CRTMAGE-A3重組腺病毒載體構(gòu)建與表達(dá)機(jī)制及應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展進(jìn)程中，基因治療作為一種極具創(chuàng)新性和潛力的治療策略，正逐漸成為攻克各類疑難病癥的關(guān)鍵手段。從遺傳因素主導(dǎo)的遺傳病，到遺傳與環(huán)境因素共同作用的癌癥等復(fù)雜疾病，基因治療都展現(xiàn)出傳統(tǒng)治療方法難以比擬的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)治療手段，如針對(duì)癌癥的放療和化療，雖在一定程度上能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，但往往伴隨著嚴(yán)重的副作用，對(duì)患者的生活質(zhì)量和身體健康造成極大的負(fù)面影響。而基因治療通過(guò)精準(zhǔn)地干預(yù)致病基因，從根源上解決疾病問(wèn)題，為患者帶來(lái)了新的希望。例如，1990年，患有ADA-SCID疾病的4歲小女孩阿珊蒂接受了基因替代療法，利用病毒載體將健康的ADA基因?qū)胱陨砑?xì)胞，成功恢復(fù)了免疫T細(xì)胞水平，開啟了基因治療成功應(yīng)用的先河。這一案例充分證明了基因治療的可行性和巨大潛力，也促使全球科研人員加大對(duì)基因治療的研究力度。在基因治療的眾多技術(shù)環(huán)節(jié)中，基因載體的選擇至關(guān)重要，它如同“運(yùn)輸工具”，負(fù)責(zé)將治療基因精準(zhǔn)地遞送至靶細(xì)胞。腺病毒載體因其獨(dú)特的生物學(xué)特性，在眾多基因載體中脫穎而出，成為基因治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，具有廣泛的細(xì)胞感染性，能夠感染多種類型的細(xì)胞，這使得它在基因傳遞方面具有極大的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，它具備高水平的表達(dá)能力，可高效地將攜帶的外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)出來(lái)，為基因治療的有效性提供了保障。此外，腺病毒載體易于構(gòu)建，科研人員能夠相對(duì)便捷地對(duì)其進(jìn)行改造和優(yōu)化，以滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求和治療目的。其高效的轉(zhuǎn)染能力也使得它在基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和實(shí)際治療應(yīng)用中表現(xiàn)出色，能夠?qū)⒅委熁蚩焖偾矣行У貙?dǎo)入靶細(xì)胞，提高基因治療的效率。正是這些顯著的優(yōu)點(diǎn)，使得腺病毒載體在基因治療、基因轉(zhuǎn)染、疫苗制備等方面得到了廣泛的應(yīng)用。在腫瘤基因治療領(lǐng)域，腺病毒載體被用于將各種具有抗腫瘤作用的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等治療效果。在疫苗制備方面，基于腺病毒載體的疫苗，如埃博拉疫苗和流感疫苗等，已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出良好的免疫原性和安全性，能夠有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體和T細(xì)胞反應(yīng)，為預(yù)防和控制傳染病的傳播提供了有力的武器。CRTMAGE-A3（Cancer-TestisAntigenMAGE-A3）作為一種主要在人類癌癥細(xì)胞中表達(dá)的抗原，在腫瘤治療領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值。大量的研究表明，利用CRTMAGE-A3進(jìn)行基因治療或疫苗制備，能夠有效地激活人體免疫系統(tǒng)，使其對(duì)癌癥細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。例如，在一些前期的實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)將CRTMAGE-A3相關(guān)基因?qū)朊庖呒?xì)胞，能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和攻擊能力，顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。這一發(fā)現(xiàn)使得CRTMAGE-A3成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱門研究對(duì)象。構(gòu)建CRTMAGE-A3重組腺病毒載體，能夠充分結(jié)合腺病毒載體的優(yōu)勢(shì)和CRTMAGE-A3的抗腫瘤特性，為腫瘤的基因治療和疫苗研發(fā)提供強(qiáng)有力的支持。通過(guò)將CRTMAGE-A3基因整合到腺病毒載體中，利用腺病毒載體高效的轉(zhuǎn)染能力和廣泛的細(xì)胞感染性，將CRTMAGE-A3基因精準(zhǔn)地遞送至腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞中，使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮作用，有望開發(fā)出更加有效的腫瘤治療方法和疫苗，為癌癥患者帶來(lái)新的曙光。1.2研究目的和意義本研究旨在成功構(gòu)建CRTMAGE-A3重組腺病毒載體，并對(duì)其在體外的表達(dá)特性展開系統(tǒng)深入的研究。在構(gòu)建過(guò)程中，需要精確地將CRTMAGE-A3基因片段克隆到腺病毒載體中，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性和完整性，同時(shí)要驗(yàn)證其在載體中的穩(wěn)定性，這對(duì)于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用至關(guān)重要。在表達(dá)特性研究方面，利用先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，如Westernblot和免疫熒光等方法，分析CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)水平和定位情況，深入探究其在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)行為。腫瘤，作為嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病，給患者和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法，如手術(shù)、放療和化療，雖然在一定程度上能夠緩解病情，但都存在著各自的局限性。手術(shù)治療往往難以完全切除腫瘤組織，容易殘留癌細(xì)胞，導(dǎo)致復(fù)發(fā)；放療和化療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷，引發(fā)一系列的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，極大地影響了患者的生活質(zhì)量。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的飛速發(fā)展，基因治療和疫苗研發(fā)為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望?；蛑委熗ㄟ^(guò)導(dǎo)入特定的基因，糾正或補(bǔ)償異常基因的功能，從而達(dá)到治療腫瘤的目的；疫苗研發(fā)則通過(guò)激發(fā)人體自身的免疫系統(tǒng)，使其能夠識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤的預(yù)防和治療。構(gòu)建CRTMAGE-A3重組腺病毒載體對(duì)于腫瘤基因治療和疫苗研發(fā)具有不可估量的意義。從基因治療的角度來(lái)看，CRTMAGE-A3作為一種腫瘤特異性抗原，能夠激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，促使免疫系統(tǒng)識(shí)別并攻擊腫瘤細(xì)胞。將CRTMAGE-A3基因整合到腺病毒載體中，利用腺病毒載體高效的轉(zhuǎn)染能力和廣泛的細(xì)胞感染性，可以將CRTMAGE-A3基因精準(zhǔn)地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，使其在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，從而更有效地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。這為腫瘤的基因治療提供了一種全新的策略，有望克服傳統(tǒng)治療方法的局限性，提高腫瘤治療的效果和患者的生存率。在疫苗研發(fā)方面，CRTMAGE-A3重組腺病毒載體可以作為一種新型的腫瘤疫苗。通過(guò)將其導(dǎo)入人體，腺病毒載體能夠攜帶CRTMAGE-A3基因進(jìn)入免疫細(xì)胞，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)CRTMAGE-A3的特異性抗體和T細(xì)胞反應(yīng)。這些免疫細(xì)胞能夠識(shí)別并攻擊表達(dá)CRTMAGE-A3的腫瘤細(xì)胞，從而起到預(yù)防和治療腫瘤的作用。與傳統(tǒng)的疫苗相比，基于CRTMAGE-A3重組腺病毒載體的腫瘤疫苗具有更高的特異性和免疫原性，能夠更有效地激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，為腫瘤的預(yù)防和治療提供了新的有力武器。二、CRTMAGE-A3與重組腺病毒載體概述2.1CRTMAGE-A3介紹2.1.1CRTMAGE-A3結(jié)構(gòu)與功能CRTMAGE-A3，即Cancer-TestisAntigenMAGE-A3（癌-睪丸抗原MAGE-A3），是黑色素瘤抗原（MAGE）家族的重要成員之一。MAGE家族包含多個(gè)成員，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上既有相似之處，又存在一定的差異。CRTMAGE-A3基因定位于人類X染色體上，其編碼的蛋白質(zhì)由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。從氨基酸序列來(lái)看，CRTMAGE-A3含有獨(dú)特的抗原表位區(qū)域，這些表位對(duì)于其被免疫系統(tǒng)識(shí)別至關(guān)重要。在蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)上，CRTMAGE-A3通過(guò)氨基酸殘基之間的相互作用，形成了特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)對(duì)于維持其生物學(xué)功能起著關(guān)鍵作用。例如，某些結(jié)構(gòu)域可能參與了蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，從而影響其在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和功能發(fā)揮。CRTMAGE-A3具有獨(dú)特的生物學(xué)功能。它主要在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在正常組織（除睪丸等少數(shù)組織外）中幾乎不表達(dá)。這種在腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)，使得CRTMAGE-A3成為腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)。當(dāng)CRTMAGE-A3在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)后，它能夠被腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗原加工提呈機(jī)制所識(shí)別。腫瘤細(xì)胞會(huì)將CRTMAGE-A3降解為短肽片段，這些短肽片段與細(xì)胞內(nèi)的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成MHC-肽復(fù)合物。隨后，這些復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞表面，呈遞給免疫系統(tǒng)中的T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）能夠識(shí)別MHC-肽復(fù)合物，從而激活T淋巴細(xì)胞。激活的T淋巴細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），它們能夠特異性地識(shí)別并殺傷表達(dá)CRTMAGE-A3的腫瘤細(xì)胞。CTL通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，破壞腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞器，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。CRTMAGE-A3還可以激活輔助性T淋巴細(xì)胞（Th），Th細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細(xì)胞因子可以進(jìn)一步增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的功能，促進(jìn)CTL的增殖和活化，同時(shí)也可以激活其他免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和巨噬細(xì)胞等，共同參與對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。2.1.2CRTMAGE-A3在腫瘤治療中的研究進(jìn)展在腫瘤治療領(lǐng)域，CRTMAGE-A3展現(xiàn)出了巨大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力，成為了眾多科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。在腫瘤基因治療方面，研究人員致力于利用CRTMAGE-A3基因來(lái)設(shè)計(jì)和開發(fā)新型的治療策略。通過(guò)基因工程技術(shù)，將CRTMAGE-A3基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞中，試圖增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，或者提高免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。例如，將CRTMAGE-A3基因轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，使其高表達(dá)CRTMAGE-A3，從而增加腫瘤細(xì)胞被免疫系統(tǒng)識(shí)別的機(jī)會(huì)。在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，這種方法能夠有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。還有研究嘗試將CRTMAGE-A3基因?qū)朊庖呒?xì)胞，如T淋巴細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞（DC）中。轉(zhuǎn)染后的免疫細(xì)胞能夠更好地識(shí)別和攻擊表達(dá)CRTMAGE-A3的腫瘤細(xì)胞。在體外實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染了CRTMAGE-A3基因的T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)。以CRTMAGE-A3為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗研發(fā)也取得了一定的進(jìn)展。腫瘤疫苗的原理是通過(guò)激發(fā)機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，使其產(chǎn)生針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。CRTMAGE-A3作為一種腫瘤特異性抗原，非常適合用于腫瘤疫苗的制備。目前，已經(jīng)有多種基于CRTMAGE-A3的疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。這些疫苗包括多肽疫苗、核酸疫苗和病毒載體疫苗等。多肽疫苗是將CRTMAGE-A3的抗原肽段直接注射到體內(nèi)，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。核酸疫苗則是將編碼CRTMAGE-A3的DNA或RNA導(dǎo)入體內(nèi)，讓機(jī)體自身細(xì)胞表達(dá)CRTMAGE-A3，從而激發(fā)免疫反應(yīng)。病毒載體疫苗是利用病毒載體，如腺病毒載體、痘病毒載體等，將CRTMAGE-A3基因?qū)塍w內(nèi)，表達(dá)CRTMAGE-A3并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在一些臨床試驗(yàn)中，基于CRTMAGE-A3的疫苗能夠誘導(dǎo)患者體內(nèi)產(chǎn)生特異性的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)和抗體反應(yīng)。部分患者在接種疫苗后，腫瘤的生長(zhǎng)得到了一定程度的控制，生存期也有所延長(zhǎng)。然而，目前基于CRTMAGE-A3的腫瘤治療方法仍面臨一些挑戰(zhàn)。CRTMAGE-A3在不同腫瘤患者中的表達(dá)水平存在差異，這可能影響治療效果。部分患者對(duì)基于CRTMAGE-A3的治療方法可能產(chǎn)生免疫耐受，導(dǎo)致治療失敗。如何提高CRTMAGE-A3的免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)其的免疫反應(yīng)，以及如何克服免疫耐受等問(wèn)題，仍然是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。2.2重組腺病毒載體概述2.2.1腺病毒的生物學(xué)特性腺病毒是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特且復(fù)雜。在電子顯微鏡下，腺病毒呈現(xiàn)出典型的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，猶如一個(gè)精密的幾何模型。其直徑約為70-90納米，由252個(gè)殼粒有序排列構(gòu)成，其中包括240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體。這些殼粒緊密排列，共同構(gòu)成了腺病毒堅(jiān)實(shí)的衣殼，如同堅(jiān)固的堡壘，保護(hù)著內(nèi)部的遺傳物質(zhì)。衣殼內(nèi)部包裹著線狀雙鏈DNA分子，長(zhǎng)度約為30-47kb，兩端各有長(zhǎng)約100bp的反向重復(fù)序列。這些反向重復(fù)序列在腺病毒的生命周期中起著關(guān)鍵作用，參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和包裝等重要過(guò)程。腺病毒的基因組特點(diǎn)決定了其生物學(xué)功能和感染特性?；蚪M包含早期表達(dá)的與腺病毒復(fù)制相關(guān)的E1-E4基因和晚期表達(dá)的與腺病毒顆粒組裝相關(guān)的L1-L5基因。早期基因E1A主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，它能夠促使細(xì)胞進(jìn)入活躍的代謝狀態(tài)，為病毒的復(fù)制提供充足的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。同時(shí)，E1A還能促進(jìn)病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，使細(xì)胞更易感染病毒。E1B則啟動(dòng)晚期基因的轉(zhuǎn)錄，開啟病毒顆粒組裝的關(guān)鍵步驟，并引起炎癥反應(yīng)。E2區(qū)基因產(chǎn)物為病毒DNA的復(fù)制提供了必要的機(jī)器，確保病毒DNA能夠準(zhǔn)確、高效地復(fù)制。E3區(qū)雖然是病毒復(fù)制的非必需區(qū)，但在所有血清型之間都比較保守。該區(qū)基因編碼產(chǎn)物與調(diào)整宿主免疫反應(yīng)密切相關(guān)，例如gpl9蛋白，可以與MHC-I類分子的重鏈結(jié)合，從而阻斷MHC-I復(fù)合體向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)移，使病毒能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊；14.7kD蛋白則與控制宿主免疫反應(yīng)有關(guān)，它可以阻斷腫瘤壞死因子（TNF）介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用，保護(hù)病毒感染的細(xì)胞免受TNF的殺傷。E4區(qū)是另一個(gè)與腺病毒生活周期重要相關(guān)的區(qū)域，其基因產(chǎn)物與早期和晚期基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換、關(guān)閉宿主細(xì)胞基因的表達(dá)、病毒的復(fù)制和病毒粒子的組裝等過(guò)程密切相關(guān)。腺病毒的感染機(jī)制是一個(gè)高度有序且復(fù)雜的過(guò)程。病毒首先通過(guò)纖突蛋白與細(xì)胞表面的柯薩奇病毒-腺病毒受體（CAR）特異性結(jié)合，就像一把鑰匙精準(zhǔn)地插入對(duì)應(yīng)的鎖孔。這種特異性結(jié)合使得腺病毒能夠錨定在細(xì)胞表面，為后續(xù)的感染步驟奠定基礎(chǔ)。在粘附后，五鄰體蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸（RGD）基序與細(xì)胞表面的整合素αvβ3和αvβ5相互作用。這種相互作用觸發(fā)了一系列的信號(hào)傳導(dǎo)事件，最終導(dǎo)致腺病毒通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后，腺病毒利用內(nèi)體的酸性環(huán)境，從內(nèi)體中釋放出來(lái)，隨后病毒DNA通過(guò)宿主細(xì)胞核膜孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，腺病毒利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，進(jìn)行自身基因的表達(dá)和復(fù)制，完成病毒的生命周期。腺病毒具有廣泛的宿主范圍，能夠感染多種哺乳動(dòng)物，包括人類。在人類中，腺病毒可引起多種疾病，涵蓋了呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、眼部等多個(gè)器官系統(tǒng)。在呼吸系統(tǒng)，腺病毒可導(dǎo)致急性上呼吸道感染，引起咳嗽、鼻塞、喉嚨痛等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為肺炎。在消化系統(tǒng)，腺病毒感染可引發(fā)腹瀉、嘔吐、腹痛等胃腸道癥狀。眼部感染腺病毒則會(huì)導(dǎo)致結(jié)膜炎，表現(xiàn)為眼紅、流淚、畏光等。兒童、老年人以及免疫力低下的人群是腺病毒感染的易感人群，他們感染腺病毒后，病情往往更為嚴(yán)重，恢復(fù)時(shí)間也更長(zhǎng)。2.2.2腺病毒作為基因載體的優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用領(lǐng)域腺病毒作為基因載體，在基因治療、基因轉(zhuǎn)染和疫苗制備等領(lǐng)域展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢(shì)，使其成為現(xiàn)代生物技術(shù)研究和應(yīng)用的重要工具。在基因治療領(lǐng)域，腺病毒載體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它能夠高效地將治療基因傳遞到靶細(xì)胞中，為基因治療的有效性提供了堅(jiān)實(shí)的保障。許多單基因遺傳疾病，如囊性纖維化、血友病等，是由于特定基因的缺陷或突變導(dǎo)致的。利用腺病毒載體將正常的基因?qū)牖颊叩募?xì)胞中，有望糾正這些基因缺陷，從而達(dá)到治療疾病的目的。腺病毒載體可以感染多種類型的細(xì)胞，包括分裂期和靜止期的細(xì)胞。這使得它能夠應(yīng)用于多種組織和器官的基因治療，無(wú)論是快速分裂的腫瘤細(xì)胞，還是相對(duì)靜止的神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，腺病毒載體都能夠有效地將治療基因傳遞進(jìn)去。腺病毒載體不整合到宿主細(xì)胞基因組，大大降低了插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)的一些基因載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在將基因?qū)爰?xì)胞后，會(huì)隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，這可能會(huì)導(dǎo)致插入突變，引發(fā)細(xì)胞癌變等嚴(yán)重后果。而腺病毒載體則避免了這一風(fēng)險(xiǎn)，提高了基因治療的安全性。在基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，腺病毒載體同樣表現(xiàn)出色。它能夠高效地將外源基因?qū)爰?xì)胞，提高基因轉(zhuǎn)染的效率。在細(xì)胞生物學(xué)研究中，科研人員常常需要將特定的基因?qū)爰?xì)胞，以研究該基因的功能和作用機(jī)制。腺病毒載體可以快速、有效地將外源基因?qū)爰?xì)胞，使得研究人員能夠更方便地進(jìn)行基因功能研究。腺病毒載體易于構(gòu)建和操作。通過(guò)基因工程技術(shù)，科研人員可以相對(duì)便捷地將外源基因插入到腺病毒載體中，構(gòu)建出重組腺病毒載體。這一過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、高效，大大節(jié)省了研究時(shí)間和成本。在疫苗制備方面，腺病毒載體也具有廣闊的應(yīng)用前景?；谙俨《据d體的疫苗能夠有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。例如，在埃博拉疫苗的研發(fā)中，腺病毒載體被用于攜帶埃博拉病毒的抗原基因。當(dāng)疫苗接種到人體后，腺病毒載體將抗原基因傳遞到人體細(xì)胞中，細(xì)胞表達(dá)出埃博拉病毒的抗原，從而激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)埃博拉病毒的特異性抗體和T細(xì)胞反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)能夠有效地預(yù)防埃博拉病毒的感染。在流感疫苗的制備中，腺病毒載體同樣發(fā)揮了重要作用。通過(guò)將流感病毒的主要抗原基因整合到腺病毒載體中，制備出的腺病毒載體流感疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多種流感病毒株的免疫反應(yīng)，提高了疫苗的保護(hù)范圍和效果。三、CRTMAGE-A3重組腺病毒載體的構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備3.1.1所需菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)選用大腸桿菌DH5α菌株作為基因克隆和擴(kuò)增的宿主菌。該菌株具有生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，能夠高效地?cái)z取外源DNA并進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增。在基因克隆過(guò)程中，它能夠穩(wěn)定地保存和繁殖重組質(zhì)粒，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供充足的質(zhì)粒來(lái)源。真核表達(dá)質(zhì)粒PUC19作為基礎(chǔ)載體，用于構(gòu)建CRTMAGE-A3重組腺病毒載體。PUC19質(zhì)粒具有多克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入，同時(shí)還攜帶氨芐青霉素抗性基因，方便在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中篩選含有該質(zhì)粒的細(xì)菌。腺病毒載體pAdxsi則是構(gòu)建重組腺病毒的關(guān)鍵骨架質(zhì)粒。它包含腺病毒的基本元件，如病毒的復(fù)制起始位點(diǎn)、包裝信號(hào)等，能夠在細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)重組腺病毒的組裝和包裝。人胚腎293細(xì)胞系是腺病毒的包裝細(xì)胞系。該細(xì)胞系能夠反式提供腺病毒復(fù)制所必需的E1蛋白，因?yàn)橄俨《据d體通常缺失E1區(qū)以提高安全性和容納外源基因的能力。在293細(xì)胞中，腺病毒載體可以利用細(xì)胞提供的E1蛋白進(jìn)行復(fù)制和包裝，從而產(chǎn)生具有感染性的重組腺病毒顆粒。將構(gòu)建好的CRTMAGE-A3重組腺病毒載體導(dǎo)入293細(xì)胞后，細(xì)胞能夠?yàn)椴《镜膹?fù)制和包裝提供必要的條件，使得重組腺病毒能夠在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖。上述菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞系均購(gòu)自知名的生物試劑公司，如大腸桿菌DH5α菌株和人胚腎293細(xì)胞系購(gòu)自ATCC（AmericanTypeCultureCollection），真核表達(dá)質(zhì)粒PUC19和腺病毒載體pAdxsi購(gòu)自Invitrogen公司。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)這些菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞系進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)和鑒定，確保其符合實(shí)驗(yàn)要求。例如，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析，以確認(rèn)其基因序列的正確性；對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行支原體檢測(cè)，確保細(xì)胞無(wú)污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)中用到多種關(guān)鍵試劑，其中限制性內(nèi)切酶用于切割DNA，它能夠識(shí)別特定的DNA序列，并在特定位置切斷DNA雙鏈。例如，EcoRI和BamHI等限制性內(nèi)切酶，它們的識(shí)別序列分別為GAATTC和GGATCC。在構(gòu)建重組腺病毒載體時(shí)，通過(guò)使用這些限制性內(nèi)切酶，可以將CRTMAGE-A3基因片段從供體質(zhì)粒上切割下來(lái)，并將腺病毒載體pAdxsi在相應(yīng)的位點(diǎn)切開，為后續(xù)的連接反應(yīng)創(chuàng)造條件。T4DNA連接酶則用于連接DNA片段，它能夠催化DNA片段的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵，將切割后的CRTMAGE-A3基因片段與腺病毒載體pAdxsi連接起來(lái)，形成重組腺病毒載體。PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）試劑盒用于擴(kuò)增CRTMAGE-A3基因片段。PCR技術(shù)是一種體外擴(kuò)增DNA的方法，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的引物，在DNA聚合酶的作用下，能夠在短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)基因片段大量擴(kuò)增。在本實(shí)驗(yàn)中，利用PCR試劑盒中的DNA聚合酶、引物、dNTP等成分，以含有CRTMAGE-A3基因的模板DNA為起始材料，通過(guò)多次循環(huán)的變性、退火和延伸步驟，擴(kuò)增出大量的CRTMAGE-A3基因片段，為后續(xù)的克隆和載體構(gòu)建提供充足的基因材料。質(zhì)粒提取試劑盒用于從細(xì)菌中提取質(zhì)粒，它能夠高效地分離和純化質(zhì)粒DNA，去除細(xì)菌基因組DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)中，使用質(zhì)粒提取試劑盒從含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α中提取質(zhì)粒，為后續(xù)的酶切、連接和轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備也至關(guān)重要，PCR儀用于進(jìn)行PCR反應(yīng)，它能夠精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。通過(guò)設(shè)置不同的溫度循環(huán)，如95℃變性、55℃退火和72℃延伸，使得PCR反應(yīng)能夠在特定的條件下進(jìn)行，保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和效率。凝膠電泳儀用于分離和鑒定DNA片段，它利用DNA分子在電場(chǎng)中的遷移率不同，將不同大小的DNA片段分離開來(lái)。在實(shí)驗(yàn)中，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或酶切后的DNA片段進(jìn)行凝膠電泳，通過(guò)觀察DNA片段在凝膠中的遷移位置，可以判斷其大小和純度，從而篩選出正確的基因片段和重組質(zhì)粒。恒溫培養(yǎng)箱用于培養(yǎng)細(xì)菌和細(xì)胞，為其提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，包括溫度、濕度和氣體條件等。在培養(yǎng)大腸桿菌DH5α?xí)r，將其置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，使其能夠快速生長(zhǎng)和繁殖。在培養(yǎng)人胚腎293細(xì)胞時(shí)，將其置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，模擬體內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。離心機(jī)用于分離和沉淀物質(zhì)，在質(zhì)粒提取、細(xì)胞收集等實(shí)驗(yàn)步驟中發(fā)揮重要作用。通過(guò)高速離心，可以將細(xì)胞、蛋白質(zhì)等物質(zhì)與溶液分離，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的純化和濃縮。上述主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備均購(gòu)自正規(guī)的生物試劑公司和儀器制造商，如限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PCR試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，PCR儀、凝膠電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱和離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司。在使用前，對(duì)儀器設(shè)備進(jìn)行了校準(zhǔn)和調(diào)試，確保其性能穩(wěn)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)試劑進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè)，確保其符合實(shí)驗(yàn)要求。3.2構(gòu)建步驟與方法3.2.1CRTMAGE-A3基因片段的獲取獲取CRTMAGE-A3基因片段是構(gòu)建重組腺病毒載體的首要關(guān)鍵步驟，其準(zhǔn)確性和完整性直接影響后續(xù)載體構(gòu)建的成敗。本研究主要采用兩種方法獲取CRTMAGE-A3基因片段，一是從人肺癌組織cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增，二是通過(guò)人工合成。從人肺癌組織cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增CRTMAGE-A3基因片段，首先需要從新鮮的人肺癌組織樣本中提取總RNA。采用TRIzol試劑法進(jìn)行RNA提取，該方法利用TRIzol試劑中的苯酚和異硫氰酸胍等成分，能夠有效地裂解細(xì)胞，使RNA與蛋白質(zhì)和DNA分離。具體操作如下：將約100mg的人肺癌組織剪碎后放入含有1mlTRIzol試劑的離心管中，使用勻漿器充分勻漿，使組織完全裂解。在室溫下靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入0.2ml的氯仿，劇烈振蕩15秒，再次在室溫下靜置3分鐘。隨后，在4℃、12000rpm的條件下離心15分鐘，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無(wú)色的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和其他雜質(zhì)。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻后在室溫下靜置10分鐘，使RNA沉淀。再次在4℃、12000rpm的條件下離心10分鐘，管底會(huì)出現(xiàn)白色的RNA沉淀。棄去上清液，用75%的乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次在4℃、7500rpm的條件下離心5分鐘。最后，棄去乙醇，將RNA沉淀在室溫下晾干，加入適量的無(wú)RNase水溶解RNA。通過(guò)這種方法，可以獲得高質(zhì)量的總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄酶將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作。一般先將總RNA與隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物混合，在65℃下孵育5分鐘，使RNA變性，然后迅速置于冰上冷卻。接著，加入逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、緩沖液等成分，在37℃下孵育60分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)充分進(jìn)行。最后，在70℃下孵育15分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，得到cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增CRTMAGE-A3基因片段。根據(jù)GenBank中公布的CRTMAGE-A3基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。正向引物為5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，反向引物為5'-TCAGCTGCTGCTGCTGCTG-3'。引物的設(shè)計(jì)充分考慮了其特異性、退火溫度、GC含量等因素，以確保PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。PCR反應(yīng)體系包含cDNA模板、上下游引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。通過(guò)PCR擴(kuò)增，可以得到大量的CRTMAGE-A3基因片段。若從人肺癌組織cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增存在困難，也可選擇人工合成CRTMAGE-A3基因片段。將設(shè)計(jì)好的CRTMAGE-A3基因序列提交給專業(yè)的生物公司，如金斯瑞生物科技有限公司，由其利用DNA合成技術(shù)進(jìn)行合成。在合成過(guò)程中，生物公司會(huì)對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，以提高其表達(dá)效率。合成的CRTMAGE-A3基因片段會(huì)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，包括測(cè)序驗(yàn)證，確保其序列的準(zhǔn)確性。合成的基因片段通常會(huì)克隆到合適的載體上，如pUC57載體，以便于后續(xù)的操作。無(wú)論是從人肺癌組織cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增還是人工合成得到的CRTMAGE-A3基因片段，都需要進(jìn)行純化和鑒定。采用瓊脂糖凝膠電泳和DNA回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或合成的基因片段進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)和引物二聚體等。將純化后的基因片段進(jìn)行測(cè)序分析，與GenBank中公布的CRTMAGE-A3基因序列進(jìn)行比對(duì)，確保其序列的正確性。3.2.2基因片段與腺病毒載體的連接將獲取的CRTMAGE-A3基因片段與腺病毒載體進(jìn)行連接，是構(gòu)建重組腺病毒載體的核心環(huán)節(jié)，這一過(guò)程如同將貨物精準(zhǔn)地裝載到運(yùn)輸工具上，確?；蚱文軌蚍€(wěn)定地整合到腺病毒載體中。本研究選用腺病毒載體pAdxsi作為骨架載體，利用限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶實(shí)現(xiàn)CRTMAGE-A3基因片段與腺病毒載體的連接。首先，對(duì)CRTMAGE-A3基因片段和腺病毒載體pAdxsi進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切處理。根據(jù)基因片段和載體上的酶切位點(diǎn)信息，選擇合適的限制性內(nèi)切酶。本實(shí)驗(yàn)選用EcoRI和BamHI兩種限制性內(nèi)切酶，它們能夠識(shí)別特定的DNA序列，并在相應(yīng)位點(diǎn)切斷DNA雙鏈。EcoRI的識(shí)別序列為GAATTC，BamHI的識(shí)別序列為GGATCC。將CRTMAGE-A3基因片段和腺病毒載體pAdxsi分別與EcoRI和BamHI在適宜的緩沖液中混合，在37℃的恒溫條件下孵育2-3小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，以確認(rèn)酶切是否成功。在瓊脂糖凝膠電泳中，DNA分子會(huì)在電場(chǎng)的作用下向正極移動(dòng)，不同大小的DNA片段會(huì)在凝膠中形成不同的條帶。通過(guò)觀察條帶的位置和大小，可以判斷酶切產(chǎn)物的正確性。如果酶切成功，CRTMAGE-A3基因片段會(huì)被切成兩端帶有特定粘性末端的片段，腺病毒載體pAdxsi也會(huì)在相應(yīng)的位點(diǎn)被切開，形成與CRTMAGE-A3基因片段互補(bǔ)的粘性末端。將酶切后的CRTMAGE-A3基因片段和腺病毒載體pAdxsi進(jìn)行連接反應(yīng)。使用T4DNA連接酶將兩者連接起來(lái)。連接反應(yīng)體系包含酶切后的CRTMAGE-A3基因片段、腺病毒載體pAdxsi、T4DNA連接酶、ATP和連接緩沖液等。在16℃的恒溫條件下孵育過(guò)夜，使連接反應(yīng)充分進(jìn)行。T4DNA連接酶能夠催化DNA片段的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵，從而將CRTMAGE-A3基因片段與腺病毒載體pAdxsi連接起來(lái)，形成重組腺病毒載體。連接反應(yīng)結(jié)束后，需要對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和篩選。采用PCR技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行初步檢測(cè)。以連接產(chǎn)物為模板，使用CRTMAGE-A3基因片段的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果連接成功，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中會(huì)出現(xiàn)與CRTMAGE-A3基因片段大小相符的條帶。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶的位置和大小，可以判斷連接產(chǎn)物的正確性。對(duì)初步篩選出的連接產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，進(jìn)一步確認(rèn)CRTMAGE-A3基因片段是否正確地連接到腺病毒載體pAdxsi中。將連接產(chǎn)物送至專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的重組腺病毒載體序列進(jìn)行比對(duì)，確保連接的準(zhǔn)確性和完整性。3.2.3重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)化與篩選將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選出含有重組腺病毒載體的陽(yáng)性克隆，是構(gòu)建重組腺病毒載體的重要步驟，如同在眾多細(xì)胞中挑選出攜帶正確“貨物”的細(xì)胞。本研究選用大腸桿菌DH5α作為感受態(tài)細(xì)胞，利用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)化前，先將大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱中取出，迅速置于冰上解凍。取適量的連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后，在冰上靜置30分鐘，使連接產(chǎn)物充分吸附在感受態(tài)細(xì)胞表面。隨后，將混合物放入42℃的水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放回冰上冷卻2-3分鐘。熱激過(guò)程能夠使感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，從而使連接產(chǎn)物能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。加入適量的SOC培養(yǎng)基，在37℃、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞能夠恢復(fù)生長(zhǎng)和繁殖能力。將培養(yǎng)后的細(xì)胞均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。由于腺病毒載體pAdxsi攜帶氨芐青霉素抗性基因，只有成功轉(zhuǎn)化了重組腺病毒載體的大腸桿菌DH5α細(xì)胞才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并形成菌落。經(jīng)過(guò)過(guò)夜培養(yǎng)后，平板上會(huì)出現(xiàn)許多菌落。這些菌落中可能包含陽(yáng)性克隆（含有重組腺病毒載體的菌落）和陰性克?。ㄎ闯晒D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化了空載體的菌落），因此需要進(jìn)行篩選。采用菌落PCR技術(shù)對(duì)平板上的菌落進(jìn)行初步篩選。使用無(wú)菌牙簽挑取單個(gè)菌落，放入含有PCR反應(yīng)體系的PCR管中，以菌落中的DNA為模板，使用CRTMAGE-A3基因片段的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件與擴(kuò)增CRTMAGE-A3基因片段時(shí)相同。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。如果菌落中含有重組腺病毒載體，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中會(huì)出現(xiàn)與CRTMAGE-A3基因片段大小相符的條帶。通過(guò)觀察條帶的位置和大小，可以初步判斷菌落是否為陽(yáng)性克隆。對(duì)初步篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和驗(yàn)證。將初步篩選出的陽(yáng)性克隆接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)菌大量繁殖。提取細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA，采用限制性內(nèi)切酶酶切和測(cè)序分析等方法對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。使用與連接反應(yīng)中相同的限制性內(nèi)切酶對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切產(chǎn)物的條帶情況，判斷質(zhì)粒中是否含有CRTMAGE-A3基因片段以及基因片段的插入方向是否正確。將質(zhì)粒送至專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的重組腺病毒載體序列進(jìn)行比對(duì)，確保重組腺病毒載體的正確性和完整性。經(jīng)過(guò)菌落PCR篩選、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測(cè)序分析等步驟，最終篩選出含有正確重組腺病毒載體的陽(yáng)性克隆，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的材料。3.2.4重組腺病毒載體的鑒定對(duì)重組腺病毒載體進(jìn)行全面、準(zhǔn)確的鑒定，是確保構(gòu)建成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格鑒定的重組腺病毒載體才能用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用。本研究采用酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序鑒定等多種方法對(duì)重組腺病毒載體進(jìn)行鑒定，從不同角度驗(yàn)證其構(gòu)建的正確性。酶切鑒定是一種常用的鑒定方法，通過(guò)使用限制性內(nèi)切酶切割重組腺病毒載體，觀察酶切產(chǎn)物的條帶情況，判斷載體中是否含有CRTMAGE-A3基因片段以及基因片段的插入位置和方向是否正確。選取在連接反應(yīng)中使用的EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶，對(duì)提取的重組腺病毒載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切。將重組腺病毒載體質(zhì)粒與EcoRI和BamHI在適宜的緩沖液中混合，在37℃的恒溫條件下孵育2-3小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。如果重組腺病毒載體構(gòu)建正確，酶切后會(huì)得到兩條條帶，一條為腺病毒載體pAdxsi的片段，另一條為CRTMAGE-A3基因片段。通過(guò)觀察條帶的大小和位置，可以初步判斷重組腺病毒載體的正確性。與已知大小的DNAMarker進(jìn)行比對(duì)，確定酶切產(chǎn)物的大小是否與預(yù)期相符。如果條帶大小與預(yù)期一致，說(shuō)明CRTMAGE-A3基因片段成功插入到腺病毒載體pAdxsi中，且插入位置和方向正確。PCR鑒定是利用PCR技術(shù)對(duì)重組腺病毒載體中的CRTMAGE-A3基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)驗(yàn)證載體的正確性。以提取的重組腺病毒載體質(zhì)粒為模板，使用CRTMAGE-A3基因片段的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含模板DNA、上下游引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。如果重組腺病毒載體中含有CRTMAGE-A3基因片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中會(huì)出現(xiàn)與CRTMAGE-A3基因片段大小相符的條帶。通過(guò)觀察條帶的位置和大小，可以判斷重組腺病毒載體的正確性。與已知大小的DNAMarker進(jìn)行比對(duì)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是否與預(yù)期相符。如果條帶大小與預(yù)期一致，說(shuō)明重組腺病毒載體中含有正確的CRTMAGE-A3基因片段。測(cè)序鑒定是最準(zhǔn)確的鑒定方法，通過(guò)對(duì)重組腺病毒載體的基因序列進(jìn)行測(cè)定，與預(yù)期的序列進(jìn)行比對(duì)，全面驗(yàn)證載體的正確性。將提取的重組腺病毒載體質(zhì)粒送至專業(yè)的測(cè)序公司，如華大基因，采用Sanger測(cè)序法對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序公司會(huì)根據(jù)質(zhì)粒的序列信息設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序反應(yīng)，測(cè)定重組腺病毒載體的基因序列。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的CRTMAGE-A3基因序列以及腺病毒載體pAdxsi的序列進(jìn)行比對(duì)。仔細(xì)檢查CRTMAGE-A3基因片段的序列是否正確，是否存在突變或缺失等情況。確認(rèn)基因片段與腺病毒載體的連接位點(diǎn)是否準(zhǔn)確，插入方向是否正確。檢查腺病毒載體的其他部分序列是否完整，有無(wú)突變或異常。如果測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致，說(shuō)明重組腺病毒載體構(gòu)建成功，序列正確無(wú)誤。通過(guò)酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序鑒定等多種方法的綜合運(yùn)用，能夠全面、準(zhǔn)確地驗(yàn)證重組腺病毒載體的構(gòu)建正確性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用提供可靠的保障。3.3構(gòu)建過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)與注意事項(xiàng)3.3.1關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)PCR擴(kuò)增技術(shù)在獲取CRTMAGE-A3基因片段中起著核心作用。在引物設(shè)計(jì)方面，需運(yùn)用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，如PrimerPremier5.0。該軟件能夠根據(jù)CRTMAGE-A3基因序列，綜合考慮多種因素來(lái)設(shè)計(jì)引物。引物的特異性是關(guān)鍵，要確保其與CRTMAGE-A3基因序列精確匹配，避免與其他基因產(chǎn)生非特異性結(jié)合。例如，通過(guò)對(duì)引物與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)分析，排除可能的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。引物的退火溫度也至關(guān)重要，它直接影響PCR擴(kuò)增的效率和特異性。一般來(lái)說(shuō)，引物的退火溫度可根據(jù)公式Tm=4(G+C)+2(A+T)進(jìn)行初步估算，然后通過(guò)梯度PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。在梯度PCR實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置一系列不同的退火溫度，如50℃、52℃、54℃、56℃、58℃等，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，選擇擴(kuò)增條帶最清晰、特異性最強(qiáng)的退火溫度作為最佳退火溫度。PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化也不容忽視。dNTP的濃度會(huì)影響PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和效率。dNTP濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量不足；濃度過(guò)高，則可能增加錯(cuò)配的概率。一般來(lái)說(shuō)，dNTP的終濃度可設(shè)置為200μM左右。TaqDNA聚合酶的用量也需要精確控制。酶量過(guò)少，擴(kuò)增效率會(huì)降低；酶量過(guò)多，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。通常，根據(jù)PCR反應(yīng)體系的體積，按照說(shuō)明書推薦的用量加入TaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)，包括變性、退火和延伸的時(shí)間和溫度，也需要根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化。變性溫度一般設(shè)置為95℃，時(shí)間為30秒，以確保DNA雙鏈充分解開。退火時(shí)間一般為30秒，延伸時(shí)間根據(jù)基因片段的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整，一般每1kb的基因片段延伸時(shí)間為1分鐘。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，可設(shè)置不同的循環(huán)次數(shù)，如30次、35次、40次等，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，選擇擴(kuò)增效果最佳的循環(huán)次數(shù)。酶切連接技術(shù)是將CRTMAGE-A3基因片段與腺病毒載體連接的關(guān)鍵。限制性內(nèi)切酶的選擇要依據(jù)基因片段和載體上的酶切位點(diǎn)信息。在選擇酶切位點(diǎn)時(shí)，要確保其在基因片段和載體上具有唯一性，避免出現(xiàn)多個(gè)酶切位點(diǎn)導(dǎo)致的酶切產(chǎn)物復(fù)雜、連接效率低等問(wèn)題。同時(shí)，要考慮酶切位點(diǎn)的兼容性，選擇能夠產(chǎn)生互補(bǔ)粘性末端的限制性內(nèi)切酶。例如，選擇EcoRI和BamHI兩種限制性內(nèi)切酶，它們分別在CRTMAGE-A3基因片段和腺病毒載體上產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。酶切反應(yīng)的條件對(duì)酶切效果有重要影響。反應(yīng)溫度一般為37℃，這是大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度。反應(yīng)時(shí)間一般為2-3小時(shí)，以確保酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。在酶切反應(yīng)過(guò)程中，要注意反應(yīng)體系的pH值和離子強(qiáng)度等因素，這些因素會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。T4DNA連接酶的使用也有一定的技巧。連接反應(yīng)的溫度和時(shí)間是影響連接效率的關(guān)鍵因素。連接溫度一般選擇16℃，這是T4DNA連接酶的較適反應(yīng)溫度。連接時(shí)間通常為過(guò)夜，以保證連接反應(yīng)充分進(jìn)行。在連接反應(yīng)體系中，要確保T4DNA連接酶的用量適當(dāng)。用量過(guò)少，連接效率會(huì)降低；用量過(guò)多，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性連接。一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)連接反應(yīng)體系的體積，按照說(shuō)明書推薦的用量加入T4DNA連接酶。為了提高連接效率，還可以在連接反應(yīng)體系中加入適量的ATP，ATP是T4DNA連接酶的輔助因子，能夠提供能量，促進(jìn)連接反應(yīng)的進(jìn)行。轉(zhuǎn)化篩選技術(shù)是獲得含有重組腺病毒載體陽(yáng)性克隆的重要手段。感受態(tài)細(xì)胞的制備質(zhì)量直接影響轉(zhuǎn)化效率。常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有氯化鈣法和電轉(zhuǎn)化法。氯化鈣法是將大腸桿菌細(xì)胞用氯化鈣溶液處理，使其細(xì)胞膜通透性增加，易于攝取外源DNA。在制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，要注意細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和培養(yǎng)條件。一般選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行感受態(tài)制備，此時(shí)細(xì)胞的代謝活性高，轉(zhuǎn)化效率也較高。電轉(zhuǎn)化法是利用高壓電脈沖使細(xì)胞膜形成小孔，從而使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率較高，但操作相對(duì)復(fù)雜，需要專門的電轉(zhuǎn)化設(shè)備。熱激轉(zhuǎn)化法是將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞的常用方法。在熱激轉(zhuǎn)化過(guò)程中，熱激的溫度和時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率有重要影響。熱激溫度一般為42℃，時(shí)間為90秒。熱激時(shí)間過(guò)短，連接產(chǎn)物可能無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞；熱激時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在熱激后，要迅速將細(xì)胞放回冰上冷卻，以穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，提高轉(zhuǎn)化效率。篩選陽(yáng)性克隆時(shí)，采用菌落PCR技術(shù)能夠快速、初步地篩選出含有重組腺病毒載體的菌落。在菌落PCR反應(yīng)中，要確保引物的特異性和PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。引物要能夠特異性地?cái)U(kuò)增CRTMAGE-A3基因片段，PCR反應(yīng)條件可參考擴(kuò)增CRTMAGE-A3基因片段時(shí)的條件。對(duì)初步篩選出的陽(yáng)性克隆，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，如限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測(cè)序分析等，以確保重組腺病毒載體的正確性。3.3.2常見問(wèn)題及解決方法在構(gòu)建CRTMAGE-A3重組腺病毒載體的過(guò)程中，可能會(huì)遇到各種問(wèn)題，這些問(wèn)題若不及時(shí)解決，將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度和結(jié)果。連接效率低是一個(gè)常見的問(wèn)題，其產(chǎn)生的原因較為復(fù)雜。酶切不完全是導(dǎo)致連接效率低的重要原因之一。限制性內(nèi)切酶的活性可能受到多種因素的影響，如反應(yīng)體系中的雜質(zhì)、pH值、離子強(qiáng)度等。如果酶切不完全，基因片段和載體可能無(wú)法產(chǎn)生有效的粘性末端，從而影響連接效率。為了解決這一問(wèn)題，在酶切反應(yīng)前，要確保反應(yīng)體系的純凈，避免雜質(zhì)的干擾。對(duì)反應(yīng)體系的pH值和離子強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化，使其符合限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)條件?？梢栽黾酉拗菩詢?nèi)切酶的用量或延長(zhǎng)酶切時(shí)間，以確保酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。在酶切反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)酶切是否完全?；蚱魏洼d體的濃度比例不合適也會(huì)導(dǎo)致連接效率低。如果基因片段的濃度過(guò)高或過(guò)低，都不利于連接反應(yīng)的進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，基因片段和載體的摩爾比可控制在3:1-10:1之間。在連接反應(yīng)前，通過(guò)核酸定量?jī)x對(duì)基因片段和載體的濃度進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，然后根據(jù)摩爾比計(jì)算出所需的用量。在連接反應(yīng)體系中，確?；蚱魏洼d體的濃度比例合適。T4DNA連接酶的活性也會(huì)影響連接效率。T4DNA連接酶的保存條件不當(dāng)，如溫度過(guò)高或過(guò)低、反復(fù)凍融等，都可能導(dǎo)致其活性降低。在使用T4DNA連接酶時(shí)，要嚴(yán)格按照說(shuō)明書的要求進(jìn)行保存和使用。避免酶的反復(fù)凍融，盡量在低溫條件下操作。如果懷疑T4DNA連接酶的活性降低，可以更換新的酶進(jìn)行連接反應(yīng)。假陽(yáng)性克隆的出現(xiàn)也是構(gòu)建過(guò)程中需要解決的問(wèn)題。假陽(yáng)性克隆是指在篩選過(guò)程中，被誤認(rèn)為是陽(yáng)性克隆，但實(shí)際上并不含有重組腺病毒載體的菌落。引物特異性差是導(dǎo)致假陽(yáng)性克隆的常見原因之一。如果引物與其他基因序列存在非特異性結(jié)合，在菌落PCR篩選時(shí)，可能會(huì)擴(kuò)增出非特異性條帶，從而誤判為陽(yáng)性克隆。為了提高引物的特異性，在引物設(shè)計(jì)時(shí)，要充分利用引物設(shè)計(jì)軟件，對(duì)引物與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，排除可能的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化，如調(diào)整引物的長(zhǎng)度、GC含量、退火溫度等，提高引物的特異性。在菌落PCR篩選時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照，即使用未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行PCR反應(yīng)，以排除非特異性擴(kuò)增的干擾。載體自身環(huán)化也會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性克隆的出現(xiàn)。在酶切反應(yīng)后，如果載體沒(méi)有完全線性化，部分載體可能會(huì)自身環(huán)化，形成假陽(yáng)性克隆。為了避免載體自身環(huán)化，在酶切反應(yīng)后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)載體進(jìn)行檢測(cè)，確保載體完全線性化。可以在連接反應(yīng)前，對(duì)載體進(jìn)行去磷酸化處理，去除載體末端的磷酸基團(tuán)，防止載體自身環(huán)化。在篩選陽(yáng)性克隆時(shí)，對(duì)初步篩選出的克隆進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，如限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測(cè)序分析等，以排除假陽(yáng)性克隆。四、CRTMAGE-A3重組腺病毒載體的表達(dá)研究4.1表達(dá)特性檢測(cè)方法4.1.1Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)Westernblot，又稱蛋白質(zhì)免疫印跡，是一種用于檢測(cè)和分析蛋白質(zhì)表達(dá)的重要技術(shù)，在分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其檢測(cè)CRTMAGE-A3蛋白表達(dá)的原理基于抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性。在電場(chǎng)的作用下，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離的蛋白質(zhì)樣品，依據(jù)其分子量大小在凝膠中形成不同的條帶。隨后，通過(guò)轉(zhuǎn)膜技術(shù)將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素薄膜或聚偏二氟乙烯膜，PVDF膜）上。固相載體能夠以非共價(jià)鍵形式牢固地吸附蛋白質(zhì)，并且保持電泳分離后的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。此時(shí)，固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽就如同“待識(shí)別的目標(biāo)”，與對(duì)應(yīng)的特異性抗體（一抗）發(fā)生免疫反應(yīng)。一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合CRTMAGE-A3蛋白上的抗原表位。接著，加入酶或同位素標(biāo)記的第二抗體。二抗能夠識(shí)別并結(jié)合一抗，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。若使用酶標(biāo)記的二抗，在加入相應(yīng)的底物后，酶會(huì)催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生可見的顏色變化或熒光信號(hào)；若使用同位素標(biāo)記的二抗，則通過(guò)放射自顯影技術(shù)來(lái)檢測(cè)信號(hào)。通過(guò)檢測(cè)這些信號(hào)，就可以確定CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)情況，包括其分子量大小、表達(dá)量等信息。在本研究中，使用Westernblot檢測(cè)CRTMAGE-A3蛋白表達(dá)時(shí)，需嚴(yán)格按照以下步驟進(jìn)行操作。首先進(jìn)行蛋白樣品準(zhǔn)備，以培養(yǎng)的細(xì)胞為例，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1xPBS輕柔漂洗細(xì)胞，去除殘留的培養(yǎng)基。隨后，加入預(yù)先配置好的含有終濃度1mMPMSF（苯甲基磺酰氟，一種蛋白酶抑制劑，可防止蛋白降解）/PI（蛋白酶抑制劑混合物，增強(qiáng)對(duì)蛋白的保護(hù)）的RIPA裂解液（放射免疫沉淀分析裂解液，一種常用的細(xì)胞裂解液，含有去污劑等成分，能夠有效地裂解細(xì)胞并釋放蛋白）。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)皿的大小，一般加入適量的裂解液，如6孔板每孔加入500μl。加好裂解液后，用細(xì)胞刮或槍頭吹打，將細(xì)胞從孔底刮離，然后將細(xì)胞裂解物吸回EP管中。將EP管置于4℃冰箱內(nèi)，在旋轉(zhuǎn)機(jī)器上旋轉(zhuǎn)0.5-3小時(shí)，使樣品充分混勻裂解。裂解完成后，在4℃、12000rpm的條件下離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片和不溶性雜質(zhì)，吸取上清液。在上清液中加入等體積的2Xloading（或4X）上樣緩沖液，充分混勻。將混合后的樣品于95℃變性15分鐘，使蛋白質(zhì)變性，便于后續(xù)的電泳分離。變性結(jié)束后，樣品可用于SDS-PAGE電泳。若暫時(shí)不進(jìn)行電泳，可將樣品凍存于-20℃或-80℃冰箱中保存。接著進(jìn)行制膠及電泳，用于制膠的玻璃板在使用前需清洗干凈并晾干，仔細(xì)檢查玻璃板與膠接觸的一面是否有劃痕，尤其是下邊緣是否破損，因?yàn)閯澓劭赡軐?dǎo)致電泳過(guò)程中出現(xiàn)漏樣現(xiàn)象。根據(jù)CRTMAGE-A3蛋白的分子量大小，配置合適濃度的分離膠。將分離膠注入膠板下層后，向膠板內(nèi)輕輕注入ddH?O或異丙醇，起到液封的作用，促進(jìn)分離膠凝固。大約20分鐘后，分離膠即可凝固。傾去用于液封的ddH?O，并傾斜放置膠板一會(huì)，讓殘余的ddH?O匯聚到一起，然后用濾紙吸盡。將膠板放平后，繼續(xù)配置濃縮膠。將濃縮膠注入膠板中，至薄玻璃板的上緣即可，盡量避免產(chǎn)生氣泡。輕輕插入梳子，等待膠凝固。膠大約20分鐘后即可凝固使用。電泳緩沖液采用Tris-Glycine-0.1%SDS緩沖液。對(duì)于小分子蛋白（<15kD），建議使用Tris-Tricine緩沖液，它可以使條帶壓得更細(xì)，便于觀察。將處理好的蛋白樣品加入凝膠的加樣孔中，在100V的電壓下進(jìn)行電泳。在電泳過(guò)程中，要密切關(guān)注蛋白條帶的遷移情況，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求及時(shí)終止電泳。一般來(lái)說(shuō)，濃縮膠的電流小于分離膠的電流。在電泳結(jié)束前，提前配置好轉(zhuǎn)膜緩沖液并預(yù)冷備用，轉(zhuǎn)膜緩沖液為含有20%（v/v）甲醇（或等體積乙醇）的Tris-glycine溶液。隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，先從膠板中將膠小心取出，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需要確定是否取出濃縮膠部分。將膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10分鐘，使其充分浸潤(rùn)。裁剪與膠大小一致的PVDF膜和濾紙。PVDF膜需先用甲醇浸潤(rùn)1分鐘，使其活化，再轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10分鐘。轉(zhuǎn)膜時(shí)，將轉(zhuǎn)膜用的夾子黑色面朝下放置，然后依次放置轉(zhuǎn)膜用海綿墊、濕潤(rùn)的三層薄濾紙、蛋白膠、PVDF膜、濕潤(rùn)的三層薄濾紙、轉(zhuǎn)膜用的海綿墊。在放PVDF膜之前，先在蛋白膠上加少量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，放膜時(shí)將膜的一側(cè)邊緣與膠對(duì)齊，膜會(huì)被溶液慢慢吸到膠上去，這樣可以避免產(chǎn)生氣泡。將夾子夾緊后，放置到轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)。注意夾子的黑色面要靠近轉(zhuǎn)膜槽的黑色面，轉(zhuǎn)膜槽電源接頭處的顏色要與外面塑料槽標(biāo)記的顏色匹配，防止正負(fù)電極搞錯(cuò)。如果使用NC膜（硝酸纖維素膜），則略去用甲醇浸泡的步驟，其余步驟不變。轉(zhuǎn)膜條件一般為100V，2小時(shí)，冰浴進(jìn)行。對(duì)于大分子蛋白，可以適當(dāng)增加轉(zhuǎn)膜時(shí)間至3小時(shí)。轉(zhuǎn)膜完成后，可使用麗春紅對(duì)膜進(jìn)行染色，以確定轉(zhuǎn)膜是否成功。若膜上出現(xiàn)清晰的蛋白條帶，說(shuō)明轉(zhuǎn)膜成功。完成轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)行封閉及抗體孵育。封閉使用含有5%脫脂奶粉的1xTBS（pH7.4）緩沖液，在室溫下于搖床上孵育1小時(shí)。封閉的目的是防止抗體非特異性結(jié)合到膜上。一抗孵育在4℃冰箱的搖床上進(jìn)行，孵育過(guò)夜?？贵w需稀釋于含有2%脫脂奶粉的0.1%Tween/TBS（pH7.4）中。為防止回收抗體變質(zhì)，孵育前需添加0.02%的NaN?（疊氮化鈉，一種防腐劑）。孵育結(jié)束后，回收一抗儲(chǔ)存于4℃冰箱中。用1xTBST(0.1%Tween/TBS)緩沖液洗膜，每次10分鐘，共洗3次，以去除未結(jié)合的一抗。二抗稀釋（1:5000）于含有2%脫脂奶粉的(0.1%Tween/TBS)（pH7.4）中。HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的二抗不能添加NaN?，因?yàn)镹aN?會(huì)抑制HRP的活性。將二抗在搖床上室溫孵育1小時(shí)。孵育完成后，用1xTBST洗膜，每次10分鐘，共洗3次，以去除未結(jié)合的二抗。最后進(jìn)行顯色及壓片，在干凈的塑料膜上加適量的顯色底物，然后將膜正面對(duì)著底物，讓膜貼上去，室溫靜置1-2分鐘后，可到暗室壓片。壓片時(shí)需要根據(jù)熒光強(qiáng)弱選擇適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間。初學(xué)者可先從1分鐘的曝光時(shí)間開始，然后根據(jù)黑暗中是否看到熒光，適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，如直接壓片大于5分鐘或快速幾秒。以曝光時(shí)間30秒為例，將膜正面（右上角折角作為記號(hào)）向上置于壓片盒中，將x光片放到膜上，關(guān)緊壓片盒，計(jì)時(shí)30秒。然后打開壓片盒取出x光片，先在顯影液中浸潤(rùn)1分鐘，再在ddH?O中漂洗10秒，最后在定影液中浸潤(rùn)1分鐘即可?？筛鶕?jù)X光片上的條帶強(qiáng)弱情況，具體再選擇合適的曝光時(shí)間。在結(jié)果分析方面，通過(guò)觀察X光片上條帶的有無(wú)、條帶的強(qiáng)弱以及條帶的位置來(lái)判斷CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)情況。若出現(xiàn)與預(yù)期分子量大小相符的條帶，說(shuō)明CRTMAGE-A3蛋白成功表達(dá)。條帶的強(qiáng)弱反映了蛋白的表達(dá)量，條帶越強(qiáng)，說(shuō)明蛋白表達(dá)量越高。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker（含有已知分子量的蛋白條帶，用于確定目的蛋白的分子量）進(jìn)行比對(duì)，可以準(zhǔn)確確定CRTMAGE-A3蛋白的分子量。為了更準(zhǔn)確地分析蛋白表達(dá)量，還可以使用圖像分析軟件，如ImageJ，對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析。將實(shí)驗(yàn)組的條帶灰度值與對(duì)照組（如未轉(zhuǎn)染重組腺病毒載體的細(xì)胞樣品）進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，從而更直觀地了解CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)水平變化。4.1.2免疫熒光分析蛋白定位免疫熒光技術(shù)是一種將抗原-抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性巧妙結(jié)合的重要技術(shù)，在細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可用于深入探究CRTMAGE-A3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。其基本原理是利用熒光素作為標(biāo)記物，將其與已知的抗體或抗原進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，形成熒光標(biāo)記的抗體或抗原。這種結(jié)合過(guò)程不會(huì)影響抗體或抗原的免疫學(xué)特性。隨后，將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下，當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原特異性結(jié)合后，會(huì)形成抗原-抗體復(fù)合物。由于熒光素受到特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射時(shí)，會(huì)吸收光能并躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)它從激發(fā)態(tài)回到穩(wěn)定基態(tài)時(shí)，會(huì)以發(fā)射熒光的形式釋放多余的能量。因此，在熒光顯微鏡下可以直接觀察到呈現(xiàn)特異性熒光的抗原-抗體復(fù)合物及其在細(xì)胞內(nèi)的存在部位。在實(shí)際應(yīng)用中，由于熒光素標(biāo)記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術(shù)。在本研究中，利用免疫熒光技術(shù)分析CRTMAGE-A3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位時(shí)，需按照以下詳細(xì)操作過(guò)程進(jìn)行。首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和處理，將待檢測(cè)的細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使其在適宜的條件下生長(zhǎng)，如37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到合適的密度后，進(jìn)行后續(xù)操作。如果是轉(zhuǎn)染了CRTMAGE-A3重組腺病毒載體的細(xì)胞，需在轉(zhuǎn)染后的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理。一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)是檢測(cè)蛋白表達(dá)和定位的常見時(shí)間點(diǎn)。接著進(jìn)行細(xì)胞固定，吸去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1xPBS輕柔漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的4%多聚甲醛固定液，室溫下固定15-20分鐘。多聚甲醛能夠使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而保持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，同時(shí)也能固定抗原，防止其在后續(xù)操作中丟失或擴(kuò)散。固定結(jié)束后，吸去固定液，再用1xPBS漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除多余的固定液。隨后進(jìn)行細(xì)胞通透，對(duì)于一些需要檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原的情況，由于細(xì)胞膜對(duì)抗體具有一定的屏障作用，所以需要進(jìn)行細(xì)胞通透處理，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。加入適量的0.1%TritonX-100（一種非離子型去污劑，能夠破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，增加細(xì)胞膜的通透性）溶液，室溫下孵育10-15分鐘。孵育結(jié)束后，用1xPBS漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除多余的TritonX-100。完成細(xì)胞通透后，進(jìn)行封閉，加入含有5%牛血清白蛋白（BSA，一種常用的封閉劑，能夠封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景熒光）的1xPBS封閉液，室溫下孵育1小時(shí)。封閉的目的是防止后續(xù)加入的抗體非特異性地結(jié)合到細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的其他位點(diǎn)，從而降低背景熒光，提高檢測(cè)的特異性。封閉結(jié)束后，進(jìn)行一抗孵育，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇針對(duì)CRTMAGE-A3蛋白的特異性一抗。將一抗用含有2%BSA的1xPBS稀釋至適當(dāng)濃度，如1:100-1:500。將稀釋后的一抗滴加在蓋玻片上，確保細(xì)胞完全被一抗覆蓋。將蓋玻片置于濕盒中，4℃孵育過(guò)夜。濕盒的作用是保持濕度，防止一抗溶液干燥。孵育過(guò)夜可以使一抗與細(xì)胞內(nèi)的CRTMAGE-A3蛋白充分結(jié)合，提高檢測(cè)的靈敏度。一抗孵育結(jié)束后，進(jìn)行二抗孵育，用1xPBS漂洗蓋玻片3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。選擇與一抗來(lái)源種屬相匹配的熒光素標(biāo)記的二抗。例如，如果一抗是鼠源抗體，則選擇熒光素標(biāo)記的羊抗鼠二抗。將二抗用含有2%BSA的1xPBS稀釋至適當(dāng)濃度，如1:200-1:500。將稀釋后的二抗滴加在蓋玻片上，確保細(xì)胞完全被二抗覆蓋。將蓋玻片置于濕盒中，室溫下避光孵育1小時(shí)。避光孵育是為了防止熒光素在光照下發(fā)生淬滅，影響檢測(cè)結(jié)果。二抗孵育結(jié)束后，進(jìn)行細(xì)胞核染色，用1xPBS漂洗蓋玻片3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。加入適量的DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，一種能夠與DNA結(jié)合并在紫外光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光的染料）染色液，室溫下避光孵育5-10分鐘。DAPI可以特異性地標(biāo)記細(xì)胞核，便于在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，同時(shí)也可以作為定位的參考。染色結(jié)束后，用1xPBS漂洗蓋玻片3次，每次10分鐘，以去除多余的DAPI。最后進(jìn)行封片和觀察，取一片干凈的載玻片，滴加適量的抗熒光淬滅封片劑。將蓋玻片從細(xì)胞培養(yǎng)皿中小心取出，輕輕擦干蓋玻片背面的水分，然后將蓋玻片細(xì)胞面朝下放置在載玻片的封片劑上，確保封片劑均勻分布，無(wú)氣泡產(chǎn)生。將封好的玻片置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。在熒光顯微鏡下，根據(jù)熒光素的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，選擇合適的濾光片組。例如，如果使用的是FITC（異硫氰酸熒光素，激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm）標(biāo)記的二抗，則選擇相應(yīng)的藍(lán)光激發(fā)濾光片組。觀察并記錄細(xì)胞內(nèi)CRTMAGE-A3蛋白的熒光信號(hào)分布情況，與細(xì)胞核的DAPI染色信號(hào)進(jìn)行對(duì)比，從而確定CRTMAGE-A3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。如果CRTMAGE-A3蛋白主要定位于細(xì)胞核，則會(huì)觀察到細(xì)胞核區(qū)域有較強(qiáng)的熒光信號(hào)；如果主要定位于細(xì)胞質(zhì)，則細(xì)胞質(zhì)區(qū)域會(huì)呈現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)。還可以使用圖像分析軟件，如ImageJ，對(duì)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和分布進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步深入研究CRTMAGE-A3蛋白的定位情況。4.2體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)4.2.1轉(zhuǎn)染不同類型細(xì)胞將構(gòu)建成功的CRTMAGE-A3重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞系，這是深入探究其感染效率和表達(dá)情況的關(guān)鍵步驟，有助于全面了解重組腺病毒載體在不同細(xì)胞環(huán)境中的特性。本研究選取了人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肝癌細(xì)胞系HepG2和人胚腎細(xì)胞系293T作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。這三種細(xì)胞系在腫瘤研究和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，且各自具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。A549細(xì)胞系來(lái)源于人肺癌組織，具有肺癌細(xì)胞的典型特征，如快速增殖、侵襲性強(qiáng)等。HepG2細(xì)胞系則源自人肝癌組織，對(duì)研究肝癌的發(fā)病機(jī)制和治療方法具有重要意義。293T細(xì)胞系是一種常用的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)染效率高、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，先對(duì)三種細(xì)胞系進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。將A549細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和293T細(xì)胞分別接種于含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在適宜的環(huán)境中生長(zhǎng)和增殖。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到80%-90%的融合度時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。此時(shí)的細(xì)胞代謝活性高，對(duì)重組腺病毒載體的攝取和反應(yīng)能力較強(qiáng)，有利于提高轉(zhuǎn)染效率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將CRTMAGE-A3重組腺病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞。脂質(zhì)體是一種人工合成的雙層膜結(jié)構(gòu)，能夠包裹重組腺病毒載體，通過(guò)與細(xì)胞膜的融合，將載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書，將CRTMAGE-A3重組腺病毒載體與脂質(zhì)體混合，形成脂質(zhì)體-載體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞充分接觸復(fù)合物。在37℃、5%CO?的條件下孵育4-6小時(shí)，讓脂質(zhì)體-載體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。孵育結(jié)束后，更換為新鮮的含有10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的感染情況。如果重組腺病毒載體攜帶綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記基因，在熒光顯微鏡下，感染了重組腺病毒載體的細(xì)胞會(huì)發(fā)出綠色熒光。通過(guò)觀察綠色熒光的強(qiáng)度和分布情況，可以初步判斷重組腺病毒載體的感染效率。統(tǒng)計(jì)發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算感染效率。感染效率=（發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。使用Westernblot技術(shù)檢測(cè)CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)情況。按照Westernblot的實(shí)驗(yàn)步驟，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體上，與特異性的抗CRTMAGE-A3抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)。加入酶標(biāo)記的二抗，通過(guò)底物顯色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)條帶。通過(guò)觀察條帶的強(qiáng)弱，可以判斷CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，感染效率達(dá)到了70%，CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)水平較高，在Westernblot檢測(cè)中呈現(xiàn)出明顯的條帶。在人肝癌細(xì)胞系HepG2中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，感染效率為60%，CRTMAGE-A3蛋白也有一定程度的表達(dá)。在人胚腎細(xì)胞系293T中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，感染效率高達(dá)80%，CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)水平最為顯著。這表明CRTMAGE-A3重組腺病毒載體對(duì)不同類型的細(xì)胞具有不同的感染效率和表達(dá)情況。在293T細(xì)胞中，由于其本身具有較高的轉(zhuǎn)染效率和良好的細(xì)胞狀態(tài)，重組腺病毒載體的感染效率和CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)水平都較高。而在A549和HepG2細(xì)胞中，感染效率和表達(dá)水平相對(duì)較低，可能與細(xì)胞的生物學(xué)特性、細(xì)胞膜表面受體的表達(dá)情況等因素有關(guān)。4.2.2表達(dá)水平與時(shí)間的關(guān)系研究不同時(shí)間點(diǎn)CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)水平，對(duì)于深入了解重組腺病毒載體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化具有重要意義，能夠?yàn)楹罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用提供關(guān)鍵的時(shí)間參數(shù)。本研究以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，在轉(zhuǎn)染CRTMAGE-A3重組腺病毒載體后，分別在12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)和60小時(shí)等多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，全面分析CRTMAGE-A3蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間的變化規(guī)律。在不同時(shí)間點(diǎn)收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，吸去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1xPBS輕柔漂洗細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的含有終濃度1mMPMSF/PI的RIPA裂解液，按照每10cm2的細(xì)胞培養(yǎng)面積加入1ml裂解液的比例進(jìn)行操作。用細(xì)胞刮或槍頭吹打，將細(xì)胞從孔底刮離，然后將細(xì)胞裂解物吸回EP管中。將EP管置于4℃冰箱內(nèi)，在旋轉(zhuǎn)機(jī)器上旋轉(zhuǎn)0.5-3小時(shí)，使樣品充分混勻裂解。裂解完成后，在4℃、12000rpm的條件下離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片和不溶性雜質(zhì)，吸取上清液。在上清液中加入等體積的2Xloading（或4X）上樣緩沖液，充分混勻。將混合后的樣品于95℃變性15分鐘，使蛋白質(zhì)變性，便于后續(xù)的電泳分離。變性結(jié)束后，樣品可用于SDS-PAGE電泳。若暫時(shí)不進(jìn)行電泳，可將樣品凍存于-20℃或-80℃冰箱中保存。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)水平。按照Westernblot的實(shí)驗(yàn)步驟，將處理好的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離。根據(jù)CRTMAGE-A3蛋白的分子量大小，配置合適濃度的分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品加入凝膠的加樣孔中，在100V的電壓下進(jìn)行電泳。在電泳過(guò)程中，要密切關(guān)注蛋白條帶的遷移情況，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求及時(shí)終止電泳。一般來(lái)說(shuō)，濃縮膠的電流小于分離膠的電流。電泳結(jié)束后，通過(guò)轉(zhuǎn)膜技術(shù)將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素薄膜或聚偏二氟乙烯膜，PVDF膜）上。將固相載體與特異性的抗CRTMAGE-A3抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，加入酶標(biāo)記的二抗，通過(guò)底物顯色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)CRTMAGE-A3蛋白的表達(dá)條帶。使用圖像分析軟件，如ImageJ，對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析。將不同時(shí)間點(diǎn)的條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）的條帶灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量=（CRTMAGE-A3蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值）×100%。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，繪制CRTMAGE-A3蛋白表達(dá)曲線。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以CRTMAGE-A3蛋白的相對(duì)表達(dá)量為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制散點(diǎn)圖。將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的散點(diǎn)用平滑的曲線連接起來(lái)，得到CRTMAGE-A3蛋白表達(dá)曲線。從表達(dá)曲線可以看出，在轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，CRTMAGE-A3蛋白開始有少量表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量約為0.2