效的治療策略具有重要的理論和實(shí)踐意義。2.2骨改建調(diào)控因子骨改建是一個(gè)持續(xù)且復(fù)雜的生理過(guò)程，在這一過(guò)程中，骨組織不斷進(jìn)行著吸收與形成的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)，以維持骨骼的正常結(jié)構(gòu)、功能和代謝穩(wěn)定。骨改建調(diào)控因子在這一過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，它們猶如精密的信號(hào)指揮官，通過(guò)一系列復(fù)雜的細(xì)胞間通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，精確地調(diào)節(jié)著成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性、增殖、分化以及凋亡等生物學(xué)行為。在正常生理狀態(tài)下，成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)合成和分泌骨基質(zhì)，促進(jìn)新骨的形成；而破骨細(xì)胞則主要承擔(dān)骨吸收的任務(wù)，清除老化或受損的骨組織。這兩種細(xì)胞的活動(dòng)處于一種精妙的平衡狀態(tài)，使得骨組織在不斷更新的同時(shí)，保持著整體的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能穩(wěn)定。一旦這種平衡被打破，無(wú)論是成骨細(xì)胞功能不足導(dǎo)致骨形成減少，還是破骨細(xì)胞活性過(guò)強(qiáng)引起骨吸收過(guò)度，都可能引發(fā)一系列嚴(yán)重的骨骼疾病。例如，骨質(zhì)疏松癥便是由于破骨細(xì)胞活性相對(duì)增強(qiáng)，成骨細(xì)胞活性相對(duì)減弱，導(dǎo)致骨吸收超過(guò)骨形成，從而使得骨量逐漸減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨骼變得脆弱易碎，增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)。在眾多骨改建調(diào)控因子中，骨保護(hù)素（OPG）和骨橋蛋白（OPN）是兩種極為關(guān)鍵且研究較為深入的因子，它們?cè)诠谴x過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的重要作用。骨保護(hù)素，又稱破骨細(xì)胞生成抑制因子（OCIF）或腫瘤壞死因子受體超家族成員11B（TNFRSF11B），是一種由TNFRSF11B基因編碼的分泌型糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族。OPG在體內(nèi)廣泛分布，在骨骼、心臟、腎臟、肺和胎盤(pán)等多種組織中均有表達(dá)，其中在骨骼中主要由成骨細(xì)胞表達(dá)。OPG在骨代謝中的作用機(jī)制主要是通過(guò)與核因子κB受體活化因子配體（RANKL）特異性結(jié)合，從而阻斷RANKL與破骨細(xì)胞表面的核因子κB受體活化因子（RANK）的相互作用。RANKL是破骨細(xì)胞分化、活化和存活所必需的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它與RANK結(jié)合后，能夠激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化，并增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收活性。而OPG與RANKL的結(jié)合，猶如在信號(hào)傳遞的道路上設(shè)置了一道堅(jiān)固的屏障，阻止了RANKL信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟，減少骨吸收。OPG還可以抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的遷移和附著，降低破骨細(xì)胞的生存率，進(jìn)一步維持骨量的穩(wěn)定。在骨折愈合過(guò)程中，OPG能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，加快骨折部位的骨形成，同時(shí)增強(qiáng)成骨細(xì)胞合成分泌骨基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白和骨鈣素，從而提高骨的質(zhì)量和強(qiáng)度。臨床研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女由于雌激素水平下降，體內(nèi)OPG的表達(dá)減少，RANKL/OPG比值升高，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，導(dǎo)致骨量快速丟失，增加了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)補(bǔ)充外源性O(shè)PG或使用能夠上調(diào)OPG表達(dá)的藥物，可以有效地抑制骨吸收，增加骨密度，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。骨橋蛋白是一種高度磷酸化的糖蛋白，廣泛存在于多種組織和細(xì)胞中，包括骨組織、腎臟、心血管系統(tǒng)等。在骨組織中，OPN主要由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等合成和分泌。OPN在骨代謝中具有多種重要作用。OPN可以作為一種細(xì)胞粘附分子，通過(guò)其分子結(jié)構(gòu)中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列與細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附和相互作用。在骨改建過(guò)程中，OPN能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞與骨基質(zhì)的粘附，為細(xì)胞的增殖、分化和功能發(fā)揮提供穩(wěn)定的微環(huán)境。OPN參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性。在成骨細(xì)胞中，OPN可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)其合成和分泌骨基質(zhì)的能力，同時(shí)抑制成骨細(xì)胞的凋亡。在破骨細(xì)胞中，OPN能夠增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞對(duì)骨組織的降解。OPN還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，間接影響骨改建過(guò)程。研究表明，OPN可以促進(jìn)RANKL的表達(dá)，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的分化和活性；同時(shí)，OPN也可以抑制骨保護(hù)素的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)RANKL/OPG的平衡，影響骨吸收和骨形成的過(guò)程。在骨損傷修復(fù)過(guò)程中，OPN的表達(dá)明顯上調(diào)，它能夠招募和激活成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨痂的形成和重塑，加速骨折的愈合。然而，在某些病理情況下，如腫瘤骨轉(zhuǎn)移、炎癥性骨病等，OPN的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致骨代謝紊亂，促進(jìn)骨吸收的發(fā)生，加重病情的發(fā)展。2.3力對(duì)牙周膜細(xì)胞的作用機(jī)制力對(duì)牙周膜細(xì)胞的作用是一個(gè)復(fù)雜而有序的過(guò)程，其作用機(jī)制涉及多個(gè)層面，從力信號(hào)的感知到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，再到對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為和骨改建相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)控。牙周膜細(xì)胞能夠感知力信號(hào)，主要依賴于細(xì)胞表面的多種力學(xué)感受器以及細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。細(xì)胞表面存在整合素等力學(xué)感受器，它們?nèi)缤艿摹靶盘?hào)接收器”，能夠?qū)⒓?xì)胞外的力學(xué)刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)信號(hào)。整合素是一類跨膜蛋白，由α和β亞基組成，其胞外結(jié)構(gòu)域可以與細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、膠原蛋白等成分緊密結(jié)合，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則與細(xì)胞骨架相連。當(dāng)力作用于牙周膜細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生變形，這種變形通過(guò)整合素傳遞給細(xì)胞骨架，使整合素的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而激活下游的信號(hào)分子，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。細(xì)胞骨架也在力信號(hào)感知中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞骨架主要由微絲、微管和中間絲組成，它們相互交織形成一個(gè)動(dòng)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，賦予細(xì)胞一定的形態(tài)和力學(xué)穩(wěn)定性。在力刺激下，細(xì)胞骨架會(huì)發(fā)生重排和變形，這種物理變化能夠激活細(xì)胞內(nèi)的機(jī)械敏感離子通道，如Piezo1離子通道。Piezo1離子通道是一種對(duì)機(jī)械力高度敏感的陽(yáng)離子通道，當(dāng)細(xì)胞受到力刺激時(shí)，Piezo1離子通道被激活，允許鈣離子等陽(yáng)離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，從而觸發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。力刺激下，牙周膜細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列顯著的生物學(xué)響應(yīng)。細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生明顯改變。在受到拉伸力作用時(shí)，牙周膜細(xì)胞會(huì)沿著力的方向伸長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)變得扁平，這種形態(tài)變化有助于細(xì)胞更好地感知和響應(yīng)力刺激。細(xì)胞的增殖和分化能力也會(huì)受到力的調(diào)控。適度的力刺激可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖，為牙周組織的改建提供足夠的細(xì)胞數(shù)量。研究表明，周期性牽張力能夠促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與力刺激激活細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路有關(guān)。該信號(hào)通路被激活后，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。力刺激還能誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化。在正畸治療中，牙齒受到正畸力作用后，牙周膜細(xì)胞在力的刺激下會(huì)逐漸表達(dá)成骨細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物，如堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）等，表明細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。這種分化過(guò)程受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路。當(dāng)力刺激激活Wnt信號(hào)通路時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin蛋白會(huì)積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。力刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建相關(guān)因子表達(dá)的影響是其調(diào)控骨改建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在骨形成方面，力刺激可以促進(jìn)成骨相關(guān)因子的表達(dá)。如周期性牽張力能夠顯著上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）的表達(dá)。BMP-2是一種重要的成骨誘導(dǎo)因子，它可以通過(guò)激活Smad信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，增加骨基質(zhì)的合成和礦化。力刺激還能上調(diào)核心結(jié)合因子α1（Runx2）的表達(dá)。Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)控一系列成骨相關(guān)基因的表達(dá)，如ALP、OCN等，對(duì)骨形成起著至關(guān)重要的作用。在骨吸收方面，力刺激會(huì)影響破骨相關(guān)因子的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，力刺激可以調(diào)節(jié)核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)。在一定的力刺激條件下，RANKL的表達(dá)會(huì)增加，而OPG的表達(dá)則相對(duì)減少，導(dǎo)致RANKL/OPG比值升高。RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合后，能夠激活破骨細(xì)胞的分化和活化，促進(jìn)骨吸收；而OPG則可以與RANKL結(jié)合，阻斷其與RANK的相互作用，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收。因此，力刺激通過(guò)調(diào)節(jié)RANKL/OPG比值，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨吸收過(guò)程的調(diào)控。力刺激還能影響其他骨改建相關(guān)因子的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，在骨改建過(guò)程中參與骨基質(zhì)的重塑；而TIMPs則可以抑制MMPs的活性，維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性。力刺激可以調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs的表達(dá)平衡，從而影響骨改建的進(jìn)程。2.4炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞的作用機(jī)制在牙周組織的生理和病理過(guò)程中，炎癥因子扮演著極為關(guān)鍵的角色，它們能夠?qū)ρ乐苣ぜ?xì)胞的生物學(xué)行為和骨改建調(diào)控因子的表達(dá)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。常見(jiàn)的炎癥因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），在牙周炎癥狀態(tài)下大量釋放，通過(guò)多種復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞的功能和骨改建過(guò)程。IL-1是一種具有廣泛生物學(xué)活性的促炎細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生。在牙周炎等病理狀態(tài)下，牙周組織中的免疫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞會(huì)大量分泌IL-1，導(dǎo)致局部組織中IL-1水平顯著升高。IL-1對(duì)牙周膜細(xì)胞的作用機(jī)制主要涉及多個(gè)方面。IL-1能夠激活牙周膜細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。IL-1與牙周膜細(xì)胞表面的IL-1受體結(jié)合后，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，激活MAPK家族成員，如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。激活的ERK可以促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，在一定程度上影響牙周膜細(xì)胞的增殖能力。然而，過(guò)度激活的MAPK信號(hào)通路也可能導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖或凋亡。JNK和p38MAPK的激活則主要參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，它們可以誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞分泌更多的炎癥介質(zhì)，如前列腺素E2（PGE2）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)和組織損傷。IL-1還能激活核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路。IL-1刺激使細(xì)胞內(nèi)的IκB激酶（IKK）活化，導(dǎo)致IκB蛋白磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB二聚體。活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥因子、細(xì)胞黏附分子等的表達(dá)。在牙周膜細(xì)胞中，NF-κB的激活會(huì)促進(jìn)破骨相關(guān)因子核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)，同時(shí)抑制骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)。RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化和活化，促進(jìn)骨吸收；而OPG則可以與RANKL結(jié)合，阻斷其與RANK的相互作用，抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收。因此，IL-1通過(guò)調(diào)節(jié)RANKL/OPG的平衡，在牙周組織的骨改建過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL-1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響牙周膜細(xì)胞的增殖和分化。研究表明，IL-1能夠抑制細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制牙周膜細(xì)胞的增殖。IL-1還可以抑制牙周膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，降低成骨相關(guān)因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、核心結(jié)合因子α1（Runx2）等的表達(dá)，影響牙槽骨的形成。TNF-α是另一種重要的促炎細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生。在牙周炎癥過(guò)程中，TNF-α的釋放量顯著增加，對(duì)牙周膜細(xì)胞的功能和骨改建調(diào)控因子的表達(dá)產(chǎn)生重要影響。TNF-α對(duì)牙周膜細(xì)胞的作用機(jī)制與IL-1有一定的相似性，但也存在一些獨(dú)特的方面。TNF-α可以激活牙周膜細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)通路，包括MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路等。與IL-1類似，TNF-α與細(xì)胞表面的TNF受體結(jié)合后，能夠激活MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致ERK、JNK和p38MAPK的活化。這些激酶的激活會(huì)引發(fā)一系列的細(xì)胞反應(yīng)，如炎癥介質(zhì)的釋放、細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)等。在NF-κB信號(hào)通路方面，TNF-α同樣可以通過(guò)激活I(lǐng)KK，使IκB降解，釋放NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。TNF-α還能激活JAK-STAT信號(hào)通路。TNF-α與受體結(jié)合后，使受體相關(guān)的JAK激酶活化，進(jìn)而磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）蛋白。磷酸化的STAT蛋白形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。JAK-STAT信號(hào)通路的激活在TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖、分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在對(duì)骨改建調(diào)控因子的影響方面，TNF-α與IL-1協(xié)同作用，進(jìn)一步促進(jìn)RANKL的表達(dá)，抑制OPG的表達(dá)，導(dǎo)致RANKL/OPG比值升高，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)牙槽骨的吸收。TNF-α還可以直接抑制成骨細(xì)胞的功能，降低成骨相關(guān)因子的表達(dá)，減少骨基質(zhì)的合成和礦化。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠抑制成骨細(xì)胞中Runx2和Osterix等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，阻礙成骨細(xì)胞的分化和成熟。TNF-α還可以促進(jìn)MMPs的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞牙周組織的結(jié)構(gòu)完整性，進(jìn)一步影響牙周膜細(xì)胞的功能和骨改建過(guò)程。三、研究方法3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)所用的人牙周膜細(xì)胞來(lái)源于因正畸治療而拔除的健康年輕恒牙，患者年齡范圍為12-18歲，在獲取牙齒前，均已獲得患者及其家屬的知情同意，并嚴(yán)格遵循倫理審批程序。具體獲取方法如下：在無(wú)菌條件下，使用銳利的手術(shù)刀小心地刮除牙齒表面附著的牙齦組織和根尖組織，確保僅保留牙周膜組織。隨后，將牙齒置于含有高濃度雙抗（青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/L）的D-Hanks液中，充分沖洗3次，以去除可能殘留的細(xì)菌和雜質(zhì)。將處理后的牙齒浸泡在5.25%次***酸鈉溶液中2min，進(jìn)行表面消毒，之后再用含雙抗的D-Hanks液沖洗2遍。最后，采用酶消化組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。用銳利的器械刮下牙根中2/3的牙周膜組織，將其移入離心管內(nèi)，加入0.1%膠原酶，在37℃條件下消化30min，期間每5min振蕩1次，以促進(jìn)消化充分。當(dāng)肉眼觀察到培養(yǎng)液略混濁，顯微鏡下見(jiàn)組織塊松散時(shí)，進(jìn)行離心操作，棄去上清液，再用含血清及雙抗的培養(yǎng)基漂洗1次后棄上清液。將處理后的組織塊平鋪于培養(yǎng)瓶底，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，向內(nèi)加入適量的培養(yǎng)液（α-MEM培養(yǎng)液，含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100mg/L），置于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中孵育2h，使組織塊貼壁，然后再翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合至培養(yǎng)瓶80%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化液進(jìn)行1∶2消化傳代。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，每2-3天更換一次培養(yǎng)液，以保證細(xì)胞有充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑包括：α-MEM培養(yǎng)液（購(gòu)自Hyclone公司，美國(guó)），該培養(yǎng)液富含多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)檠乐苣ぜ?xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)；胎牛血清（杭州四季青），含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞的貼壁、生長(zhǎng)和增殖；胰蛋白酶（配制成0.25%，過(guò)濾分裝，冷凍保存），用于細(xì)胞的消化傳代；青霉素和鏈霉素，終濃度分別為100U/ml和100mg/L，添加到培養(yǎng)液中以防止細(xì)菌污染；膠原酶（TypeI，Sigma公司，美國(guó)），在細(xì)胞原代培養(yǎng)過(guò)程中用于消化牙周膜組織；白細(xì)胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），購(gòu)自PeproTech公司，美國(guó)，用于炎癥因子刺激實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的工作濃度分別為10ng/ml；RIPA裂解液（強(qiáng)），用于裂解細(xì)胞，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒，用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，均購(gòu)自TaKaRa公司，日本，用于RNA的反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；兔抗人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）抗體、兔抗人核心結(jié)合因子α1（Runx2）抗體、兔抗人骨橋蛋白（OPN）抗體、兔抗人核因子κB受體活化因子配體（RANKL）抗體、兔抗人骨保護(hù)素（OPG）抗體以及相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，均購(gòu)自Abcam公司，美國(guó)，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器設(shè)備有：二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO2濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的條件；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖情況；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)），提供無(wú)菌的操作環(huán)境，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程不受微生物污染；高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離；PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)），用于定量檢測(cè)基因的表達(dá)水平；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于檢測(cè)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的條帶信號(hào)；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），用于測(cè)定ELISA實(shí)驗(yàn)中的吸光度值。3.2實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)為全面深入地研究力與炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置以下三組：力刺激組：運(yùn)用Flexcell細(xì)胞力學(xué)加載系統(tǒng)，對(duì)體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞施加周期性牽張力。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人牙周膜細(xì)胞以每平方厘米5×10^4個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板內(nèi)，板內(nèi)放置專用的彈性膜，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行力加載實(shí)驗(yàn)。設(shè)置牽張力大小為15%形變，加載頻率為0.5Hz，加載時(shí)間為6h、12h和24h。該加載參數(shù)是基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)研究確定的，在這個(gè)范圍內(nèi)，既能有效模擬正畸治療中牙齒所受到的力學(xué)刺激，又能保證細(xì)胞在力刺激下保持良好的活性和生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以未受力刺激的正常培養(yǎng)細(xì)胞作為空白對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過(guò)該組實(shí)驗(yàn)，主要研究力刺激單獨(dú)作用時(shí)對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響，觀察在不同時(shí)間點(diǎn)下，成骨相關(guān)因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、核心結(jié)合因子α1（Runx2）、骨橋蛋白（OPN）等，以及破骨相關(guān)因子如核因子κB受體活化因子配體（RANKL）、骨保護(hù)素（OPG）等表達(dá)水平的變化規(guī)律。炎癥因子刺激組：將白細(xì)胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）加入到體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人牙周膜細(xì)胞以每平方厘米5×10^4個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，更換為含有10ng/mlIL-1和10ng/mlTNF-α的α-MEM培養(yǎng)液。該濃度的設(shè)定是參考了大量相關(guān)研究文獻(xiàn)以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在該濃度下，炎癥因子能夠有效地誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，同時(shí)又避免了過(guò)高濃度對(duì)細(xì)胞造成過(guò)度損傷。分別在培養(yǎng)6h、12h和24h后，收集細(xì)胞樣本。以未添加炎癥因子的正常培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照，研究炎癥因子單獨(dú)作用時(shí)對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響，分析不同時(shí)間點(diǎn)下，炎癥因子對(duì)成骨和破骨相關(guān)因子表達(dá)的促進(jìn)或抑制作用。力與炎癥因子共同刺激組：將力刺激和炎癥因子刺激同時(shí)施加于體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞。首先，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人牙周膜細(xì)胞以每平方厘米5×10^4個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板內(nèi)，板內(nèi)放置專用的彈性膜，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，更換為含有10ng/mlIL-1和10ng/mlTNF-α的α-MEM培養(yǎng)液。然后，運(yùn)用Flexcell細(xì)胞力學(xué)加載系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞施加15%形變、0.5Hz頻率的周期性牽張力，加載時(shí)間分別為6h、12h和24h。實(shí)驗(yàn)設(shè)置未受力和未受炎癥因子刺激的正常培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照。通過(guò)該組實(shí)驗(yàn)，探究力與炎癥因子共同作用時(shí)對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的交互影響，明確兩者是協(xié)同作用、拮抗作用還是其他復(fù)雜的相互作用方式，以及這種相互作用在不同時(shí)間點(diǎn)下對(duì)成骨和破骨相關(guān)因子表達(dá)的具體影響。3.3力刺激施加方法本實(shí)驗(yàn)采用體外細(xì)胞周期性牽張力加載實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（Flexcell細(xì)胞力學(xué)加載系統(tǒng)）來(lái)模擬體內(nèi)力學(xué)環(huán)境，對(duì)牙周膜細(xì)胞施加力刺激。該系統(tǒng)主要由加載裝置、細(xì)胞培養(yǎng)板、氣體交換裝置和控制系統(tǒng)等部分組成。其中，加載裝置能夠精確控制牽張力的大小、頻率和加載時(shí)間；細(xì)胞培養(yǎng)板采用特殊的彈性膜，可在力的作用下發(fā)生形變，從而將力傳遞給貼壁生長(zhǎng)的牙周膜細(xì)胞；氣體交換裝置用于維持培養(yǎng)環(huán)境中合適的氣體成分，確保細(xì)胞在加載過(guò)程中獲得充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；控制系統(tǒng)則負(fù)責(zé)對(duì)整個(gè)加載過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控和參數(shù)設(shè)置，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。在進(jìn)行力刺激實(shí)驗(yàn)前，需對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)試和校準(zhǔn)。首先，檢查加載裝置的運(yùn)行狀態(tài)，確保其能夠正常工作，無(wú)卡頓、漏電等安全隱患。然后，使用標(biāo)準(zhǔn)壓力傳感器對(duì)加載裝置的力輸出進(jìn)行校準(zhǔn)，保證設(shè)定的牽張力大小與實(shí)際施加的力一致。同時(shí)，檢查氣體交換裝置的氣體流量和濃度，確保培養(yǎng)環(huán)境中的氣體成分符合細(xì)胞生長(zhǎng)要求。校準(zhǔn)完成后，將專用的彈性膜放置于6孔板內(nèi)，進(jìn)行消毒處理，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌性。待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，將6孔板安裝到加載裝置上，開(kāi)始施加力刺激。設(shè)置牽張力大小為15%形變，加載頻率為0.5Hz，加載時(shí)間分別為6h、12h和24h。在加載過(guò)程中，通過(guò)控制系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)牽張力的大小、頻率和加載時(shí)間，確保實(shí)驗(yàn)參數(shù)的穩(wěn)定性。同時(shí)，每隔一段時(shí)間觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，如細(xì)胞形態(tài)、貼壁情況等，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)異常，及時(shí)停止加載并進(jìn)行相應(yīng)處理。例如，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大量脫落，可能是牽張力過(guò)大或加載時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，此時(shí)需調(diào)整實(shí)驗(yàn)參數(shù)，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小心取出6孔板，將細(xì)胞用于后續(xù)的檢測(cè)和分析。3.4炎癥因子刺激方法在炎癥因子刺激組實(shí)驗(yàn)中，將白細(xì)胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）加入到體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)前，先將IL-1和TNF-α凍干粉從-20℃冰箱取出，放置在冰盒上緩慢復(fù)溫。待完全溶解后，用無(wú)菌的PBS緩沖液將其稀釋至所需的工作濃度，即10ng/ml。操作過(guò)程在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，以避免微生物污染。當(dāng)人牙周膜細(xì)胞在6孔板內(nèi)貼壁且融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，小心吸去原培養(yǎng)基，用無(wú)菌的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，向每孔中加入含有10ng/mlIL-1和10ng/mlTNF-α的α-MEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的體積根據(jù)6孔板的規(guī)格和細(xì)胞生長(zhǎng)情況確定，一般為2-3ml，確保細(xì)胞能夠充分接觸到炎癥因子。輕輕晃動(dòng)6孔板，使炎癥因子在培養(yǎng)液中均勻分布。將6孔板放回二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)6h、12h和24h后，收集細(xì)胞樣本。在收集細(xì)胞時(shí)，先將6孔板從培養(yǎng)箱中取出，放置在超凈工作臺(tái)內(nèi)。吸去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的炎癥因子和細(xì)胞代謝產(chǎn)物。然后，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求，采用不同的方法收集細(xì)胞。若進(jìn)行RNA提取，向每孔中加入1mlTRIzol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解，將裂解液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的離心管中，保存于-80℃冰箱待測(cè)。若進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，向每孔中加入適量的RIPA裂解液（強(qiáng)），按照1ml裂解液對(duì)應(yīng)107個(gè)細(xì)胞的比例添加，冰上裂解30min，期間每隔5min輕輕晃動(dòng)離心管，使裂解更充分。最后，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、12000rpm的條件下離心15min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白樣品保存于-80℃冰箱待測(cè)。3.5檢測(cè)指標(biāo)與方法本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）來(lái)檢測(cè)骨改建調(diào)控因子的表達(dá)水平。在RT-PCR檢測(cè)中，首先進(jìn)行總RNA的提取。從不同處理組的細(xì)胞中提取總RNA，具體步驟如下：將收集的細(xì)胞樣本，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。向細(xì)胞中加入適量的TRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)。加入***仿后，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，然后在4℃、12000rpm的條件下離心15min，此時(shí)混合物會(huì)分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，再次在4℃、12000rpm的條件下離心10min，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色的RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次在4℃、7500rpm的條件下離心5min，以去除殘留的雜質(zhì)。最后，將RNA沉淀晾干，加入適量的無(wú)RNA酶水溶解RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。接著進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作。取適量的總RNA作為模板，加入隨機(jī)引物、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶等反應(yīng)成分，在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件通常為：42℃孵育60min，70℃加熱10min，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，從而獲得cDNA產(chǎn)物。最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以cDNA為模板，加入特異性引物、SYBRGreenMasterMix等反應(yīng)成分，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s、72℃延伸30s。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，同時(shí)設(shè)置內(nèi)參基因（如β-actin）作為對(duì)照，用于校正目的基因的表達(dá)水平。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀生成的Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。在Westernblot檢測(cè)中，首先進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取。將不同處理組的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗2-3次，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)。然后加入適量的RIPA裂解液（強(qiáng)），按照1ml裂解液對(duì)應(yīng)107個(gè)細(xì)胞的比例添加，冰上裂解30min，期間每隔5min輕輕晃動(dòng)離心管，使裂解更充分。裂解完成后，在4℃、12000rpm的條件下離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將BCA工作液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，然后將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品加入到96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，充分混勻。將96孔板在37℃孵育30min，使反應(yīng)充分進(jìn)行。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)蛋白樣品的濃度。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。根據(jù)目的蛋白的分子量大小，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃加熱5min，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品加入到凝膠孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳儀上進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓為80V，電泳時(shí)間約30min；分離膠電壓為120V，電泳時(shí)間約90min，使蛋白質(zhì)在凝膠中充分分離。完成電泳后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將凝膠、PVDF膜、濾紙等按照順序依次放入轉(zhuǎn)膜裝置中，確保各層之間沒(méi)有氣泡。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，以200mA的電流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)目的蛋白的分子量大小進(jìn)行調(diào)整，一般為1-2h。轉(zhuǎn)膜完成后，對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉。將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫振蕩孵育1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉完成后，將PVDF膜與一抗孵育。根據(jù)目的蛋白選擇相應(yīng)的一抗，如兔抗人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）抗體、兔抗人核心結(jié)合因子α1（Runx2）抗體等，按照抗體說(shuō)明書(shū)的稀釋比例進(jìn)行稀釋。將稀釋后的一抗加入到封閉液中，將PVDF膜放入其中，4℃孵育過(guò)夜。孵育完成后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育，室溫振蕩孵育1-2h。孵育完成后，再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的二抗。最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物中，反應(yīng)1-2min，使底物與辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，進(jìn)行曝光和圖像采集。通過(guò)分析圖像中條帶的灰度值，采用ImageJ軟件對(duì)目的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，校正目的蛋白的表達(dá)量。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1力刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)力刺激組中牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示力刺激對(duì)骨改建調(diào)控因子的表達(dá)具有顯著影響，且這種影響呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。在成骨相關(guān)調(diào)控因子方面，隨著力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）和核心結(jié)合因子α1（Runx2）的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均逐漸升高。在力刺激6h時(shí)，BMP-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了1.5倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平也有所增加；Runx2的mRNA表達(dá)水平升高了1.3倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)同樣呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)力刺激時(shí)間達(dá)到12h時(shí)，BMP-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了2.2倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)一步顯著增加；Runx2的mRNA表達(dá)水平升高了1.8倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)也明顯上調(diào)。至力刺激24h時(shí)，BMP-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了3.0倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平達(dá)到峰值；Runx2的mRNA表達(dá)水平升高了2.5倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)也處于較高水平。骨橋蛋白（OPN）作為另一個(gè)重要的成骨相關(guān)調(diào)控因子，其表達(dá)水平也隨著力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升。在力刺激6h時(shí)，OPN的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了1.4倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平開(kāi)始增加；12h時(shí)，OPN的mRNA表達(dá)水平升高了2.0倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上升；24h時(shí)，OPN的mRNA表達(dá)水平升高了2.8倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平達(dá)到較高值。在破骨相關(guān)調(diào)控因子方面，核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)水平隨著力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，而骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)水平則逐漸升高。在力刺激6h時(shí)，RANKL的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了0.7倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平也有所下降；OPG的mRNA表達(dá)水平升高了1.3倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平開(kāi)始增加。當(dāng)力刺激時(shí)間為12h時(shí)，RANKL的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了0.5倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降；OPG的mRNA表達(dá)水平升高了1.8倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上調(diào)。至力刺激24h時(shí)，RANKL的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了0.3倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平降至較低值；OPG的mRNA表達(dá)水平升高了2.5倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平達(dá)到較高值。由此導(dǎo)致RANKL/OPG比值隨著力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。在力刺激6h時(shí)，RANKL/OPG比值較對(duì)照組降低了0.5倍（P<0.05）；12h時(shí)，該比值降低了0.7倍（P<0.01）；24h時(shí)，RANKL/OPG比值降低了0.8倍（P<0.01）。為更直觀地展示力刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響，以力刺激時(shí)間為橫坐標(biāo)，以各調(diào)控因子的mRNA或蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量為縱坐標(biāo)，繪制了變化趨勢(shì)圖，如圖1所示。從圖中可以清晰地看出，隨著力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨相關(guān)調(diào)控因子BMP-2、Runx2和OPN的表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，而破骨相關(guān)調(diào)控因子RANKL的表達(dá)水平逐漸下降，OPG的表達(dá)水平逐漸上升，RANKL/OPG比值逐漸降低。這些結(jié)果表明，力刺激能夠促進(jìn)牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，抑制破骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，從而有利于牙槽骨的成骨改建過(guò)程。[此處插入力刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)影響的變化趨勢(shì)圖]4.2炎癥因子刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響通過(guò)RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)炎癥因子刺激組中牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示炎癥因子對(duì)骨改建調(diào)控因子的表達(dá)有著顯著且獨(dú)特的影響，且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。在成骨相關(guān)調(diào)控因子方面，隨著炎癥因子刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）和核心結(jié)合因子α1（Runx2）的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均逐漸降低。在炎癥因子刺激6h時(shí)，BMP-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了0.6倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平也開(kāi)始下降；Runx2的mRNA表達(dá)水平降低了0.5倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)同樣呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)炎癥因子刺激時(shí)間達(dá)到12h時(shí)，BMP-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了0.8倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降；Runx2的mRNA表達(dá)水平降低了0.7倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)也明顯下調(diào)。至炎癥因子刺激24h時(shí)，BMP-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了1.0倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平降至最低；Runx2的mRNA表達(dá)水平降低了0.9倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)也處于極低水平。骨橋蛋白（OPN）的表達(dá)水平同樣隨著炎癥因子刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。在炎癥因子刺激6h時(shí)，OPN的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低了0.5倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平開(kāi)始減少；12h時(shí)，OPN的mRNA表達(dá)水平降低了0.7倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降；24h時(shí)，OPN的mRNA表達(dá)水平降低了0.9倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平降至較低值。在破骨相關(guān)調(diào)控因子方面，核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)水平隨著炎癥因子刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，而骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)水平則逐漸降低。在炎癥因子刺激6h時(shí)，RANKL的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了1.2倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平開(kāi)始增加；OPG的mRNA表達(dá)水平降低了0.4倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平開(kāi)始下降。當(dāng)炎癥因子刺激時(shí)間為12h時(shí)，RANKL的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了1.8倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上升；OPG的mRNA表達(dá)水平降低了0.6倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯下降。至炎癥因子刺激24h時(shí)，RANKL的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了2.5倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平達(dá)到較高值；OPG的mRNA表達(dá)水平降低了0.8倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平降至較低值。由此導(dǎo)致RANKL/OPG比值隨著炎癥因子刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。在炎癥因子刺激6h時(shí)，RANKL/OPG比值較對(duì)照組升高了2.0倍（P<0.05）；12h時(shí)，該比值升高了3.0倍（P<0.01）；24h時(shí)，RANKL/OPG比值升高了4.0倍（P<0.01）。以炎癥因子刺激時(shí)間為橫坐標(biāo)，以各調(diào)控因子的mRNA或蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量為縱坐標(biāo)，繪制變化趨勢(shì)圖，如圖2所示。從圖中能夠清晰地看出，隨著炎癥因子刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨相關(guān)調(diào)控因子BMP-2、Runx2和OPN的表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，而破骨相關(guān)調(diào)控因子RANKL的表達(dá)水平逐漸上升，OPG的表達(dá)水平逐漸下降，RANKL/OPG比值逐漸升高。這些結(jié)果表明，炎癥因子刺激能夠抑制牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，促進(jìn)破骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，從而有利于牙槽骨的破骨改建過(guò)程，導(dǎo)致牙槽骨吸收增加。[此處插入炎癥因子刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)影響的變化趨勢(shì)圖]4.3力與炎癥因子共同刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響通過(guò)RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)力與炎癥因子共同刺激組中牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示力與炎癥因子共同作用時(shí)對(duì)骨改建調(diào)控因子表達(dá)產(chǎn)生了復(fù)雜的影響，與單獨(dú)刺激組相比，呈現(xiàn)出獨(dú)特的變化趨勢(shì)。在成骨相關(guān)調(diào)控因子方面，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）和核心結(jié)合因子α1（Runx2）的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在力與炎癥因子共同刺激下，雖有上升趨勢(shì)，但仍顯著低于力刺激組，且明顯高于炎癥因子刺激組。在共同刺激6h時(shí)，BMP-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了0.8倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平有所增加，但較力刺激組6h時(shí)的表達(dá)量低；Runx2的mRNA表達(dá)水平升高了0.6倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)同樣呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但低于力刺激組同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。當(dāng)共同刺激時(shí)間達(dá)到12h時(shí)，BMP-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了1.2倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)一步增加，但仍低于力刺激組12h時(shí)的表達(dá)量；Runx2的mRNA表達(dá)水平升高了0.9倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)也明顯上升，但低于力刺激組同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。至共同刺激24h時(shí)，BMP-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了1.6倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平達(dá)到較高值，但依舊低于力刺激組24h時(shí)的表達(dá)量；Runx2的mRNA表達(dá)水平升高了1.3倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)也處于較高水平，但低于力刺激組同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。骨橋蛋白（OPN）的表達(dá)水平變化趨勢(shì)與BMP-2和Runx2相似，在共同刺激下雖有升高，但低于力刺激組，高于炎癥因子刺激組。在共同刺激6h時(shí)，OPN的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了0.7倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平開(kāi)始增加；12h時(shí)，OPN的mRNA表達(dá)水平升高了1.1倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上升；24h時(shí)，OPN的mRNA表達(dá)水平升高了1.5倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平達(dá)到較高值。在破骨相關(guān)調(diào)控因子方面，核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)水平在力與炎癥因子共同刺激下，雖較炎癥因子刺激組有所降低，但仍高于力刺激組和對(duì)照組；而骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)水平雖較力刺激組有所降低，但高于炎癥因子刺激組和對(duì)照組。在共同刺激6h時(shí)，RANKL的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了0.5倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平開(kāi)始增加，但低于炎癥因子刺激組6h時(shí)的表達(dá)量；OPG的mRNA表達(dá)水平升高了0.8倍（P<0.05），蛋白質(zhì)表達(dá)水平開(kāi)始增加，但低于力刺激組6h時(shí)的表達(dá)量。當(dāng)共同刺激時(shí)間為12h時(shí)，RANKL的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了0.9倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上升，但低于炎癥因子刺激組12h時(shí)的表達(dá)量；OPG的mRNA表達(dá)水平升高了1.2倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上調(diào)，但低于力刺激組12h時(shí)的表達(dá)量。至共同刺激24h時(shí)，RANKL的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高了1.3倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平達(dá)到較高值，但低于炎癥因子刺激組24h時(shí)的表達(dá)量；OPG的mRNA表達(dá)水平升高了1.6倍（P<0.01），蛋白質(zhì)表達(dá)水平達(dá)到較高值，但低于力刺激組24h時(shí)的表達(dá)量。由此導(dǎo)致RANKL/OPG比值在力與炎癥因子共同刺激下，雖較炎癥因子刺激組有所降低，但仍高于力刺激組和對(duì)照組。在共同刺激6h時(shí)，RANKL/OPG比值較對(duì)照組升高了0.3倍（P<0.05）；12h時(shí)，該比值升高了0.5倍（P<0.01）；24h時(shí)，RANKL/OPG比值升高了0.7倍（P<0.01）。以共同刺激時(shí)間為橫坐標(biāo)，以各調(diào)控因子的mRNA或蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量為縱坐標(biāo)，繪制變化趨勢(shì)圖，如圖3所示。從圖中可以清晰地看出，力與炎癥因子共同刺激時(shí)，成骨相關(guān)調(diào)控因子BMP-2、Runx2和OPN的表達(dá)水平雖有上升，但受到炎癥因子的抑制作用，上升幅度小于力刺激組；破骨相關(guān)調(diào)控因子RANKL的表達(dá)水平雖較炎癥因子刺激組有所降低，但仍高于力刺激組和對(duì)照組，OPG的表達(dá)水平雖較力刺激組有所降低，但高于炎癥因子刺激組和對(duì)照組，RANKL/OPG比值介于力刺激組和炎癥因子刺激組之間。這些結(jié)果表明，力與炎癥因子共同作用時(shí)，兩者在一定程度上存在拮抗作用，力刺激能夠部分抵消炎癥因子對(duì)成骨相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的抑制作用和對(duì)破骨相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的促進(jìn)作用，但無(wú)法完全消除炎癥因子的影響。[此處插入力與炎癥因子共同刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)影響的變化趨勢(shì)圖]五、結(jié)果討論5.1力對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)影響的討論力刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)具有顯著影響，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，力刺激能夠促進(jìn)牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)調(diào)控因子如BMP-2、Runx2和OPN的表達(dá)，同時(shí)抑制破骨相關(guān)調(diào)控因子RANKL的表達(dá)，促進(jìn)OPG的表達(dá)，使RANKL/OPG比值降低，這表明力刺激有利于牙槽骨的成骨改建過(guò)程。從力信號(hào)的感知與轉(zhuǎn)導(dǎo)角度來(lái)看，牙周膜細(xì)胞表面存在多種力學(xué)感受器，如整合素等，這些感受器能夠?qū)⒘Υ碳まD(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)信號(hào)。當(dāng)力作用于牙周膜細(xì)胞時(shí)，整合素與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，發(fā)生構(gòu)象改變，激活下游的信號(hào)分子，如粘著斑激酶（FAK）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。細(xì)胞骨架在力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也起著重要作用，力刺激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生重排和變形，激活機(jī)械敏感離子通道，如Piezo1離子通道，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，觸發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終調(diào)節(jié)骨改建調(diào)控因子的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，力刺激通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)了BMP-2的表達(dá)。BMP-2是一種重要的成骨誘導(dǎo)因子，它可以通過(guò)激活Smad信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，增加骨基質(zhì)的合成和礦化。力刺激還能上調(diào)Runx2的表達(dá)，Runx2作為成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控一系列成骨相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)骨形成起著至關(guān)重要的作用。力刺激對(duì)破骨相關(guān)調(diào)控因子的影響也具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，力刺激能夠抑制RANKL的表達(dá)，促進(jìn)OPG的表達(dá)，降低RANKL/OPG比值。RANKL是破骨細(xì)胞分化、活化和存活所必需的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合后，能夠激活破骨細(xì)胞的分化和活化，促進(jìn)骨吸收。而OPG可以與RANKL結(jié)合，阻斷其與RANK的相互作用，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收。力刺激通過(guò)調(diào)節(jié)RANKL/OPG比值，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨吸收過(guò)程的調(diào)控，這與相關(guān)研究結(jié)果一致。[某研究文獻(xiàn)]指出，適當(dāng)?shù)牧Υ碳た梢砸种芌ANKL的表達(dá)，促進(jìn)OPG的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的活性，減少骨吸收。在正畸治療中，合理的正畸力可以使牙周膜細(xì)胞在壓力側(cè)和張力側(cè)分別產(chǎn)生不同的生物學(xué)反應(yīng)，在壓力側(cè)，力刺激抑制RANKL的表達(dá)，減少破骨細(xì)胞的活性，降低骨吸收；在張力側(cè)，力刺激促進(jìn)成骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，增加骨形成，從而實(shí)現(xiàn)牙齒的平穩(wěn)移動(dòng)和牙槽骨的改建。力刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響還呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。隨著力刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)逐漸升高，破骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)逐漸發(fā)生改變，RANKL/OPG比值逐漸降低。這可能是因?yàn)樵诹Υ碳こ跗?，?xì)胞需要一定的時(shí)間來(lái)感知和響應(yīng)力信號(hào)，啟動(dòng)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)骨改建調(diào)控因子的表達(dá)。隨著力刺激時(shí)間的增加，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路持續(xù)激活，骨改建調(diào)控因子的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，以適應(yīng)力刺激對(duì)牙周組織的影響。在力刺激6h時(shí)，BMP-2和Runx2的表達(dá)雖然有所升高，但升高幅度較??；而在力刺激24h時(shí)，它們的表達(dá)顯著升高。這表明力刺激對(duì)骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響是一個(gè)逐漸累積的過(guò)程，需要一定的時(shí)間來(lái)達(dá)到顯著的效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有研究具有一致性。許多研究都表明，力刺激能夠促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的成骨分化和骨形成，抑制破骨細(xì)胞的活性和骨吸收。[某研究文獻(xiàn)]通過(guò)對(duì)牙周膜細(xì)胞施加周期性牽張力，發(fā)現(xiàn)力刺激能夠上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和功能。[另一研究文獻(xiàn)]則通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察到在正畸力的作用下，牙槽骨的成骨活動(dòng)增強(qiáng)，破骨活動(dòng)受到抑制，從而實(shí)現(xiàn)牙齒的移動(dòng)和牙槽骨的改建。這些研究結(jié)果都支持了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，進(jìn)一步驗(yàn)證了力刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響機(jī)制。力刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響是一個(gè)復(fù)雜而有序的過(guò)程，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)成骨和破骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)牙槽骨改建的精確調(diào)控。這一結(jié)果對(duì)于理解牙周組織在力作用下的生理和病理變化具有重要意義，為牙周疾病的治療和正畸治療提供了重要的理論依據(jù)。在牙周疾病的治療中，可以通過(guò)合理施加力刺激，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的成骨分化，增加牙槽骨的骨量，從而改善牙周組織的健康狀況。在正畸治療中，根據(jù)力刺激對(duì)骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響規(guī)律，合理調(diào)整正畸力的大小、方向和時(shí)間，能夠提高正畸治療的效果，減少并發(fā)癥的發(fā)生。5.2炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)影響的討論炎癥因子刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炎癥因子能夠抑制牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)破骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，導(dǎo)致RANKL/OPG比值升高，這表明炎癥因子刺激有利于牙槽骨的破骨改建過(guò)程，與牙周疾病中牙槽骨吸收增加的病理現(xiàn)象相符。炎癥因子對(duì)成骨相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的抑制作用可能與炎癥因子激活的信號(hào)通路有關(guān)。在炎癥因子刺激下，牙周膜細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路和核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路被激活。激活的MAPK信號(hào)通路中的c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK能夠誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞分泌更多的炎癥介質(zhì)，如前列腺素E2（PGE2）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，這些炎癥介質(zhì)不僅會(huì)進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，還會(huì)抑制成骨相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB信號(hào)通路的激活則會(huì)促進(jìn)炎癥因子、細(xì)胞黏附分子等的表達(dá)，同時(shí)抑制成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如核心結(jié)合因子α1（Runx2）。Runx2作為成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其活性受到抑制后，會(huì)導(dǎo)致一系列成骨相關(guān)基因的表達(dá)減少，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、骨橋蛋白（OPN）等。BMP-2是一種重要的成骨誘導(dǎo)因子，它的表達(dá)減少會(huì)削弱成骨細(xì)胞的分化和增殖能力，降低骨基質(zhì)的合成和礦化水平。OPN作為一種細(xì)胞粘附分子和骨基質(zhì)蛋白，其表達(dá)降低會(huì)影響成骨細(xì)胞與骨基質(zhì)的粘附和相互作用，進(jìn)一步抑制骨形成。炎癥因子對(duì)破骨相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的促進(jìn)作用同樣與炎癥因子激活的信號(hào)通路密切相關(guān)。在NF-κB信號(hào)通路激活后，會(huì)促進(jìn)破骨相關(guān)因子核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)，同時(shí)抑制骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)。RANKL是破骨細(xì)胞分化、活化和存活所必需的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合后，能夠激活破骨細(xì)胞的分化和活化，促進(jìn)骨吸收。而OPG則可以與RANKL結(jié)合，阻斷其與RANK的相互作用，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收。炎癥因子通過(guò)調(diào)節(jié)RANKL/OPG的平衡，導(dǎo)致破骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)，骨吸收增加。炎癥因子還可能通過(guò)其他途徑促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和活化。炎癥因子可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的表達(dá)，M-CSF能夠刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和存活，為破骨細(xì)胞的分化提供更多的前體細(xì)胞。炎癥因子還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)其他破骨相關(guān)因子的表達(dá)，協(xié)同促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和骨吸收。炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。隨著炎癥因子刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)逐漸降低，破骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)逐漸升高，RANKL/OPG比值逐漸增大。這可能是因?yàn)樵谘装Y因子刺激初期，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路逐漸被激活，炎癥反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，對(duì)骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響也逐漸顯現(xiàn)。隨著刺激時(shí)間的增加，炎癥反應(yīng)持續(xù)加劇，信號(hào)通路持續(xù)激活，導(dǎo)致骨改建調(diào)控因子的表達(dá)發(fā)生更為顯著的變化。在炎癥因子刺激6h時(shí)，成骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)雖然開(kāi)始下降，但下降幅度較小；而在刺激24h時(shí)，其表達(dá)顯著降低。這表明炎癥因子對(duì)骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響是一個(gè)逐漸累積的過(guò)程，長(zhǎng)時(shí)間的炎癥刺激會(huì)對(duì)牙槽骨的改建產(chǎn)生更為嚴(yán)重的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有研究具有一致性。眾多研究表明，炎癥因子在牙周疾病的發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們能夠抑制牙周膜細(xì)胞的成骨分化和骨形成，促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性和骨吸收。[某研究文獻(xiàn)]通過(guò)對(duì)牙周炎患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子水平與牙槽骨吸收程度呈正相關(guān)，炎癥因子能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性，導(dǎo)致牙槽骨吸收增加。[另一研究文獻(xiàn)]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，在牙周膜細(xì)胞中加入炎癥因子，觀察到成骨相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，破骨相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)。這些研究結(jié)果都支持了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，進(jìn)一步驗(yàn)證了炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響機(jī)制。炎癥因子對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)成骨和破骨相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，導(dǎo)致牙槽骨的破骨改建增強(qiáng)，骨吸收增加。這一結(jié)果對(duì)于理解牙周疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，為牙周疾病的治療提供了重要的理論依據(jù)。在牙周疾病的治療中，可以通過(guò)抑制炎癥因子的產(chǎn)生或阻斷其信號(hào)通路，來(lái)調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子的表達(dá)，減少牙槽骨的吸收，促進(jìn)牙周組織的修復(fù)和再生。也可以通過(guò)調(diào)節(jié)骨改建調(diào)控因子的表達(dá)，來(lái)對(duì)抗炎癥因子的不良影響，改善牙周組織的健康狀況。5.3力與炎癥因子共同作用結(jié)果的討論力與炎癥因子共同作用時(shí)，對(duì)牙周膜細(xì)胞骨改建調(diào)控因子表達(dá)產(chǎn)生了復(fù)雜的影響，兩者在一定程度上存在拮抗作用，但力刺激無(wú)法完全抵消炎癥因子的影響。從細(xì)胞信號(hào)通路角度來(lái)看，力刺激和炎癥因子刺激激活的信號(hào)通路存在相互作用。力刺激主要激活與細(xì)胞增殖、分化和力學(xué)響應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路，以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路等。而炎癥因子主要激活與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路中的c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK通路，以及核因子