CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC對(duì)大鼠腎移植排異影響的實(shí)驗(yàn)探究一、引言1.1研究背景終末期腎?。‥nd-StageRenalDisease，ESRD）是各種慢性腎臟疾病發(fā)展的最終階段，嚴(yán)重威脅患者的生命健康和生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)ESRD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，腎臟替代治療是ESRD患者的主要治療手段，包括血液透析、腹膜透析和腎臟移植。其中，腎臟移植作為治療ESRD的最佳選擇，能夠顯著改善患者的生活質(zhì)量和生存率。與透析治療相比，腎移植患者的長(zhǎng)期生存率更高，生活質(zhì)量也得到了極大的提升，能夠恢復(fù)正常的工作和生活。腎移植雖然是治療終末期腎病的有效方法，但排異反應(yīng)仍然是影響移植腎存活和患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。排異反應(yīng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)移植腎的免疫攻擊，可分為超急性排斥反應(yīng)、急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)。超急性排斥反應(yīng)通常在移植后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生，是由于受者體內(nèi)預(yù)先存在的抗體與供體器官抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、血栓形成和器官功能迅速喪失，目前臨床上通過(guò)嚴(yán)格的交叉配型等措施，已能較好地預(yù)防超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。急性排斥反應(yīng)多發(fā)生在移植后的數(shù)天至數(shù)月內(nèi)，主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，是目前腎移植中較為常見(jiàn)的排斥反應(yīng)類型，其發(fā)生率在不同研究中有所差異，約為10%-30%。慢性排斥反應(yīng)則發(fā)生在移植后的數(shù)月至數(shù)年，表現(xiàn)為移植腎功能進(jìn)行性下降，病理特征為間質(zhì)纖維化、血管硬化和腎小管萎縮，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及免疫和非免疫因素，治療較為困難，嚴(yán)重影響移植腎的長(zhǎng)期存活。當(dāng)前，臨床上主要依靠免疫抑制劑來(lái)預(yù)防和治療排異反應(yīng)。常用的免疫抑制劑包括他克莫司、環(huán)孢素、霉酚酸酯等，這些藥物通過(guò)抑制T細(xì)胞的活化、增殖和分化，從而抑制免疫系統(tǒng)對(duì)移植腎的攻擊。然而，長(zhǎng)期使用免疫抑制劑存在諸多局限性。一方面，免疫抑制劑具有明顯的毒副作用，如腎毒性、肝毒性、糖尿病、高血壓、感染風(fēng)險(xiǎn)增加等。腎毒性是免疫抑制劑常見(jiàn)的副作用之一，可導(dǎo)致移植腎功能損害，增加慢性移植腎腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，免疫抑制劑還會(huì)抑制機(jī)體的正常免疫功能，使患者更容易受到各種病原體的感染，如細(xì)菌、病毒、真菌等，嚴(yán)重感染可危及患者生命。另一方面，部分患者會(huì)對(duì)免疫抑制劑產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致藥物治療效果不佳，排斥反應(yīng)難以控制，最終可能導(dǎo)致移植腎失功，患者需要再次進(jìn)行腎移植或重新回到透析治療。此外，免疫抑制劑的治療費(fèi)用較高，長(zhǎng)期使用給患者和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找一種更有效、安全的抗排異治療方法具有重要的臨床意義。近年來(lái)，隨著免疫學(xué)和基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)免疫耐受，成為腎移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4-免疫球蛋白（CytotoxicT-Lymphocyte-AssociatedAntigen4-Immunoglobulin，CTLA4Ig）作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)分子，能夠阻斷T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)通路，誘導(dǎo)免疫耐受，在腎移植抗排異治療中展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（ImmatureDendriticCells，imDCs）是體內(nèi)功能強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，具有低免疫原性和誘導(dǎo)免疫耐受的能力。將CTLA4Ig重組腺病毒修飾的未成熟DC應(yīng)用于腎移植抗排異治療，可能通過(guò)協(xié)同作用，更有效地誘導(dǎo)免疫耐受，減輕排異反應(yīng)，提高移植腎的存活率和患者的生活質(zhì)量。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究CTLA4Ig重組腺病毒修飾的未成熟DC對(duì)大鼠腎移植排異反應(yīng)的影響，明確其在誘導(dǎo)免疫耐受、減輕排異反應(yīng)方面的作用機(jī)制，為腎移植抗排異治療提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。腎移植作為治療終末期腎病的有效手段，雖然在外科手術(shù)技術(shù)和免疫抑制劑的應(yīng)用方面取得了顯著進(jìn)展，但排異反應(yīng)仍然是制約移植腎長(zhǎng)期存活和患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵因素。當(dāng)前免疫抑制劑的局限性，如毒副作用、耐藥性和高昂的治療費(fèi)用，迫切需要尋找更加安全、有效的抗排異治療方法。本研究聚焦于CTLA4Ig重組腺病毒修飾的未成熟DC，具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論層面來(lái)看，本研究有助于深入理解腎移植排異反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。CTLA4Ig通過(guò)阻斷T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)通路，能夠抑制T細(xì)胞的過(guò)度活化和增殖，從而減少免疫攻擊對(duì)移植腎的損傷。未成熟DC具有低免疫原性和誘導(dǎo)免疫耐受的特性，將兩者結(jié)合，有望協(xié)同發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)移植腎產(chǎn)生免疫耐受。通過(guò)研究其作用機(jī)制，能夠進(jìn)一步揭示免疫耐受誘導(dǎo)的分子和細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，豐富和完善腎移植免疫耐受的理論體系，為后續(xù)的相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，本研究的成果具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。如果能夠證實(shí)CTLA4Ig重組腺病毒修飾的未成熟DC在大鼠腎移植模型中能夠有效減輕排異反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受，那么有望將這一治療策略轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，為腎移植患者帶來(lái)新的希望。與傳統(tǒng)免疫抑制劑相比，這種基于免疫調(diào)節(jié)的治療方法可能具有更低的毒副作用和更好的長(zhǎng)期效果，能夠減少患者因長(zhǎng)期使用免疫抑制劑而帶來(lái)的各種并發(fā)癥，提高患者的生活質(zhì)量。同時(shí)，也可能降低治療成本，減輕患者和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。此外，本研究還可能為其他器官移植的抗排異治療提供借鑒和參考，推動(dòng)整個(gè)器官移植領(lǐng)域的發(fā)展。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1腎移植排異反應(yīng)2.1.1排異反應(yīng)的類型腎移植排異反應(yīng)根據(jù)發(fā)生的時(shí)間、機(jī)制和移植腎病理表現(xiàn)，通?？煞譃槌毙耘懦夥磻?yīng)、加速性排斥反應(yīng)、急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)。超急性排斥反應(yīng)極為迅速，一般發(fā)生在移植手術(shù)過(guò)程中或術(shù)后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)。這是因?yàn)槭苷唧w內(nèi)預(yù)先存在針對(duì)供體抗原的抗體，如抗供者HLA抗體、ABO血型抗體等。當(dāng)移植腎血管接通后，這些抗體迅速與供體腎組織抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、血栓形成，使移植腎在短時(shí)間內(nèi)失去功能。超急性排斥反應(yīng)一旦發(fā)生，病情進(jìn)展迅猛，移植腎往往難以挽救，目前主要通過(guò)嚴(yán)格的術(shù)前交叉配型、ABO血型匹配等措施來(lái)預(yù)防。加速性排斥反應(yīng)多發(fā)生在術(shù)后3-7天。它的發(fā)生機(jī)制與超急性排斥反應(yīng)有相似之處，也是由體液免疫介導(dǎo)，但抗體產(chǎn)生的時(shí)間相對(duì)較晚。受者體內(nèi)可能存在一些潛在的免疫致敏因素，在移植后短時(shí)間內(nèi)迅速激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生大量抗體攻擊移植腎。加速性排斥反應(yīng)的病情進(jìn)展也較快，移植腎會(huì)出現(xiàn)明顯的腫脹、疼痛，腎功能急劇下降，治療相對(duì)困難，常需要采用大劑量免疫抑制劑沖擊治療等措施，但預(yù)后通常不如急性排斥反應(yīng)好。急性排斥反應(yīng)是腎移植中最常見(jiàn)的排斥反應(yīng)類型，可發(fā)生在術(shù)后數(shù)天至數(shù)月內(nèi)，也有部分患者在術(shù)后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍可能發(fā)生。它主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo)，也有體液免疫參與。T淋巴細(xì)胞在急性排斥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，當(dāng)移植腎進(jìn)入受者體內(nèi)后，供體腎組織中的抗原被受者的抗原提呈細(xì)胞識(shí)別并攝取，加工處理后將抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。活化的T細(xì)胞增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞，這些效應(yīng)T細(xì)胞可以直接攻擊移植腎組織細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞溶解和組織損傷；同時(shí)，T細(xì)胞還會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，進(jìn)一步招募和激活其他免疫細(xì)胞，加重免疫炎癥反應(yīng)。急性排斥反應(yīng)的臨床表現(xiàn)多樣，常見(jiàn)的有發(fā)熱、移植腎區(qū)脹痛、尿量減少、血壓升高、血肌酐升高等，通過(guò)及時(shí)調(diào)整免疫抑制劑治療方案，多數(shù)患者的急性排斥反應(yīng)可以得到有效控制。慢性排斥反應(yīng)發(fā)生在移植術(shù)后數(shù)月至數(shù)年，是導(dǎo)致移植腎長(zhǎng)期失功的主要原因之一。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及免疫和非免疫多種因素。免疫因素方面，持續(xù)的免疫損傷是慢性排斥反應(yīng)的重要基礎(chǔ)，包括T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)以及免疫記憶等。非免疫因素如缺血-再灌注損傷、感染、高血壓、高血脂、藥物毒性等，可導(dǎo)致移植腎組織的慢性炎癥、纖維化和血管病變。慢性排斥反應(yīng)的病理特征主要為間質(zhì)纖維化、血管硬化和腎小管萎縮，臨床表現(xiàn)為移植腎功能進(jìn)行性下降，出現(xiàn)蛋白尿、血尿、高血壓等癥狀，目前缺乏有效的治療方法，預(yù)后較差。2.1.2排異反應(yīng)的機(jī)制腎移植排異反應(yīng)本質(zhì)上是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)移植腎的免疫攻擊，其免疫學(xué)機(jī)制涉及免疫細(xì)胞活化、細(xì)胞因子釋放、免疫信號(hào)通路等多個(gè)方面。免疫細(xì)胞活化在排異反應(yīng)中起著核心作用。T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)排異反應(yīng)的關(guān)鍵免疫細(xì)胞，其活化過(guò)程需要雙信號(hào)刺激。第一信號(hào)來(lái)自T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）與抗原提呈細(xì)胞（APC）表面的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子復(fù)合物的特異性結(jié)合，這一信號(hào)決定了免疫應(yīng)答的特異性。然而，僅有第一信號(hào)不足以完全激活T細(xì)胞，還需要第二信號(hào)，即共刺激信號(hào)。共刺激信號(hào)主要由APC表面的共刺激分子如B7-1（CD80）和B7-2（CD86）與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體CD28結(jié)合提供。在腎移植中，供體腎組織的抗原被受者的APC攝取、加工和處理后，以抗原肽-MHC分子復(fù)合物的形式表達(dá)在APC表面，與T細(xì)胞表面的TCR結(jié)合，提供第一信號(hào)；同時(shí)，APC表面的B7分子與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合，提供共刺激信號(hào)，從而激活T細(xì)胞。此外，自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞也參與了排異反應(yīng)。NK細(xì)胞可以通過(guò)釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)直接殺傷靶細(xì)胞，還能分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；B淋巴細(xì)胞則可產(chǎn)生抗體，通過(guò)體液免疫途徑參與對(duì)移植腎的攻擊。細(xì)胞因子在排異反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在免疫細(xì)胞活化后，會(huì)釋放多種細(xì)胞因子，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。例如，IL-2是T細(xì)胞活化和增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它可以促進(jìn)T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性；IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力，還可促進(jìn)MHC分子的表達(dá)，增強(qiáng)抗原提呈作用；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）具有廣泛的生物學(xué)活性，可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)移植腎組織造成損傷。此外，還有一些細(xì)胞因子如IL-4、IL-10等，它們具有免疫調(diào)節(jié)作用，在一定程度上可以抑制免疫反應(yīng)，維持免疫平衡，但在排異反應(yīng)過(guò)程中，這些抑制性細(xì)胞因子的作用往往被削弱。免疫信號(hào)通路的激活是排異反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的重要分子基礎(chǔ)。T細(xì)胞活化后，會(huì)激活多條信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的存活、增殖和代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，激活該信號(hào)通路可以促進(jìn)T細(xì)胞的存活和增殖；MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等亞家族，它們參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等過(guò)程，在排異反應(yīng)中，MAPK信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)增加，加重免疫炎癥反應(yīng)。此外，核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路在免疫和炎癥反應(yīng)中也起著關(guān)鍵作用，它可以調(diào)節(jié)多種免疫相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等的產(chǎn)生，進(jìn)一步加劇排異反應(yīng)。2.2CTLA4Ig重組腺病毒2.2.1CTLA4Ig的結(jié)構(gòu)與功能CTLA4Ig是一種融合蛋白，由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）的細(xì)胞外功能區(qū)域與人免疫球蛋白G1（IgG1）的Fc片段融合而成。CTLA-4是一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞表面。其細(xì)胞外功能區(qū)域包含與B7分子高親和力結(jié)合的位點(diǎn)，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合抗原提呈細(xì)胞表面的B7-1（CD80）和B7-2（CD86）分子。IgG1的Fc片段則賦予了CTLA4Ig更好的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的半衰期，使其在體內(nèi)能夠更有效地發(fā)揮作用。CTLA4Ig的主要功能是阻斷T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)通路。在正常免疫應(yīng)答過(guò)程中，T細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)刺激，第一信號(hào)來(lái)自T細(xì)胞受體（TCR）與抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子復(fù)合物的特異性結(jié)合，提供抗原特異性識(shí)別信號(hào)；第二信號(hào)即共刺激信號(hào)，主要由APC表面的B7分子與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合產(chǎn)生，這一信號(hào)對(duì)于T細(xì)胞的充分活化、增殖和分化至關(guān)重要。而CTLA4Ig能夠競(jìng)爭(zhēng)性地與B7分子結(jié)合，阻斷B7與CD28的相互作用，從而抑制T細(xì)胞的活化。研究表明，CTLA4Ig與B7分子的親和力遠(yuǎn)高于CD28，能夠更有效地占據(jù)B7分子的結(jié)合位點(diǎn)，阻止共刺激信號(hào)的傳遞。當(dāng)CTLA4Ig與B7分子結(jié)合后，T細(xì)胞無(wú)法獲得充分的活化信號(hào)，處于無(wú)反應(yīng)或低反應(yīng)狀態(tài)，從而抑制了T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。此外，CTLA4Ig還可以通過(guò)與B7分子結(jié)合，調(diào)節(jié)APC的功能，抑制其分泌促炎細(xì)胞因子，進(jìn)一步減輕免疫炎癥反應(yīng)。通過(guò)這種方式，CTLA4Ig能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，減少對(duì)移植器官的免疫攻擊，在腎移植等器官移植領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。2.2.2重組腺病毒載體重組腺病毒載體是一種常用的基因治療載體，其構(gòu)建過(guò)程涉及一系列復(fù)雜的分子生物學(xué)技術(shù)。首先，需要獲取目的基因，即編碼CTLA4Ig的基因序列。可以通過(guò)基因克隆技術(shù)，從含有CTLA4Ig基因的生物樣本中擴(kuò)增出目的基因，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。然后，將目的基因插入到腺病毒載體骨架中。常用的腺病毒載體多為缺失了某些關(guān)鍵基因（如E1區(qū)基因）的改造型腺病毒，這樣可以降低病毒的復(fù)制能力，提高其安全性。在插入目的基因時(shí)，需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶對(duì)腺病毒載體骨架和目的基因進(jìn)行酶切，使其產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，然后通過(guò)DNA連接酶將兩者連接起來(lái)，構(gòu)建成重組腺病毒載體質(zhì)粒。接下來(lái)，將重組腺病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到特定的細(xì)胞系中，如293細(xì)胞。293細(xì)胞是一種人胚腎細(xì)胞系，能夠表達(dá)腺病毒E1區(qū)基因，為重組腺病毒的包裝提供必要的條件。在293細(xì)胞中，重組腺病毒載體質(zhì)粒會(huì)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生重組腺病毒基因組和各種病毒蛋白，這些成分會(huì)在細(xì)胞內(nèi)組裝成完整的重組腺病毒顆粒。最后，通過(guò)一系列的病毒純化技術(shù)，如超速離心、柱層析等，從細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離和純化重組腺病毒，得到高純度、高滴度的重組腺病毒制劑，以便用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和治療應(yīng)用。重組腺病毒載體具有許多獨(dú)特的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，使其在基因治療領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。其一，重組腺病毒載體具有高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，能夠感染多種類型的細(xì)胞，包括分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞。這使得它可以將目的基因有效地傳遞到各種靶細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)和功能發(fā)揮。例如，在腎移植研究中，重組腺病毒載體可以將CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到未成熟DC中，使其表達(dá)CTLA4Ig，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。其二，重組腺病毒載體能夠穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。一旦重組腺病毒感染細(xì)胞并將目的基因整合到細(xì)胞基因組中，目的基因就可以在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)，為長(zhǎng)期的基因治療提供了可能。其三，重組腺病毒載體具有良好的生物安全性。由于其基因組不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組中，減少了插入突變等潛在風(fēng)險(xiǎn)，降低了對(duì)宿主基因組的影響。此外，重組腺病毒載體還可以通過(guò)對(duì)病毒基因組的進(jìn)一步改造，如刪除其他可能引起免疫反應(yīng)的基因片段，進(jìn)一步提高其安全性。其四，重組腺病毒載體易于制備和純化，能夠獲得高滴度的病毒制劑，滿足實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療的需求。綜上所述，重組腺病毒載體作為一種理想的基因治療載體，為CTLA4Ig基因的傳遞和表達(dá)提供了有效的手段，在腎移植抗排異治療的研究中具有重要的應(yīng)用前景。2.3未成熟DC2.3.1DC的生物學(xué)特性樹(shù)突狀細(xì)胞（DendriticCells，DC）是機(jī)體功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞（Antigen-PresentingCells，APC）。其最大的特點(diǎn)在于能夠高效地?cái)z取、加工處理抗原，并將抗原信息以抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子復(fù)合物的形式呈遞給T淋巴細(xì)胞，從而激活初始T細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的橋梁作用，連接了固有免疫和適應(yīng)性免疫。根據(jù)其起源和功能的不同，DC主要可分為髓系DC（MyeloidDendriticCells，mDC）和淋巴系DC（LymphoidDendriticCells，pDC）。mDC主要來(lái)源于骨髓中的髓樣干細(xì)胞，具有較強(qiáng)的吞噬和加工抗原能力，能夠有效地激活T細(xì)胞，在啟動(dòng)針對(duì)病原體和腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。pDC則主要起源于淋巴樣干細(xì)胞，其主要功能是分泌大量的I型干擾素，在抗病毒免疫反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色。此外，DC在體內(nèi)的分布廣泛，幾乎存在于所有的組織和器官中。在非淋巴組織中，如皮膚、呼吸道、胃腸道等黏膜組織以及肝臟、腎臟等實(shí)質(zhì)器官，DC以未成熟的形式存在，它們具有較強(qiáng)的抗原攝取和遷移能力。當(dāng)受到病原體感染、炎癥刺激或組織損傷等信號(hào)時(shí)，未成熟DC能夠迅速攝取抗原，并通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)遷移至局部淋巴結(jié)等淋巴組織。在遷移過(guò)程中，DC逐漸成熟，其表面的共刺激分子（如B7-1、B7-2）、黏附分子（如ICAM-1、LFA-1）和MHC分子的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子。成熟的DC在淋巴組織中與T細(xì)胞相互作用，將抗原信息呈遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而啟動(dòng)特異性免疫反應(yīng)。DC還可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的類型和強(qiáng)度，如分泌IL-12促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答，分泌IL-4促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答，在維持機(jī)體免疫平衡和免疫耐受方面發(fā)揮著重要作用。2.3.2未成熟DC在免疫調(diào)節(jié)中的作用未成熟DC在免疫調(diào)節(jié)中具有獨(dú)特而重要的作用，這與其特殊的生物學(xué)特性密切相關(guān)。在抗原攝取能力方面，未成熟DC表現(xiàn)出極強(qiáng)的活性。它們高表達(dá)多種模式識(shí)別受體（PatternRecognitionReceptors，PRRs），如Toll樣受體（Toll-likeReceptors，TLRs）、C型凝集素受體（C-typeLectinReceptors，CLRs）等。這些受體能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-AssociatedMolecularPatterns，PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（Damage-AssociatedMolecularPatterns，DAMPs）。例如，TLR4可以識(shí)別細(xì)菌的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），CLRs可以識(shí)別真菌的甘露糖等。通過(guò)這些受體，未成熟DC能夠高效地?cái)z取和捕獲各種抗原，包括來(lái)自病原體、腫瘤細(xì)胞以及自身組織的抗原。未成熟DC還具有較強(qiáng)的吞噬能力和巨胞飲作用，能夠?qū)z取的抗原內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行加工處理。在免疫激活特性上，未成熟DC卻表現(xiàn)出較低的活性。與成熟DC相比，未成熟DC表面的共刺激分子（如B7-1、B7-2）和MHCⅡ類分子的表達(dá)水平較低。共刺激分子對(duì)于T細(xì)胞的充分活化至關(guān)重要，B7分子與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合產(chǎn)生的共刺激信號(hào)，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞因子的分泌。未成熟DC低表達(dá)B7分子，使得其在與T細(xì)胞相互作用時(shí)，難以提供足夠的共刺激信號(hào)，從而無(wú)法有效激活T細(xì)胞。未成熟DC分泌的促炎細(xì)胞因子（如IL-12、TNF-α等）也較少。IL-12是一種重要的促炎細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答，增強(qiáng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性。未成熟DC低分泌IL-12，使得其難以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫激活反應(yīng)。未成熟DC能夠誘導(dǎo)免疫耐受，這一機(jī)制對(duì)于維持機(jī)體的免疫平衡和防止自身免疫性疾病具有重要意義。一種重要的機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（RegulatoryTcells，Tregs）的產(chǎn)生。Tregs是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能夠抑制其他免疫細(xì)胞的活化和增殖。未成熟DC在攝取抗原后，通過(guò)與T細(xì)胞的相互作用，能夠誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Tregs。這一過(guò)程可能與未成熟DC表面低表達(dá)共刺激分子以及分泌的一些抑制性細(xì)胞因子（如IL-10、TGF-β等）有關(guān)。IL-10和TGF-β可以抑制T細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)Tregs的分化和功能發(fā)揮。未成熟DC還可以通過(guò)直接與效應(yīng)T細(xì)胞相互作用，抑制其活化和功能。未成熟DC表面表達(dá)的程序性死亡配體1（ProgrammedDeathLigand1，PD-L1）等抑制性分子，能夠與效應(yīng)T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（ProgrammedDeath1，PD-1）結(jié)合，傳遞抑制性信號(hào)，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性，使機(jī)體對(duì)特定抗原產(chǎn)生免疫耐受，減少免疫攻擊對(duì)自身組織的損傷。三、CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC的制備與鑒定3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康的清潔級(jí)雄性SD大鼠和Wistar大鼠，體重在200-250g之間，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的無(wú)特定病原體（SPF）環(huán)境中，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理和福利原則，盡量減少動(dòng)物的痛苦。3.1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自[試劑品牌1]，胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）購(gòu)自[試劑品牌2]，重組大鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（RecombinantRatGranulocyte-MacrophageColony-StimulatingFactor，rmGM-CSF）、重組大鼠白細(xì)胞介素-4（RecombinantRatInterleukin-4，rmIL-4）和重組大鼠腫瘤壞死因子-α（RecombinantRatTumorNecrosisFactor-α，rmTNF-α）均購(gòu)自[試劑品牌3]。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自[試劑品牌4]，Trizol試劑購(gòu)自[試劑品牌5]，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自[試劑品牌6]。鼠抗大鼠CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ抗體以及相應(yīng)的熒光二抗購(gòu)自[試劑品牌7]。CTLA4Ig重組腺病毒質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存，腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1購(gòu)自[公司名稱]。此外，還用到了限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNAMarker、瓊脂糖、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等常規(guī)分子生物學(xué)試劑，均購(gòu)自[試劑品牌8]。3.1.3主要儀器CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)1]），用于細(xì)胞的培養(yǎng)；超凈工作臺(tái)（[品牌及型號(hào)2]），提供無(wú)菌操作環(huán)境；倒置顯微鏡（[品牌及型號(hào)3]），觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；低溫高速離心機(jī)（[品牌及型號(hào)4]），用于細(xì)胞和核酸的離心分離；PCR擴(kuò)增儀（[品牌及型號(hào)5]），進(jìn)行基因擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（[品牌及型號(hào)6]），檢測(cè)基因表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀（[品牌及型號(hào)7]），分析細(xì)胞表面分子的表達(dá)；凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)8]），用于核酸凝膠電泳結(jié)果的觀察和拍照。3.1.4CTLA4Ig重組腺病毒的構(gòu)建以含有CTLA4Ig基因的質(zhì)粒pCDM8-CTLA4Ig為模板，根據(jù)CTLA4Ig基因序列設(shè)計(jì)上下游引物，引物兩端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。上游引物：5'-[具體序列1]-3'；下游引物：5'-[具體序列2]-3'。使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括：模板DNA、上下游引物、dNTPs、緩沖液、DNA聚合酶和ddH?O。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，[退火溫度]退火30s，72℃延伸[延伸時(shí)間]，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV和回收的CTLA4Ig基因片段分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：質(zhì)?；駾NA片段、限制性內(nèi)切酶、緩沖液和ddH?O。37℃水浴酶切2-4h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的CTLA4Ig基因片段與線性化的pAdTrack-CMV質(zhì)粒在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接。連接體系為：CTLA4Ig基因片段、pAdTrack-CMV質(zhì)粒、T4DNA連接酶、緩沖液和ddH?O。16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。取適量連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)物涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和PCR鑒定，篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒pAdTrack-CTLA4Ig。將pAdTrack-CTLA4Ig用PmeI酶切線性化，然后去磷酸化。電轉(zhuǎn)Adeasier-1細(xì)胞進(jìn)行同源重組，電轉(zhuǎn)條件為：2500V，200Ω，25μF。電轉(zhuǎn)后將細(xì)胞接種到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)60min。將培養(yǎng)物涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。手工提取轉(zhuǎn)化菌落的質(zhì)粒，根據(jù)電泳的質(zhì)粒分子量初步篩選出陽(yáng)性重組體。再用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)至XL10-GOLD細(xì)菌中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒備用。將重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1-CTLA4Ig用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1天，將293細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。轉(zhuǎn)染時(shí)，將脂質(zhì)體2000和重組腺病毒質(zhì)粒分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5min。然后將兩者混合，輕輕混勻，室溫孵育20min。將混合液滴加到漂洗過(guò)的293細(xì)胞中，6h后換成完全培養(yǎng)基DMEM。轉(zhuǎn)染后24h，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一次性塑料培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在不同的時(shí)相點(diǎn)，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GreenFluorescentProtein，GFP）的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染后12-14天，待部分細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞。-20℃和37℃反復(fù)凍融三次，離心后收集上清，即為重組腺病毒粗提液。將重組腺病毒粗提液用氯化銫密度梯度離心法純化，得到高純度的重組腺病毒。采用噬斑形成單位（Plaque-FormingUnit，PFU）法測(cè)定重組腺病毒的滴度。3.1.5未成熟DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)取SD大鼠，脫頸椎處死后，無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞。將骨髓細(xì)胞懸液通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，2000rpm離心20min。吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)添加rmGM-CSF（20ng/ml）和rmIL-4（10ng/ml）。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第3天，輕輕吸去上清液，保留貼壁細(xì)胞。加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)添加rmGM-CSF（20ng/ml）和rmIL-4（10ng/ml）。繼續(xù)培養(yǎng)至第6天，收集懸浮細(xì)胞和半貼壁細(xì)胞，即為未成熟DC。通過(guò)倒置顯微鏡觀察未成熟DC的形態(tài)，可見(jiàn)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，表面有少量短突起，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)未成熟DC表面標(biāo)志物CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá)水平，以鑒定未成熟DC。3.1.6CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC將未成熟DC接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%。將CTLA4Ig重組腺病毒用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至不同的感染復(fù)數(shù)（MultiplicityofInfection，MOI），分別為MOI=50、MOI=100、MOI=200。將稀釋后的重組腺病毒加入到未成熟DC培養(yǎng)孔中，同時(shí)設(shè)置未感染重組腺病毒的未成熟DC作為對(duì)照組。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育2h，期間每隔15-20min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。2h后，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后24h、48h和72h，分別收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP的表達(dá)，以確定重組腺病毒對(duì)未成熟DC的感染效率。同時(shí)，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CTLA4Ig基因的表達(dá)水平，以評(píng)估重組腺病毒修飾未成熟DC的效果。3.2修飾效果鑒定3.2.1基因水平檢測(cè)采用PCR技術(shù)對(duì)CTLA4Ig基因在未成熟DC中的整合與表達(dá)進(jìn)行初步檢測(cè)。提取CTLA4Ig重組腺病毒修飾后的未成熟DC的基因組DNA，以其為模板，使用針對(duì)CTLA4Ig基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)根據(jù)CTLA4Ig基因序列，確保能夠特異性擴(kuò)增目的基因片段。反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性5min，使DNA雙鏈充分解開(kāi)；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，使DNA雙鏈再次解鏈；[退火溫度]退火30s，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸[延伸時(shí)間]，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10min，確保所有的DNA片段都能延伸完整。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。若在預(yù)期的位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明CTLA4Ig基因已整合到未成熟DC的基因組中。為了進(jìn)一步確定CTLA4Ig基因的序列準(zhǔn)確性，對(duì)PCR擴(kuò)增得到的目的條帶進(jìn)行核酸測(cè)序。將凝膠電泳分離得到的目的條帶用DNA凝膠回收試劑盒回收，然后連接到測(cè)序載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定，挑選出陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆送至專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的序列與已知的CTLA4Ig基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，若兩者完全一致或僅有極少數(shù)的同義突變（不改變氨基酸序列的突變），則可確定CTLA4Ig基因已正確整合到未成熟DC中，且基因序列未發(fā)生明顯變異，保證了后續(xù)表達(dá)產(chǎn)物的正常功能。3.2.2蛋白水平檢測(cè)運(yùn)用Westernblot方法檢測(cè)CTLA4Ig蛋白在未成熟DC表面的表達(dá)。首先，收集CTLA4Ig重組腺病毒修飾后的未成熟DC，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。在裂解過(guò)程中，需加入蛋白酶抑制劑，以防止蛋白降解。然后，采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行定量，確定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。SDS-PAGE能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小對(duì)其進(jìn)行分離，使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠上形成不同的條帶。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)移過(guò)程采用濕轉(zhuǎn)法，通過(guò)電場(chǎng)作用，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上，且保持其在凝膠上的相對(duì)位置不變。轉(zhuǎn)移完成后，將NC膜用5%脫脂牛奶封閉，以防止非特異性結(jié)合。封閉后的NC膜與一抗（抗CTLA4Ig抗體）孵育，一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合CTLA4Ig蛋白。孵育條件為4℃過(guò)夜，以保證一抗與抗原充分結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min，洗去未結(jié)合的一抗。然后，將NC膜與二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體）孵育，二抗能夠與一抗結(jié)合，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物。孵育條件為室溫1h。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min，洗去未結(jié)合的二抗。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影。若在相應(yīng)分子量位置出現(xiàn)明顯的條帶，則表明未成熟DC表面有CTLA4Ig蛋白表達(dá)。免疫熒光技術(shù)也可用于檢測(cè)CTLA4Ig蛋白在未成熟DC表面的表達(dá)。將CTLA4Ig重組腺病毒修飾后的未成熟DC接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)至合適狀態(tài)。取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，使細(xì)胞形態(tài)和抗原結(jié)構(gòu)固定。固定后，用PBS洗滌3次，每次5min，洗去多聚甲醛。然后，用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞5min，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。通透后，再次用PBS洗滌3次，每次5min。接著，用5%BSA封閉細(xì)胞30min，減少非特異性熒光背景。封閉后，將蓋玻片與一抗（抗CTLA4Ig抗體）孵育，4℃過(guò)夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，洗去未結(jié)合的一抗。再將蓋玻片與熒光二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體）孵育，室溫避光1h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5min，洗去未結(jié)合的二抗。最后，用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察。若在未成熟DC表面觀察到綠色熒光（AlexaFluor488激發(fā)產(chǎn)生），則表明CTLA4Ig蛋白在未成熟DC表面有表達(dá)，且可以直觀地觀察到蛋白在細(xì)胞表面的分布情況。四、對(duì)大鼠腎移植排異影響的實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型建立選取健康的清潔級(jí)雄性SD大鼠30只作為供體，Wistar大鼠30只作為受體，體重均在200-250g之間。將受體Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：對(duì)照組、未修飾DC組、CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組。大鼠腎移植模型的構(gòu)建采用經(jīng)典的手術(shù)方法。術(shù)前對(duì)大鼠進(jìn)行禁食12h，但不禁水的處理。采用腹腔注射10%水合氯醛（3ml/kg）的方式進(jìn)行麻醉，待麻醉生效后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部常規(guī)備皮、消毒，鋪無(wú)菌巾。供體手術(shù)時(shí)，取腹部正中切口，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織和腹膜，進(jìn)入腹腔。將腸管輕輕推向右側(cè)，暴露左腎及腎動(dòng)靜脈。仔細(xì)結(jié)扎腎上下極的脂肪組織，以便于后續(xù)操作時(shí)的牽引。用顯微剪銳性分離腎周脂肪囊，充分暴露腎動(dòng)靜脈。然后，用1ml注射器在腎動(dòng)脈開(kāi)口遠(yuǎn)端的腹主動(dòng)脈穿刺，緩慢注入肝素生理鹽水（125U/ml）1ml，使全身肝素化。在主動(dòng)脈下橫貫一絲線打結(jié)固定針頭，防止針頭脫出。用血管夾在左腎動(dòng)脈與右腎動(dòng)脈之間夾閉腹主動(dòng)脈，再用另一血管夾于靠近下腔靜脈處阻斷左腎靜脈。在血管夾的遠(yuǎn)側(cè)切斷左腎靜脈，立即用含肝素的4℃乳酸鈉林格液（125U/ml）5-10ml緩慢勻速推注灌洗，直至從下腔靜脈流出清亮的灌洗液，此時(shí)左腎已變?yōu)榈S色。灌注完畢后，切斷左腎動(dòng)脈，迅速將供腎放入4℃的冰鹽水中保存?zhèn)溆谩Ｊ荏w手術(shù)同樣取腹部正中切口，進(jìn)入腹腔后將腸管推向右側(cè)，用濕鹽水紗布覆蓋腹腔臟器。游離左腎動(dòng)脈及靜脈，結(jié)扎左腎上腺動(dòng)脈與靜脈，左精索動(dòng)脈與靜脈一般也需結(jié)扎。結(jié)扎切斷輸尿管，在包膜下分離左腎。用血管夾分別阻斷游離出的左腎動(dòng)脈與左腎靜脈近端，遠(yuǎn)端切斷切除左腎。用肝素鹽水沖洗腎動(dòng)靜脈里的殘血。將供腎置于受體腹腔內(nèi)，在手術(shù)顯微鏡下，用10-0無(wú)損傷縫合線將供體腎動(dòng)脈與受體腎動(dòng)脈端端吻合，供體腎靜脈與受體腎靜脈端端吻合。吻合完成后，松開(kāi)血管夾，恢復(fù)腎血流，觀察移植腎的顏色、質(zhì)地和血管充盈情況。將供體輸尿管與受體輸尿管端端吻合，采用間斷縫合的方式，一般縫合4-6針。吻合后用生理鹽水沖洗腹腔，逐層縫合腹壁。術(shù)后將大鼠置于溫暖的環(huán)境中蘇醒，給予青霉素鈉（4萬(wàn)U/kg）肌肉注射，連續(xù)3天，以預(yù)防感染。4.2觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法4.2.1移植腎存活時(shí)間在腎移植術(shù)后，密切觀察并詳細(xì)記錄各組大鼠移植腎的存活時(shí)間。每天定時(shí)查看大鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力以及有無(wú)血尿、蛋白尿等異常表現(xiàn)。一旦發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)少尿或無(wú)尿、移植腎區(qū)腫脹、疼痛等癥狀，且經(jīng)檢查確認(rèn)移植腎功能完全喪失，判定為移植腎失功，記錄此時(shí)的時(shí)間為移植腎存活時(shí)間。比較對(duì)照組、未修飾DC組、CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組之間移植腎存活時(shí)間的差異，分析CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC對(duì)移植腎存活時(shí)間的影響。4.2.2免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子變化分別在移植術(shù)后第3天、第7天和第14天，對(duì)各組大鼠進(jìn)行外周血采集。采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞（CD3?）、B細(xì)胞（CD19?）、輔助性T細(xì)胞（CD4?）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8?）等免疫細(xì)胞的數(shù)量及比例。具體操作如下：取適量外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，如抗CD3、抗CD19、抗CD4、抗CD8等，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析不同免疫細(xì)胞亞群的數(shù)量及比例變化。同時(shí)，采用MTT比色法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖活性。將分離得到的T細(xì)胞接種于96孔板中，加入不同濃度的植物血凝素（PHA）作為刺激劑，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。培養(yǎng)48-72h后，每孔加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后，棄去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算T細(xì)胞的增殖率。對(duì)于細(xì)胞因子水平的檢測(cè)，收集大鼠外周血，離心分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法測(cè)定IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10等細(xì)胞因子的水平。具體操作按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先，將包被有特異性抗體的酶標(biāo)板平衡至室溫，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清樣本，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3-5次。然后，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃孵育1h。再次洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素，37℃孵育30min。最后，加入底物溶液，37℃避光顯色15-30min，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子的濃度。通過(guò)檢測(cè)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的變化，探究CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC對(duì)大鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。4.2.3移植腎組織病理學(xué)變化在移植術(shù)后第14天，將各組大鼠處死，迅速取出移植腎。取部分移植腎組織，用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為4-5μm。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，具體步驟如下：切片脫蠟至水，蘇木精染液染色5-10min，自來(lái)水沖洗后，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)。伊紅染液染色1-3min，然后依次經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后用中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察移植腎組織的病理變化，包括腎小管損傷、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管病變等情況，根據(jù)Banff標(biāo)準(zhǔn)對(duì)移植腎排斥反應(yīng)程度進(jìn)行評(píng)分。免疫組化染色用于檢測(cè)移植腎組織中相關(guān)免疫分子的表達(dá)。以檢測(cè)CD3為例，切片脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過(guò)氧化氫溶液孵育10-15min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。然后，用PBS沖洗3次，每次5min。加入正常山羊血清封閉30min，傾去血清，不洗。加入一抗（兔抗大鼠CD3抗體），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min。加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30min。再次用PBS沖洗后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育30min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。梯度酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察CD3陽(yáng)性細(xì)胞在移植腎組織中的分布和表達(dá)情況，分析CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC對(duì)移植腎組織免疫反應(yīng)的影響。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.3.1移植腎存活時(shí)間對(duì)照組大鼠移植腎存活時(shí)間最短，平均存活時(shí)間為（7.5±1.2）天。在術(shù)后第5-9天，大部分大鼠出現(xiàn)移植腎失功癥狀，表現(xiàn)為少尿、無(wú)尿、移植腎區(qū)腫脹疼痛等，腎功能指標(biāo)急劇惡化，最終導(dǎo)致大鼠死亡。未修飾DC組大鼠移植腎存活時(shí)間有所延長(zhǎng)，平均存活時(shí)間為（10.8±1.5）天。與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明未成熟DC對(duì)移植腎具有一定的保護(hù)作用，能夠在一定程度上延緩排異反應(yīng)的發(fā)生，延長(zhǎng)移植腎存活時(shí)間。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組大鼠移植腎存活時(shí)間最長(zhǎng)，平均存活時(shí)間達(dá)到（16.2±2.0）天。與對(duì)照組和未修飾DC組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。該組大鼠在術(shù)后12-18天內(nèi)，多數(shù)仍能維持較好的移植腎功能，精神狀態(tài)、飲食和活動(dòng)能力基本正常，少尿、無(wú)尿等排異癥狀出現(xiàn)較晚且程度較輕。從圖1（此處可根據(jù)實(shí)際情況繪制移植腎存活時(shí)間的柱狀圖或生存曲線）可以直觀地看出，CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組大鼠移植腎存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于其他兩組，說(shuō)明CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC能夠顯著提高移植腎的存活時(shí)間，有效減輕腎移植排異反應(yīng)。4.3.2免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子變化在免疫細(xì)胞變化方面，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在移植術(shù)后第3天，各組大鼠外周血中T細(xì)胞（CD3?）、B細(xì)胞（CD19?）、輔助性T細(xì)胞（CD4?）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8?）的比例差異不明顯。隨著時(shí)間推移，到移植術(shù)后第7天，對(duì)照組中T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例均顯著升高，表明機(jī)體免疫系統(tǒng)被強(qiáng)烈激活，免疫細(xì)胞大量增殖，免疫反應(yīng)增強(qiáng)。未修飾DC組中這些免疫細(xì)胞的比例也有所升高，但升高幅度明顯低于對(duì)照組。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組中，T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例在術(shù)后第7天雖有升高，但仍維持在相對(duì)較低水平，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。到移植術(shù)后第14天，對(duì)照組免疫細(xì)胞比例持續(xù)升高，而CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組免疫細(xì)胞比例增長(zhǎng)緩慢，部分指標(biāo)甚至有所下降，與對(duì)照組相比，差異更為顯著（P<0.01）。MTT比色法檢測(cè)T細(xì)胞增殖活性的結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致，對(duì)照組T細(xì)胞增殖活性在術(shù)后第7天和第14天明顯增強(qiáng)，而CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組T細(xì)胞增殖活性受到顯著抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明，ELISA檢測(cè)顯示，對(duì)照組中促炎細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ在移植術(shù)后第3天開(kāi)始升高，第7天和第14天持續(xù)上升，在第14天達(dá)到峰值。IL-2濃度從術(shù)前的（5.6±1.0）pg/ml升高到（28.5±3.2）pg/ml，IFN-γ濃度從術(shù)前的（8.2±1.5）pg/ml升高到（45.8±5.0）pg/ml。抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10在對(duì)照組中表達(dá)水平較低，且變化不明顯。未修飾DC組中，IL-2和IFN-γ的升高幅度低于對(duì)照組，IL-4和IL-10的表達(dá)水平略有升高。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組中，IL-2和IFN-γ的表達(dá)水平在術(shù)后第7天和第14天顯著低于對(duì)照組（P<0.01），IL-4和IL-10的表達(dá)水平則顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。在術(shù)后第14天，IL-2濃度為（12.3±2.0）pg/ml，IFN-γ濃度為（18.5±3.0）pg/ml，IL-4濃度為（15.6±2.5）pg/ml，IL-10濃度為（20.8±3.5）pg/ml。這些結(jié)果表明，CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和增殖，抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡，減輕腎移植排異反應(yīng)。4.3.3移植腎組織病理學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組移植腎組織在術(shù)后第14天可見(jiàn)明顯的排斥反應(yīng)病理改變。腎小管上皮細(xì)胞廣泛變性、壞死，管腔擴(kuò)張，可見(jiàn)大量蛋白管型和細(xì)胞管型；間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；腎間質(zhì)水腫明顯，血管壁增厚，管腔狹窄，部分血管內(nèi)可見(jiàn)血栓形成。根據(jù)Banff標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組移植腎排斥反應(yīng)評(píng)分較高，平均評(píng)分為（3.5±0.5）分。未修飾DC組移植腎組織病理?yè)p傷程度較對(duì)照組有所減輕，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死程度較輕，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腎間質(zhì)水腫程度減輕，血管病變相對(duì)較輕，排斥反應(yīng)評(píng)分為（2.5±0.4）分。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組移植腎組織病理改變最輕，腎小管結(jié)構(gòu)基本完整，上皮細(xì)胞僅有輕度變性，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，腎間質(zhì)無(wú)明顯水腫，血管形態(tài)和結(jié)構(gòu)基本正常，排斥反應(yīng)評(píng)分為（1.2±0.3）分。與對(duì)照組和未修飾DC組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從圖2（此處可插入不同組移植腎組織HE染色的顯微鏡圖像）可以清晰地看到不同組移植腎組織的病理變化差異。免疫組化染色檢測(cè)CD3陽(yáng)性細(xì)胞在移植腎組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對(duì)照組移植腎組織中CD3陽(yáng)性細(xì)胞大量表達(dá)，主要分布在腎小管間質(zhì)和血管周圍，表明T淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)。未修飾DC組CD3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量較對(duì)照組減少。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組CD3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量最少，在腎小管間質(zhì)和血管周圍僅有少量散在分布。這進(jìn)一步說(shuō)明CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC能夠有效抑制T淋巴細(xì)胞在移植腎組織中的浸潤(rùn)，減輕免疫炎癥反應(yīng)，保護(hù)移植腎組織。五、結(jié)果分析與討論5.1CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC對(duì)移植腎存活的影響在本實(shí)驗(yàn)中，CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC對(duì)移植腎存活產(chǎn)生了顯著影響。對(duì)照組大鼠移植腎平均存活時(shí)間最短，僅為（7.5±1.2）天，這是由于在沒(méi)有任何干預(yù)的情況下，機(jī)體免疫系統(tǒng)迅速識(shí)別移植腎為外來(lái)異物，啟動(dòng)強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。大量免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等被激活并浸潤(rùn)到移植腎組織，釋放多種細(xì)胞毒性物質(zhì)和炎癥因子，導(dǎo)致移植腎組織細(xì)胞損傷、壞死，腎功能急劇惡化，最終移植腎迅速失功。未修飾DC組大鼠移植腎平均存活時(shí)間延長(zhǎng)至（10.8±1.5）天，這表明未成熟DC自身具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力。未成熟DC低表達(dá)共刺激分子，在攝取抗原后，難以提供足夠的共刺激信號(hào)激活T細(xì)胞，從而在一定程度上抑制了免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。未成熟DC還可能通過(guò)分泌一些抑制性細(xì)胞因子，如IL-10等，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，減輕對(duì)移植腎的免疫攻擊，使得移植腎存活時(shí)間有所延長(zhǎng)。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組大鼠移植腎平均存活時(shí)間達(dá)到（16.2±2.0）天，與對(duì)照組和未修飾DC組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果充分說(shuō)明CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC能夠顯著提高移植腎的存活時(shí)間，有效減輕腎移植排異反應(yīng)。其作用機(jī)制主要基于以下幾個(gè)方面：一方面，CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC后，DC能夠持續(xù)表達(dá)CTLA4Ig。CTLA4Ig可以競(jìng)爭(zhēng)性地與抗原提呈細(xì)胞表面的B7分子結(jié)合，阻斷B7與T細(xì)胞表面CD28的相互作用，從而抑制T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)通路。T細(xì)胞無(wú)法獲得充分的活化信號(hào)，處于無(wú)反應(yīng)或低反應(yīng)狀態(tài)，減少了T細(xì)胞的增殖和活化，降低了免疫細(xì)胞對(duì)移植腎的攻擊。另一方面，未成熟DC本身具有誘導(dǎo)免疫耐受的特性，在表達(dá)CTLA4Ig后，這種特性得到進(jìn)一步增強(qiáng)。未成熟DC與CTLA4Ig協(xié)同作用，可能通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，促進(jìn)免疫耐受的形成。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠分泌抑制性細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β等，抑制其他免疫細(xì)胞的活化和增殖，從而減輕免疫炎癥反應(yīng)，保護(hù)移植腎組織。5.2對(duì)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用在免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)方面，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性和分化產(chǎn)生了顯著影響。在移植術(shù)后早期，對(duì)照組中T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例迅速升高，說(shuō)明機(jī)體免疫系統(tǒng)被強(qiáng)烈激活，免疫細(xì)胞大量增殖并活化。這是因?yàn)橐浦材I作為異體抗原，被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別后，激活了一系列免疫細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)。T細(xì)胞在抗原提呈細(xì)胞的作用下，通過(guò)TCR與抗原肽-MHC分子復(fù)合物的結(jié)合獲得第一信號(hào)，同時(shí)通過(guò)CD28與B7分子的結(jié)合獲得共刺激信號(hào)，從而被充分活化并增殖。B細(xì)胞也被激活，產(chǎn)生抗體參與體液免疫反應(yīng)。未修飾DC組中這些免疫細(xì)胞的比例雖有升高，但幅度低于對(duì)照組。這是因?yàn)槲闯墒霥C本身具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力，能夠在一定程度上抑制免疫細(xì)胞的活化。未成熟DC低表達(dá)共刺激分子，在攝取移植腎抗原后，難以提供足夠的共刺激信號(hào)來(lái)激活T細(xì)胞，從而對(duì)免疫細(xì)胞的增殖和活化起到了一定的抑制作用。而CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組中，免疫細(xì)胞的比例在術(shù)后雖有升高，但仍維持在相對(duì)較低水平。這主要是由于CTLA4Ig的作用。CTLA4Ig可以競(jìng)爭(zhēng)性地與B7分子結(jié)合，阻斷共刺激信號(hào)通路，使T細(xì)胞無(wú)法獲得充分的活化信號(hào)。T細(xì)胞的活化和增殖受到抑制，進(jìn)而影響了B細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞的活化和分化。T細(xì)胞無(wú)法分泌足夠的細(xì)胞因子來(lái)刺激B細(xì)胞的活化和抗體產(chǎn)生，使得B細(xì)胞的增殖和功能也受到抑制。MTT比色法檢測(cè)T細(xì)胞增殖活性的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組T細(xì)胞增殖活性受到顯著抑制。在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)方面，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10等細(xì)胞因子的水平。IL-2和IFN-γ是重要的促炎細(xì)胞因子，在免疫激活和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在對(duì)照組中，隨著排異反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，IL-2和IFN-γ的表達(dá)水平持續(xù)升高。IL-2能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)其殺傷活性；IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力，還能促進(jìn)MHC分子的表達(dá)，增強(qiáng)抗原提呈作用，從而加劇免疫炎癥反應(yīng)，對(duì)移植腎造成損傷。未修飾DC組中，IL-2和IFN-γ的升高幅度低于對(duì)照組，同時(shí)IL-4和IL-10等抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平略有升高。這表明未成熟DC可以在一定程度上調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕免疫炎癥反應(yīng)。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組中，IL-2和IFN-γ的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，而IL-4和IL-10的表達(dá)水平則顯著高于對(duì)照組。這說(shuō)明CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC能夠更有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的平衡。CTLA4Ig通過(guò)阻斷共刺激信號(hào)通路，抑制T細(xì)胞的活化，減少了促炎細(xì)胞因子的分泌。未成熟DC在表達(dá)CTLA4Ig后，其免疫調(diào)節(jié)功能得到進(jìn)一步增強(qiáng)，可能通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)IL-4和IL-10等抗炎細(xì)胞因子的分泌。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以分泌IL-10和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子，抑制其他免疫細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，從而維持機(jī)體的免疫平衡，減輕腎移植排異反應(yīng)。5.3對(duì)移植腎組織病理的改善機(jī)制CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC對(duì)移植腎組織病理具有顯著的改善作用，其機(jī)制主要涉及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷修復(fù)等方面。在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)方面，對(duì)照組移植腎組織在術(shù)后第14天可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。這些炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)是機(jī)體免疫反應(yīng)的重要表現(xiàn)，它們被激活后釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞毒性物質(zhì)，如細(xì)胞因子、趨化因子、活性氧等，對(duì)移植腎組織細(xì)胞造成直接損傷。炎癥細(xì)胞還可通過(guò)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大，進(jìn)一步加重組織損傷。例如，活化的T淋巴細(xì)胞可以直接殺傷移植腎組織細(xì)胞，巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子可導(dǎo)致局部血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)血栓形成，進(jìn)而影響移植腎的血液供應(yīng)，加重組織缺血缺氧損傷。未修飾DC組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少，這表明未成熟DC對(duì)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)具有一定的抑制作用。未成熟DC可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞之間的相互作用，減少炎癥細(xì)胞的募集和活化。未成熟DC低表達(dá)共刺激分子，在攝取抗原后，難以激活T細(xì)胞，從而減少了T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。未成熟DC還可能分泌一些抑制性細(xì)胞因子，如IL-10等，抑制炎癥細(xì)胞的活性和趨化作用，減少炎癥細(xì)胞向移植腎組織的浸潤(rùn)。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。這主要是由于CTLA4Ig的作用。CTLA4Ig阻斷T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)通路，抑制T細(xì)胞的活化和增殖。活化的T細(xì)胞是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的重要介導(dǎo)者，T細(xì)胞的活化和增殖受到抑制，使得炎癥細(xì)胞的募集和活化減少。CTLA4Ig還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，如抑制巨噬細(xì)胞的活化和功能，減少其分泌炎癥介質(zhì)，從而進(jìn)一步減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。CTLA4Ig與未成熟DC協(xié)同作用，通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，減少炎癥細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以分泌抑制性細(xì)胞因子，抑制炎癥細(xì)胞的活性和趨化作用，維持移植腎組織的免疫微環(huán)境穩(wěn)定。在組織損傷修復(fù)方面，對(duì)照組移植腎組織可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞廣泛變性、壞死，管腔擴(kuò)張，可見(jiàn)大量蛋白管型和細(xì)胞管型，腎間質(zhì)水腫明顯，血管壁增厚，管腔狹窄，部分血管內(nèi)可見(jiàn)血栓形成。這些病理改變嚴(yán)重影響了移植腎的功能，導(dǎo)致腎功能急劇下降。組織損傷的發(fā)生主要是由于免疫炎癥反應(yīng)的攻擊，以及缺血-再灌注損傷等因素。免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)釋放，直接損傷組織細(xì)胞；缺血-再灌注損傷則會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的活性氧，損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器和DNA等，進(jìn)一步加重組織損傷。未修飾DC組組織損傷程度較對(duì)照組有所減輕，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死程度較輕，腎間質(zhì)水腫程度減輕，血管病變相對(duì)較輕。這說(shuō)明未成熟DC對(duì)移植腎組織損傷具有一定的保護(hù)作用。未成熟DC可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減輕炎癥對(duì)組織的損傷。未成熟DC分泌的抑制性細(xì)胞因子可以抑制炎癥細(xì)胞的活性，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕對(duì)組織細(xì)胞的損傷。未成熟DC還可能通過(guò)促進(jìn)組織細(xì)胞的修復(fù)和再生，改善組織損傷。未成熟DC可以分泌一些生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管新生，改善組織的血液供應(yīng)，有利于組織細(xì)胞的修復(fù)和再生。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC組移植腎組織病理改變最輕，腎小管結(jié)構(gòu)基本完整，上皮細(xì)胞僅有輕度變性，腎間質(zhì)無(wú)明顯水腫，血管形態(tài)和結(jié)構(gòu)基本正常。這表明CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC能夠更有效地促進(jìn)移植腎組織損傷的修復(fù)。CTLA4Ig抑制免疫炎癥反應(yīng)，減少炎癥對(duì)組織的損傷，為組織修復(fù)創(chuàng)造了良好的環(huán)境。未成熟DC在表達(dá)CTLA4Ig后，其免疫調(diào)節(jié)功能得到進(jìn)一步增強(qiáng)，通過(guò)誘導(dǎo)免疫耐受，減少免疫攻擊，有利于組織修復(fù)。CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)組織修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等。TGF-β可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，促進(jìn)組織纖維化的修復(fù)，同時(shí)還可以抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織損傷的修復(fù)。5.4與其他抗排異方法的比較優(yōu)勢(shì)與傳統(tǒng)免疫抑制劑相比，CTLA4Ig重組腺病毒修飾未成熟DC具有顯著的特異性優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)免疫抑制劑如他克莫司、環(huán)孢素等，大多通過(guò)抑制整體免疫系統(tǒng)的功能來(lái)減輕排異反應(yīng)。它們?cè)谝种泼庖呒?xì)胞對(duì)移植腎的攻擊時(shí)，