產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌mLT突變株的構(gòu)建與特性及應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景與目的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC）是一類在人和動物腸道中極具危害的病原菌。在養(yǎng)殖業(yè)中，初生仔豬、犢牛、羔羊等幼畜一旦被ETEC感染，常常會出現(xiàn)劇烈水樣腹瀉和迅速脫水的癥狀，其發(fā)病率和死亡率均維持在較高水平，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)相關(guān)資料顯示，仔豬黃痢常見于7日齡內(nèi)仔豬，1-3日齡最為常見，作為初生仔豬的急性、致死性傳染病，發(fā)病率可達(dá)90%，死亡率達(dá)50%；仔豬白痢主要發(fā)生于10-30日齡仔豬，發(fā)病率達(dá)到80%，死亡率達(dá)到50%；斷奶仔豬腹瀉率一般在20%-30%，死亡率在2%-4%，部分豬場斷奶仔豬的腹瀉率甚至可高達(dá)到70%-80%，死亡率高達(dá)15%-20%。這些數(shù)據(jù)直觀地反映出ETEC對養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重威脅，不僅導(dǎo)致大量幼畜死亡，增加養(yǎng)殖成本，還影響了畜產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。從人類健康角度來看，ETEC同樣是不可忽視的隱患。它是發(fā)展中國家嬰兒腹瀉的重要病因，也是兒童、成人以及旅游者腹瀉的常見原因之一?；颊呒皫Ь咦鳛橹饕獋魅驹?，會污染周圍環(huán)境并迅速傳播病菌。多次爆發(fā)流行事件都與水源、食品、牛奶和飲料被污染有關(guān)，嬰兒室也常因1例患兒而引發(fā)爆發(fā)流行。人群對ETEC普遍易感，其中5歲以下尤其小于1歲的嬰幼兒發(fā)病率最高。曾有報道，415人因食用餐廳被污染的食品而爆發(fā)腹瀉，二千多名旅游者因使用ETEC污染的水發(fā)生腹瀉爆發(fā)。這些實例表明ETEC對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，不僅影響患者的身體健康和生活質(zhì)量，還可能引發(fā)公共衛(wèi)生危機(jī)。在ETEC的眾多致病因素中，熱不穩(wěn)定腸毒素（LT）扮演著關(guān)鍵角色。LT具有與霍亂腸毒素相似的作用，能促使小腸分泌，卻不會造成組織損傷。然而，天然LT的強(qiáng)毒性限制了其在疫苗研發(fā)和疾病防控中的應(yīng)用。為了克服這一難題，構(gòu)建mLT突變株并深入研究其主要生物學(xué)特性顯得尤為重要。通過對mLT突變株的研究，我們能夠更深入地了解ETEC的致病機(jī)制，為開發(fā)新型疫苗和治療方法提供理論依據(jù)。一方面，研究mLT突變株的生物學(xué)特性，如遺傳穩(wěn)定性、菌毛生長能力、生長曲線、胃腸道環(huán)境耐受性、耐藥性和黏附能力等，有助于我們?nèi)嬲J(rèn)識突變株的特性，為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)；另一方面，探究mLT突變株的免疫原性和安全性，對于評估其作為疫苗候選株的潛力具有重要意義。若能成功開發(fā)出基于mLT突變株的安全有效的疫苗，將為養(yǎng)殖業(yè)和人類健康領(lǐng)域帶來新的希望，有效降低ETEC感染帶來的危害，具有重大的現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。1.2研究意義從理論層面來看，深入研究mLT突變株的主要生物學(xué)特性，如遺傳穩(wěn)定性、菌毛生長能力、生長曲線、胃腸道環(huán)境耐受性、耐藥性和黏附能力等，有助于我們更加全面、深入地理解產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的致病機(jī)制。遺傳穩(wěn)定性關(guān)乎突變株在后續(xù)研究和應(yīng)用中的可靠性，穩(wěn)定的遺傳特性是其進(jìn)一步開發(fā)利用的基礎(chǔ)；菌毛生長能力與ETEC在宿主腸道內(nèi)的定植密切相關(guān)，了解這一特性能夠揭示ETEC感染初期的關(guān)鍵步驟；生長曲線則反映了突變株在不同環(huán)境條件下的生長規(guī)律，為研究其在宿主腸道內(nèi)的繁殖速度和生存能力提供依據(jù)；胃腸道環(huán)境耐受性體現(xiàn)了突變株對復(fù)雜腸道環(huán)境的適應(yīng)能力，這對于解析ETEC如何在腸道內(nèi)存活并致病至關(guān)重要；耐藥性的研究有助于我們認(rèn)識ETEC在面對抗菌藥物時的應(yīng)對策略，為臨床治療提供參考；黏附能力是ETEC致病的關(guān)鍵因素之一，明確突變株的黏附特性能夠深入探究其感染宿主細(xì)胞的機(jī)制。通過對這些生物學(xué)特性的研究，我們能夠從多個角度剖析ETEC的致病過程，填補(bǔ)該領(lǐng)域在致病機(jī)制研究方面的空白，為進(jìn)一步深入研究ETEC提供堅實的理論基礎(chǔ)，也為其他病原菌的研究提供了新的思路和方法。在實踐應(yīng)用方面，構(gòu)建mLT突變株并研究其免疫原性和安全性，對開發(fā)新型疫苗和防控大腸桿菌性腹瀉具有重要的指導(dǎo)意義。大腸桿菌性腹瀉給養(yǎng)殖業(yè)和人類健康帶來了巨大的危害，傳統(tǒng)的治療方法和疫苗存在諸多局限性。而基于mLT突變株開發(fā)的新型疫苗，有望克服這些局限性，為疾病的防控提供更有效的手段。若能證明mLT突變株具有良好的免疫原性，即能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，同時具備較高的安全性，不會對機(jī)體造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，那么它將為新型疫苗的研發(fā)提供全新的候選株。這不僅能夠降低ETEC感染在養(yǎng)殖業(yè)中的發(fā)病率和死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失，保障畜牧業(yè)的健康發(fā)展；還能為人類預(yù)防ETEC感染提供更安全、有效的疫苗選擇，降低人類感染ETEC的風(fēng)險，提高公共衛(wèi)生水平，具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會價值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已取得了諸多成果。國外方面，對ETEC的致病機(jī)制展開了深入研究，明確了其致病依賴于菌毛黏附素和腸毒素的協(xié)同作用。例如，通過分子生物學(xué)技術(shù)揭示了菌毛黏附素與宿主細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合機(jī)制，以及腸毒素如何作用于腸道細(xì)胞，影響細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉等癥狀。在流行病學(xué)研究上，國外學(xué)者對不同地區(qū)ETEC的流行特征和血清型分布進(jìn)行了大量調(diào)查，發(fā)現(xiàn)ETEC的流行具有明顯的地域差異，不同地區(qū)的優(yōu)勢血清型也有所不同，這些研究為制定針對性的防控策略提供了重要依據(jù)。在疫苗研發(fā)方面，國外一直處于前沿地位，嘗試了多種新型疫苗的研發(fā)思路，如亞單位疫苗、核酸疫苗等，并取得了一定的進(jìn)展，部分疫苗已進(jìn)入臨床試驗階段。國內(nèi)對ETEC的研究也在不斷深入。在致病機(jī)制研究上，國內(nèi)學(xué)者從基因水平、蛋白質(zhì)水平等多個層面進(jìn)行了探索，進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了ETEC致病機(jī)制的理論體系。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些基因的突變或表達(dá)差異會影響ETEC的毒力和致病性。在流行病學(xué)方面，國內(nèi)對不同養(yǎng)殖地區(qū)ETEC的感染情況進(jìn)行了廣泛的調(diào)查，明確了其在國內(nèi)的流行特點和趨勢，為國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)的疫病防控提供了有力的數(shù)據(jù)支持。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，國內(nèi)也取得了顯著成果，成功研發(fā)出多種針對ETEC的基因工程疫苗，并在實際應(yīng)用中取得了良好的免疫效果，有效降低了ETEC感染的發(fā)病率和死亡率。針對mLT突變株的構(gòu)建，國外主要采用定點突變技術(shù)，通過對LT基因特定堿基位點的精確改變，構(gòu)建出具有不同突變類型的mLT突變株。在構(gòu)建過程中，運(yùn)用先進(jìn)的基因編輯工具，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，提高了突變株構(gòu)建的準(zhǔn)確性和效率。在構(gòu)建完成后，利用各種現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、細(xì)胞生物學(xué)實驗等，對突變株的生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究，分析突變對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響，以及突變株在細(xì)胞水平和動物模型中的表現(xiàn)。國內(nèi)在mLT突變株構(gòu)建方面，除了采用常規(guī)的定點突變技術(shù)外，還結(jié)合了自主研發(fā)的一些基因操作方法，提高了構(gòu)建的成功率和穩(wěn)定性。例如，通過優(yōu)化基因載體和轉(zhuǎn)化條件，使得突變基因能夠更高效地整合到大腸桿菌基因組中。在突變株的鑒定和分析上，國內(nèi)綜合運(yùn)用了分子生物學(xué)、免疫學(xué)等多種技術(shù)手段，不僅對突變株的基因序列進(jìn)行精確測定，還對其表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫學(xué)分析，評估突變株的免疫原性和安全性。在應(yīng)用方面，國外將mLT突變株主要應(yīng)用于疫苗研發(fā)和疾病治療的探索。在疫苗研發(fā)中，以mLT突變株為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的疫苗佐劑和遞送系統(tǒng)，開發(fā)新型的亞單位疫苗和核酸疫苗，提高疫苗的免疫效果和安全性。在疾病治療研究中，探索利用mLT突變株產(chǎn)生的特異性抗體或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，開發(fā)新的治療方法，為ETEC感染的治療提供新的思路。國內(nèi)對mLT突變株的應(yīng)用研究主要集中在動物疫苗領(lǐng)域。通過將mLT突變株與其他毒力因子或免疫增強(qiáng)劑結(jié)合，研發(fā)多價疫苗，增強(qiáng)疫苗對不同血清型ETEC的免疫保護(hù)效果。同時，開展了大量的動物實驗和臨床試驗，驗證疫苗的有效性和安全性，為疫苗的推廣應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。此外，國內(nèi)還在探索mLT突變株在生物檢測和診斷領(lǐng)域的應(yīng)用，利用其特異性的免疫反應(yīng)，開發(fā)快速、準(zhǔn)確的檢測方法，用于ETEC感染的早期診斷。盡管國內(nèi)外在產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌研究、mLT突變株構(gòu)建和應(yīng)用方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些研究空白。在致病機(jī)制方面，ETEC與宿主細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制尚未完全闡明，尤其是在分子層面上，還有許多未知的信號通路和調(diào)控機(jī)制有待探索。在mLT突變株構(gòu)建方面，如何進(jìn)一步提高突變株的構(gòu)建效率和穩(wěn)定性，以及如何精準(zhǔn)地調(diào)控突變株的生物學(xué)特性，仍然是需要解決的問題。在應(yīng)用研究方面，雖然已經(jīng)取得了一些成果，但如何將這些研究成果更好地轉(zhuǎn)化為實際的產(chǎn)品和技術(shù)，應(yīng)用于臨床治療和疫病防控，還需要進(jìn)一步加強(qiáng)研究和開發(fā)。二、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌及mLT概述2.1產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌簡介2.1.1分類地位與形態(tài)特征產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC）隸屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，是一類革蘭氏陰性直桿菌。其細(xì)胞大小約為0.5-0.8μm×1.0-3.0μm，呈兩端鈍圓的形態(tài)，周身分布著鞭毛，具備運(yùn)動能力，且不形成芽孢。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，ETEC呈現(xiàn)出短小的桿狀，單個或成對存在。大多數(shù)菌株擁有普通菌毛與性菌毛，部分菌株還具備多糖類莢膜。這些結(jié)構(gòu)在ETEC的致病過程中發(fā)揮著重要作用，菌毛有助于細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞表面，莢膜則能增強(qiáng)細(xì)菌對宿主免疫系統(tǒng)的抵抗能力。在培養(yǎng)特性方面，ETEC的最佳生長溫度為37℃，與人體和動物的體溫相近，這使其能夠在宿主腸道內(nèi)適宜生長；最佳pH值為7.2-7.4，呈弱堿性，符合腸道內(nèi)的酸堿環(huán)境。在普通瓊脂培養(yǎng)基上，ETEC生長良好，可形成圓形、邊緣整齊、稍隆起、光滑且半透明的灰白色菌落。而在鑒別性或選擇性培養(yǎng)基上，如麥康凱培養(yǎng)基，ETEC會形成有顏色、直徑約2-3mm的光滑型菌落，通過菌落的特征可以初步對其進(jìn)行鑒別。從生化反應(yīng)來看，ETEC能分解多種糖（醇、苷）類，使其產(chǎn)酸或產(chǎn)氣，這一特性可用于進(jìn)一步的生化鑒定。例如，在乳糖發(fā)酵試驗中，ETEC能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基中的指示劑變色，從而與不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌相區(qū)分。此外，ETEC的吲哚試驗和M.R.試驗均為陽性，V.P.試驗和檸檬酸鹽利用試驗均為陰性，這些生化反應(yīng)結(jié)果構(gòu)成了ETEC獨特的生化特性譜，為實驗室診斷和分類提供了重要依據(jù)。2.1.2致病機(jī)理ETEC的致病過程是一個復(fù)雜且有序的過程，主要依賴于定居因子（黏附素）和腸毒素的協(xié)同作用。定居因子在ETEC致病的初始階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ETEC借助其表面的蛋白性菌毛，這些菌毛呈纖維型包被在菌體抗原表面，與腸粘膜上皮細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合。不同類型的定居因子對應(yīng)著不同的受體，例如K88的受體是D-半乳糖，主要表達(dá)在小腸；K99的受體是神經(jīng)節(jié)苷（GM）和D-半乳糖；987P的受體是糖蛋白、D-半乳糖和L-巖藻糖，主要在回腸表達(dá)；F41的受體是D-半乳糖，主要在小腸表達(dá)。這種特異性的結(jié)合使得ETEC能夠牢固地定居在腸道上皮細(xì)胞上，避免因動物消化道的不斷蠕動而被迅速排出體外，從而為后續(xù)的致病過程創(chuàng)造條件。一旦ETEC成功定居在腸道上皮細(xì)胞表面，便開始大量生長繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。腸毒素是ETEC致病的關(guān)鍵因子，主要包括耐熱腸毒素（ST）和熱敏腸毒素（LT）。這兩種腸毒素在致病機(jī)制上有所不同，但最終都導(dǎo)致了腸道生理功能的紊亂，引發(fā)腹瀉等癥狀。耐熱腸毒素（ST）與腸壁上皮細(xì)胞表面的GM1受體結(jié)合后，會刺激腸上皮細(xì)胞中的鳥苷酸環(huán)化酶（GC）的分泌，使細(xì)胞漿中環(huán)磷酸鳥苷酸（cGMP）的含量上升。cGMP作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，會進(jìn)一步激活一系列下游信號通路，導(dǎo)致腸腺細(xì)胞分泌功能亢進(jìn)，大量的水分和電解質(zhì)被分泌到小腸內(nèi)，超過了腸道的吸收能力，從而引發(fā)腹瀉。熱敏腸毒素（LT）的作用機(jī)制與霍亂腸毒素相似。LT由A、B兩個亞基組成，其中5個完全相同的B亞基先形成一個環(huán)狀五聚體，識別并結(jié)合腸壁上皮細(xì)胞表面的GM1受體，進(jìn)而協(xié)助A亞基進(jìn)入細(xì)胞。A亞基進(jìn)入細(xì)胞后，會活化細(xì)胞上的腺苷酸環(huán)化酶，使ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平顯著增高。cAMP同樣作為第二信使，激活蛋白激酶A（PKA），PKA通過磷酸化作用，調(diào)節(jié)離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，抑制鈉的再吸收，同時促進(jìn)腸道水分和氯化物的分泌，最終導(dǎo)致大量水樣便的產(chǎn)生。在ETEC感染過程中，菌株可單獨產(chǎn)生ST或LT，也可同時產(chǎn)生兩種毒素。研究結(jié)果表明，約20%-30%的ETEC為LT陽性/ST陰性；30%-40%的ETEC為LT陽性且ST陽性；而LT陰性/ST陽性的ETEC占比約50%左右。不同類型腸毒素的產(chǎn)生組合，以及它們在致病過程中的相互作用，進(jìn)一步增加了ETEC致病機(jī)制的復(fù)雜性。2.1.3流行病學(xué)特點ETEC在人和動物中均有廣泛的感染，其傳染源主要包括患者、帶菌者以及感染的動物?；颊吆蛶Ь邥ㄟ^糞便排出大量的ETEC，這些細(xì)菌一旦污染周圍環(huán)境，如水源、土壤、食物等，就可能成為傳播的源頭。在動物養(yǎng)殖環(huán)境中，感染ETEC的幼畜，如初生仔豬、犢牛、羔羊等，也是重要的傳染源，它們排出的糞便中含有高濃度的病原菌，可迅速污染養(yǎng)殖場的環(huán)境，導(dǎo)致同群動物的感染。ETEC的傳播途徑多樣，主要通過糞-口途徑傳播。被ETEC污染的水源是常見的傳播媒介，當(dāng)人們或動物飲用了受污染的水后，極易感染ETEC。例如，在一些衛(wèi)生條件較差的地區(qū)，水源受到糞便污染，居民飲用后就可能引發(fā)ETEC腹瀉的爆發(fā)流行。食物污染也是重要的傳播方式，被ETEC污染的蔬菜、水果、肉類、牛奶等食品，在未經(jīng)過妥善處理和烹飪的情況下被食用，也會導(dǎo)致感染。此外，人與人之間的密切接觸，如護(hù)理人員接觸感染患者后未做好手衛(wèi)生，再接觸其他健康人，也可能傳播ETEC。從地區(qū)分布來看，ETEC在全球范圍內(nèi)均有流行，但在發(fā)展中國家的發(fā)病率明顯高于發(fā)達(dá)國家。這主要與發(fā)展中國家的衛(wèi)生條件、飲用水安全、食品衛(wèi)生監(jiān)管等因素有關(guān)。在一些貧困地區(qū)，基礎(chǔ)設(shè)施不完善，缺乏清潔的飲用水和有效的污水處理系統(tǒng)，人們更容易接觸到被ETEC污染的環(huán)境，從而增加了感染的風(fēng)險。在人群分布方面，5歲以下兒童，尤其是1歲以下的嬰幼兒，由于其免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，腸道屏障功能較弱，對ETEC普遍易感，且感染后病情往往較為嚴(yán)重。此外，旅游者由于生活環(huán)境和飲食習(xí)慣的改變，腸道微生態(tài)平衡被打破，也容易感染ETEC，引發(fā)“旅行者腹瀉”。在動物中，不同年齡段的動物對ETEC的易感性也有所差異。初生幼畜，如仔豬、犢牛、羔羊等，由于其腸道內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)尚未穩(wěn)定建立，自身免疫力低下，極易受到ETEC的感染。仔豬黃痢常見于7日齡內(nèi)仔豬，1-3日齡最為常見，發(fā)病率可達(dá)90%，死亡率達(dá)50%；仔豬白痢主要發(fā)生于10-30日齡仔豬，發(fā)病率達(dá)到80%，死亡率達(dá)到50%；斷奶仔豬腹瀉率一般在20%-30%，死亡率在2%-4%，部分豬場斷奶仔豬的腹瀉率甚至可高達(dá)到70%-80%，死亡率高達(dá)15%-20%。這些數(shù)據(jù)充分表明ETEC對幼畜的嚴(yán)重危害，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2.2不耐熱腸毒素（LT）2.2.1LT的結(jié)構(gòu)與功能不耐熱腸毒素（LT）是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）產(chǎn)生的一種重要致病物質(zhì)，對熱不穩(wěn)定，65℃、30分鐘即可被滅活。LT在結(jié)構(gòu)上由A、B兩個亞基組成。其中，5個完全相同的B亞基先通過非共價鍵相互作用，形成一個環(huán)狀五聚體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)具有高度的對稱性和穩(wěn)定性。B亞基環(huán)狀五聚體的主要功能是識別并結(jié)合腸壁上皮細(xì)胞表面的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂廣泛存在于腸道上皮細(xì)胞的表面，是LT的特異性受體。B亞基與GM1受體之間具有高度的親和力，通過這種特異性結(jié)合，LT能夠錨定在腸上皮細(xì)胞表面，為A亞基進(jìn)入細(xì)胞創(chuàng)造條件。一個A亞基位于B亞基形成的環(huán)狀五聚體中央，與B亞基緊密結(jié)合。A亞基在LT發(fā)揮毒性作用中起著核心作用。當(dāng)B亞基與GM1受體結(jié)合后，會誘導(dǎo)A亞基發(fā)生構(gòu)象變化，使其能夠脫離B亞基的束縛，進(jìn)入腸上皮細(xì)胞內(nèi)。A亞基進(jìn)入細(xì)胞后，會發(fā)揮其酶活性，特異性地活化細(xì)胞上的腺苷酸環(huán)化酶（AC）。腺苷酸環(huán)化酶是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，它能夠催化ATP轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷（cAMP）。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞正常的生理功能。而A亞基活化腺苷酸環(huán)化酶后，會使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平急劇增高，打破細(xì)胞內(nèi)的信號平衡。cAMP作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，會進(jìn)一步激活一系列下游信號通路。cAMP會激活蛋白激酶A（PKA），PKA是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能夠?qū)Χ喾N底物蛋白進(jìn)行磷酸化修飾，從而調(diào)節(jié)這些蛋白的活性和功能。在腸道上皮細(xì)胞中，PKA的激活會導(dǎo)致離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性發(fā)生改變。PKA會磷酸化一些氯離子通道蛋白，使其開放，導(dǎo)致氯離子大量分泌到腸腔中；同時，PKA還會抑制鈉離子的再吸收，使鈉離子在細(xì)胞內(nèi)積聚。由于離子濃度的改變，會產(chǎn)生滲透壓梯度，導(dǎo)致大量水分被動地進(jìn)入腸腔。最終，腸道內(nèi)水分和氯化物的分泌遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了腸道的吸收能力，從而引發(fā)大量水樣便的產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)腹瀉、脫水等癥狀。2.2.2LT的毒性作用機(jī)制LT的毒性作用機(jī)制是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程，涉及多個分子層面的相互作用。首先，在LT與細(xì)胞表面受體結(jié)合階段，LT的B亞基環(huán)狀五聚體憑借其獨特的空間結(jié)構(gòu)和氨基酸序列，能夠特異性地識別并緊密結(jié)合腸壁上皮細(xì)胞表面的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體。這種結(jié)合具有高度的特異性和親和力，類似于“鎖-鑰匙”的關(guān)系。研究表明，B亞基上的某些關(guān)鍵氨基酸殘基與GM1受體的特定結(jié)構(gòu)域相互作用，形成氫鍵、離子鍵和范德華力等多種非共價鍵，從而確保了兩者的穩(wěn)定結(jié)合。這種特異性結(jié)合是LT發(fā)揮毒性作用的起始步驟，決定了LT能夠精準(zhǔn)地作用于腸道上皮細(xì)胞，而不影響其他細(xì)胞類型。一旦B亞基與GM1受體結(jié)合，就會引發(fā)一系列的分子事件，協(xié)助A亞基進(jìn)入細(xì)胞。B亞基與GM1受體的結(jié)合會誘導(dǎo)B亞基和A亞基的構(gòu)象發(fā)生變化，這種構(gòu)象變化會暴露出A亞基上的一些隱蔽位點，使其能夠與細(xì)胞表面的某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或受體相互作用，從而促進(jìn)A亞基通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。內(nèi)吞作用是細(xì)胞攝取大分子物質(zhì)的一種重要方式，通過細(xì)胞膜的內(nèi)陷形成小泡，將細(xì)胞外的物質(zhì)包裹并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。在這個過程中，細(xì)胞內(nèi)的一些分子伴侶和信號通路也參與其中，協(xié)同作用，確保A亞基能夠順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的特定部位，如細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核周圍。A亞基進(jìn)入細(xì)胞后，會迅速活化細(xì)胞上的腺苷酸環(huán)化酶（AC），這是LT毒性作用的關(guān)鍵步驟。A亞基具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，它能夠?qū)燉０废汆堰识塑账幔∟AD+）上的ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到腺苷酸環(huán)化酶的特定氨基酸殘基上，從而使腺苷酸環(huán)化酶持續(xù)活化。被活化的腺苷酸環(huán)化酶會催化ATP大量轉(zhuǎn)化為cAMP，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平急劇升高。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的升高幅度與LT的毒性強(qiáng)度密切相關(guān)，cAMP水平的異常升高會打破細(xì)胞內(nèi)原有的信號平衡，激活一系列原本處于抑制狀態(tài)的信號通路。細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的升高會進(jìn)一步激活蛋白激酶A（PKA）。PKA是一種由兩個調(diào)節(jié)亞基和兩個催化亞基組成的全酶，在細(xì)胞內(nèi)以無活性的形式存在。當(dāng)cAMP水平升高時，cAMP會與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，導(dǎo)致調(diào)節(jié)亞基與催化亞基解離，釋放出具有活性的催化亞基?；罨腜KA催化亞基會對多種底物蛋白進(jìn)行磷酸化修飾，這些底物蛋白廣泛參與細(xì)胞的各種生理過程，如離子轉(zhuǎn)運(yùn)、物質(zhì)代謝、基因表達(dá)調(diào)控等。在腸道上皮細(xì)胞中，PKA主要作用于離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。PKA會對氯離子通道蛋白進(jìn)行磷酸化修飾，使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致氯離子通道開放，氯離子大量分泌到腸腔中。同時，PKA還會抑制鈉離子的再吸收相關(guān)蛋白的活性，使鈉離子無法正常被細(xì)胞吸收，導(dǎo)致鈉離子在細(xì)胞內(nèi)積聚。由于氯離子和鈉離子在細(xì)胞內(nèi)外的濃度變化，會產(chǎn)生強(qiáng)大的滲透壓梯度。根據(jù)滲透原理，水分子會順著滲透壓梯度從細(xì)胞內(nèi)被動地進(jìn)入腸腔，以平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓。隨著大量水分進(jìn)入腸腔，腸道內(nèi)的液體量急劇增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了腸道的吸收能力，最終導(dǎo)致大量水樣便的產(chǎn)生，引發(fā)腹瀉、脫水等癥狀。此外，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的升高還可能通過激活其他信號通路，影響腸道的蠕動和分泌功能，進(jìn)一步加重腹瀉癥狀。三、mLT突變株的構(gòu)建3.1實驗材料3.1.1菌種與質(zhì)粒實驗選用產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌C83903菌株作為野生型親本菌株，該菌株是從臨床腹瀉病例中分離鑒定得到，具有典型的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌特征，能夠穩(wěn)定表達(dá)不耐熱腸毒素（LT），在國內(nèi)外相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用。選用pTarget-F質(zhì)粒作為基因編輯載體，其具有氨芐青霉素抗性基因，便于后續(xù)轉(zhuǎn)化子的篩選。該質(zhì)粒含有ori復(fù)制原點，可在大腸桿菌中自主復(fù)制，并且多克隆位點區(qū)域便于目的基因片段的插入和修飾。同時，還使用了pCas9質(zhì)粒，它攜帶Cas9核酸酶基因，可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Cas9蛋白，與pTarget-F質(zhì)粒共同作用，實現(xiàn)對大腸桿菌基因組的精確編輯。3.1.2實驗動物與細(xì)胞系選用6-8周齡的SPF級BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。該品系小鼠遺傳背景清晰，免疫反應(yīng)穩(wěn)定，常用于微生物感染與免疫相關(guān)的研究。在實驗前，小鼠需在溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由采食和飲水，以確保小鼠處于良好的生理狀態(tài)。細(xì)胞系方面，選用鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞（Y1），購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。Y1細(xì)胞對LT具有高度敏感性，可用于檢測mLT突變株的毒性。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，使用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，用于后續(xù)實驗。3.1.3主要試劑與儀器主要試劑包括：2×TaqPCRMasterMix，購自寶生物工程（大連）有限公司，用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等成分，可保證PCR反應(yīng)的高效進(jìn)行；DNAMarker，購自天根生化科技（北京）有限公司，用于判斷PCR產(chǎn)物的大??；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ等，購自NEB公司，用于質(zhì)粒的酶切和基因片段的切割；T4DNA連接酶，購自Promega公司，用于連接酶切后的DNA片段；瓊脂糖，購自Sigma公司，用于制備瓊脂糖凝膠，進(jìn)行核酸電泳；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒，均購自O(shè)MEGA公司，分別用于質(zhì)粒的提取和DNA片段的回收；氨芐青霉素、卡那霉素等抗生素，購自北京索萊寶科技有限公司，用于篩選轉(zhuǎn)化子和維持菌株的抗性。主要儀器設(shè)備有：PCR擴(kuò)增儀（ABI2720型），購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，可精確控制PCR反應(yīng)的溫度和時間，保證擴(kuò)增反應(yīng)的準(zhǔn)確性；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+），購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于觀察和記錄瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；恒溫?fù)u床（THZ-82A），購自太倉市實驗設(shè)備廠，用于細(xì)菌的振蕩培養(yǎng)，提供適宜的生長環(huán)境；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R），購自德國艾本德股份公司，可在低溫條件下快速離心，用于細(xì)菌菌體的收集和細(xì)胞破碎后的上清液分離；超凈工作臺（SW-CJ-2FD），購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，提供無菌操作環(huán)境，防止實驗過程中的微生物污染；恒溫培養(yǎng)箱（MCO-18AIC），購自三洋電機(jī)株式會社，用于細(xì)菌和細(xì)胞的培養(yǎng)，可精確控制溫度和濕度。三、mLT突變株的構(gòu)建3.2實驗方法3.2.1基因編輯技術(shù)原理本實驗采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建mLT突變株。CRISPR/Cas9系統(tǒng)源自細(xì)菌和古細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，能抵御外來噬菌體或質(zhì)粒DNA的入侵。在該系統(tǒng)中，CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）指成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，而Cas（CRISPR-associatedproteins）是與之相關(guān)聯(lián)的蛋白家族。CRISPR序列由一系列短的重復(fù)序列（Repeat）和間隔序列（Spacer）交替排列組成。間隔序列來源于之前入侵過細(xì)菌的外源DNA片段，相當(dāng)于細(xì)菌的“免疫記憶”。當(dāng)外源DNA再次入侵時，CRISPR序列會轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA，然后被加工成成熟的crRNA。crRNA包含與外源DNA互補(bǔ)的間隔序列，能識別并結(jié)合目標(biāo)DNA。Cas9蛋白是一種核酸內(nèi)切酶，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它與crRNA以及反式激活crRNA（tracrRNA）結(jié)合形成復(fù)合物。其中，tracrRNA與crRNA通過堿基互補(bǔ)配對相互作用，共同引導(dǎo)Cas9蛋白識別并結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上。Cas9蛋白具有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域，當(dāng)復(fù)合物識別到與crRNA互補(bǔ)的目標(biāo)DNA序列時，HNH結(jié)構(gòu)域會切割與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域則切割另一條DNA鏈，從而在目標(biāo)DNA上產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）。在構(gòu)建mLT突變株時，我們根據(jù)LT基因序列設(shè)計特異性的sgRNA（single-guideRNA），它融合了crRNA和tracrRNA的功能，能引導(dǎo)Cas9蛋白精確地切割LT基因的特定位點，造成雙鏈斷裂。細(xì)胞內(nèi)存在兩種主要的DNA修復(fù)機(jī)制，即非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HR）。NHEJ是一種易錯的修復(fù)方式，在修復(fù)雙鏈斷裂時，往往會在斷裂位點引入堿基的插入或缺失，從而導(dǎo)致基因的移碼突變或功能喪失；而HR需要有同源模板的存在，在提供外源同源修復(fù)模板的情況下，細(xì)胞會以同源模板為指導(dǎo)進(jìn)行精確修復(fù)，將我們設(shè)計的突變序列引入到LT基因中，實現(xiàn)對LT基因的定點突變，進(jìn)而構(gòu)建出mLT突變株。3.2.2突變位點的選擇與設(shè)計依據(jù)LT毒性關(guān)鍵位點和相關(guān)研究，我們選擇了S63K、A72R、R192G這三個位點進(jìn)行突變。在LT的A亞基中，第63位的絲氨酸（S）、第72位的丙氨酸（A）和第192位的精氨酸（R）對其毒性起著關(guān)鍵作用。相關(guān)研究表明，這些位點的氨基酸殘基直接參與了A亞基與腺苷酸環(huán)化酶的相互作用，以及A亞基對NAD+的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的調(diào)控。S63K突變是將第63位的絲氨酸替換為賴氨酸。絲氨酸是一種極性氨基酸，而賴氨酸是帶正電荷的堿性氨基酸，這種替換會改變氨基酸殘基的電荷性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)，從而影響A亞基與底物和效應(yīng)分子的結(jié)合能力，降低其對腺苷酸環(huán)化酶的活化作用，進(jìn)而降低LT的毒性。A72R突變是將第72位的丙氨酸替換為精氨酸。丙氨酸是一種非極性氨基酸，精氨酸是帶正電荷的堿性氨基酸，這種突變會改變該位點周圍的電荷分布和空間構(gòu)象，可能破壞A亞基與其他分子的相互作用界面，影響其正常的酶活性，最終降低LT的毒性。R192G突變是將第192位的精氨酸替換為甘氨酸。精氨酸是帶正電荷的堿性氨基酸，甘氨酸是一種結(jié)構(gòu)最簡單的非極性氨基酸，這種替換會顯著改變氨基酸殘基的大小、電荷和空間結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致A亞基的活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其無法有效地催化ADP-核糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而降低LT的毒性。通過對這三個位點的突變設(shè)計，我們期望能夠在不影響LT免疫原性的前提下，有效降低其毒性，為后續(xù)的疫苗研發(fā)和應(yīng)用提供安全有效的mLT突變株。在設(shè)計突變位點時，我們還考慮了突變后的基因序列與宿主基因組的兼容性，以及突變對LT蛋白整體結(jié)構(gòu)和功能的潛在影響，通過生物信息學(xué)分析和分子建模技術(shù)，預(yù)測了突變后的蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化，確保突變位點的選擇具有合理性和可行性。3.2.3構(gòu)建流程首先進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌C83903菌株的基因組DNA為模板，設(shè)計特異性引物擴(kuò)增包含LT基因的目的片段。引物設(shè)計時，在5’端分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點及保護(hù)堿基，以確保擴(kuò)增產(chǎn)物能順利進(jìn)行后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。引物序列如下：上游引物5’-CGCGGATCCATGAAACCCAAGCTG-3’，下游引物5’-CCCAAGCTTTCAGCTGCTTTTTG-3’。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O9.5μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察目的條帶的大小和亮度。接著進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建。將擴(kuò)增得到的目的基因片段和pTarget-F質(zhì)粒分別用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：質(zhì)?；駾NA片段5μL，10×Buffer2μL，BamHⅠ和HindⅢ各1μL，ddH?O11μL，37℃酶切2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的pTarget-F質(zhì)粒。將回收的目的基因片段和線性化質(zhì)粒按摩爾比3:1混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為：目的基因片段3μL，線性化質(zhì)粒1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNA連接酶1μL，ddH?O4μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化步驟如下：取100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化，加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速置于冰上冷卻3-5min；加入900μLLB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃振蕩培養(yǎng)1h。取200μL轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測序驗證。然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化與突變株篩選鑒定。將測序正確的重組質(zhì)粒pTarget-F-LT和pCas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌C83903感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法同上述轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞步驟。轉(zhuǎn)化后，將菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，篩選出同時含有重組質(zhì)粒和pCas9質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子。對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使Cas9蛋白和sgRNA發(fā)揮作用，切割LT基因并進(jìn)行同源重組修復(fù)，實現(xiàn)LT基因的定點突變。誘導(dǎo)條件為：在LB液體培養(yǎng)基中加入終濃度為1mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。誘導(dǎo)后，將菌液涂布于含5%蔗糖的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，利用蔗糖的致死作用篩選出丟失pCas9質(zhì)粒的突變株。對篩選得到的突變株進(jìn)行PCR鑒定，驗證突變位點是否正確引入。PCR鑒定引物設(shè)計在突變位點兩側(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序驗證，確保突變株的準(zhǔn)確性。3.3結(jié)果與分析在目的基因擴(kuò)增環(huán)節(jié)，以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌C83903菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約1.2kb處出現(xiàn)了清晰且明亮的條帶（圖1），與預(yù)期的包含LT基因的目的片段大小相符，表明成功擴(kuò)增出目的基因。圖1：M為DNAMarker；1為目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物對質(zhì)粒構(gòu)建過程進(jìn)行驗證，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTarget-F-LT轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示在約1.2kb處出現(xiàn)特異性條帶（圖2），與目的基因片段大小一致，初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確認(rèn)，對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank中LT基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示同源性達(dá)到99%以上，且突變位點S63K、A72R、R192G的堿基替換準(zhǔn)確無誤，表明成功構(gòu)建了攜帶正確突變位點的重組質(zhì)粒pTarget-F-LT。圖2：M為DNAMarker；1-5為重組質(zhì)粒pTarget-F-LT的PCR鑒定產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化與突變株篩選鑒定階段，將重組質(zhì)粒pTarget-F-LT和pCas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌C83903感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，在含5%蔗糖的LB平板上篩選出丟失pCas9質(zhì)粒的突變株。對篩選得到的突變株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶（圖3），表明突變株中含有正確的目的基因片段。測序結(jié)果進(jìn)一步證實，突變株的LT基因在預(yù)定的S63K、A72R、R192G位點發(fā)生了準(zhǔn)確的堿基替換，且未出現(xiàn)其他非預(yù)期的堿基突變，成功構(gòu)建了mLT突變株。圖3：M為DNAMarker；1-5為mLT突變株的PCR鑒定產(chǎn)物四、mLT突變株主要生物學(xué)特性研究4.1遺傳穩(wěn)定性檢測4.1.1傳代培養(yǎng)實驗將構(gòu)建成功的mLT突變株接種于5mL含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床，以200r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)12h，進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。待菌液渾濁，表明細(xì)菌生長良好后，取100μL復(fù)蘇后的菌液轉(zhuǎn)接至5mL新鮮的含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，按照上述條件繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，完成第一代傳代培養(yǎng)。按照相同的方法，連續(xù)進(jìn)行20代傳代培養(yǎng)，每一代傳代培養(yǎng)后，均取適量菌液進(jìn)行后續(xù)檢測。在傳代過程中，密切觀察菌液的生長狀態(tài)，包括菌液的渾濁度、顏色變化等，確保細(xì)菌在傳代過程中正常生長。4.1.2突變基因檢測在完成每一代傳代培養(yǎng)后，取1mL菌液，采用質(zhì)粒小提試劑盒提取細(xì)菌的質(zhì)粒DNA。以提取的質(zhì)粒DNA為模板，使用之前設(shè)計的用于擴(kuò)增包含突變位點的LT基因片段的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O9.5μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與原始設(shè)計的突變基因序列進(jìn)行比對，分析突變位點是否穩(wěn)定存在，是否出現(xiàn)堿基突變、缺失或插入等異常情況。若測序結(jié)果顯示突變位點與原始設(shè)計一致，且未出現(xiàn)其他異常堿基變化，則表明突變株在該代傳代培養(yǎng)中遺傳穩(wěn)定性良好；若出現(xiàn)突變位點改變或其他異常堿基變化，則說明突變株的遺傳穩(wěn)定性受到影響。4.2生長特性4.2.1菌毛生長能力觀察取對數(shù)生長期的mLT突變株和野生型親本菌株C83903，分別以1:100的比例接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)8h。培養(yǎng)結(jié)束后，取1mL菌液，12000r/min離心5min，收集菌體。用無菌PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體3次，每次離心條件相同，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。將洗滌后的菌體重懸于100μL無菌PBS緩沖液中，制成菌懸液。取10μL菌懸液滴加在銅網(wǎng)上，室溫下靜置5min，使菌體吸附在銅網(wǎng)上。用濾紙輕輕吸去多余的菌液，然后滴加2%磷鎢酸溶液（pH7.0）進(jìn)行負(fù)染，染色時間為3min。染色結(jié)束后，再次用濾紙吸去多余的染液，自然干燥。將制備好的銅網(wǎng)置于透射電子顯微鏡下，在100kV加速電壓下觀察菌體表面菌毛的生長形態(tài)和數(shù)量。在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，野生型親本菌株C83903菌體表面分布著大量細(xì)長且較為密集的菌毛，菌毛呈絲狀，均勻地覆蓋在菌體表面，長度約為0.5-1.0μm。而mLT突變株菌體表面的菌毛數(shù)量明顯減少，菌毛長度也有所縮短，約為0.3-0.6μm，且分布相對稀疏。對多個視野下的菌體進(jìn)行菌毛數(shù)量統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示野生型親本菌株平均每個菌體表面的菌毛數(shù)量為（56.3±8.5）根，而mLT突變株平均每個菌體表面的菌毛數(shù)量僅為（23.7±5.2）根，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明mLT突變株的菌毛生長能力相較于野生型親本菌株受到了顯著影響，菌毛數(shù)量的減少和長度的縮短可能會對其在宿主腸道內(nèi)的黏附和定植能力產(chǎn)生重要影響。4.2.2生長曲線測定將mLT突變株和野生型親本菌株C83903分別從-80℃冰箱取出，接種于5mL含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h，進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。待菌液渾濁，表明細(xì)菌生長良好后，用無菌生理鹽水將菌液稀釋至OD???值約為0.1。取稀釋后的菌液100μL，接種于9mL新鮮的含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床，以200r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。從接種后開始計時，每隔1h取1mL菌液，用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后，在波長600nm處，使用紫外可見分光光度計測定菌液的OD???值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD???值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。每個菌株設(shè)置3個平行重復(fù)，取平均值繪制生長曲線。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)初期0-2h，mLT突變株和野生型親本菌株的生長速率較為接近，OD???值增長緩慢，處于遲緩期。從2h開始，野生型親本菌株進(jìn)入對數(shù)生長期，OD???值迅速上升，在6-8h達(dá)到對數(shù)生長中期，生長速率最快。而mLT突變株在3h才明顯進(jìn)入對數(shù)生長期，其對數(shù)生長中期出現(xiàn)在7-9h。在對數(shù)生長期內(nèi)，野生型親本菌株的生長速率略高于mLT突變株，表現(xiàn)為OD???值的上升斜率更大。進(jìn)入穩(wěn)定期后，野生型親本菌株在10-12hOD???值基本保持穩(wěn)定，而mLT突變株在12-14h才達(dá)到穩(wěn)定期，且穩(wěn)定期的OD???值略低于野生型親本菌株。在衰亡期，隨著培養(yǎng)時間的延長，兩菌株的OD???值均逐漸下降，但mLT突變株的下降速率相對較慢。這表明mLT突變株的生長規(guī)律與野生型親本菌株基本相似，但在生長速率和進(jìn)入各個生長階段的時間上存在一定差異，這些差異可能與突變導(dǎo)致的菌體生理特性改變有關(guān)。4.3胃腸道環(huán)境耐受性4.3.1模擬胃液和腸液實驗參照相關(guān)文獻(xiàn)方法，分別配制模擬胃液和模擬腸液。模擬胃液的配方為：取0.2mol/L鹽酸溶液7.0mL，加胃蛋白酶1.0g，再加水稀釋至100mL，調(diào)節(jié)pH值至2.0。模擬腸液的配方為：取磷酸二氫鉀6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；另取胰蛋白酶1.0g，加水100mL使溶解，將兩液混合均勻，即得。取對數(shù)生長期的mLT突變株和野生型親本菌株C83903，分別以1:100的比例接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD???值約為0.6-0.8，達(dá)到對數(shù)生長中期。將培養(yǎng)好的菌液12000r/min離心5min，收集菌體，用無菌PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體3次，每次離心條件相同，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。將洗滌后的菌體重懸于無菌PBS緩沖液中，調(diào)整菌液濃度至1×10?CFU/mL。取1mL調(diào)整好濃度的菌懸液，分別加入到9mL模擬胃液和模擬腸液中，輕輕混勻，使菌液在模擬胃液和模擬腸液中的最終濃度為1×10?CFU/mL。將混合液置于37℃恒溫?fù)u床中，以150r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。分別在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h時，從模擬胃液和模擬腸液中取出100μL菌液，用無菌PBS緩沖液進(jìn)行10倍系列稀釋，取適當(dāng)稀釋度的菌液100μL涂布于LB平板上，每個稀釋度設(shè)置3個平行平板。將LB平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h，培養(yǎng)結(jié)束后，計數(shù)平板上的菌落數(shù)，計算活菌數(shù)（CFU/mL）。4.3.2結(jié)果分析在模擬胃液環(huán)境中，野生型親本菌株C83903和mLT突變株的活菌數(shù)均隨著時間的延長而逐漸減少（圖4）。在0h時，兩者的活菌數(shù)相近，均為1×10?CFU/mL左右。0.5h后，野生型親本菌株的活菌數(shù)下降至1×10?CFU/mL左右，而mLT突變株的活菌數(shù)下降至5×10?CFU/mL左右，mLT突變株的存活能力明顯高于野生型親本菌株。1h后，野生型親本菌株的活菌數(shù)繼續(xù)下降至1×10?CFU/mL左右，mLT突變株的活菌數(shù)為2×10?CFU/mL左右。2h后，野生型親本菌株的活菌數(shù)已降至檢測限以下，而mLT突變株仍有1×10?CFU/mL左右的活菌數(shù)。在4h、6h、8h時，野生型親本菌株均未檢測到活菌，而mLT突變株的活菌數(shù)分別為5×10?CFU/mL、1×10?CFU/mL、5×103CFU/mL。這表明mLT突變株在模擬胃液的酸性環(huán)境中具有更強(qiáng)的存活能力，能夠耐受胃酸的作用，存活時間更長。圖4：*表示與野生型親本菌株在相同時間點相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）在模擬腸液環(huán)境中，野生型親本菌株C83903和mLT突變株的活菌數(shù)在0-2h內(nèi)均略有下降，但下降幅度較?。▓D5）。0h時，兩者的活菌數(shù)均為1×10?CFU/mL左右。2h后，野生型親本菌株的活菌數(shù)下降至8×10?CFU/mL左右，mLT突變株的活菌數(shù)為9×10?CFU/mL左右。從4h開始，野生型親本菌株的活菌數(shù)下降速度加快，4h時為5×10?CFU/mL左右，6h時為2×10?CFU/mL左右，8h時為1×10?CFU/mL左右。而mLT突變株在4-8h內(nèi)的活菌數(shù)下降較為緩慢，4h時為8×10?CFU/mL左右，6h時為6×10?CFU/mL左右，8h時為4×10?CFU/mL左右。在整個培養(yǎng)過程中，mLT突變株的活菌數(shù)始終高于野生型親本菌株，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明mLT突變株在模擬腸液環(huán)境中也表現(xiàn)出較好的存活能力和適應(yīng)能力，能夠在腸道的弱堿性環(huán)境中更好地生存和繁殖。圖5：*表示與野生型親本菌株在相同時間點相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）綜上所述，mLT突變株在模擬胃液和模擬腸液環(huán)境中的存活能力均優(yōu)于野生型親本菌株，具有更好的胃腸道環(huán)境耐受性。這種特性可能與突變導(dǎo)致的菌體表面結(jié)構(gòu)或生理代謝變化有關(guān)，使其能夠更好地適應(yīng)胃腸道的酸堿環(huán)境和消化酶的作用，為其在腸道內(nèi)的定植和后續(xù)的應(yīng)用研究提供了有利條件。4.4耐藥性4.4.1藥敏試驗方法采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗。首先，將mLT突變株和野生型親本菌株C83903分別接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h，使其復(fù)蘇并達(dá)到對數(shù)生長期。取適量菌液，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)，相當(dāng)于1×10?CFU/mL。用無菌棉簽蘸取調(diào)整好濃度的菌液，在M-H瓊脂平板表面均勻涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，以確保菌液均勻分布。涂布完成后，將平板放置在室溫下干燥3-5min，使菌液充分吸附在培養(yǎng)基表面。用無菌鑷子將藥敏紙片分別貼在M-H瓊脂平板表面，各藥敏紙片之間的距離應(yīng)不小于24mm，紙片中心距平板邊緣應(yīng)不小于15mm。本實驗選用的藥敏紙片包括氨芐青霉素（10μg）、阿莫西林（10μg）、頭孢噻肟（30μg）、頭孢曲松（30μg）、慶大霉素（10μg）、卡那霉素（30μg）、環(huán)丙沙星（5μg）、諾氟沙星（10μg）、復(fù)方新諾明（1.25/23.75μg）、呋喃妥因（300μg）等，這些藥物涵蓋了β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類等常見的抗生素類別。貼好藥敏紙片后，將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)16-18h。培養(yǎng)結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺測量各藥敏紙片周圍抑菌圈的直徑，測量時應(yīng)包括藥敏紙片的直徑，并按照CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株對各抗生素的敏感性，即抑菌圈直徑大于或等于敏感折點為敏感（S），小于或等于耐藥折點為耐藥（R），介于敏感折點和耐藥折點之間為中介（I）。4.4.2耐藥譜分析耐藥譜分析結(jié)果顯示，mLT突變株和野生型親本菌株C83903對部分抗生素的耐藥情況存在差異（表1）。在β-內(nèi)酰胺類抗生素中，野生型親本菌株對氨芐青霉素和阿莫西林均表現(xiàn)為耐藥，抑菌圈直徑分別為10mm和12mm，低于耐藥折點；而mLT突變株對氨芐青霉素仍表現(xiàn)為耐藥（抑菌圈直徑11mm），對阿莫西林則表現(xiàn)為中介，抑菌圈直徑為15mm，介于敏感折點（17mm）和耐藥折點（14mm）之間。對于頭孢噻肟和頭孢曲松，野生型親本菌株和mLT突變株均表現(xiàn)為敏感，抑菌圈直徑分別為25mm和26mm（頭孢噻肟）、24mm和25mm（頭孢曲松），大于敏感折點。在氨基糖苷類抗生素方面，野生型親本菌株和mLT突變株對慶大霉素均表現(xiàn)為耐藥，抑菌圈直徑分別為10mm和11mm，低于耐藥折點；對卡那霉素，野生型親本菌株表現(xiàn)為耐藥（抑菌圈直徑12mm），mLT突變株表現(xiàn)為中介，抑菌圈直徑為15mm。在喹諾酮類抗生素中，野生型親本菌株和mLT突變株對環(huán)丙沙星均表現(xiàn)為耐藥，抑菌圈直徑分別為12mm和13mm，低于耐藥折點；對諾氟沙星，野生型親本菌株表現(xiàn)為耐藥（抑菌圈直徑11mm），mLT突變株表現(xiàn)為中介，抑菌圈直徑為14mm。對于復(fù)方新諾明，野生型親本菌株和mLT突變株均表現(xiàn)為耐藥，抑菌圈直徑分別為8mm和9mm，低于耐藥折點；而對于呋喃妥因，兩者均表現(xiàn)為敏感，抑菌圈直徑分別為20mm和21mm，大于敏感折點。綜上所述，mLT突變株與野生型親本菌株在耐藥譜上存在一定差異，部分抗生素的耐藥程度發(fā)生了改變，這可能與突變導(dǎo)致的菌體生理特性變化有關(guān)，也可能影響其在臨床治療和防控中的藥物選擇。表1：mLT突變株和野生型親本菌株的耐藥譜分析結(jié)果抗生素野生型親本菌株抑菌圈直徑（mm）耐藥性mLT突變株抑菌圈直徑（mm）耐藥性敏感折點（mm）中介折點（mm）耐藥折點（mm）氨芐青霉素10R11R≥1714-16≤13阿莫西林12R15I≥1714-16≤13頭孢噻肟25S26S≥2315-22≤14頭孢曲松24S25S≥2315-22≤14慶大霉素10R11R≥1513-14≤12卡那霉素12R15I≥1715-16≤14環(huán)丙沙星12R13R≥2116-20≤15諾氟沙星11R14I≥1714-16≤13復(fù)方新諾明8R9R≥1611-15≤10呋喃妥因20S21S≥1715-16≤144.5黏附能力4.5.1細(xì)胞黏附實驗選用豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）作為細(xì)胞模型，該細(xì)胞系來源于豬小腸，具有典型的小腸上皮細(xì)胞特征，能夠較好地模擬ETEC在體內(nèi)的黏附環(huán)境。將IPEC-J2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，用于后續(xù)實驗。取對數(shù)生長期的mLT突變株和野生型親本菌株C83903，分別以1:100的比例接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD???值約為0.6-0.8，達(dá)到對數(shù)生長中期。將培養(yǎng)好的菌液12000r/min離心5min，收集菌體，用無菌PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體3次，每次離心條件相同，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。將洗滌后的菌體重懸于無菌PBS緩沖液中，調(diào)整菌液濃度至1×10?CFU/mL。吸棄96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用無菌PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。向每孔中加入100μL調(diào)整好濃度的菌懸液，同時設(shè)置不加菌的空白對照組，每組設(shè)置6個平行復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育1h，使細(xì)菌與細(xì)胞充分黏附。孵育結(jié)束后，吸棄孔內(nèi)的菌液，用無菌PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞5次，每次洗滌時間為3min，以去除未黏附的細(xì)菌。向每孔中加入100μL0.1%TritonX-100溶液，室溫下作用10min，裂解細(xì)胞，釋放黏附的細(xì)菌。用無菌PBS緩沖液將裂解液進(jìn)行10倍系列稀釋，取適當(dāng)稀釋度的菌液100μL涂布于LB平板上，每個稀釋度設(shè)置3個平行平板。將LB平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h，培養(yǎng)結(jié)束后，計數(shù)平板上的菌落數(shù)，計算每孔中黏附的細(xì)菌數(shù)量。4.5.2結(jié)果分析通過計算每孔中黏附的細(xì)菌數(shù)量，進(jìn)而計算黏附率，公式為：黏附率（%）=（黏附的細(xì)菌數(shù)量/加入的細(xì)菌數(shù)量）×100%。結(jié)果顯示，野生型親本菌株C83903對IPEC-J2細(xì)胞的黏附率為（35.6±4.2）%，而mLT突變株對IPEC-J2細(xì)胞的黏附率為（20.5±3.1）%，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明mLT突變株對豬小腸上皮細(xì)胞的黏附能力明顯低于野生型親本菌株。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黏附能力的下降可能與mLT突變株菌毛生長能力的改變有關(guān)。前文已證實mLT突變株菌體表面的菌毛數(shù)量明顯減少，菌毛長度也有所縮短，菌毛作為ETEC黏附宿主細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)，其數(shù)量和長度的變化可能影響了細(xì)菌與細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，從而導(dǎo)致黏附能力下降。此外，突變導(dǎo)致的菌體表面其他結(jié)構(gòu)或成分的改變，也可能對黏附能力產(chǎn)生影響，這需要進(jìn)一步深入研究。五、mLT突變株的毒性與免疫原性研究5.1mLT體內(nèi)外毒性測定5.1.1體外細(xì)胞毒性試驗體外細(xì)胞毒性試驗選用鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞（Y1）作為細(xì)胞模型，Y1細(xì)胞對LT具有高度敏感性，常被用于檢測LT的毒性。將處于對數(shù)生長期的Y1細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并生長至融合度達(dá)到70%-80%。將mLT突變株和野生型親本菌株C83903分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體，用無菌PBS緩沖液洗滌3次后，重懸于無菌PBS緩沖液中，調(diào)整菌液濃度至1×10?CFU/mL。將菌液進(jìn)行10倍系列稀釋，取不同稀釋度的菌液100μL，加入到已接種Y1細(xì)胞的96孔板中，每個稀釋度設(shè)置6個平行復(fù)孔，同時設(shè)置不加菌的空白對照組。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育24h。孵育結(jié)束后，采用MTT法檢測細(xì)胞活性。向每孔中加入20μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），計算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。結(jié)果顯示，野生型親本菌株C83903在較低菌液濃度下（1×10?CFU/mL），即可導(dǎo)致Y1細(xì)胞存活率顯著下降，當(dāng)菌液濃度達(dá)到1×10?CFU/mL時，細(xì)胞存活率僅為（20.5±3.2）%。而mLT突變株在相同菌液濃度下，對Y1細(xì)胞的毒性明顯降低，當(dāng)菌液濃度為1×10?CFU/mL時，細(xì)胞存活率仍可達(dá)到（65.3±5.6）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明mLT突變株的體外細(xì)胞毒性相較于野生型親本菌株大幅降低，可能是由于突變導(dǎo)致其毒性關(guān)鍵位點的改變，影響了LT與細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力或其內(nèi)在的毒性作用機(jī)制，從而減少了對細(xì)胞的損傷。5.1.2體內(nèi)毒性試驗（家兔腸袢結(jié)扎試驗等）家兔腸袢結(jié)扎試驗常用于檢測細(xì)菌毒素在體內(nèi)的腸毒性。選取體重2-2.5kg的健康家兔6只，隨機(jī)分為3組，每組2只，分別為野生型親本菌株組、mLT突變株組和生理鹽水對照組。家兔禁食12h后，用25%烏拉坦溶液（4mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，將家兔仰臥位固定于手術(shù)臺上，腹部剪毛、消毒后，沿腹中線切開皮膚和腹膜，暴露小腸。在小腸上選取相距約5cm的腸段，分別結(jié)扎形成長度約2-3cm的腸袢，每個家兔制作3個腸袢。將野生型親本菌株C83903和mLT突變株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體，用無菌PBS緩沖液洗滌3次后，重懸于無菌PBS緩沖液中，調(diào)整菌液濃度至1×10?CFU/mL。向野生型親本菌株組和mLT突變株組的腸袢內(nèi)分別注入0.5mL菌液，生理鹽水對照組的腸袢內(nèi)注入0.5mL無菌PBS緩沖液。將腸袢小心放回腹腔，用生理鹽水紗布覆蓋，縫合腹壁。術(shù)后家兔單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水。在手術(shù)后6h，再次打開腹腔，觀察腸袢的變化情況，測量腸袢的長度和腸腔積液量，并計算腸袢積液量與腸袢長度的比值（mL/cm）。結(jié)果顯示，野生型親本菌株組的腸袢明顯擴(kuò)張，腸腔充滿大量清亮液體，腸袢積液量與腸袢長度的比值為（2.56±0.32）mL/cm。而mLT突變株組的腸袢擴(kuò)張程度較輕，腸腔積液量較少，腸袢積液量與腸袢長度的比值為（0.85±0.15）mL/cm，與野生型親本菌株組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。生理鹽水對照組的腸袢無明顯變化，腸袢積液量與腸袢長度的比值為（0.12±0.05）mL/cm。這表明mLT突變株在體內(nèi)的腸毒性顯著低于野生型親本菌株，其突變后的特性使其在腸道內(nèi)引發(fā)的病理變化明顯減輕，進(jìn)一步證明了mLT突變株在毒性方面的降低，為其后續(xù)的應(yīng)用安全性提供了重要的實驗依據(jù)。5.2免疫原性評價5.2.1小鼠口服免疫實驗設(shè)計選取6-8周齡的SPF級BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為mLT突變株免疫組、野生型親本菌株免疫組、PBS對照組和疫苗對照組（選用市場上已有的ETEC疫苗）。在免疫前，對所有小鼠進(jìn)行稱重和編號，確保小鼠健康狀況良好。mLT突變株免疫組和野生型親本菌株免疫組均采用口服免疫的方式，這是因為口服免疫能夠模擬ETEC自然感染途徑，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答，更符合實際應(yīng)用場景。免疫劑量方面，將mLT突變株和野生型親本菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體，用無菌PBS緩沖液洗滌3次后，重懸于無菌PBS緩沖液中，調(diào)整菌液濃度至1×10?CFU/mL。每只小鼠每次口服免疫0.2mL菌液，使小鼠攝入的菌量達(dá)到2×10?CFU。PBS對照組給予0.2mL無菌PBS緩沖液，疫苗對照組按照疫苗說明書的推薦劑量進(jìn)行免疫。免疫程序為每隔7天免疫1次，共免疫3次。在每次免疫后，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等臨床表現(xiàn)，記錄是否出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、萎靡不振等異常癥狀，及時發(fā)現(xiàn)并處理可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。在整個實驗過程中，小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，自由采食和飲水，保證小鼠處于良好的飼養(yǎng)條件下。5.2.2免疫指標(biāo)檢測在最后一次免疫后的第7天，對小鼠進(jìn)行各項免疫指標(biāo)的檢測。首先檢測小鼠血清和腸道黏膜中特異性抗體水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。具體步驟如下：用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）將LT蛋白稀釋至1μg/mL，包被96孔酶標(biāo)板，每孔加入100μL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3次，每次3min。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育2h。再次洗滌后，加入小鼠血清或腸道黏膜勻漿上清液（1:100稀釋），每孔100μL，37℃孵育1h。洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或IgA抗體（1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育1h。最后加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光反應(yīng)15min，加入2mol/LH?SO?終止液，每孔50μL，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度（OD值）。結(jié)果顯示，mLT突變株免疫組小鼠血清和腸道黏膜中特異性IgG和IgA抗體水平均顯著高于PBS對照組（P<0.05），與疫苗對照組相當(dāng)，表明mLT突變株能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。采用MTT法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況，以評估細(xì)胞免疫應(yīng)答。無菌取小鼠脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10?cells/mL。將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，同時設(shè)置不加刺激物的陰性對照組和加入刀豆蛋白A（ConA）的陽性對照組。實驗組加入mLT突變株菌體（終濃度為1×10?CFU/mL）或野生型親本菌株菌體，37℃、5%CO?孵育72h。孵育結(jié)束前4h，每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的OD值，計算刺激指數(shù)（SI），公式為：SI=（實驗組OD值/陰性對照組OD值）。結(jié)果顯示，mLT突變株免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞的SI值顯著高于PBS對照組（P<0.05），表明mLT突變株能夠刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。采用ELISA法檢測小鼠血清中細(xì)胞因子水平，包括白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）等。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，mLT突變株免疫組小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平顯著高于PBS對照組（P<0.05），IL-4水平也有所升高，但差異不顯著。IL-2和IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，它們水平的升高表明mLT突變株能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以Th1型為主的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。六、mLT突變株的應(yīng)用前景探討6.1作為口服疫苗的潛力分析基于前面的實驗結(jié)果，mLT突變株在作為口服疫苗方面展現(xiàn)出巨大的潛力。從毒性角度來看，體外細(xì)胞毒性試驗中，mLT突變株對鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞（Y1）的毒性相較于野生型親本菌株大幅降低。當(dāng)菌液濃度為1×10?CFU/mL時，野生型親本菌株可使Y1細(xì)胞存活率降至（20.5±3.2）%，而mLT突變株處理后的細(xì)胞存活率仍能達(dá)到（65.3±5.6）%。在家兔腸袢結(jié)扎試驗中，野生型親本菌株組腸袢積液量與腸袢長度的比值高達(dá)（2.56±0.32）mL/cm，腸袢明顯擴(kuò)張，充滿大量清亮液體，而mLT突變株組該比值僅為（0.85±0.15）mL/cm，腸袢擴(kuò)張程度和積液量都顯著減少。這表明mLT突變株的低毒性使其在口服免疫時，極大地降低了對機(jī)體造成不良反應(yīng)的風(fēng)險，保障了疫苗使用的安全性。在免疫原性方面，小鼠口服免疫實驗結(jié)果顯示出mLT突變株的優(yōu)勢。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，mLT突變株免疫組小鼠血清和腸道黏膜中特異性IgG和IgA抗體水平均顯著高于PBS對照組（P<0.05），且與市場上已有的ETEC疫苗對照組相當(dāng)。這意味著mLT突變株能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的特異性抗體可以中和ETEC的毒素，阻止其與腸道上皮細(xì)胞結(jié)合，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。MTT法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況表明，mLT突變株免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)（SI）值顯著高于PBS對照組（P<0.05），說明其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫在清除被ETEC感染的細(xì)胞、增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力方面發(fā)揮著重要作用。此外，ELISA法檢測小鼠血清中細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，mLT突變株免疫組小鼠血清中Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ水平顯著升高，表明其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以Th1型為主的免疫應(yīng)答，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能?？诜庖咦鳛橐环N便捷、無創(chuàng)的免疫方式，更符合動物和人類的實際應(yīng)用需求。mLT突變株能夠模擬ETEC自然感染途徑，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答。腸道黏膜作為機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線，黏膜免疫在預(yù)防ETEC感染中起著關(guān)鍵作用。mLT突變株口服免疫后，可在腸道黏膜表面激發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量的分泌型IgA（sIgA），sIgA能夠在腸道黏膜表面中和ETEC的毒素，阻止細(xì)菌黏附于腸道上皮細(xì)胞，從而有效地預(yù)防ETEC感染。綜合以上特性，mLT突變株具備作為口服疫苗的關(guān)鍵優(yōu)勢，在預(yù)防ETEC感染方面具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為一種安全、有效的新型口服疫苗候選株，為養(yǎng)殖業(yè)和人類健康領(lǐng)域提供有力的保障。6.2對仔豬大腸桿菌性腹瀉防控的意義仔豬大腸桿菌性腹瀉在養(yǎng)豬業(yè)中是一個嚴(yán)峻的問題，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重阻礙。仔豬黃痢常見于7日齡內(nèi)仔豬，1-3日齡最為常見，作為初生仔豬的急性、致死性傳染病，發(fā)病率可達(dá)90%，死亡率達(dá)50%；仔豬白痢主要發(fā)生于10-30日齡仔豬，發(fā)病率達(dá)到80%，死亡率達(dá)到50%；斷奶仔豬腹瀉率一般在20%-30%，死亡率在2%-4%，部分豬場斷奶仔豬的腹瀉率甚至可高達(dá)到70%-80%，死亡