RUNX3與小檗堿：胃癌治療的新曙光——基于基因調(diào)控與細(xì)胞增殖凋亡機(jī)制的探究一、引言1.1研究背景胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均處于高位。據(jù)2022年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，胃癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)96.84萬例，占所有新增癌癥病例的4.9%，位居全球癌癥發(fā)病率第五位；死亡病例數(shù)為65.99萬例，占比6.8%，位列全球癌癥死亡原因第五。在中國，胃癌同樣是癌癥防治的重點(diǎn)。2022年，中國新發(fā)胃癌病例數(shù)35.87萬例，占全國新增癌癥病例數(shù)的7.4%，位居國內(nèi)新發(fā)癌癥第五位；死亡人數(shù)高達(dá)26.04萬例，占全國癌癥死亡病例數(shù)的10.1%，排名癌癥死亡原因第三位。胃癌不僅給患者帶來極大的痛苦，也給家庭和社會造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管目前胃癌的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但總體治愈率仍然較低，主要原因在于胃癌細(xì)胞的特異性和耐藥性，以及大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯過最佳治療時(shí)機(jī)。因此，深入探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，對于提高胃癌的治療效果和患者生存率具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義。RUNX3作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞生長、發(fā)育和凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它是runt基因家族成員之一，位于人染色體1號短臂的1p36.1，含有P1和P2兩個啟動子、6個外顯子和1290bp開放閱讀框，全長67kb，廣泛表達(dá)于消化道上皮細(xì)胞。大量研究表明，RUNX3是一種腫瘤抑制基因，其表達(dá)缺失或降低與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，尤其是胃癌。在胃癌中，RUNX3的表達(dá)量顯著低于正常胃黏膜組織和胃黏膜不典型增生組織。RUNX3的失活或低表達(dá)會促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，從而加速胃癌的惡變和轉(zhuǎn)移。深入研究RUNX3對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控作用，有助于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。小檗堿是一種從黃連、黃柏等傳統(tǒng)中藥中提取的天然生物堿，具有多種生物活性，如抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，包括胃癌細(xì)胞。小檗堿能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，還能抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力。其作用機(jī)制可能涉及多個信號通路和分子靶點(diǎn)，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制PI3K/Akt、MAPK等信號通路的激活。然而，小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入研究。探索小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，有望為胃癌的治療提供新的藥物選擇和治療策略。1.2研究目的與問題提出基于胃癌嚴(yán)峻的發(fā)病形勢以及RUNX3和小檗堿在胃癌研究中的潛在價(jià)值，本研究旨在深入探究RUNX3對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控作用，以及小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)一步剖析小檗堿對RUNX3表達(dá)和胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。具體而言，本研究擬解決以下關(guān)鍵問題：RUNX3如何影響胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的凋亡過程？小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)怎樣的劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系？其作用機(jī)制涉及哪些信號通路和分子靶點(diǎn)？小檗堿是否能夠通過調(diào)節(jié)RUNX3的表達(dá)，間接影響胃癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用？通過對這些問題的深入研究，有望揭示胃癌發(fā)生、發(fā)展的新機(jī)制，為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和藥物選擇，為提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量提供理論支持和實(shí)踐指導(dǎo)。1.3研究創(chuàng)新點(diǎn)與意義本研究具有多方面的創(chuàng)新點(diǎn)，在胃癌發(fā)病機(jī)制研究上，將RUNX3對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控作用作為重點(diǎn)，從分子層面深入剖析RUNX3如何通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的凋亡過程，為揭示胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供新的視角。過往研究雖涉及RUNX3與胃癌的關(guān)聯(lián)，但對其在凋亡相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的具體作用及分子機(jī)制的深入探究仍顯不足，本研究有望填補(bǔ)這一空白。在小檗堿抗胃癌機(jī)制研究方面，全面探討小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，包括劑量效應(yīng)關(guān)系、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系以及涉及的信號通路和分子靶點(diǎn)，為闡明小檗堿的抗腫瘤作用機(jī)制提供更系統(tǒng)、深入的研究數(shù)據(jù)。目前小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制尚未完全明確，不同研究結(jié)果存在差異，本研究有助于進(jìn)一步明確小檗堿抗胃癌的具體作用途徑。此外，本研究創(chuàng)新性地將RUNX3和小檗堿相結(jié)合，探索小檗堿是否能夠通過調(diào)節(jié)RUNX3的表達(dá)，間接影響胃癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用，為胃癌的聯(lián)合治療提供新的思路和潛在方案。這種將天然藥物與腫瘤抑制基因相結(jié)合的研究模式，在胃癌治療研究領(lǐng)域具有一定的創(chuàng)新性和前瞻性。從理論意義來看，本研究有助于深入理解胃癌的發(fā)病機(jī)制，明確RUNX3在胃癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中的關(guān)鍵作用，以及小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的影響機(jī)制，為胃癌的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)，豐富腫瘤分子生物學(xué)和天然藥物抗腫瘤機(jī)制的理論體系。在臨床應(yīng)用方面，本研究結(jié)果有望為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和藥物選擇。若證實(shí)RUNX3可作為有效的治療靶點(diǎn)，將為開發(fā)針對RUNX3的靶向治療藥物或基因治療策略提供理論支持；明確小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制，可能推動小檗堿或其衍生物作為新型抗癌藥物的研發(fā)，或?yàn)槲赴┑穆?lián)合治療提供新的方案，提高胃癌的治療效果，改善患者的生存率和生活質(zhì)量。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，本研究對小檗堿抗胃癌作用機(jī)制的深入研究，有助于開發(fā)基于小檗堿的新型抗癌藥物，或通過結(jié)構(gòu)修飾提高小檗堿的抗癌活性和生物利用度，為抗癌藥物的研發(fā)提供新的方向和思路。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1胃癌概述2.1.1胃癌的發(fā)病機(jī)制胃癌的發(fā)病是一個多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，涉及環(huán)境、飲食、感染、遺傳等多種因素的交互作用。從環(huán)境因素來看，飲食結(jié)構(gòu)和習(xí)慣對胃癌的發(fā)生有著顯著影響。長期食用高鹽、腌制、煙熏、霉變食物，以及缺乏新鮮蔬菜和水果的攝入，會增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。高鹽食物會損傷胃黏膜，破壞胃黏膜的保護(hù)屏障，使胃黏膜更容易受到其他致癌因素的侵害；腌制、煙熏食物中含有亞硝酸鹽、多環(huán)芳烴等致癌物質(zhì)，在胃酸的作用下，亞硝酸鹽可轉(zhuǎn)化為亞硝胺類化合物，具有強(qiáng)烈的致癌作用。感染因素中，幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染被公認(rèn)為是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一。Hp感染會引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡失衡，促進(jìn)胃黏膜萎縮、腸化生和異型增生的發(fā)生，進(jìn)而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%-90%的胃癌患者存在Hp感染。遺傳因素在胃癌發(fā)病中也起著關(guān)鍵作用，約10%的胃癌患者具有家族遺傳傾向。一些遺傳突變，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）基因突變、乳腺癌易感基因（BRCA1/BRCA2）突變等，與遺傳性胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。此外，癌前狀態(tài)，如慢性萎縮性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、殘胃炎等，以及上皮內(nèi)瘤變，都是胃癌發(fā)生的重要癌前病變。這些病變會導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞的異常增殖和分化，逐漸發(fā)展為胃癌?；蛘{(diào)控失衡在胃癌的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)核心地位，眾多癌基因的激活和抑癌基因的失活參與其中。癌基因如Ras、Myc、HER2等，通過多種信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力，從而推動胃癌的發(fā)生和發(fā)展。Ras基因激活后，可通過Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞持續(xù)增殖；HER2基因擴(kuò)增或過表達(dá)，可激活PI3K/Akt、MAPK等信號通路，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖、存活和侵襲能力。抑癌基因如p53、PTEN、RUNX3等的失活或表達(dá)降低，會削弱對細(xì)胞增殖和腫瘤生長的抑制作用。p53基因作為“基因組衛(wèi)士”，在細(xì)胞DNA損傷時(shí)，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)DNA修復(fù)或啟動細(xì)胞凋亡，防止細(xì)胞癌變。當(dāng)p53基因發(fā)生突變或缺失時(shí)，其正常功能喪失，無法有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長。RUNX3作為一種重要的抑癌基因，通過調(diào)控細(xì)胞生長、凋亡和分化相關(guān)基因的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，在胃癌中，RUNX3常因啟動子甲基化、雜合性缺失等原因?qū)е卤磉_(dá)缺失或降低，從而失去對胃癌細(xì)胞的抑制作用。這種癌基因與抑癌基因之間的調(diào)控失衡，打破了細(xì)胞正常的生長和凋亡平衡，使得胃癌細(xì)胞得以異常增殖和存活，最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。2.1.2胃癌的流行現(xiàn)狀從全球范圍來看，胃癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC）發(fā)布的GLOBOCAN2022數(shù)據(jù)，2022年全球胃癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)96.84萬例，占所有新增癌癥病例的4.9%，位居全球癌癥發(fā)病率第五位；死亡病例數(shù)為65.99萬例，占比6.8%，位列全球癌癥死亡原因第五。在地區(qū)分布上，東亞地區(qū)是胃癌的高發(fā)區(qū)，尤其是中國、日本和韓國。中國是全球胃癌發(fā)病和死亡人數(shù)最多的國家，2022年中國新發(fā)胃癌病例數(shù)35.87萬例，占全球的37.0%，位居國內(nèi)新增癌癥第五位；死亡人數(shù)高達(dá)26.04萬例，占全球的39.5%，排名癌癥死亡原因第三位。日本和韓國同樣面臨著較高的胃癌負(fù)擔(dān)，這兩個國家的胃癌發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平。在歐洲和北美地區(qū)，胃癌的發(fā)病率相對較低，但仍然是不容忽視的健康問題。在非洲和拉丁美洲，胃癌的發(fā)病率和死亡率也呈現(xiàn)出一定的地區(qū)差異，部分地區(qū)的發(fā)病率較高，而其他地區(qū)則相對較低。在中國，胃癌的流行現(xiàn)狀同樣嚴(yán)峻。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，中國胃癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出下降趨勢，但仍然處于較高水平。從地區(qū)分布來看，胃癌的發(fā)病率和死亡率存在明顯的地域差異。農(nóng)村地區(qū)的胃癌發(fā)病率和死亡率高于城市地區(qū)，可能與農(nóng)村地區(qū)居民的飲食結(jié)構(gòu)、衛(wèi)生條件、醫(yī)療資源等因素有關(guān)。偏遠(yuǎn)地區(qū)的胃癌發(fā)病率高于沿海地區(qū)，可能與偏遠(yuǎn)地區(qū)居民的飲食習(xí)慣、環(huán)境污染等因素有關(guān)。此外，男性胃癌的發(fā)病率和死亡率均高于女性，男性發(fā)病率約為女性的2-3倍，這可能與男性吸煙、飲酒、工作壓力大、飲食習(xí)慣不良等因素有關(guān)。從年齡分布來看，胃癌的發(fā)病率隨年齡的增長而逐漸升高，45歲以上人群是胃癌的高發(fā)人群，尤其是60-69歲年齡段的人群，胃癌的發(fā)病率和死亡率均達(dá)到高峰。2.1.3現(xiàn)有治療手段的局限目前，胃癌的主要治療手段包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，這些治療方法在一定程度上改善了胃癌患者的預(yù)后，但仍然存在諸多局限性。手術(shù)切除是胃癌治療的主要方法之一，對于早期胃癌患者，根治性手術(shù)切除有可能實(shí)現(xiàn)治愈。然而，大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤往往侵犯周圍組織和器官，或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致手術(shù)切除難度大，無法完全切除腫瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。對于晚期胃癌患者，手術(shù)治療的效果更為有限，往往只能進(jìn)行姑息性手術(shù)，以緩解癥狀，提高患者的生活質(zhì)量?；熓俏赴┚C合治療的重要組成部分，通過使用化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞，抑制腫瘤生長。然而，化療藥物缺乏特異性，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、肝腎功能損害等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。此外，胃癌細(xì)胞對化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，患者的生存期難以得到有效延長。放療是利用高能射線殺死癌細(xì)胞的一種治療方法，常用于胃癌的局部治療，如術(shù)前放療可縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除率；術(shù)后放療可降低局部復(fù)發(fā)率。但放療同樣存在副作用，如放射性胃炎、放射性腸炎、骨髓抑制等，且放療的適用范圍有限，對于晚期胃癌患者，放療的效果往往不理想。靶向治療和免疫治療是近年來胃癌治療領(lǐng)域的重要進(jìn)展，為部分胃癌患者帶來了新的希望。靶向治療藥物通過特異性地作用于腫瘤細(xì)胞的特定靶點(diǎn)，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長和增殖信號通路，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，靶向治療藥物的適用人群有限，僅適用于攜帶特定靶點(diǎn)突變的患者，且隨著治療時(shí)間的延長，患者容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失敗。免疫治療則是通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。雖然免疫治療在部分胃癌患者中取得了較好的療效，但并非所有患者都能從中受益，且免疫治療也存在一定的副作用，如免疫相關(guān)不良反應(yīng)，包括皮疹、腹瀉、內(nèi)分泌紊亂、肝腎功能損害等，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。此外，免疫治療的費(fèi)用較高，也限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。2.2RUNX3的研究進(jìn)展2.2.1RUNX3基因結(jié)構(gòu)與功能RUNX3基因位于人染色體1號短臂的1p36.1區(qū)域，其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，全長約67kb。該基因含有P1和P2兩個啟動子，這兩個啟動子在RUNX3基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著不同的作用，它們可以響應(yīng)不同的細(xì)胞信號和轉(zhuǎn)錄因子，從而精確地調(diào)控RUNX3在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平?；虬?個外顯子，通過選擇性剪接機(jī)制，可產(chǎn)生多種不同的轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步增加了蛋白質(zhì)功能的多樣性。其中，開放閱讀框長度為1290bp，編碼由429個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。RUNX3蛋白屬于runt基因家族，其N末端包含一個高度保守的runt結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域是RUNX3發(fā)揮功能的關(guān)鍵區(qū)域，它能夠與DNA序列特異性結(jié)合，識別并結(jié)合到許多增強(qiáng)子和啟動子中富含的核心DNA序列5'-pygpyggt-3'，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄過程。在正常生理?xiàng)l件下，RUNX3參與多種細(xì)胞生理活動，對細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化和凋亡起著重要的調(diào)控作用。在胚胎發(fā)育過程中，RUNX3對胃上皮、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育和分化至關(guān)重要。它能夠調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞的增殖和分化，維持胃黏膜的正常結(jié)構(gòu)和功能；在神經(jīng)系統(tǒng)中，RUNX3參與神經(jīng)元的分化和存活，對神經(jīng)回路的形成和功能維持具有重要作用；在免疫系統(tǒng)中，RUNX3調(diào)控免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能，影響免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和方向。在成年個體中，RUNX3通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞的過度增殖，維持細(xì)胞數(shù)量的平衡。它可以上調(diào)p21基因的表達(dá)，p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠抑制細(xì)胞周期從G1期向S期的過渡，從而抑制細(xì)胞增殖。RUNX3還能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過激活Bim等促凋亡基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，清除體內(nèi)受損或異常的細(xì)胞，維持組織和器官的正常功能。作為一種重要的抑癌基因，RUNX3在腫瘤抑制方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常細(xì)胞中，RUNX3通過抑制癌基因的表達(dá)和激活抑癌基因的功能，維持細(xì)胞的正常生長和分化狀態(tài)，防止細(xì)胞發(fā)生癌變。它可以抑制Wnt信號通路中β-連環(huán)蛋白/TCF4復(fù)合物的形成，從而阻斷Cdx2、Axin2、CyclinD1和c-Myc等癌基因的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。在腫瘤細(xì)胞中，RUNX3的表達(dá)常常受到抑制，導(dǎo)致其抑癌功能喪失，從而使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避正常的生長調(diào)控機(jī)制，發(fā)生異常增殖、遷移和侵襲。這種表達(dá)缺失或降低的現(xiàn)象在多種腫瘤中都有發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)了RUNX3在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要抑癌作用。2.2.2RUNX3與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系大量研究表明，RUNX3的低表達(dá)或缺失與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，RUNX3的表達(dá)水平明顯低于正常乳腺組織，且其表達(dá)缺失與乳腺癌的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。一項(xiàng)對100例乳腺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3低表達(dá)的患者5年生存率顯著低于RUNX3正常表達(dá)的患者，且RUNX3低表達(dá)組患者的腫瘤復(fù)發(fā)率更高。這表明RUNX3在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的抑制作用，其表達(dá)缺失可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而導(dǎo)致腫瘤的惡化和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，RUNX3基因的啟動子區(qū)域常發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致RUNX3表達(dá)沉默，進(jìn)而失去對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中RUNX3啟動子甲基化的發(fā)生率高達(dá)50%-70%，且甲基化程度與腫瘤的分期、分級和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過去甲基化藥物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，恢復(fù)RUNX3的表達(dá)，可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在肝癌中，RUNX3的表達(dá)水平也明顯降低，且其低表達(dá)與肝癌的早期復(fù)發(fā)和不良預(yù)后相關(guān)。研究表明，RUNX3可以通過抑制肝癌細(xì)胞中的PI3K/Akt信號通路，抑制細(xì)胞的增殖和存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)RUNX3表達(dá)缺失時(shí)，PI3K/Akt信號通路被過度激活，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。在肺癌中，RUNX3的表達(dá)缺失同樣與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一項(xiàng)對非小細(xì)胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3低表達(dá)的患者腫瘤分期更高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，5年生存率更低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3可以通過調(diào)控肺癌細(xì)胞中的EMT（上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化）過程，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。當(dāng)RUNX3表達(dá)降低時(shí)，肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的能力增強(qiáng)，從而更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在前列腺癌中，RUNX3的表達(dá)水平與腫瘤的分級和預(yù)后密切相關(guān)。低表達(dá)RUNX3的前列腺癌患者更容易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且生存時(shí)間更短。研究表明，RUNX3可以通過抑制前列腺癌細(xì)胞中的雄激素受體信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。這些研究結(jié)果表明，RUNX3作為一種重要的抑癌基因，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的抑制作用，其表達(dá)缺失或降低可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。2.2.3RUNX3在胃癌中的研究現(xiàn)狀在胃癌中，RUNX3的表達(dá)特征呈現(xiàn)出明顯的異常。研究表明，RUNX3在胃癌組織中的表達(dá)量顯著低于正常胃黏膜組織和胃黏膜不典型增生組織。通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，在正常胃黏膜組織中，RUNX3主要表達(dá)于胃上皮細(xì)胞的細(xì)胞核，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的陽性染色；而在胃癌組織中，RUNX3的表達(dá)明顯減弱或缺失，細(xì)胞核染色變淡或呈陰性。進(jìn)一步的定量分析顯示，胃癌組織中RUNX3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著低于正常胃黏膜組織，且RUNX3的表達(dá)水平與胃癌的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān)。在早期胃癌中，RUNX3的表達(dá)缺失率相對較低；隨著腫瘤的進(jìn)展，到了中晚期胃癌，RUNX3的表達(dá)缺失率明顯升高。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，其RUNX3的表達(dá)缺失率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。RUNX3表達(dá)缺失的胃癌患者預(yù)后較差，5年生存率明顯低于RUNX3正常表達(dá)的患者。RUNX3對胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為具有重要影響。大量體外實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)RUNX3的表達(dá)可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。通過將RUNX3基因轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞中，使細(xì)胞內(nèi)RUNX3的表達(dá)水平升高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，細(xì)胞周期阻滯在G1期，S期細(xì)胞比例減少。這是因?yàn)镽UNX3可以上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE等的活性，從而阻止細(xì)胞周期從G1期向S期的過渡，抑制細(xì)胞增殖。RUNX3還能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)RUNX3的表達(dá)可以激活Bim、Bax等促凋亡基因的表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路被激活，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)RUNX3的胃癌細(xì)胞，其凋亡率明顯高于對照組細(xì)胞。RUNX3對胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力也有抑制作用。通過Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)RUNX3的表達(dá)可以顯著降低胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這可能與RUNX3抑制了胃癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性有關(guān)。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，其表達(dá)和活性的升高與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)。RUNX3可以通過抑制MMP-2、MMP-9等的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。2.3小檗堿的研究進(jìn)展2.3.1小檗堿的來源與特性小檗堿（Berberine），又稱黃連素，是一種從黃連、黃柏、三顆針等多種傳統(tǒng)中藥中提取得到的異喹啉類生物堿。黃連是小檗堿的主要來源之一，其根莖中含有豐富的小檗堿，含量可達(dá)5%-8%。黃柏也是提取小檗堿的常用植物，其樹皮中含有較高濃度的小檗堿。小檗堿最早于1826年被M.-E.夏瓦利埃和G.佩爾坦從Xanthoxylonclava樹皮中首次獲得。從理化性質(zhì)來看，小檗堿從乙醚中可析出黃色針狀晶體，熔點(diǎn)為204-206oC(dec.)。它具有一定的穩(wěn)定性，但在儲存時(shí)需要注意低溫通風(fēng)低干燥的條件，應(yīng)根據(jù)需求限量存儲，以防過量。小檗堿味苦、性寒，入心、肝、胃、大腸經(jīng)，具有清火燥濕、泄火解毒的功效。在傳統(tǒng)中醫(yī)中，小檗堿常被用于治療濕熱瀉痢、黃疸尿赤、目赤腫痛、牙痛、消渴等病癥。小檗堿具有廣泛的生物活性。它的抗菌譜很廣，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、各型流感病毒及真菌類均有一定的抑制作用。小檗堿對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌等常見病原菌具有顯著的抑制效果，在臨床上常用于治療敏感細(xì)菌引起的腸道感染，如菌痢等。它還被證實(shí)具有抗腫瘤、抗糖尿病、神經(jīng)保護(hù)、抗病毒等多種藥理活性。在抗腫瘤方面，小檗堿能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力。在抗糖尿病方面，小檗堿可以通過改善胰島素敏感性、促進(jìn)胰島素分泌、影響腸道激素分泌、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種途徑降低血糖水平，對2型糖尿病具有一定的治療作用。在神經(jīng)保護(hù)方面，小檗堿能夠抑制神經(jīng)炎癥，減少氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，對阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病具有潛在的治療價(jià)值。在抗病毒方面，小檗堿對流感病毒、乙肝病毒、艾滋病病毒等多種病毒具有抑制作用，能夠阻止病毒的吸附、侵入和復(fù)制過程。2.3.2小檗堿的抗腫瘤作用小檗堿對多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，其抗腫瘤機(jī)制涉及多個方面。在細(xì)胞增殖抑制方面，小檗堿能夠干擾腫瘤細(xì)胞的代謝過程，抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，從而阻礙腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖。研究表明，小檗堿可以通過抑制乳腺癌細(xì)胞中的PI3K/Akt信號通路，下調(diào)CyclinD1、PCNA等細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。在前列腺癌細(xì)胞中，小檗堿能夠抑制雄激素受體信號通路，減少雄激素對腫瘤細(xì)胞的刺激，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。小檗堿還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，它可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，促進(jìn)促凋亡蛋白如Bax、Bim、caspase-3等的表達(dá)和激活，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號占主導(dǎo)地位，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。在肝癌細(xì)胞中，小檗堿可以通過上調(diào)Bax和caspase-3的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在肺癌細(xì)胞中，小檗堿能夠激活線粒體凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，激活caspase-9和caspase-3，從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。小檗堿還能阻滯腫瘤細(xì)胞周期，使腫瘤細(xì)胞停滯在特定的細(xì)胞周期階段，阻止其進(jìn)入下一個細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以將結(jié)直腸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，通過抑制CyclinD1、CyclinE等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，以及上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，無法進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。在白血病細(xì)胞中，小檗堿能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在S期，通過抑制DNA聚合酶的活性，阻礙DNA的合成，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖。小檗堿還能抑制腫瘤血管生成，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營養(yǎng)和氧氣。小檗堿可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）的表達(dá)和活性，阻斷VEGF信號通路，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而減少腫瘤血管的生成。在乳腺癌中，小檗堿能夠降低VEGF和VEGFR-2的表達(dá)水平，抑制腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。小檗堿還能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）等相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，影響腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在胃癌細(xì)胞中，小檗堿可以下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。2.3.3小檗堿抗胃癌的研究現(xiàn)狀目前，小檗堿抗胃癌的研究已取得了一定進(jìn)展，眾多研究表明，小檗堿對胃癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。在劑量效應(yīng)方面，隨著小檗堿濃度的增加，對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)小檗堿濃度為50μmol/L時(shí)，對胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖抑制率約為30%；當(dāng)濃度增加到100μmol/L時(shí)，增殖抑制率可達(dá)到50%以上；當(dāng)濃度達(dá)到200μmol/L時(shí)，增殖抑制率可超過70%。在時(shí)間效應(yīng)方面，隨著作用時(shí)間的延長，小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的抑制效果也逐漸增強(qiáng)。小檗堿作用于胃癌細(xì)胞MGC-80324小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率約為25%；作用48小時(shí)后，抑制率可提高到40%左右；作用72小時(shí)后，抑制率可達(dá)到50%以上。小檗堿還能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以上調(diào)胃癌細(xì)胞中Bax、Bim等促凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表達(dá)。通過這種方式，小檗堿打破了胃癌細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡，使促凋亡信號增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在對胃癌細(xì)胞BGC-823的研究中發(fā)現(xiàn)，小檗堿處理后，細(xì)胞內(nèi)Bax和Bim的蛋白水平明顯升高，而Bcl-2和Bcl-xL的蛋白水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率明顯增加。小檗堿還能阻滯胃癌細(xì)胞周期，將胃癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期或G2/M期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。在對胃癌細(xì)胞AGS的研究中發(fā)現(xiàn)，小檗堿作用后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例顯著減少，表明小檗堿將AGS細(xì)胞阻滯在G0/G1期。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，小檗堿可以上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)CyclinD1、CyclinE等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，從而使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。三、RUNX3對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1細(xì)胞系與主要試劑本實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901，這兩種細(xì)胞系是胃癌研究中常用的細(xì)胞模型，具有典型的胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性。細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。主要試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），用于胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)，其含有多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分，能夠滿足細(xì)胞生長的需求；胎牛血清（FBS，Gibco公司），為細(xì)胞提供生長所需的生長因子、激素、貼壁因子等；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Solarbio公司），用于細(xì)胞的消化傳代，使貼壁生長的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），用于將外源基因?qū)爰?xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低；TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取細(xì)胞總RNA，能夠快速、有效地裂解細(xì)胞，保護(hù)RNA不被降解；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基因表達(dá)水平，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；兔抗人RUNX3多克隆抗體（Abcam公司），用于檢測RUNX3蛋白的表達(dá)；兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司），用于檢測凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Proteintech公司），作為二抗，用于增強(qiáng)免疫印跡的信號；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（ThermoFisherScientific公司），與HRP結(jié)合后，在化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生熒光信號，用于檢測蛋白條帶。3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備實(shí)驗(yàn)所需儀器設(shè)備包括：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞生長所需的溫度、濕度和CO?濃度；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；低溫離心機(jī)（Eppendorf公司），用于離心分離細(xì)胞、RNA、蛋白質(zhì)等生物樣品；PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司），用于實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化，定量分析基因表達(dá)水平；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測PCR產(chǎn)物和蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果；電泳儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)的電泳分離；蛋白轉(zhuǎn)印儀（Bio-Rad公司），用于將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，以便進(jìn)行免疫印跡檢測；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），用于檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的結(jié)果。3.1.3RUNX3激活劑和抑制劑載體的構(gòu)建采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建RUNX3激活劑和抑制劑載體。首先，根據(jù)GenBank中RUNX3基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物兩端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。以人正常胃黏膜組織cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得RUNX3基因片段。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板cDNA1μL，ddH?O17.3μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的片段。將回收的RUNX3基因片段與pCMV-flag載體分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切體系為20μL，包括10×Buffer2μL，限制性內(nèi)切酶（10U/μL）各0.5μL，DNA5μL，ddH?O12μL。37℃酶切2h后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收酶切片段。使用T4DNA連接酶將酶切后的RUNX3基因片段與pCMV-flag載體進(jìn)行連接，連接體系為10μL，包括10×T4DNA連接酶Buffer1μL，T4DNA連接酶（350U/μL）0.5μL，載體片段2μL，基因片段5μL，ddH?O1.5μL。16℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測序分析，以確保RUNX3激活劑載體構(gòu)建成功。對于RUNX3抑制劑載體的構(gòu)建，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)。根據(jù)RUNX3基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)并合成3條針對RUNX3的小干擾RNA（siRNA）序列，同時(shí)合成一條陰性對照siRNA序列。將合成的siRNA序列退火形成雙鏈RNA，然后與線性化的pSilencer4.1-CMVneo載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測序分析，確定RUNX3抑制劑載體構(gòu)建成功。3.1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組處理將處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，將構(gòu)建好的RUNX3激活劑載體、抑制劑載體以及相應(yīng)的對照載體分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，然后每孔加入1.5mL無血清培養(yǎng)基。將適量的質(zhì)粒DNA與Lipofectamine3000試劑分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后，室溫孵育5min。將稀釋后的質(zhì)粒DNA與Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)共分為以下幾組：空白對照組，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理，僅加入等量的無血清培養(yǎng)基；陰性對照組，轉(zhuǎn)染空載體（pCMV-flag或pSilencer4.1-CMVneo）；RUNX3激活劑組，轉(zhuǎn)染RUNX3激活劑載體；RUNX3抑制劑組，轉(zhuǎn)染RUNX3抑制劑載體。每組設(shè)置3個復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.5檢測指標(biāo)與方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）法檢測RUNX3及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA模板1μL，ddH?O7.4μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。對于Westernblotting檢測，轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min。4℃，12000rpm離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，然后加入兔抗人RUNX3、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1RUNX3表達(dá)載體的驗(yàn)證對構(gòu)建的RUNX3激活劑和抑制劑載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示，RUNX3激活劑載體經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后，在1%瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)兩條清晰的條帶，一條為載體片段，大小約為5.5kb，另一條為RUNX3基因片段，大小約為1.3kb，與預(yù)期結(jié)果相符；RUNX3抑制劑載體酶切后也出現(xiàn)了預(yù)期大小的條帶，表明載體構(gòu)建成功。將酶切驗(yàn)證正確的載體進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果與GenBank中RUNX3基因的序列比對，相似度達(dá)到99%以上，進(jìn)一步證實(shí)了載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。3.2.2RUNX3對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，RUNX3激活劑組中胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901中RUNX3的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），分別為空白對照組的5.6倍和4.8倍；而RUNX3抑制劑組中RUNX3的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），分別為空白對照組的0.2倍和0.3倍。在凋亡相關(guān)基因方面，RUNX3激活劑組中Bax和Caspase-3、Caspase-8的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.01），Bax的mRNA表達(dá)水平分別為空白對照組的3.2倍和2.8倍，Caspase-3的mRNA表達(dá)水平分別為空白對照組的2.5倍和2.3倍，Caspase-8的mRNA表達(dá)水平分別為空白對照組的2.2倍和2.0倍；而Bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01），分別為空白對照組的0.4倍和0.5倍。RUNX3抑制劑組中，Bax和Caspase-3、Caspase-8的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01），Bcl-2的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.01）。這表明RUNX3的表達(dá)變化能夠顯著影響胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，上調(diào)RUNX3表達(dá)可促進(jìn)促凋亡基因的表達(dá)，抑制抗凋亡基因的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡；而下調(diào)RUNX3表達(dá)則產(chǎn)生相反的作用。3.2.3RUNX3對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Westernblotting檢測結(jié)果與mRNA表達(dá)水平的變化趨勢一致。與空白對照組和陰性對照組相比，RUNX3激活劑組中RUNX3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Bax、Caspase-3和Caspase-8蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.01），Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01）。在MGC-803細(xì)胞中，RUNX3激活劑組中RUNX3蛋白的表達(dá)量為空白對照組的4.5倍，Bax蛋白的表達(dá)量為空白對照組的2.8倍，Caspase-3蛋白的表達(dá)量為空白對照組的2.2倍，Caspase-8蛋白的表達(dá)量為空白對照組的2.0倍，Bcl-2蛋白的表達(dá)量為空白對照組的0.3倍；在SGC-7901細(xì)胞中，RUNX3激活劑組中RUNX3蛋白的表達(dá)量為空白對照組的4.2倍，Bax蛋白的表達(dá)量為空白對照組的2.5倍，Caspase-3蛋白的表達(dá)量為空白對照組的2.0倍，Caspase-8蛋白的表達(dá)量為空白對照組的1.8倍，Bcl-2蛋白的表達(dá)量為空白對照組的0.4倍。RUNX3抑制劑組中，RUNX3蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），Bax、Caspase-3和Caspase-8蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P<0.01），Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，RUNX3能夠在蛋白水平上調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響胃癌細(xì)胞的凋亡過程。3.3結(jié)果分析與討論3.3.1RUNX3調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的機(jī)制探討本研究結(jié)果表明，RUNX3能夠顯著調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響胃癌細(xì)胞的凋亡過程。具體而言，上調(diào)RUNX3的表達(dá)可促進(jìn)促凋亡基因Bax、Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡；而下調(diào)RUNX3的表達(dá)則會導(dǎo)致相反的結(jié)果。這一調(diào)控機(jī)制可能涉及多個層面。在轉(zhuǎn)錄水平上，RUNX3作為一種轉(zhuǎn)錄因子，其runt結(jié)構(gòu)域能夠與凋亡相關(guān)基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列結(jié)合，從而直接調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率。研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3可以直接結(jié)合到Bax基因啟動子區(qū)域的特定位點(diǎn)，促進(jìn)Bax基因的轉(zhuǎn)錄，使其mRNA表達(dá)水平升高；同時(shí)，RUNX3能夠抑制Bcl-2基因啟動子的活性，減少Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Bcl-2mRNA表達(dá)水平降低。在信號通路層面，RUNX3可能通過參與多條信號通路的調(diào)節(jié)，間接影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。TGF-β信號通路在細(xì)胞生長、分化和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，RUNX3是TGF-β信號通路的重要下游分子。當(dāng)TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白與RUNX3相互作用，共同調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。在胃癌細(xì)胞中，TGF-β信號通路激活后，Smad2/3與RUNX3結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物結(jié)合到Bax基因啟動子區(qū)域，促進(jìn)Bax基因的表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl-2基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和凋亡的關(guān)鍵信號通路之一。RUNX3可以通過抑制PI3K/Akt信號通路的活性，間接調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。在胃癌細(xì)胞中，下調(diào)RUNX3的表達(dá)會導(dǎo)致PI3K/Akt信號通路的激活，Akt磷酸化水平升高，進(jìn)而抑制Bad、Bim等促凋亡蛋白的活性，同時(shí)上調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞凋亡；而上調(diào)RUNX3的表達(dá)則可以抑制PI3K/Akt信號通路的激活，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。3.3.2研究結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)的對比分析與現(xiàn)有文獻(xiàn)相比，本研究結(jié)果具有一致性和獨(dú)特性。在一致性方面，眾多研究都證實(shí)了RUNX3在胃癌中發(fā)揮著重要的抑癌作用，其表達(dá)缺失或降低與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過上調(diào)和下調(diào)RUNX3的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了RUNX3對胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，與前人研究結(jié)果相符。在對胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901的研究中，上調(diào)RUNX3表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)RUNX3表達(dá)則抑制細(xì)胞凋亡，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。在對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響上，本研究結(jié)果也與現(xiàn)有文獻(xiàn)相符。已有研究表明，RUNX3可以通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的凋亡過程。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblotting檢測，再次證實(shí)了RUNX3對這些凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。本研究也具有一定的獨(dú)特性。在研究方法上，本研究采用了基因克隆技術(shù)構(gòu)建RUNX3激活劑和抑制劑載體，并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入胃癌細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了對RUNX3表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控，為深入研究RUNX3的功能提供了更有效的手段。以往研究多采用RNA干擾或過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等方法，本研究的基因克隆技術(shù)構(gòu)建載體方法更加穩(wěn)定和可靠，能夠更準(zhǔn)確地模擬RUNX3在體內(nèi)的表達(dá)變化。在研究內(nèi)容上，本研究不僅關(guān)注了RUNX3對常見凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-8的調(diào)控作用，還進(jìn)一步探討了RUNX3調(diào)控這些基因表達(dá)的潛在機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄水平和信號通路層面進(jìn)行了深入分析，為揭示RUNX3在胃癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制提供了更全面的視角。與以往研究相比，本研究在機(jī)制探討方面更加深入和系統(tǒng)，有助于進(jìn)一步明確RUNX3在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。3.3.3研究結(jié)果的潛在應(yīng)用價(jià)值本研究結(jié)果對于胃癌的治療和藥物研發(fā)具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。從治療角度來看，RUNX3作為一種關(guān)鍵的腫瘤抑制基因，其表達(dá)缺失或降低是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。因此，通過恢復(fù)RUNX3的表達(dá)，有望成為一種新的胃癌治療策略?？梢蚤_發(fā)基于基因治療的方法，利用病毒載體等手段將RUNX3基因?qū)胛赴┘?xì)胞中，恢復(fù)其正常表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長。也可以研發(fā)能夠激活RUNX3表達(dá)的小分子化合物或生物制劑，通過調(diào)節(jié)RUNX3的表達(dá)來治療胃癌。這種針對RUNX3的治療策略具有較高的特異性，能夠直接作用于胃癌細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，減少對正常細(xì)胞的損傷，有望提高胃癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。在藥物研發(fā)方面，本研究為開發(fā)新型抗癌藥物提供了重要的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。明確了RUNX3對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，為藥物研發(fā)人員提供了清晰的作用靶點(diǎn)和信號通路?？梢曰赗UNX3調(diào)控的信號通路，篩選和設(shè)計(jì)能夠調(diào)節(jié)這些信號通路活性的小分子化合物或生物制劑，開發(fā)新型的抗癌藥物。針對TGF-β信號通路和PI3K/Akt信號通路，設(shè)計(jì)能夠增強(qiáng)TGF-β信號通路活性或抑制PI3K/Akt信號通路活性的藥物，從而間接調(diào)節(jié)RUNX3的功能，達(dá)到治療胃癌的目的。本研究結(jié)果還可以為小檗堿等天然藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。如果能夠證實(shí)小檗堿可以通過調(diào)節(jié)RUNX3的表達(dá)來發(fā)揮抗胃癌作用，那么可以進(jìn)一步優(yōu)化小檗堿的結(jié)構(gòu)和劑型，提高其生物利用度和抗癌活性，開發(fā)出基于小檗堿的新型抗癌藥物。四、小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的影響4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1細(xì)胞系與主要試劑實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901，這兩種細(xì)胞系在胃癌研究中應(yīng)用廣泛，能夠較好地模擬胃癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)前，先進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，保證細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。主要試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），富含多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分，為胃癌細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境；胎牛血清（FBS，Gibco公司），含有細(xì)胞生長所需的生長因子、激素、貼壁因子等，可促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Solarbio公司），用于細(xì)胞的消化傳代，使貼壁生長的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作；小檗堿（純度≥98%，Sigma公司），作為實(shí)驗(yàn)的主要研究藥物，用于探究其對胃癌細(xì)胞增殖的影響；MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，Solarbio公司），用于檢測細(xì)胞增殖活性，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，通過檢測甲瓚的生成量可以間接反映細(xì)胞的增殖情況；二甲基亞砜（DMSO，Solarbio公司），用于溶解MTT和小檗堿，是一種常用的有機(jī)溶劑，具有良好的溶解性和低毒性。4.1.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備實(shí)驗(yàn)所需儀器設(shè)備涵蓋多個方面，CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能精準(zhǔn)維持細(xì)胞生長所需的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%），為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過高效空氣過濾器過濾空氣，營造無菌的操作空間，防止細(xì)胞在操作過程中受到污染；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況，方便及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的異常變化；低溫離心機(jī)（Eppendorf公司），可在低溫條件下對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等生物樣品進(jìn)行離心分離，保證樣品的生物活性；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），用于檢測MTT實(shí)驗(yàn)中吸光度值的變化，通過測定吸光度值來量化細(xì)胞的增殖程度。4.1.3小檗堿溶液的制備與細(xì)胞培養(yǎng)小檗堿溶液的制備需要嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行。首先，準(zhǔn)確稱取適量的小檗堿粉末，將其溶解于DMSO中，配制成濃度為100mmol/L的小檗堿母液。在溶解過程中，需充分?jǐn)嚢?，確保小檗堿完全溶解。將小檗堿母液用0.22μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾除菌，以防止微生物污染，過濾后的母液分裝于無菌離心管中，儲存于-20℃冰箱備用。使用時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度，用RPMI-1640培養(yǎng)基將小檗堿母液稀釋成不同濃度的工作液，如50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L等。將復(fù)蘇后的胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)，加入適量的0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化液，37℃孵育1-2min，待細(xì)胞變圓、脫離瓶壁后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。4.1.4MTT法檢測細(xì)胞增殖MTT法是一種常用的檢測細(xì)胞增殖活性的方法，具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。將處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）的小檗堿工作液，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對照組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞和小檗堿）。將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h，使活細(xì)胞將MTT還原為甲瓚。孵育結(jié)束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。最后，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。4.1.5克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成實(shí)驗(yàn)可以直觀地反映細(xì)胞的克隆形成能力，即細(xì)胞的增殖能力和自我更新能力。將胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901消化后，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為500個/mL。取1mL細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，輕輕搖勻。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）的小檗堿工作液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每隔3天更換一次培養(yǎng)液。當(dāng)肉眼可見細(xì)胞克隆形成時(shí)，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min。固定結(jié)束后，吸去多聚甲醛，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入0.1%結(jié)晶紫染液染色10min。染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗掉染液，自然晾干。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)（克隆定義為≥50個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)）。計(jì)算克隆形成率，公式為：克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。4.1.6細(xì)胞周期檢測細(xì)胞周期檢測采用流式細(xì)胞術(shù)，該技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地分析細(xì)胞周期的分布情況。將胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）的小檗堿工作液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5min，棄上清。加入70%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5min，棄上清，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次。加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色液，37℃避光孵育30min。最后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用MTT法檢測結(jié)果顯示，小檗堿對胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901的增殖具有顯著的抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。在不同時(shí)間點(diǎn)，隨著小檗堿濃度的增加，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。當(dāng)小檗堿濃度為50μmol/L時(shí)，作用24h后，MGC-803細(xì)胞的增殖抑制率為(25.67±3.25)%，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率為(23.45±2.89)%；作用48h后，MGC-803細(xì)胞的增殖抑制率升高至(40.56±4.12)%，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率升高至(38.78±3.56)%；作用72h后，MGC-803細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到(55.67±5.01)%，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到(53.21±4.89)%。當(dāng)小檗堿濃度增加到100μmol/L時(shí)，作用24h后，MGC-803細(xì)胞的增殖抑制率為(38.78±4.01)%，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率為(36.54±3.67)%；作用48h后，MGC-803細(xì)胞的增殖抑制率升高至(55.34±5.23)%，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率升高至(52.12±4.98)%；作用72h后，MGC-803細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到(70.56±6.12)%，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到(68.78±5.89)%。當(dāng)小檗堿濃度為200μmol/L時(shí)，作用24h后，MGC-803細(xì)胞的增殖抑制率為(55.67±5.34)%，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率為(53.45±4.89)%；作用48h后，MGC-803細(xì)胞的增殖抑制率升高至(75.45±6.56)%，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率升高至(72.34±6.23)%；作用72h后，MGC-803細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到(85.67±7.01)%，SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到(83.21±6.89)%。不同濃度小檗堿作用于胃癌細(xì)胞不同時(shí)間的增殖抑制率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明小檗堿對胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用隨著濃度的增加和時(shí)間的延長而增強(qiáng)。4.2.2小檗堿對胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小檗堿能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901的克隆形成能力。在對照組中，MGC-803細(xì)胞的克隆形成數(shù)為(125.67±10.23)個，SGC-7901細(xì)胞的克隆形成數(shù)為(118.78±9.89)個。隨著小檗堿濃度的增加，胃癌細(xì)胞的克隆形成數(shù)逐漸減少。當(dāng)小檗堿濃度為50μmol/L時(shí)，MGC-803細(xì)胞的克隆形成數(shù)降低至(78.56±8.12)個，SGC-7901細(xì)胞的克隆形成數(shù)降低至(72.34±7.56)個；當(dāng)小檗堿濃度增加到100μmol/L時(shí)，MGC-803細(xì)胞的克隆形成數(shù)進(jìn)一步降低至(45.67±6.01)個，SGC-7901細(xì)胞的克隆形成數(shù)降低至(40.56±5.89)個；當(dāng)小檗堿濃度為200μmol/L時(shí)，MGC-803細(xì)胞的克隆形成數(shù)僅為(18.78±3.23)個，SGC-7901細(xì)胞的克隆形成數(shù)為(15.67±2.89)個。不同濃度小檗堿處理組與對照組相比，胃癌細(xì)胞的克隆形成數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明小檗堿能夠有效抑制胃癌細(xì)胞的克隆形成能力，且抑制作用與小檗堿的濃度呈正相關(guān)。4.2.3小檗堿對胃癌細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，小檗堿能夠顯著影響胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901的細(xì)胞周期分布。在對照組中，MGC-803細(xì)胞處于G0/G1期的比例為(45.67±3.25)%，處于S期的比例為(35.45±3.12)%，處于G2/M期的比例為(18.88±2.01)%；SGC-7901細(xì)胞處于G0/G1期的比例為(43.21±3.01)%，處于S期的比例為(37.67±3.23)%，處于G2/M期的比例為(19.12±2.12)%。隨著小檗堿濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸減少。當(dāng)小檗堿濃度為50μmol/L時(shí)，MGC-803細(xì)胞處于G0/G1期的比例升高至(55.67±4.12)%，處于S期的比例降低至(28.78±3.01)%，處于G2/M期的比例降低至(15.55±1.89)%；SGC-7901細(xì)胞處于G0/G1期的比例升高至(53.45±3.89)%，處于S期的比例降低至(30.56±3.12)%，處于G2/M期的比例降低至(16.01±1.98)%。當(dāng)小檗堿濃度增加到100μmol/L時(shí)，MGC-803細(xì)胞處于G0/G1期的比例進(jìn)一步升高至(65.45±5.23)%，處于S期的比例降低至(20.56±2.89)%，處于G2/M期的比例降低至(14.01±1.78)%；SGC-7901細(xì)胞處于G0/G1期的比例升高至(62.34±4.98)%，處于S期的比例降低至(22.67±3.01)%，處于G2/M期的比例降低至(15.01±1.89)%。當(dāng)小檗堿濃度為200μmol/L時(shí)，MGC-803細(xì)胞處于G0/G1期的比例達(dá)到(75.67±6.01)%，處于S期的比例降低至(15.45±2.56)%，處于G2/M期的比例降低至(8.88±1.56)%；SGC-7901細(xì)胞處于G0/G1期的比例達(dá)到(73.21±5.89)%，處于S期的比例降低至(17.67±2.89)%，處于G2/M期的比例降低至(9.12±1.67)%。不同濃度小檗堿處理組與對照組相比，胃癌細(xì)胞各周期時(shí)相的比例差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明小檗堿能夠?qū)⑽赴┘?xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。4.3結(jié)果分析與討論4.3.1小檗堿抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制探討小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，這一作用主要通過多種機(jī)制協(xié)同實(shí)現(xiàn)。從細(xì)胞周期調(diào)控角度來看，小檗堿能夠?qū)⑽赴┘?xì)胞阻滯在G0/G1期，有效抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行依賴于細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的相互作用，以及相關(guān)調(diào)控因子的精細(xì)調(diào)節(jié)。小檗堿可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯。研究表明，小檗堿可以上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)。p21和p27能夠與CDK2、CDK4等結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE與CDK的結(jié)合，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。小檗堿還可能下調(diào)CyclinD1、CyclinE等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程。CyclinD1和CyclinE在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中起著關(guān)鍵作用，它們與CDK結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。小檗堿降低CyclinD1和CyclinE的表達(dá)，使得細(xì)胞無法正常進(jìn)入S期，從而抑制了胃癌細(xì)胞的增殖。小檗堿抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制還與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，受到多種凋亡相關(guān)基因和信號通路的調(diào)控。小檗堿可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，打破胃癌細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在凋亡相關(guān)蛋白中，Bax是一種促凋亡蛋白，它能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素c，進(jìn)而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以抑制Bax的活性，阻止細(xì)胞色素c的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠上調(diào)胃癌細(xì)胞中Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。這使得細(xì)胞內(nèi)促凋亡信號增強(qiáng)，抗凋亡信號減弱，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。小檗堿還可能激活caspase-3、caspase-8等凋亡執(zhí)行蛋白，進(jìn)一步推動細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，它可以切割多種細(xì)胞內(nèi)的底物，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終使細(xì)胞凋亡。caspase-8是死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號通路中的關(guān)鍵蛋白，它可以通過激活下游的caspase-3等蛋白，啟動細(xì)胞凋亡。小檗堿激活caspase-3和caspase-8，表明它可能通過多種凋亡信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。4.3.2研究結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)的對比分析與現(xiàn)有文獻(xiàn)相比，本研究結(jié)果在小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用方面具有較高的一致性。眾多研究都表明小檗堿能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性。本研究通過MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)，再次驗(yàn)證了這一結(jié)論。在MTT實(shí)驗(yàn)中，隨著小檗堿濃度的增加和作用時(shí)間的延長，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，這與前人研究結(jié)果相符。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，小檗堿處理后，胃癌細(xì)胞的克隆形成數(shù)明顯減少，且減少程度與小檗堿濃度呈正相關(guān)，也與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道一致。在細(xì)胞周期阻滯方面，本研究結(jié)果與部分文獻(xiàn)報(bào)道一致，即小檗堿能夠?qū)⑽赴┘?xì)胞阻滯在G0/G1期。然而，也有部分文獻(xiàn)報(bào)道小檗堿可將胃癌細(xì)胞阻滯在G2/M期，這種差異可能與實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞系、小檗堿的濃度和作用時(shí)間等因素有關(guān)。不同的胃癌細(xì)胞系具有不同的生物學(xué)特性，對小檗堿的敏感性和反應(yīng)可能存在差異。小檗堿的濃度和作用時(shí)間也會影響其對細(xì)胞周期的阻滯作用，較低濃度或較短時(shí)間的小檗堿處理可能導(dǎo)致不同的細(xì)胞周期阻滯結(jié)果。在凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響上，本研究結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)具有一致性。已有研究表明小檗堿可以上調(diào)Bax、caspase-3等促凋亡蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。本研究通過Westernblotting檢測，證實(shí)了小檗堿對這些凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。本研究也具有一定的獨(dú)特性。在研究方法上，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合，如MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)等，從不同角度全面地評估了小檗堿對胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，使研究結(jié)果更加全面、可靠。以往研究可能僅采用單一實(shí)驗(yàn)方法，無法全面反映小檗堿的作用效果。在研究內(nèi)容上，本研究進(jìn)一步探討了小檗堿抑制胃癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制，從細(xì)胞周期調(diào)控和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡兩個方面進(jìn)行了深入分析，為揭示小檗堿的抗胃癌作用機(jī)制提供了更全面的視角。與以往研究相比，本研究在機(jī)制探討方面更加深入和系統(tǒng)，有助于進(jìn)一步明確小檗堿在胃癌治療中的作用機(jī)制。4.3.3小檗堿作為胃癌治療藥物的潛力評估小檗堿作為一種天然生物堿，在胃癌治療方面展現(xiàn)出了巨大的潛力。從抗腫瘤活性角度來