第三節(jié)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)檢驗法是最常見化膿性球菌，需氧或兼性厭氧食物中毒:火腿\加工肉制品\冰淇淋\沙拉等化膿性感染:要求外用藥及普通滴眼劑不得檢出本菌。第1頁一、生物學(xué)性狀金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生各種毒素及酶，這些毒性物質(zhì)是它致病力強物質(zhì)基礎(chǔ)，能引發(fā)局部及全身化膿性炎癥，嚴(yán)重時可發(fā)展成為敗血癥及膿毒血癥，是人類化膿性感染中最主要病原菌。第2頁球形，大小不一，直徑為0.4-1.2μm，平均為0.8μm。無鞭毛，無芽孢。不形成莢膜。在固體基質(zhì)上，常堆聚成葡萄串狀。在液體培養(yǎng)基中，呈雙、呈鏈狀排列。革蘭染色陽性；當(dāng)衰老、死亡或被中性粒細(xì)胞吞噬后常轉(zhuǎn)為陰性。（一）形態(tài)與染色第3頁（二）培養(yǎng)特征菌落0.8-1.5mm，圓形不透明、邊緣整齊、光滑最適溫度37℃，最適pH7.4。需氧或兼性厭氧，在20%-30%CO2環(huán)境中有利毒素產(chǎn)生。耐鹽，在10%-15%氯化鈉培養(yǎng)基中能生長。在營養(yǎng)瓊脂平板上產(chǎn)生金黃色脂溶性色素。在血瓊脂平板上，菌落較大，且產(chǎn)生全透明溶血環(huán)。在卵黃高鹽瓊脂平板上分解卵磷脂在菌落周圍形成白色乳濁圈。第4頁（三）生化反應(yīng)糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣甲基紅陽性，v-P陽性，吲哚陰性尿素酶陽性，還原硝酸鹽，液化明膠產(chǎn)血漿凝固酶，耐熱DNA酶和精氨酸雙解酶，有時產(chǎn)生磷酸酶和觸酶第5頁（四）抗原結(jié)構(gòu)1.蛋白質(zhì)抗原（staphylococcalproteinA，SPA）：有種屬特異性，存在于細(xì)胞表面，是細(xì)胞壁主要成份，能和人和動物血清中IgG結(jié)合，含有抗吞噬作用，能促使細(xì)胞分裂。90%以上菌株含有此抗原。2.多糖抗原：是半抗原，含有型特異性。分為：（1）甲型多糖抗原：從S.

aureus中提出，磷壁酸中N-乙酰葡萄糖胺核酸醇?xì)埢?）乙型多糖抗原：非致病葡萄球菌中提出，磷壁酸中N-乙酰葡萄糖胺甘油殘基（3）丙型多糖抗原：由多型葡萄球菌中提出第6頁（五）抵抗力抗干燥在60-70℃1h才能被殺死，80℃30min能存活在5%苯酚或0.1%升汞溶液10-15min才殺死耐高鹽對紅霉素、鏈霉素、慶大霉素、先鋒霉素敏感90%以上菌株對青霉素有耐藥性第7頁（六）致病性侵襲力invasiveness：溶血毒素（hemolysin,staphylolysin）:是一個外毒素，不耐熱。有αβγδ四種。α溶血毒素：對人類有致病作用是α溶血毒素，對紅細(xì)胞有溶血作用，能損傷血小板和血管平滑肌。β溶血毒素：在培養(yǎng)基上產(chǎn)生，具溶血活性。γ、δ溶血毒素：抗原性有差異第8頁溶血毒素第9頁殺白細(xì)胞素（leucocidin）：能殺死動物白細(xì)胞，含有抗原性。腸毒素（enterotoxin）：引發(fā)急性胃腸炎，對熱穩(wěn)定，有A、B、C、D、E五型。A型引發(fā)食物中毒最多。剝脫性毒素（exfoliativetoxin）：可引發(fā)人和鼠表皮剝脫性病變。第10頁凝固酶（coagulase）：普通致病性葡萄球菌產(chǎn)生此凝固酶，可分為兩種：結(jié)合凝固酶（boundcoagulase）：直接作用于血漿中纖維蛋白原，使之變成纖維蛋白，凝集成塊。游離型凝固酶（freecoagulase）：不直接作用于血漿中纖維蛋白原，而是和一個凝固酶反應(yīng)因子結(jié)合，形成一個穩(wěn)定復(fù)合物，作用于纖維蛋白原，使血漿凝固。第11頁其它物質(zhì)：產(chǎn)透明質(zhì)酸酶，皮膚壞死毒素、耐熱DNA酶和精氨酸雙解酶，有時產(chǎn)生磷酸酶和觸酶、紅瘡毒素、溶纖維蛋白酶等。第12頁二、常規(guī)檢驗法增菌培養(yǎng)：取1：10檢樣稀釋液，放至營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18-24h。分離培養(yǎng)：將增菌液用接種環(huán)沾取1-2環(huán)，劃線接種于卵黃高鹽瓊脂平板或甘露醇高鹽平板、血瓊脂平板上。36℃培養(yǎng)24-72h。第13頁卵黃高鹽瓊脂：金黃色，菌落1-2mm，圓形凸起、邊緣整齊、光滑濕潤、外周有乳濁圈。甘露醇高鹽平板：金黃色，菌落0.7-1mm，圓形凸起、邊緣整齊、光滑濕潤、外周有黃色環(huán)。血瓊脂平板上：金黃色，菌落2-4mm，圓形凸起、邊緣整齊、光滑濕潤、外周有透明溶血環(huán)。第14頁菌落圓形,表面光滑、凸起、濕潤,直徑2～3mm?；液谏梁谏?有光澤,常有淺色(非白色)邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清楚帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時含有黃油樣粘稠感。有時見到不分解脂肪菌株,除沒有不透明圈和清楚帶外,其它外觀基本相同。從長久貯存冷凍或脫水食品中分離菌落,其黑色常較經(jīng)典菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。Baird-Parker瓊脂平板第15頁在傳統(tǒng)BairdParker基礎(chǔ)中加入(兔血漿+纖維蛋白原試驗)。培養(yǎng)后，在菌落周圍出現(xiàn)大而清楚“光暈“即可證實該葡萄球凝固酶為陽性。在24小時培養(yǎng)過程中，同時進(jìn)行了選擇性分離培養(yǎng)和凝固酶試驗。與傳統(tǒng)“BairdParker瓊脂+蛋黃”觀察脂酶活性相比，凝固酶產(chǎn)生是一個愈加特異判定葡萄球菌試驗。第16頁純培養(yǎng)：挑取上述菌落2-3個，接種于營養(yǎng)肉湯瓊脂斜面上，36℃培養(yǎng)18-24h，取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。革蘭氏染色鏡檢：革蘭染色陽性球菌。無芽孢、無莢膜、排列呈不規(guī)則葡萄狀，單個、成雙或成鏈狀排列。第17頁血漿凝固酶試驗：血漿制備：以無菌手續(xù)自家兔心臟采血9mL，快速加至裝有5%檸檬酸鈉溶液1mL滅菌離心管內(nèi)，充分混合數(shù)分鐘后，1500r/min離心15min，吸收血漿備用。第18頁玻片法測結(jié)合凝固酶取載玻片一張，在玻片兩端分別滴上滅菌生理鹽水和未經(jīng)稀釋血漿各一滴。取待檢菌18-24h肉湯液或瓊脂培養(yǎng)物一接種環(huán)，加至生理鹽水中，制成濃菌懸液，取一環(huán)，與血漿混合均勻，觀察結(jié)果。在5min內(nèi)混菌血漿出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，而在鹽水中呈均勻混濁時，即為陽性反應(yīng)。同時做陽性對照和陰性對照。載玻片生理鹽水血漿待檢培養(yǎng)物第19頁試管法測游離凝固酶取滅菌小試管3支，各加血漿0.5mL；一支加入待檢菌生理鹽水懸液或營養(yǎng)肉湯液0.5mL，為試驗管另一支加陽性對照菌生理鹽水懸液或營養(yǎng)肉湯液0.5mL，做陽性對照管；再一支加生理鹽水懸液或營養(yǎng)肉湯液0.5mL，做陰性對照管。三管同時放37℃水浴中4h每隔1h觀察一次結(jié)果，不要振動或搖動試管，輕輕傾斜至橫放，檢驗各管是否凝固或有凝塊。若無凝固或凝塊現(xiàn)象，則育孵24h，再檢驗。待檢陽性對照陰性對照37℃水浴4h第20頁注意事項試管法和玻片法結(jié)果可能不一致，玻片法陰性和可疑結(jié)果用試管法確定。玻片法待檢菌懸液應(yīng)較濃，防止假陰性纖維蛋白溶酶產(chǎn)生，每小時觀察新鮮培養(yǎng)物，不然凝固酶活性低，不易檢出第21頁結(jié)果判定革蘭氏染色鏡檢陽性球菌，血漿凝固酶陽性，判為檢出金黃色葡萄球菌革蘭氏染色鏡檢不是陽性球菌，或血漿凝固酶陰性，判為未檢出金黃色葡萄球菌陰性對照有菌生長或陽性對照呈陰性結(jié)果時，重新檢驗第22頁三、其它判別試驗溶血試驗法：取5mL無菌脫纖維血，加在100mL溶化并冷卻至50℃營養(yǎng)瓊脂里，混勻后傾注平板。烘干冷凝水，備用。用接種環(huán)取微同待測菌，劃線于平板上，37℃18-24h觀察溶血環(huán)。第23頁腸毒素測定動物試驗法ELISA法反向乳膠凝集法第24頁磷酸酶試驗原理：致病型葡萄球菌可產(chǎn)生磷酸酶，使單磷酸水解，如以磷酸酚酞為基質(zhì)，則水解后可釋放出酚酞，在堿性環(huán)境中呈紅色。方法：在1000mL營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入1%磷酸酚酞溶液1mL，傾注平板，接種待檢菌，35℃18-24h，在平板上滴加濃氨水，菌落變?yōu)榧t色，則為陽性。第25頁耐熱DNA酶試驗：原理：金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生DNA酶加熱煮沸后仍含有酶活性?？伤忾L鏈DNA成寡聚核苷酸，后者遇甲苯胺藍(lán)后變成粉紅色。第26頁（1）玻片法：將溶化好TrisDNA瓊脂3mL鋪于滅菌載物玻片上，放在水平臺上待瓊脂凝固，用直徑3mm打孔器打孔3-4個。將待檢菌肉湯培養(yǎng)物100℃20min處理后冷卻，于每孔中加入1小滴36℃3h后觀察。出現(xiàn)大于5mm粉紅色圈者為陽性。第27頁（2）平板法：在分離金黃色葡萄球菌瓊脂平板上挑選并標(biāo)識所需要測試菌落，之后在60℃干燥箱內(nèi)放2h，取出后在平板上傾注10mLTrisDNA瓊脂。凝固后36℃3h后觀察結(jié)果，在標(biāo)識菌落周圍呈粉紅色