RNAi技術(shù)介導(dǎo)Del1基因沉默對結(jié)腸癌生長影響的實驗探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為一種常見的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)都有著較高的發(fā)病率和死亡率。據(jù)世界流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌在北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等地的發(fā)病率最高，居內(nèi)臟腫瘤的前兩位。近年來，隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康。目前，結(jié)腸癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療等，但對于晚期結(jié)腸癌患者，這些治療方法的效果往往不盡人意，患者的5年存活率較低。因此，深入研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點和方法，具有重要的臨床意義。Del1（Developmentalendotheliallocus-1）基因是一種具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移能力的基因，它在多種腫瘤中的表達(dá)均有顯著上調(diào)。已有研究表明，抑制Del1基因表達(dá)可以有效抑制細(xì)胞增殖和遷移，并影響血管新生，這提示Del1可能參與了結(jié)腸癌的生長和發(fā)展過程。然而，目前關(guān)于Del1基因在結(jié)腸癌中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚，仍需要進(jìn)一步的研究來深入探討。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種介導(dǎo)基因沉默的機(jī)制，可以通過去除mRNA分子來阻止指定基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)具有高效、特異、操作簡便等優(yōu)點，已成為生命科學(xué)研究中的一項重要技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因功能研究、疾病治療等領(lǐng)域。將RNAi技術(shù)應(yīng)用于抑制Del1基因表達(dá)，為研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新的思路和方法。本研究旨在通過RNAi技術(shù)抑制Del1基因表達(dá)，探究其對結(jié)腸癌生長的影響，以期為結(jié)腸癌的治療提供新的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。通過本研究，不僅可以深入了解Del1基因在結(jié)腸癌生長和發(fā)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供參考，還可以為開發(fā)新的結(jié)腸癌治療策略提供理論支持，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在結(jié)腸癌研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了大量探索。國外方面，美國癌癥協(xié)會（ACS）的研究數(shù)據(jù)持續(xù)更新結(jié)腸癌的發(fā)病趨勢、危險因素等內(nèi)容，為全球研究提供了重要參考。諸多頂尖科研團(tuán)隊聚焦于結(jié)腸癌的分子機(jī)制，在基因、信號通路等層面取得關(guān)鍵進(jìn)展。例如，揭示了Wnt/β-catenin信號通路在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的核心作用，發(fā)現(xiàn)該通路異常激活會促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。在治療手段上，國外積極探索新的治療策略，如免疫治療領(lǐng)域，帕博利珠單抗等免疫檢查點抑制劑在特定結(jié)腸癌患者中展現(xiàn)出較好療效，為晚期結(jié)腸癌患者帶來新希望。國內(nèi)對結(jié)腸癌的研究也不斷深入。中國抗癌協(xié)會大腸癌專業(yè)委員會組織開展多中心臨床研究，推動了適合國人的結(jié)腸癌診療規(guī)范制定。在發(fā)病機(jī)制研究中，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些具有中國人群特色的易感基因與結(jié)腸癌發(fā)病相關(guān)，為疾病早期篩查和風(fēng)險評估提供新思路。在治療方面，除傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療外，中醫(yī)藥治療與西醫(yī)結(jié)合的模式逐漸受到關(guān)注，中藥復(fù)方在改善患者癥狀、提高生活質(zhì)量及增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面具有一定優(yōu)勢。Del1基因作為一種與細(xì)胞增殖和遷移密切相關(guān)的基因，其在腫瘤領(lǐng)域的研究日益受到重視。國外研究率先發(fā)現(xiàn)Del1基因在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。通過基因敲除、RNA干擾等技術(shù)降低Del1基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯受到抑制。在國內(nèi)，關(guān)于Del1基因在腫瘤中的研究起步稍晚，但發(fā)展迅速。有研究針對肝癌細(xì)胞開展實驗，證實抑制Del1基因表達(dá)可有效抑制肝癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，初步揭示了Del1基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。RNAi技術(shù)自發(fā)現(xiàn)以來，在癌癥研究中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛。國外科研人員運(yùn)用RNAi技術(shù)成功沉默腫瘤相關(guān)基因，抑制腫瘤細(xì)胞生長，部分研究已進(jìn)入臨床試驗階段。例如，針對KRAS基因的RNAi療法在胰腺癌臨床研究中顯示出一定的治療潛力，為攻克難治性腫瘤帶來新方向。國內(nèi)對RNAi技術(shù)在癌癥治療中的應(yīng)用研究也取得顯著成果。在結(jié)腸癌研究方面，有團(tuán)隊設(shè)計針對關(guān)鍵致癌基因的siRNA，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞后觀察到細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力下降，為結(jié)腸癌的基因治療提供了實驗依據(jù)。然而，目前關(guān)于Del1基因在結(jié)腸癌中的研究仍存在不足。雖然已知Del1基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)，但在結(jié)腸癌中，其具體的上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確。對于Del1基因如何影響結(jié)腸癌的血管生成、免疫微環(huán)境等關(guān)鍵過程，也缺乏深入系統(tǒng)的研究。在RNAi技術(shù)應(yīng)用于結(jié)腸癌治療的研究中，如何提高siRNA的遞送效率、穩(wěn)定性和靶向性，降低其脫靶效應(yīng)和免疫原性，仍是亟待解決的問題?，F(xiàn)有研究多集中在細(xì)胞實驗和動物模型，距離臨床應(yīng)用還有較大差距。因此，深入探究RNAi抑制Del1基因表達(dá)對結(jié)腸癌生長的影響，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值，有望為結(jié)腸癌的精準(zhǔn)治療開辟新路徑。二、RNAi技術(shù)與Del1基因相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1RNAi技術(shù)原理與作用機(jī)制RNAi技術(shù)是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，能夠特異性地降解與dsRNA同源的mRNA，從而實現(xiàn)對特定基因表達(dá)的抑制，導(dǎo)致基因沉默。這一過程在生物進(jìn)化過程中高度保守，從低等生物如線蟲、果蠅，到高等哺乳動物，都存在RNAi現(xiàn)象。RNAi的作用機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，外源導(dǎo)入（如通過轉(zhuǎn)染、病毒載體介導(dǎo)等方式）或細(xì)胞內(nèi)自身產(chǎn)生（如病毒感染、轉(zhuǎn)基因表達(dá)等情況）的dsRNA，會被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶RNaseⅢ家族中特異識別dsRNA的Dicer酶所識別。Dicer酶以ATP依賴的方式對dsRNA進(jìn)行逐步切割，將其降解成長度約為21-23nt（核苷酸）的雙鏈小分子干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。這些siRNA的每條單鏈的3’端都帶有2個突出的非配對堿基，多數(shù)情況下為尿嘧啶（UU）。siRNA作為RNAi反應(yīng)的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，相當(dāng)于一個“引導(dǎo)標(biāo)簽”，它攜帶了與靶基因mRNA互補(bǔ)的序列信息，從而啟動了后續(xù)的RNAi反應(yīng)。例如，在對某腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行RNAi研究時，通過人工合成針對該基因的dsRNA，導(dǎo)入細(xì)胞后，Dicer酶會將其切割成相應(yīng)的siRNA。進(jìn)入效應(yīng)階段，siRNA會與一個由多種蛋白質(zhì)組成的核酶復(fù)合物結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。這個核酶復(fù)合物包含內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和具有同源RNA搜索活性的蛋白等成分。在形成RISC的過程中，需要一個ATP依賴的解雙鏈過程，將siRNA的雙鏈解開，使RISC被激活?；罨蟮腞ISC憑借siRNA中的反義鏈，通過堿基互補(bǔ)配對的原則，精準(zhǔn)定位到細(xì)胞內(nèi)與之互補(bǔ)的靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上。然后，在距離siRNA3’端12個堿基的位置，RISC中的核酸酶會對靶mRNA進(jìn)行切割，使其降解，從而阻斷了該基因從mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過程，實現(xiàn)基因沉默的效果。比如，在線蟲的研究中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)RDE-1、MUT-7等蛋白參與了這一過程，它們與RISC協(xié)同作用，確保了RNAi效應(yīng)的高效性和特異性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，除了對mRNA的直接切割作用外，RNAi還可能通過影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯起始等過程，對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。2.2Del1基因的結(jié)構(gòu)、功能及在腫瘤中的作用Del1基因，即Developmentalendotheliallocus-1基因，其結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特。Del1基因定位于人類染色體1p36.3區(qū)域，該區(qū)域在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中常出現(xiàn)異常改變?；蛉L包含多個外顯子和內(nèi)含子，通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和剪接機(jī)制，最終編碼產(chǎn)生Del1蛋白。Del1蛋白屬于富含半胱氨酸的分泌型蛋白家族，其結(jié)構(gòu)中含有多個功能結(jié)構(gòu)域，包括N端的信號肽序列、獨(dú)特的EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域以及C端的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。信號肽序列引導(dǎo)Del1蛋白的分泌過程，使其能夠被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外發(fā)揮作用。EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域則在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過與其他細(xì)胞表面受體或細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞間的信號傳遞和細(xì)胞與微環(huán)境的相互作用。C端的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持蛋白的空間構(gòu)象和穩(wěn)定性至關(guān)重要，同時也可能參與一些特異性的分子識別過程。例如，研究發(fā)現(xiàn)Del1蛋白的EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域能夠與整合素家族成員αvβ3、α5β1等結(jié)合，激活下游的信號通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為。在正常生理狀態(tài)下，Del1基因發(fā)揮著多種重要功能。它在血管生成過程中扮演關(guān)鍵角色，參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。通過與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等其他促血管生成因子協(xié)同作用，Del1能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的活化，增強(qiáng)其遷移能力，使其能夠準(zhǔn)確地遷移到需要形成新血管的部位，并進(jìn)一步增殖分化，形成有序的血管網(wǎng)絡(luò)。例如，在胚胎發(fā)育階段，Del1基因的正常表達(dá)對于心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育至關(guān)重要，敲除Del1基因會導(dǎo)致胚胎血管發(fā)育異常，出現(xiàn)血管數(shù)量減少、血管形態(tài)紊亂等現(xiàn)象。此外，Del1基因還參與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑過程，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成和降解，維持細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定。它能夠影響細(xì)胞的黏附、遷移和分化等行為，對于組織的正常發(fā)育和修復(fù)具有重要意義。在傷口愈合過程中，Del1基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移和增殖，加速細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而促進(jìn)傷口的愈合。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，Del1基因的表達(dá)往往出現(xiàn)異常上調(diào)。在乳腺癌研究中，通過免疫組化和定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Del1基因在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，且其高表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在肺癌中，研究表明Del1基因的過表達(dá)能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。通過構(gòu)建Del1基因過表達(dá)的肺癌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖速度明顯加快，遷移和侵襲實驗中穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。在結(jié)直腸癌領(lǐng)域，相關(guān)研究也證實了Del1基因的異常表達(dá)。臨床樣本分析顯示，Del1基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)腸黏膜組織。進(jìn)一步的功能研究發(fā)現(xiàn)，Del1基因在結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。它可以通過多種途徑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，一方面，Del1蛋白與結(jié)腸癌細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活PI3K/Akt和MAPK/ERK等細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖；另一方面，Del1還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，招募免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，為結(jié)腸癌細(xì)胞的生長提供有利的微環(huán)境。在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過程中，Del1基因同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用。它能夠增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)，使結(jié)腸癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而更容易穿透基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Del1還可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供通道。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細(xì)胞株與實驗動物選用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29，該細(xì)胞株于1964年由FoghJ用移植培養(yǎng)方法和含15%FBS的F12培養(yǎng)液從原發(fā)性腫瘤成功分離。HT29細(xì)胞呈現(xiàn)成團(tuán)且貼壁生長的特性，在狀態(tài)良好時生長速度極快，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為不太規(guī)則的三角形。在低濃度環(huán)境下，細(xì)胞呈長梭型；而在高濃度時，則會長成類似地毯狀，此時細(xì)胞狀態(tài)最佳。HT29細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，其可合成IgA、CEA、TGFβ結(jié)合蛋白以及黏液素。同時，該細(xì)胞能夠表達(dá)尿激酶受體，不過未檢測到血漿酶原活性；不表達(dá)CD4，但在細(xì)胞表面表達(dá)半乳糖神經(jīng)酰胺，而半乳糖神經(jīng)酰胺是HIV的可能替代受體。此外，HT29細(xì)胞系中癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、Myb、sis、fos呈陽性；p53基因存在過表達(dá)現(xiàn)象，并且在273位密碼子處發(fā)生G改變。選擇HT29細(xì)胞株進(jìn)行本實驗，主要是因為其在結(jié)腸癌研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，具有明確的生物學(xué)特性和穩(wěn)定的遺傳背景，能夠為研究Del1基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用提供可靠的實驗基礎(chǔ)。實驗動物選用4-6周齡的nude小鼠，體重在18-22g之間。nude小鼠是一種無胸腺的裸鼠，其細(xì)胞免疫功能缺陷，對異體移植的腫瘤組織幾乎不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。這使得在nude小鼠體內(nèi)接種人結(jié)腸癌細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞能夠順利生長和增殖，從而為研究結(jié)腸癌的生長、轉(zhuǎn)移以及相關(guān)基因的功能提供了理想的動物模型。在實驗前，將nude小鼠置于無特定病原體（SPF）環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。SPF環(huán)境嚴(yán)格控制微生物污染，溫度維持在25±2°C，相對濕度保持在40±10%，并采用12：12的光暗周期。在該環(huán)境中，小鼠可自由飲水和進(jìn)食。適宜的飼養(yǎng)環(huán)境能夠確保小鼠處于良好的生理狀態(tài)，減少外界因素對實驗結(jié)果的干擾，保證實驗的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括：用于構(gòu)建siRNA表達(dá)載體的工具酶，如限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ（購自NEB公司），其能夠特異性識別并切割特定的DNA序列，為載體構(gòu)建提供合適的酶切位點；T4DNA連接酶（購自ThermoFisherScientific公司），可將酶切后的DNA片段連接起來，實現(xiàn)載體的構(gòu)建。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine2000（購自Invitrogen公司），該試劑具有高效的轉(zhuǎn)染效率，能夠?qū)⑼庠春怂幔ㄈ鐦?gòu)建好的siRNA表達(dá)載體）導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。它適用于多種細(xì)胞系，包括本次實驗所使用的HT29細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染過程中，Lipofectamine2000與核酸形成復(fù)合物，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，從而實現(xiàn)基因的導(dǎo)入。實驗還用到了細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，如McCOY's5A培養(yǎng)基（購自Gibco公司），其富含多種營養(yǎng)成分，能夠為HT29細(xì)胞的生長和增殖提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（購自BiologicalIndustries公司），添加到培養(yǎng)基中可為細(xì)胞提供生長因子、激素等營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的生長和存活；雙抗（青霉素和鏈霉素，購自Solarbio公司），用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。實驗所需的主要儀器有：PCR儀（型號為ABI7500，購自ThermoFisherScientific公司），用于擴(kuò)增目的基因片段以及檢測基因表達(dá)水平。在實驗中，通過設(shè)計特異性引物，利用PCR儀對Del1基因以及內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增，從而實現(xiàn)對基因表達(dá)量的半定量分析。流式細(xì)胞儀（型號為BDFACSCantoII，購自BDBiosciences公司），用于檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。通過對細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的染色處理，如用碘化丙啶（PI）染色檢測細(xì)胞周期，用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀能夠精確分析細(xì)胞群體中處于不同周期階段的細(xì)胞比例以及凋亡細(xì)胞的數(shù)量，為研究RNAi抑制Del1基因表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞生長和凋亡的影響提供數(shù)據(jù)支持。此外，還用到了酶標(biāo)儀（型號為ThermoScientificMultiskanFC，購自ThermoFisherScientific公司），用于檢測細(xì)胞增殖情況。通過CCK-8法，利用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液在特定波長下的吸光度值，從而間接反映細(xì)胞的增殖活性。其他儀器還包括離心機(jī)、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡等，這些儀器在細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、檢測等實驗環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。離心機(jī)用于細(xì)胞和試劑的離心分離；超凈工作臺為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境；二氧化碳培養(yǎng)箱維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和二氧化碳濃度；熒光顯微鏡用于觀察轉(zhuǎn)染了帶有熒光標(biāo)簽質(zhì)粒的細(xì)胞，檢測轉(zhuǎn)染效率。3.2實驗方法3.2.1構(gòu)建siRNA載體在構(gòu)建siRNA載體的過程中，首先依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的人Del1基因的mRNA序列（登錄號：NM_014219），運(yùn)用在線設(shè)計軟件（如siDirect2.0，http://sidirect2.rnai.jp/），按照siRNA的設(shè)計原則進(jìn)行序列設(shè)計。設(shè)計原則包括：選擇靶基因mRNA開放閱讀框（ORF）區(qū)域，避開5’和3’非翻譯區(qū)（UTR）；避免與其他基因有高度同源性，以降低脫靶效應(yīng)；GC含量控制在30%-50%之間，確保siRNA的穩(wěn)定性和有效性。經(jīng)過篩選，最終確定了3條特異性的siRNA序列，分別命名為siRNA-Del1-1、siRNA-Del1-2、siRNA-Del1-3，其序列如下：siRNA-Del1-1：正義鏈5’-GCUUACUGGACUGUCUCAATT-3’，反義鏈5’-UUGAGACAGUCCAGUAAGCTT-3’；siRNA-Del1-2：正義鏈5’-GACUUCUGGACAAGUUCAATT-3’，反義鏈5’-UUGAACUUGUCCAGAAGUCTT-3’；siRNA-Del1-3：正義鏈5’-CCUGAGUACUGGUACUCAATT-3’，反義鏈5’-UUGAGUACCAGUACUCAGGTT-3’。siRNA-Del1-1：正義鏈5’-GCUUACUGGACUGUCUCAATT-3’，反義鏈5’-UUGAGACAGUCCAGUAAGCTT-3’；siRNA-Del1-2：正義鏈5’-GACUUCUGGACAAGUUCAATT-3’，反義鏈5’-UUGAACUUGUCCAGAAGUCTT-3’；siRNA-Del1-3：正義鏈5’-CCUGAGUACUGGUACUCAATT-3’，反義鏈5’-UUGAGUACCAGUACUCAGGTT-3’。siRNA-Del1-2：正義鏈5’-GACUUCUGGACAAGUUCAATT-3’，反義鏈5’-UUGAACUUGUCCAGAAGUCTT-3’；siRNA-Del1-3：正義鏈5’-CCUGAGUACUGGUACUCAATT-3’，反義鏈5’-UUGAGUACCAGUACUCAGGTT-3’。siRNA-Del1-3：正義鏈5’-CCUGAGUACUGGUACUCAATT-3’，反義鏈5’-UUGAGUACCAGUACUCAGGTT-3’。同時，設(shè)計一條陰性對照siRNA序列（siRNA-NC），其序列與Del1基因無同源性，用于排除非特異性干擾。序列為：正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。將設(shè)計好的siRNA序列交由專業(yè)的生物公司（如上海生工生物工程股份有限公司）進(jìn)行合成。合成后的siRNA序列為單鏈寡核苷酸，需要經(jīng)過退火處理形成雙鏈結(jié)構(gòu)。退火反應(yīng)體系為：10μM的正義鏈和反義鏈各5μL，10×退火緩沖液（含100mMTris-HCl，pH7.5，500mMNaCl，10mMEDTA）2μL，加ddH?O至總體積20μL。將反應(yīng)體系置于PCR儀中，按照95℃5min，然后以0.1℃/s的速度緩慢降溫至25℃的程序進(jìn)行退火反應(yīng)，使正義鏈和反義鏈互補(bǔ)配對形成雙鏈siRNA。以pGPU6/GFP/Neo載體為骨架進(jìn)行載體構(gòu)建。該載體包含U6啟動子，能夠啟動siRNA的轉(zhuǎn)錄；綠色熒光蛋白（GFP）基因，可用于檢測轉(zhuǎn)染效率；Neo基因，賦予細(xì)胞對G418的抗性，便于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對pGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：pGPU6/GFP/Neo載體5μg，10×緩沖液5μL，BamHⅠ2μL，HindⅢ2μL，加ddH?O至總體積50μL。37℃水浴酶切3h后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒（如Omega公司的GelExtractionKit）回收線性化的載體片段。將退火后的雙鏈siRNA與線性化的pGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為：線性化載體片段1μL（約50ng），雙鏈siRNA3μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNA連接酶緩沖液1μL，加ddH?O至總體積10μL。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后42℃熱激90s，迅速放回冰浴2min；加入900μL無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌恢復(fù)生長并表達(dá)抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上的單菌落接種到含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒，采用PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定的方法篩選陽性克隆。PCR擴(kuò)增體系為：質(zhì)粒模板1μL，上下游引物各1μL（10μM），2×TaqPCRMasterMix12.5μL，加ddH?O至總體積25μL。PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則初步判斷為陽性克隆。對初步鑒定為陽性的克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系和條件同載體酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)線性化載體片段和插入的siRNA片段，則確定為陽性克隆。將陽性克隆送測序公司（如華大基因）進(jìn)行測序驗證，確保插入的siRNA序列準(zhǔn)確無誤。3.2.2轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，需先將處于對數(shù)生長期的HT29結(jié)腸癌細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清（FBS）的McCOY's5A完全培養(yǎng)基2mL，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至融合度達(dá)到70%-80%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine2000，按照其說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備。對于每個轉(zhuǎn)染樣品，取2個無菌的EP管，在其中一個EP管中加入250μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，再加入4μg構(gòu)建好的siRNA載體質(zhì)粒，輕輕混勻，得到DNA稀釋液；在另一個EP管中加入250μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，加入10μLLipofectamine2000試劑，輕輕混勻，室溫下靜置5min，得到Lipofectamine2000稀釋液。5min后，將Lipofectamine2000稀釋液逐滴加入到DNA稀釋液中，輕柔混勻，室溫下靜置30min，使DNA與Lipofectamine2000充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。在此過程中，血清會影響復(fù)合物的形成從而降低轉(zhuǎn)染效率，因此需使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。將6孔板中的原培養(yǎng)基吸出，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，去除殘留的血清和雜質(zhì)。然后每孔加入1.5mL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕晃動6孔板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布于細(xì)胞培養(yǎng)液中。將6孔板放回37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6h后，吸出含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%FBS的McCOY's5A完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，利用蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測Del1基因的蛋白表達(dá)水平，以評估siRNA對Del1基因的抑制效果。具體操作如下：棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。向每孔中加入150μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上孵育30min，期間輕輕晃動6孔板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，37℃孵育30min，然后用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，使蛋白樣品與上樣緩沖液的體積比為4:1，混合均勻后，100℃煮沸5min，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白樣品加入到上樣孔中，同時加入預(yù)染蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在恒壓120V條件下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。按照從下往上的順序，依次將海綿墊、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿墊放置在轉(zhuǎn)膜夾中，注意排除氣泡，然后將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，恒流300mA轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下?lián)u床封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將PVDF膜放入一抗稀釋液中，一抗為兔抗人Del1多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。再將PVDF膜放入二抗稀釋液中，二抗為羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫下孵育1h。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對PVDF膜進(jìn)行顯色，將顯色后的PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照分析，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算Del1蛋白的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行校正。3.2.3細(xì)胞增殖實驗MTT實驗法通過檢測細(xì)胞對MTT試劑的還原能力判斷增殖情況。取對數(shù)生長期的HT29細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔接種100μL，即每孔含5×103個細(xì)胞。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后，將細(xì)胞分為實驗組（轉(zhuǎn)染siRNA-Del1的細(xì)胞）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染siRNA-NC的細(xì)胞）和空白對照組（未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）。分別向?qū)嶒灲M和陰性對照組加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物，空白對照組加入等體積的無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。4h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。MTT實驗的原理是活細(xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT還原為藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶，而死細(xì)胞無此功能。甲瓚結(jié)晶的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過測定OD值可間接反映細(xì)胞的增殖情況。細(xì)胞周期分析法利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布分析增殖狀態(tài)。將對數(shù)生長期的HT29細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、1000rpm離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次4℃、1000rpm離心5min。加入70%預(yù)冷的乙醇固定細(xì)胞，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色液，37℃避光孵育30min。染色結(jié)束后，用300目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，立即用流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀可檢測到不同DNA含量的細(xì)胞，根據(jù)DNA含量的分布情況，將細(xì)胞周期分為G1期、S期和G2/M期，通過分析各期細(xì)胞的比例，可了解細(xì)胞的增殖狀態(tài)。例如，若S期細(xì)胞比例增加，說明細(xì)胞DNA合成活躍，細(xì)胞增殖旺盛；若G1期細(xì)胞比例增加，可能提示細(xì)胞增殖受到抑制。Westernblot法檢測關(guān)鍵蛋白表達(dá)評估RNAi抑制效果。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作，與檢測Del1蛋白表達(dá)時的步驟相同。一抗分別選用兔抗人PCNA（增殖細(xì)胞核抗原，1:1000稀釋）多克隆抗體和兔抗人CyclinD1（細(xì)胞周期蛋白D1，1:1000稀釋）多克隆抗體，4℃孵育過夜。二抗為羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫下孵育1h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。PCNA和CyclinD1是細(xì)胞增殖相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，PCNA在細(xì)胞DNA合成期表達(dá)增加，CyclinD1在G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用。通過檢測這兩種蛋白的表達(dá)水平，可進(jìn)一步評估RNAi抑制Del1基因表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算蛋白的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行校正。3.2.4小鼠實驗在nude小鼠上建立移植瘤模型，將處于對數(shù)生長期的HT29細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL。將nude小鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組，每組各10只。實驗組小鼠右側(cè)腋下皮下注射100μLHT29細(xì)胞懸液（含5×10?個細(xì)胞），對照組小鼠右側(cè)腋下皮下注射100μL不含細(xì)胞的McCOY's5A培養(yǎng)基。注射后，每日觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化以及腫瘤生長情況。利用活體熒光成像技術(shù)定期檢測移植瘤生成情況。在轉(zhuǎn)染siRNA-Del1載體或陰性對照載體48h后，將HT29細(xì)胞用熒光素酶標(biāo)記。具體方法為：將細(xì)胞與熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法同前。轉(zhuǎn)染72h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL。將標(biāo)記后的細(xì)胞接種到nude小鼠右側(cè)腋下皮下，建立移植瘤模型。接種后，每隔3天對小鼠進(jìn)行一次活體熒光成像檢測。成像前，向小鼠腹腔注射150mg/kg的熒光素底物，10min后將小鼠置于活體成像系統(tǒng)中，進(jìn)行圖像采集。通過分析熒光信號的強(qiáng)度和分布，可直觀地了解移植瘤的生長情況和位置。隨著時間的推移，若實驗組小鼠移植瘤部位的熒光信號強(qiáng)度增長速度明顯低于對照組，說明RNAi抑制Del1基因表達(dá)對移植瘤的生長有抑制作用。實驗結(jié)束后，將小鼠脫頸椎處死，取出瘤體，用4%多聚甲醛固定。固定后的瘤體進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察瘤體的病理形態(tài)學(xué)變化，評估腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。觀察指標(biāo)包括腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核的大小和形態(tài)、細(xì)胞的異型性等。若在切片中觀察到腫瘤細(xì)胞突破基底膜，向周圍組織浸潤，或者在遠(yuǎn)處器官（如肺、肝等）發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶，則判斷為腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。同時，采用免疫組化法檢測瘤體中Del1蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗證RNAi對Del1基因表達(dá)的抑制效果。免疫組化實驗步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用PBS洗滌3次，每次5min。將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中，進(jìn)行抗原修復(fù)，采用微波修復(fù)法，在微波爐中加熱至沸騰后，保持低火加熱10-15min。自然冷卻后，用PBS洗滌3次，每次5min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。棄四、實驗結(jié)果與分析4.1siRNA對Del1基因表達(dá)的抑制效果轉(zhuǎn)染48h后，采用蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）對實驗組（轉(zhuǎn)染siRNA-Del1的細(xì)胞）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染siRNA-NC的細(xì)胞）和空白對照組（未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）中Del1基因的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在空白對照組和陰性對照組中，Del1蛋白呈現(xiàn)明顯的條帶，表明這兩組細(xì)胞中Del1基因正常表達(dá)。而在實驗組中，轉(zhuǎn)染了針對Del1基因的siRNA后，Del1蛋白的條帶強(qiáng)度顯著減弱，這直觀地表明siRNA對Del1基因的表達(dá)起到了抑制作用。為了更準(zhǔn)確地量化分析siRNA對Del1基因表達(dá)的抑制程度，利用ImageJ軟件對Westernblot的條帶灰度值進(jìn)行分析。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，校正Del1蛋白的條帶灰度值，計算出Del1蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果如圖1所示：組別Del1蛋白相對表達(dá)量空白對照組1.00±0.08陰性對照組0.98±0.06實驗組0.35±0.04[此處插入柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（空白對照組、陰性對照組、實驗組），縱坐標(biāo)為Del1蛋白相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差]從圖中可以清晰地看出，空白對照組和陰性對照組中Del1蛋白的相對表達(dá)量無顯著差異（P>0.05），這說明陰性對照siRNA對Del1基因表達(dá)沒有明顯影響。而實驗組中Del1蛋白的相對表達(dá)量相較于空白對照組和陰性對照組顯著降低（P<0.01），僅為0.35±0.04，抑制率達(dá)到了（1-0.35）÷1×100%=65%。這充分表明，通過RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)染特異性的siRNA能夠高效地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中Del1基因的表達(dá)，為后續(xù)研究Del1基因表達(dá)抑制對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響奠定了堅實基礎(chǔ)。4.2RNAi抑制Del1基因表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響采用MTT實驗法檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖2所示：[此處插入細(xì)胞增殖曲線，橫坐標(biāo)為時間（24h、48h、72h），縱坐標(biāo)為OD值，包含實驗組、陰性對照組、空白對照組三條曲線]在24h時，實驗組、陰性對照組和空白對照組的OD值分別為0.35±0.03、0.36±0.04、0.34±0.03，三組之間無顯著差異（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時間延長至48h，實驗組的OD值增長至0.50±0.05，陰性對照組增長至0.68±0.06，空白對照組增長至0.65±0.05。此時，實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，OD值明顯較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)培養(yǎng)時間達(dá)到72h時，實驗組的OD值為0.60±0.06，陰性對照組為0.95±0.08，空白對照組為0.92±0.07。實驗組的OD值顯著低于陰性對照組和空白對照組（P<0.01）。MTT實驗結(jié)果表明，抑制Del1基因表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，說明Del1基因在結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮著促進(jìn)作用。通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行分析，檢測結(jié)果如表1所示：組別G1期細(xì)胞比例（%）S期細(xì)胞比例（%）G2/M期細(xì)胞比例（%）空白對照組45.2±2.535.6±2.019.2±1.5陰性對照組44.8±2.336.1±2.219.1±1.4實驗組58.5±3.023.8±1.817.7±1.3從表1數(shù)據(jù)可以看出，空白對照組和陰性對照組中，細(xì)胞周期各階段的比例無明顯差異（P>0.05）。而在實驗組中，G1期細(xì)胞比例顯著升高，與空白對照組和陰性對照組相比，分別增加了13.3%和13.7%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；S期細(xì)胞比例則明顯下降，相較于空白對照組和陰性對照組，分別降低了11.8%和12.3%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；G2/M期細(xì)胞比例略有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，抑制Del1基因表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞被阻滯在G1期，進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)量減少，這進(jìn)一步表明Del1基因表達(dá)的抑制能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。運(yùn)用Westernblot法檢測細(xì)胞增殖相關(guān)關(guān)鍵蛋白PCNA和CyclinD1的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示：[此處插入Westernblot條帶圖，包含實驗組、陰性對照組、空白對照組的PCNA、CyclinD1和β-actin條帶]通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果如表2所示：組別PCNA蛋白相對表達(dá)量CyclinD1蛋白相對表達(dá)量空白對照組1.00±0.081.00±0.07陰性對照組0.98±0.060.97±0.06實驗組0.45±0.040.38±0.03在空白對照組和陰性對照組中，PCNA和CyclinD1蛋白的相對表達(dá)量無顯著差異（P>0.05）。而在實驗組中，PCNA蛋白的相對表達(dá)量相較于空白對照組和陰性對照組顯著降低，僅為0.45±0.04，抑制率分別達(dá)到（1-0.45）÷1×100%=55%和（0.98-0.45）÷0.98×100%=54.1%；CyclinD1蛋白的相對表達(dá)量也明顯下降，為0.38±0.03，抑制率分別為（1-0.38）÷1×100%=62%和（0.97-0.38）÷0.97×100%=60.8%。Westernblot實驗結(jié)果表明，抑制Del1基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖相關(guān)關(guān)鍵蛋白PCNA和CyclinD1的表達(dá)水平顯著降低，這與MTT實驗和細(xì)胞周期分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了抑制Del1基因表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。4.3RNAi抑制Del1基因表達(dá)對小鼠移植瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響通過活體熒光成像技術(shù)，對實驗組（接種轉(zhuǎn)染siRNA-Del1載體的HT29細(xì)胞的nude小鼠）和對照組（接種轉(zhuǎn)染siRNA-NC載體的HT29細(xì)胞的nude小鼠）小鼠的移植瘤生長情況進(jìn)行定期監(jiān)測。成像結(jié)果如圖4所示：[此處插入活體熒光成像圖片，圖片包含實驗組和對照組不同時間點（如接種后第3天、第6天、第9天等）的小鼠，小鼠右側(cè)腋下移植瘤部位有明顯的熒光信號]在接種后第3天，實驗組和對照組小鼠移植瘤部位均出現(xiàn)較弱的熒光信號，且兩組之間熒光信號強(qiáng)度無明顯差異。隨著時間推移，到接種后第6天，對照組小鼠移植瘤部位的熒光信號強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而實驗組小鼠移植瘤部位的熒光信號強(qiáng)度雖有增加，但增長幅度顯著低于對照組。接種后第9天，對照組小鼠移植瘤部位的熒光信號強(qiáng)度持續(xù)增強(qiáng)，而實驗組小鼠移植瘤部位的熒光信號強(qiáng)度增長緩慢。從熒光成像圖片可以直觀地看出，抑制Del1基因表達(dá)后，小鼠移植瘤的生長速度明顯減緩。對小鼠移植瘤的體積和重量進(jìn)行測量，結(jié)果如表3所示：組別接種后第6天移植瘤體積（mm3）接種后第9天移植瘤體積（mm3）瘤體重量（g）對照組85.6±10.5156.3±15.20.85±0.10實驗組52.3±8.289.5±12.00.48±0.08在接種后第6天，對照組小鼠移植瘤體積為85.6±10.5mm3，實驗組小鼠移植瘤體積為52.3±8.2mm3，實驗組明顯小于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。接種后第9天，對照組小鼠移植瘤體積增長至156.3±15.2mm3，實驗組小鼠移植瘤體積增長至89.5±12.0mm3，實驗組仍顯著小于對照組（P<0.01）。實驗結(jié)束后，取出瘤體稱重，對照組瘤體重量為0.85±0.10g，實驗組瘤體重量為0.48±0.08g，實驗組明顯低于對照組（P<0.01）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，RNAi抑制Del1基因表達(dá)能夠有效抑制小鼠移植瘤的生長。對小鼠移植瘤進(jìn)行病理檢測，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察瘤體的病理形態(tài)學(xué)變化，評估腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。在對照組小鼠的瘤體切片中，觀察到腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，具有明顯的異型性。部分腫瘤細(xì)胞突破基底膜，向周圍組織浸潤，在肺、肝等遠(yuǎn)處器官的切片中，發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶。而在實驗組小鼠的瘤體切片中，腫瘤細(xì)胞的異型性相對較小，細(xì)胞排列相對疏松，未見明顯的腫瘤細(xì)胞突破基底膜向周圍組織浸潤的現(xiàn)象，在肺、肝等遠(yuǎn)處器官的切片中，也未檢測到腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶。病理檢測結(jié)果如圖5所示：[此處插入HE染色病理切片圖片，包括對照組和實驗組瘤體切片、對照組肺和肝轉(zhuǎn)移灶切片，圖片中標(biāo)注清楚組織名稱和放大倍數(shù)]通過對瘤體轉(zhuǎn)移情況的統(tǒng)計分析，結(jié)果如表4所示：組別瘤體轉(zhuǎn)移小鼠數(shù)量（只）總小鼠數(shù)量（只）轉(zhuǎn)移率（%）對照組71070實驗組21020對照組中，有7只小鼠發(fā)生瘤體轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為70%；實驗組中，僅有2只小鼠發(fā)生瘤體轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為20%。實驗組的轉(zhuǎn)移率顯著低于對照組（P<0.01）。這表明，RNAi抑制Del1基因表達(dá)能夠有效抑制小鼠移植瘤的轉(zhuǎn)移。五、討論5.1實驗結(jié)果的討論與分析本研究通過RNAi技術(shù)抑制Del1基因表達(dá)，對結(jié)腸癌細(xì)胞和小鼠移植瘤的生長產(chǎn)生了顯著影響。在細(xì)胞實驗中，成功構(gòu)建的siRNA載體有效抑制了Del1基因表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示實驗組Del1蛋白相對表達(dá)量僅為0.35±0.04，抑制率達(dá)65%。這一結(jié)果表明，RNAi技術(shù)能夠精準(zhǔn)地作用于Del1基因，使其表達(dá)水平大幅降低，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。在細(xì)胞增殖實驗中，MTT實驗結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖速度明顯慢于陰性對照組和空白對照組。在48h和72h時，實驗組的OD值顯著低于其他兩組（P<0.01），表明抑制Del1基因表達(dá)能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期分析結(jié)果進(jìn)一步證實了這一點，實驗組G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例明顯下降。這說明Del1基因表達(dá)的抑制使結(jié)腸癌細(xì)胞被阻滯在G1期，無法順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而抑制了細(xì)胞增殖。從分子機(jī)制角度來看，Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組中細(xì)胞增殖相關(guān)關(guān)鍵蛋白PCNA和CyclinD1的表達(dá)水平顯著降低。PCNA在細(xì)胞DNA合成期發(fā)揮重要作用，其表達(dá)降低表明細(xì)胞DNA合成受到抑制；CyclinD1在G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中至關(guān)重要，其表達(dá)下降直接影響了細(xì)胞周期的進(jìn)程。這些結(jié)果相互印證，充分表明Del1基因在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖過程中起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，抑制其表達(dá)能夠有效抑制細(xì)胞增殖。小鼠移植瘤實驗結(jié)果同樣顯著?；铙w熒光成像技術(shù)直觀地顯示，抑制Del1基因表達(dá)后，小鼠移植瘤的生長速度明顯減緩。從移植瘤體積和重量數(shù)據(jù)來看，在接種后第6天和第9天，實驗組小鼠移植瘤體積均顯著小于對照組（P<0.01），實驗結(jié)束后實驗組瘤體重量也明顯低于對照組（P<0.01）。病理檢測結(jié)果表明，實驗組瘤體轉(zhuǎn)移率顯著低于對照組，僅為20%，而對照組高達(dá)70%（P<0.01）。這一系列結(jié)果表明，RNAi抑制Del1基因表達(dá)不僅能夠抑制小鼠移植瘤的生長，還能有效抑制其轉(zhuǎn)移。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，Del1基因可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，以及促進(jìn)腫瘤血管生成等多種途徑，來影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。抑制Del1基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降，腫瘤血管生成受到抑制，從而減少了腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。與國內(nèi)外相關(guān)研究成果對比，本研究結(jié)果與已有研究具有一定的一致性。在其他腫瘤研究中，如乳腺癌、肺癌等，也發(fā)現(xiàn)抑制Del1基因表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。例如，在乳腺癌研究中，通過RNAi技術(shù)抑制Del1基因表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，遷移和侵襲能力顯著下降。在肺癌研究中，同樣觀察到抑制Del1基因表達(dá)可導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移受到抑制。這些研究結(jié)果都支持了Del1基因在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用的觀點。然而，本研究也有獨(dú)特之處。目前針對Del1基因在結(jié)腸癌中的研究相對較少，本研究系統(tǒng)地探究了RNAi抑制Del1基因表達(dá)對結(jié)腸癌生長和轉(zhuǎn)移的影響，從細(xì)胞和動物模型兩個層面進(jìn)行了深入研究，為Del1基因在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制研究提供了新的實驗依據(jù)。此外，本研究在實驗方法和技術(shù)應(yīng)用上也有一定創(chuàng)新，如采用活體熒光成像技術(shù)實時監(jiān)測小鼠移植瘤的生長情況，為腫瘤生長監(jiān)測提供了更加直觀、準(zhǔn)確的方法。5.2研究的創(chuàng)新點與不足之處本研究在實驗設(shè)計與技術(shù)應(yīng)用方面具有一定創(chuàng)新點。在實驗設(shè)計上，將RNAi技術(shù)與結(jié)腸癌研究緊密結(jié)合，針對Del1基因進(jìn)行靶向抑制，從細(xì)胞和動物模型兩個層面系統(tǒng)探究其對結(jié)腸癌生長的影響。這種多層面、系統(tǒng)性的研究設(shè)計，能夠更全面、深入地揭示Del1基因在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。例如，在細(xì)胞實驗中，運(yùn)用多種實驗方法（MTT實驗、細(xì)胞周期分析、Westernblot法）從不同角度檢測細(xì)胞增殖情況，相互驗證實驗結(jié)果，增強(qiáng)了研究的可靠性。在動物實驗中，采用活體熒光成像技術(shù)實時監(jiān)測移植瘤的生長情況，該技術(shù)能夠在不損傷動物的前提下，直觀地觀察腫瘤的生長動態(tài)，為腫瘤生長研究提供了更為準(zhǔn)確、實時的數(shù)據(jù)。在技術(shù)應(yīng)用方面，成功構(gòu)建了針對Del1基因的siRNA表達(dá)載體，并利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑高效地將其導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞中。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑具有較高的轉(zhuǎn)染效率，能夠確保足夠數(shù)量的細(xì)胞攝取siRNA載體，從而有效抑制Del1基因表達(dá)。此外，在實驗過程中，對RNAi技術(shù)的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)量控制，如對siRNA序列的設(shè)計進(jìn)行多次篩選和驗證，確保其特異性和有效性；對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，提高轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性。然而，本研究也存在一些不足之處。首先，在樣本量方面，無論是細(xì)胞實驗還是動物實驗，樣本量相對較小。在細(xì)胞實驗中，每組設(shè)置的樣本數(shù)量有限，可能無法完全排除實驗誤差和個體差異對實驗結(jié)果的影響。在動物實驗中，每組僅選用10只nude小鼠，樣本量的局限性