Syk和nm23-H1：大腸癌診療新視角下的分子密碼一、引言1.1研究背景與意義大腸癌，作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)193萬，死亡病例數(shù)達(dá)94萬，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第三位。在我國，大腸癌的發(fā)病率也不容小覷，且發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化。大腸癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，這不僅增加了治療難度，還導(dǎo)致患者的預(yù)后較差，5年生存率較低。中晚期大腸癌患者常伴有腫瘤轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。因此，深入研究大腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診斷和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高大腸癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。Syk（Spleentyrosinekinase）即脾酪氨酸激酶，是一種非受體型酪氨酸激酶，最初被認(rèn)為是造血細(xì)胞特有的信號(hào)分子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Syk在許多腫瘤的演進(jìn)中有異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌、胃癌等實(shí)體瘤中，Syk的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，其低表達(dá)或缺失可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在乳腺癌細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染野生型Syk-mRNA可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移瘤形成；而在Syk表達(dá)陽性的細(xì)胞系中，過表達(dá)蛋白激酶缺陷的Syk則顯著增加其腫瘤發(fā)生率和生長速度。這表明Syk可能具有抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞間的黏附等過程有關(guān)。nm23-H1是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，定位于染色體17q21.3，編碼由152個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量為17kD的蛋白質(zhì)。大量研究表明，nm23-H1基因的表達(dá)水平與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤中，nm23-H1表達(dá)降低或缺失與腫瘤的高轉(zhuǎn)移潛能和不良預(yù)后相關(guān)。對(duì)101例大腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H1蛋白表達(dá)與Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，手術(shù)時(shí)有肝轉(zhuǎn)移組較無肝轉(zhuǎn)移組低，手術(shù)后有肝轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組較無肝轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組低，Cox模型分析顯示nm23-H1是大腸癌預(yù)后的一個(gè)保護(hù)性指標(biāo)。nm23-H1可能通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架的重構(gòu)、血管生成等過程，來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。目前，關(guān)于Syk和nm23-H1在大腸癌中的研究相對(duì)較少，二者在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究旨在探討Syk和nm23-H1在大腸癌組織中的表達(dá)情況，分析其與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系，以及二者之間的相關(guān)性，以期為大腸癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對(duì)于Syk和nm23-H1的研究開展相對(duì)較早。關(guān)于Syk，諸多研究聚焦于其在腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵角色。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，Syk能夠通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移。在白血病細(xì)胞中，Syk可調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞的凋亡與分化產(chǎn)生影響。在大腸癌的研究方面，國外學(xué)者通過對(duì)大量臨床樣本的分析，揭示了Syk表達(dá)缺失與大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)200例大腸癌患者的研究表明，Syk低表達(dá)的患者其腫瘤復(fù)發(fā)率更高，生存期更短。對(duì)于nm23-H1，國外研究深入探究了其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。研究顯示，nm23-H1能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，來抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。在小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)nm23-H1的腫瘤細(xì)胞，其肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量明顯減少。在大腸癌的研究中，國外有研究分析了nm23-H1與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)nm23-H1低表達(dá)與大腸癌的高分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在國內(nèi)，相關(guān)研究也取得了一定的成果。在Syk的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，Syk基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化現(xiàn)象，這導(dǎo)致了Syk表達(dá)的下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在大腸癌的研究中，國內(nèi)研究通過免疫組化等方法檢測Syk的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Syk在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著低于正常大腸黏膜組織，且其表達(dá)與大腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在nm23-H1的研究中，國內(nèi)有研究從基因多態(tài)性的角度展開探索，發(fā)現(xiàn)nm23-H1基因的某些單核苷酸多態(tài)性與大腸癌的易感性相關(guān)。通過對(duì)150例大腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶特定基因型的患者，其腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高。在臨床研究方面，國內(nèi)研究同樣證實(shí)了nm23-H1低表達(dá)與大腸癌的不良預(yù)后相關(guān)。然而，當(dāng)前國內(nèi)外的研究仍存在一些不足之處。在Syk和nm23-H1的聯(lián)合研究方面，相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少，二者在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的協(xié)同作用機(jī)制尚未完全明確。大部分研究主要集中在蛋白表達(dá)水平的檢測，對(duì)于基因水平的調(diào)控機(jī)制研究還不夠深入。此外，現(xiàn)有的研究樣本量相對(duì)較小，研究結(jié)果的普遍性和可靠性有待進(jìn)一步提高。在臨床應(yīng)用方面，雖然Syk和nm23-H1顯示出了作為大腸癌診斷和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)的潛力，但目前仍缺乏大規(guī)模的臨床驗(yàn)證，距離實(shí)際應(yīng)用還有一定的差距。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究Syk和nm23-H1在大腸癌中的表達(dá)規(guī)律，明確二者與大腸癌臨床病理特征之間的內(nèi)在聯(lián)系，分析它們?cè)诖竽c癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為大腸癌的早期診斷、精準(zhǔn)預(yù)后評(píng)估以及靶向治療提供科學(xué)且可靠的理論依據(jù)和極具潛力的靶點(diǎn)。在研究方法上，本研究采用免疫組化方法，對(duì)收集的大腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，以確定Syk和nm23-H1蛋白的表達(dá)水平。通過分析Syk和nm23-H1的表達(dá)與大腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，來揭示它們?cè)诖竽c癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以確定Syk和nm23-H1表達(dá)與大腸癌臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、Syk和nm23-H1的生物學(xué)特性2.1Syk的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1Syk的分子結(jié)構(gòu)Syk即脾酪氨酸激酶，屬于非受體型酪氨酸激酶家族，其編碼基因?yàn)閟yk，定位于人類染色體9q22。Syk蛋白由628個(gè)氨基酸組成，分子量約為72kDa。其分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特，在N末端含有兩個(gè)Src同源2（SH2）結(jié)構(gòu)域，分別為N端SH2結(jié)構(gòu)域（SH2（N））和C端SH2結(jié)構(gòu)域（SH2（C）），這兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域在Syk的功能發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用。它們能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合含有磷酸化酪氨酸殘基的基序，通過與免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）的結(jié)合，從而激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路。例如，在B細(xì)胞中，Syk通過其SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化的CD79相結(jié)合，形成B細(xì)胞抗原受體復(fù)合物，進(jìn)而啟動(dòng)B細(xì)胞的活化信號(hào)。在兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域之間存在功能域間域A（IDA），該區(qū)域形成一個(gè)螺旋形的環(huán)結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮著重要作用，有助于Syk與其他信號(hào)分子的相互識(shí)別和結(jié)合。SH2（C）與激酶功能域SH1之間的部分稱為功能域間域B（IDB），IDB區(qū)域具有五個(gè)想象中的自體磷酸化位點(diǎn)，這個(gè)連接片段為其他信號(hào)分子SH2與磷酸化位結(jié)合提供錨著位。C末端的激酶結(jié)構(gòu)域（SH1）則具有酪氨酸激酶活性，能夠催化底物蛋白酪氨酸殘基的磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的傳遞和放大。此外，Syk分子還包含銅鋅螯合結(jié)構(gòu)域、酸性區(qū)域等。銅鋅螯合結(jié)構(gòu)域參與Syk的定位和結(jié)合，影響其在細(xì)胞內(nèi)的分布和與其他分子的相互作用。酸性區(qū)域可調(diào)節(jié)Syk與膜蛋白產(chǎn)生的作用力，對(duì)Syk的活性調(diào)節(jié)具有重要意義。長度為2989bp的3’端UTR含有兩個(gè)UA富集模序，可快速與多聚腺苷酸環(huán)化作用信號(hào)相結(jié)合，通常認(rèn)為其可調(diào)節(jié)基因的穩(wěn)定性和/或翻譯啟動(dòng)效率。2.1.2Syk在正常生理過程中的作用Syk在正常生理過程中參與多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)維持機(jī)體的正常生理功能起著至關(guān)重要的作用，尤其是在免疫細(xì)胞活化和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)方面表現(xiàn)突出。在B淋巴細(xì)胞的發(fā)育及抗原受體信號(hào)傳導(dǎo)過程中，Syk發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Syk的表達(dá)貫穿于B細(xì)胞的整個(gè)發(fā)展過程，在B細(xì)胞發(fā)育早期，Syk基因的破壞會(huì)影響B(tài)細(xì)胞的分化以及幼稚B細(xì)胞的成熟，使其難以進(jìn)入循環(huán)細(xì)胞。當(dāng)抗原誘導(dǎo)B細(xì)胞受體（BCR）交聯(lián)時(shí)，胞內(nèi)ITAM發(fā)生磷酸化，胞漿中的Syk是ITAM磷酸化后首先招募并被活化的對(duì)象。活化的Syk通過一系列接頭蛋白激活磷脂酶C-γ（PLC-γ）和鳥苷酸交換因子（GEFs），經(jīng)由蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）及鈣調(diào)蛋白三條途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、NFAT和AP-1），參與并調(diào)控B細(xì)胞激活、增殖相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)生分化和增殖，并最終分泌高親和力抗體，從而啟動(dòng)和調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)。在T淋巴細(xì)胞的發(fā)展及抗原受體信號(hào)傳導(dǎo)中，Syk同樣不可或缺。Syk表達(dá)于CD4-CD8-和CD4+CD8+的胸腺細(xì)胞，但在CD4+CD8-和CD4-CD8+胸腺細(xì)胞以及外周T細(xì)胞中表達(dá)水平相對(duì)較低。雖然Syk不是T細(xì)胞雙陽性選擇的主要因素，但在T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)傳導(dǎo)過程中，Syk和ZAP-70起著重要作用。Syk可以獨(dú)立于CD45和Lck對(duì)TCR信號(hào)進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過觸發(fā)CD3酪氨酸磷酸化來啟動(dòng)TCR信號(hào)，還能與ITAM的磷酸化共同調(diào)節(jié)TCR信號(hào)，參與T細(xì)胞的發(fā)育、增殖和活化，調(diào)控細(xì)胞免疫反應(yīng)。在Fc受體信號(hào)傳導(dǎo)方面，Syk也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以高親和性IgE受體（FcεRI）為例，當(dāng)FcεRI交聯(lián)聚集時(shí)，通過其γ鏈C端ITAM的磷酸化作用使蛋白酪氨酸激酶Fyn和Syk相繼激活。Syk對(duì)FcεRI介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流和分泌、細(xì)胞因子產(chǎn)生、脫顆粒、花生四烯酸代謝等過程至關(guān)重要。缺乏Syk表達(dá)的外周血嗜堿性粒細(xì)胞不能夠脫顆粒，Syk-/-巨噬細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體誘導(dǎo)的吞噬反應(yīng)有明顯影響，Syk-/-中性粒細(xì)胞在FcRI刺激下不能夠產(chǎn)生活性氧中間體。而且，F(xiàn)c受體β-亞基（FcRβ）激活的Syk，在MHC-Ⅱ類限制性抗原提呈過程以及FcR從核內(nèi)體轉(zhuǎn)移到溶酶體過程中也是必不可少的。除了在免疫細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的重要作用外，Syk還參與氧化應(yīng)激和細(xì)胞生存信號(hào)的調(diào)節(jié)。研究證實(shí)，通過H2O2治療產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可使Syk激活。在B細(xì)胞內(nèi)，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)Syk酪氨酸磷酸化，這一過程依賴于Src家族的蛋白酪氨酸激酶Lyn的作用。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)B細(xì)胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)和ERK、JNK、p38的激活，Syk介導(dǎo)調(diào)節(jié)PLC-γ2的酪氨酸磷酸化反應(yīng)，產(chǎn)生IP3并誘導(dǎo)鈣離子從細(xì)胞內(nèi)存貯部位釋放，在氧化應(yīng)激作用下，JNK激活、細(xì)胞間蛋白酪氨酸磷酸化都會(huì)有Syk的升高，對(duì)細(xì)胞的生存和應(yīng)激反應(yīng)起到重要的調(diào)節(jié)作用。2.2nm23-H1的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1nm23-H1的分子結(jié)構(gòu)nm23-H1基因定位于人類染色體17q21.3，其編碼的蛋白質(zhì)由152個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為17kDa。nm23-H1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)呈二聚體形式，每個(gè)亞基包含一個(gè)α/β結(jié)構(gòu)域，由6個(gè)β折疊片和5個(gè)α螺旋組成。這種結(jié)構(gòu)賦予了nm23-H1獨(dú)特的生物學(xué)功能。在nm23-H1蛋白中，存在一些關(guān)鍵的功能區(qū)域。位于第116-123位氨基酸殘基的NDPK活性位點(diǎn)，對(duì)于其催化功能至關(guān)重要。該活性位點(diǎn)能夠催化二磷酸核苷（NDP）和三磷酸核苷（NTP）之間的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在細(xì)胞的能量代謝和信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，當(dāng)NDPK活性位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，nm23-H1的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能會(huì)受到顯著影響。第1-10位氨基酸殘基組成的N端區(qū)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用。它可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而參與細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)過程。有研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H1通過N端區(qū)域與微管蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而影響細(xì)胞的形態(tài)和遷移能力。此外，第135-145位氨基酸殘基構(gòu)成的C端區(qū)域也參與了nm23-H1的功能調(diào)節(jié)。該區(qū)域可能通過與其他分子相互作用，影響nm23-H1的亞細(xì)胞定位和活性。在某些腫瘤細(xì)胞中，C端區(qū)域的修飾會(huì)改變nm23-H1的定位，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而影響其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。2.2.2nm23-H1在正常生理過程中的作用nm23-H1在正常生理過程中參與了多種細(xì)胞活動(dòng)，對(duì)維持機(jī)體的正常生理功能起著重要作用。在細(xì)胞增殖方面，nm23-H1發(fā)揮著調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育過程中，nm23-H1的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。在小鼠胚胎發(fā)育的早期階段，nm23-H1在快速增殖的細(xì)胞中高表達(dá)，隨著胚胎的發(fā)育，細(xì)胞增殖速度減慢，nm23-H1的表達(dá)水平也相應(yīng)降低。這表明nm23-H1可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，來控制細(xì)胞的增殖速度。進(jìn)一步的研究表明，nm23-H1可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。nm23-H1在細(xì)胞分化過程中也扮演著重要角色。在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中，nm23-H1的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化時(shí)，nm23-H1的表達(dá)逐漸升高，而向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化時(shí)，nm23-H1的表達(dá)則相對(duì)較低。通過基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，nm23-H1缺失會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞分化異常，神經(jīng)元的生成減少，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加。這說明nm23-H1對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化具有促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。在個(gè)體發(fā)育過程中，nm23-H1同樣不可或缺。在果蠅的發(fā)育過程中，nm23-H1的同源基因的突變會(huì)導(dǎo)致果蠅翅膀發(fā)育異常，出現(xiàn)翅膀短小、畸形等現(xiàn)象。在小鼠中，nm23-H1基因敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，出現(xiàn)多種器官發(fā)育缺陷，甚至導(dǎo)致胚胎死亡。這表明nm23-H1在動(dòng)物的正常發(fā)育過程中，對(duì)于器官的形成和功能的維持具有重要意義。它可能通過參與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附等過程，來協(xié)調(diào)胚胎發(fā)育過程中各個(gè)器官的形成和發(fā)育。三、Syk和nm23-H1在大腸癌中的表達(dá)研究3.1材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料選取[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱]經(jīng)手術(shù)切除并病理確診的大腸癌組織標(biāo)本[X]例。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療?；颊吣挲g范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，其中男性[男性例數(shù)]例，女性[女性例數(shù)]例。根據(jù)2010版美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）大腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，I期[I期例數(shù)]例，II期[II期例數(shù)]例，III期[III期例數(shù)]例，IV期[IV期例數(shù)]例。同時(shí)選取距離腫瘤邊緣[X]cm以上的正常大腸黏膜組織標(biāo)本[X]例作為對(duì)照。主要實(shí)驗(yàn)材料包括：鼠抗人Syk單克隆抗體，購自[抗體公司1]，其貨號(hào)為[貨號(hào)1]，工作濃度為[具體工作濃度1]；兔抗人nm23-H1多克隆抗體，購自[抗體公司2]，貨號(hào)為[貨號(hào)2]，工作濃度為[具體工作濃度2]。免疫組化檢測試劑盒，購自[試劑盒公司]，型號(hào)為[試劑盒型號(hào)]，包含二抗、DAB顯色劑等。RNA提取試劑TRIzol，購自[試劑公司1]，產(chǎn)品編號(hào)為[編號(hào)1]；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自[試劑公司2]，型號(hào)為[試劑盒型號(hào)2]；PCR擴(kuò)增試劑盒，購自[試劑公司3]，貨號(hào)為[貨號(hào)3]。引物由[引物合成公司]合成，Syk引物序列為：上游引物5’-[具體序列1]-3’，下游引物5’-[具體序列2]-3’；nm23-H1引物序列為：上游引物5’-[具體序列3]-3’，下游引物5’-[具體序列4]-3’；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5’-[具體序列5]-3’，下游引物5’-[具體序列6]-3’。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法免疫組織化學(xué)檢測：將大腸癌組織和正常大腸黏膜組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片脫蠟至水，采用高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，即在枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）中，于高壓鍋（121℃，2min）中處理。用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，以減少非特異性染色。分別滴加鼠抗人Syk單克隆抗體和兔抗人nm23-H1多克隆抗體，4℃孵育過夜。次日，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。再滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。脫水、透明后，中性樹膠封片。用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。在高倍鏡（×400）下觀察，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-80%為陽性（++），＞80%為強(qiáng)陽性（+++）。RT-PCR技術(shù)檢測：使用TRIzol試劑提取大腸癌組織和正常大腸黏膜組織中的總RNA。具體操作如下：將組織剪碎后，加入1mlTRIzol試劑，充分勻漿。室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃，12000rpm離心15min，取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃，12000rpm離心10min，棄上清，RNA沉淀用75%乙醇洗滌兩次。4℃，7500rpm離心5min，棄上清，室溫晾干RNA沉淀。用適量DEPC水溶解RNA，測定其濃度和純度。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)條件為：42℃孵育60min，70℃加熱15min終止反應(yīng)。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括10×PCRBuffer2.5μl，dNTPMix（2.5mM）2μl，上下游引物（10μM）各1μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.25μl，cDNA模板2μl，ddH2O16.25μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，[退火溫度]℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。取PCR產(chǎn)物5μl，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，以GAPDH為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析目的基因條帶與內(nèi)參條帶的灰度值，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1Syk在大腸癌組織中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，Syk蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。在正常大腸黏膜組織中，Syk的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)1]/[正常組織例數(shù)]），其中強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[強(qiáng)陽性例數(shù)1]/[正常組織例數(shù)]），陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)2]/[正常組織例數(shù)]），弱陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)3]/[正常組織例數(shù)]）。在大腸癌組織中，Syk的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)4]/[大腸癌組織例數(shù)]），其中強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[強(qiáng)陽性例數(shù)4]/[大腸癌組織例數(shù)]），陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)5]/[大腸癌組織例數(shù)]），弱陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)6]/[大腸癌組織例數(shù)]）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Syk在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著低于正常大腸黏膜組織（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2.2nm23-H1在大腸癌組織中的表達(dá)情況nm23-H1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)部位主要為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，染色后呈現(xiàn)出棕黃色顆粒。在正常大腸黏膜組織里，nm23-H1的陽性表達(dá)率達(dá)到了[X]%（[陽性例數(shù)7]/[正常組織例數(shù)]），其中強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[強(qiáng)陽性例數(shù)5]/[正常組織例數(shù)]），陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)6]/[正常組織例數(shù)]），弱陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)7]/[正常組織例數(shù)]）。而在大腸癌組織中，nm23-H1的陽性表達(dá)率是[X]%（[陽性例數(shù)8]/[大腸癌組織例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[強(qiáng)陽性例數(shù)6]/[大腸癌組織例數(shù)]），陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)7]/[大腸癌組織例數(shù)]），弱陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)8]/[大腸癌組織例數(shù)]）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，nm23-H1在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于正常大腸黏膜組織（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2.3Syk和nm23-H1表達(dá)的相關(guān)性分析對(duì)大腸癌組織中Syk和nm23-H1的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)]，P<0.05）。即Syk表達(dá)較高的大腸癌組織中，nm23-H1的表達(dá)水平也相對(duì)較高；反之，Syk表達(dá)較低的組織中，nm23-H1的表達(dá)也較低。四、Syk和nm23-H1表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系4.1與腫瘤分化程度的關(guān)系腫瘤分化程度是反映腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞相似程度的重要指標(biāo)，它在很大程度上影響著腫瘤的生物學(xué)行為和預(yù)后。為深入探究Syk和nm23-H1在大腸癌進(jìn)展過程中的作用，本研究對(duì)不同分化程度大腸癌組織中Syk和nm23-H1的表達(dá)情況進(jìn)行了詳細(xì)分析。在高分化腺癌組織中，Syk的陽性表達(dá)率達(dá)到了[X]%（[高分化腺癌中Syk陽性例數(shù)]/[高分化腺癌例數(shù)]），其中強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[高分化腺癌中Syk強(qiáng)陽性例數(shù)]/[高分化腺癌例數(shù)]）。nm23-H1的陽性表達(dá)率為[X]%（[高分化腺癌中nm23-H1陽性例數(shù)]/[高分化腺癌例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[高分化腺癌中nm23-H1強(qiáng)陽性例數(shù)]/[高分化腺癌例數(shù)]）。這表明在高分化的大腸癌組織中，Syk和nm23-H1的表達(dá)水平相對(duì)較高，提示它們可能在維持腫瘤細(xì)胞的相對(duì)正常分化狀態(tài)中發(fā)揮著積極作用。隨著腫瘤分化程度的降低，在中分化腺癌組織中，Syk的陽性表達(dá)率下降至[X]%（[中分化腺癌中Syk陽性例數(shù)]/[中分化腺癌例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[中分化腺癌中Syk強(qiáng)陽性例數(shù)]/[中分化腺癌例數(shù)]）。nm23-H1的陽性表達(dá)率也降至[X]%（[中分化腺癌中nm23-H1陽性例數(shù)]/[中分化腺癌例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[中分化腺癌中nm23-H1強(qiáng)陽性例數(shù)]/[中分化腺癌例數(shù)]）。這說明隨著腫瘤分化程度的變差，Syk和nm23-H1的表達(dá)水平也相應(yīng)降低，提示它們的低表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的分化異常有關(guān)。在低分化腺癌組織中，Syk的陽性表達(dá)率進(jìn)一步降低至[X]%（[低分化腺癌中Syk陽性例數(shù)]/[低分化腺癌例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率僅為[X]%（[低分化腺癌中Syk強(qiáng)陽性例數(shù)]/[低分化腺癌例數(shù)]）。nm23-H1的陽性表達(dá)率為[X]%（[低分化腺癌中nm23-H1陽性例數(shù)]/[低分化腺癌例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[低分化腺癌中nm23-H1強(qiáng)陽性例數(shù)]/[低分化腺癌例數(shù)]）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，Syk和nm23-H1在高、中、低分化腺癌組織中的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Syk和nm23-H1的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度密切相關(guān)，隨著腫瘤分化程度的降低，它們的表達(dá)逐漸減少。綜上所述，Syk和nm23-H1的表達(dá)缺失或降低可能在大腸癌的低分化過程中起到了促進(jìn)作用，提示這兩個(gè)分子可能參與了腫瘤細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制。它們的低表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞失去正常的分化調(diào)控，從而使腫瘤細(xì)胞的惡性程度增加。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步理解大腸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了新的線索，也為大腸癌的診斷和治療提供了潛在的靶點(diǎn)。4.2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是大腸癌病情進(jìn)展的重要標(biāo)志之一，對(duì)患者的預(yù)后有著至關(guān)重要的影響。本研究對(duì)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中Syk和nm23-H1的表達(dá)情況進(jìn)行了深入分析，旨在探討它們?cè)诖竽c癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中的作用及潛在價(jià)值。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中，Syk的陽性表達(dá)率為[X]%（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中Syk陽性例數(shù)]/[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]），其中強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中Syk強(qiáng)陽性例數(shù)]/[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]）。nm23-H1的陽性表達(dá)率為[X]%（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中nm23-H1陽性例數(shù)]/[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中nm23-H1強(qiáng)陽性例數(shù)]/[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]）。這表明在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中，Syk和nm23-H1的表達(dá)水平相對(duì)較低。與之對(duì)比，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中，Syk的陽性表達(dá)率為[X]%（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中Syk陽性例數(shù)]/[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中Syk強(qiáng)陽性例數(shù)]/[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]）。nm23-H1的陽性表達(dá)率為[X]%（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中nm23-H1陽性例數(shù)]/[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中nm23-H1強(qiáng)陽性例數(shù)]/[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Syk和nm23-H1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這意味著Syk和nm23-H1的低表達(dá)與大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。相關(guān)研究表明，Syk可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附分子來影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。在正常細(xì)胞中，Syk能夠促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞之間的黏附作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。而在大腸癌組織中，Syk的低表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞間黏附分子表達(dá)減少，使得腫瘤細(xì)胞之間的黏附力下降，容易從原發(fā)灶脫落并通過淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。nm23-H1則可能通過影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力來抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重構(gòu)，使腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力降低，從而減少腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。nm23-H1還可能通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等蛋白水解酶，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織的侵襲能力，進(jìn)而抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。綜上所述，Syk和nm23-H1在大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，它們的低表達(dá)可能是大腸癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要危險(xiǎn)因素。檢測大腸癌組織中Syk和nm23-H1的表達(dá)水平，對(duì)于判斷大腸癌是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的價(jià)值，有望為臨床醫(yī)生制定治療方案提供重要的參考依據(jù)。4.3與臨床分期的關(guān)系臨床分期是評(píng)估大腸癌患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要依據(jù)，它綜合考慮了腫瘤的大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等多個(gè)因素。為深入了解Syk和nm23-H1在大腸癌病情進(jìn)展過程中的作用，本研究對(duì)不同臨床分期大腸癌組織中Syk和nm23-H1的表達(dá)情況進(jìn)行了詳細(xì)分析。在I期大腸癌組織中，Syk的陽性表達(dá)率為[X]%（[I期中Syk陽性例數(shù)]/[I期例數(shù)]），其中強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[I期中Syk強(qiáng)陽性例數(shù)]/[I期例數(shù)]）。nm23-H1的陽性表達(dá)率為[X]%（[I期中nm23-H1陽性例數(shù)]/[I期例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[I期中nm23-H1強(qiáng)陽性例數(shù)]/[I期例數(shù)]）。這表明在疾病的早期階段，Syk和nm23-H1仍能保持相對(duì)較高的表達(dá)水平，提示它們可能在抑制腫瘤的早期發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。隨著臨床分期的進(jìn)展，在II期大腸癌組織中，Syk的陽性表達(dá)率下降至[X]%（[II期中Syk陽性例數(shù)]/[II期例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[II期中Syk強(qiáng)陽性例數(shù)]/[II期例數(shù)]）。nm23-H1的陽性表達(dá)率也降至[X]%（[II期中nm23-H1陽性例數(shù)]/[II期例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[II期中nm23-H1強(qiáng)陽性例數(shù)]/[II期例數(shù)]）。這說明隨著病情的加重，Syk和nm23-H1的表達(dá)水平開始出現(xiàn)明顯下降。到了III期，Syk的陽性表達(dá)率進(jìn)一步降低至[X]%（[III期中Syk陽性例數(shù)]/[III期例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率僅為[X]%（[III期中Syk強(qiáng)陽性例數(shù)]/[III期例數(shù)]）。nm23-H1的陽性表達(dá)率為[X]%（[III期中nm23-H1陽性例數(shù)]/[III期例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[III期中nm23-H1強(qiáng)陽性例數(shù)]/[III期例數(shù)]）。在IV期大腸癌組織中，Syk的陽性表達(dá)率為[X]%（[IV期中Syk陽性例數(shù)]/[IV期例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[IV期中Syk強(qiáng)陽性例數(shù)]/[IV期例數(shù)]）。nm23-H1的陽性表達(dá)率為[X]%（[IV期中nm23-H1陽性例數(shù)]/[IV期例數(shù)]），強(qiáng)陽性表達(dá)率為[X]%（[IV期中nm23-H1強(qiáng)陽性例數(shù)]/[IV期例數(shù)]）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，Syk和nm23-H1在不同臨床分期大腸癌組織中的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著臨床分期的升高，Syk和nm23-H1的表達(dá)逐漸減少，它們的低表達(dá)與大腸癌的病情進(jìn)展密切相關(guān)。相關(guān)研究表明，Syk和nm23-H1的表達(dá)缺失或降低可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)大腸癌的病情進(jìn)展。Syk的低表達(dá)可能會(huì)使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。nm23-H1的低表達(dá)則可能會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)和血管生成等過程，使腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。綜上所述，Syk和nm23-H1在大腸癌的臨床分期進(jìn)展中表達(dá)逐漸降低，它們的低表達(dá)可能是大腸癌病情惡化的重要標(biāo)志。檢測Syk和nm23-H1的表達(dá)水平，對(duì)于評(píng)估大腸癌患者的病情進(jìn)展和預(yù)后具有重要的參考價(jià)值，有望為臨床治療方案的制定提供有力的依據(jù)。五、Syk和nm23-H1對(duì)大腸癌預(yù)后的影響5.1生存分析方法與結(jié)果本研究采用Kaplan-Meier法對(duì)納入研究的大腸癌患者進(jìn)行生存分析，并以Log-Rank法比較不同組間生存率的顯著性差異。通過對(duì)患者的隨訪，獲取患者的生存時(shí)間及生存狀態(tài)等信息。生存時(shí)間從手術(shù)日期開始計(jì)算，直至患者死亡、失訪或隨訪截止日期。分析結(jié)果顯示，Syk陽性表達(dá)組患者的5年生存率為[X]%（[Syk陽性組生存例數(shù)]/[Syk陽性組總例數(shù)]），而Syk陰性表達(dá)組患者的5年生存率僅為[X]%（[Syk陰性組生存例數(shù)]/[Syk陰性組總例數(shù)]）。生存曲線如圖[具體圖號(hào)]所示，Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果表明，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明Syk陽性表達(dá)的大腸癌患者具有更高的生存率，Syk表達(dá)與大腸癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)。對(duì)于nm23-H1，其陽性表達(dá)組患者的5年生存率為[X]%（[nm23-H1陽性組生存例數(shù)]/[nm23-H1陽性組總例數(shù)]），陰性表達(dá)組患者的5年生存率為[X]%（[nm23-H1陰性組生存例數(shù)]/[nm23-H1陰性組總例數(shù)]）。生存曲線分析結(jié)果顯示，nm23-H1陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組的生存曲線存在明顯差異，Log-Rank檢驗(yàn)P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明nm23-H1陽性表達(dá)的患者預(yù)后相對(duì)較好，nm23-H1表達(dá)與大腸癌患者的生存率密切相關(guān)。5.2多因素分析確定獨(dú)立預(yù)后因素為進(jìn)一步明確Syk和nm23-H1是否為大腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素，本研究采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素，包括Syk表達(dá)、nm23-H1表達(dá)、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等納入模型中。多因素分析結(jié)果顯示，Syk表達(dá)（HR=[風(fēng)險(xiǎn)比1]，95%CI：[置信區(qū)間下限1]-[置信區(qū)間上限1]，P=[P值1]）和nm23-H1表達(dá)（HR=[風(fēng)險(xiǎn)比2]，95%CI：[置信區(qū)間下限2]-[置信區(qū)間上限2]，P=[P值2]）均是大腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。具體而言，Syk陽性表達(dá)的患者相較于陰性表達(dá)患者，其死亡風(fēng)險(xiǎn)降低了[風(fēng)險(xiǎn)降低比例1]，這表明Syk的高表達(dá)對(duì)大腸癌患者的預(yù)后具有保護(hù)作用。nm23-H1陽性表達(dá)的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)比陰性表達(dá)患者降低了[風(fēng)險(xiǎn)降低比例2]，說明nm23-H1的高表達(dá)同樣對(duì)患者預(yù)后有益。腫瘤分化程度（HR=[風(fēng)險(xiǎn)比3]，95%CI：[置信區(qū)間下限3]-[置信區(qū)間上限3]，P=[P值3]）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=[風(fēng)險(xiǎn)比4]，95%CI：[置信區(qū)間下限4]-[置信區(qū)間上限4]，P=[P值4]）和臨床分期（HR=[風(fēng)險(xiǎn)比5]，95%CI：[置信區(qū)間下限5]-[置信區(qū)間上限5]，P=[P值5]）也均為大腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。隨著腫瘤分化程度的降低、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期的升高，患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Syk和nm23-H1在大腸癌預(yù)后評(píng)估中的重要價(jià)值。在臨床實(shí)踐中，檢測這兩個(gè)分子的表達(dá)水平，能夠?yàn)獒t(yī)生提供更準(zhǔn)確的預(yù)后信息，有助于制定個(gè)性化的治療方案。對(duì)于Syk和nm23-H1表達(dá)較低的患者，可考慮加強(qiáng)術(shù)后的輔助治療，如化療、靶向治療等，以降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生存率。而對(duì)于表達(dá)較高的患者，則可適當(dāng)調(diào)整治療強(qiáng)度，避免過度治療給患者帶來不必要的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。多因素分析結(jié)果還提示，在評(píng)估大腸癌患者的預(yù)后時(shí)，需要綜合考慮多個(gè)因素，全面了解患者的病情，才能做出更準(zhǔn)確的判斷。六、Syk和nm23-H1在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制探討6.1Syk影響大腸癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制6.1.1抑制腫瘤細(xì)胞增殖Syk可能通過多條信號(hào)通路來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，Syk可以通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在正常細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長、增殖和存活中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)該信號(hào)通路被過度激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Syk能夠與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，抑制PI3K的活性，進(jìn)而阻斷AKT的磷酸化和激活，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究在乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Syk可顯著降低PI3K的活性和AKT的磷酸化水平，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。在大腸癌細(xì)胞系中，干擾Syk的表達(dá)則會(huì)使PI3K/AKT信號(hào)通路激活，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。Syk還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞的正常生長和增殖至關(guān)重要，而細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如CyclinD1、p21等在其中起著關(guān)鍵作用。研究表明，Syk可以通過激活MAPK信號(hào)通路中的p38MAPK，上調(diào)p21的表達(dá)，同時(shí)抑制CyclinD1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制大腸癌細(xì)胞的增殖。在大腸癌細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染Syk表達(dá)質(zhì)粒后，p21的表達(dá)水平明顯升高，CyclinD1的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。6.1.2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在細(xì)胞凋亡過程中，Syk也發(fā)揮著重要作用，其可通過多條途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，Syk可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來影響線粒體的功能，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等），它們之間的平衡決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Syk能夠激活JNK信號(hào)通路，磷酸化Bcl-2，使其失去抗凋亡作用，同時(shí)上調(diào)Bax的表達(dá)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在大腸癌細(xì)胞系中，過表達(dá)Syk可使Bcl-2的磷酸化水平升高，Bax的表達(dá)增加，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白被激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。死亡受體途徑也是細(xì)胞凋亡的重要途徑，Syk可能參與調(diào)節(jié)該途徑。死亡受體如Fas、TNF-R等與相應(yīng)的配體結(jié)合后，可激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有研究表明，Syk可以通過與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）相互作用，增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。在大腸癌細(xì)胞中，Syk的過表達(dá)能夠促進(jìn)Fas與FADD的結(jié)合，激活caspase-8，進(jìn)而激活caspase-3等下游凋亡蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。6.1.3抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移Syk在抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面也具有重要作用，其機(jī)制主要與調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附和細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)。細(xì)胞間黏附分子對(duì)于維持細(xì)胞之間的連接和組織結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要，而腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的第一步就是細(xì)胞間黏附的破壞。Syk可以通過調(diào)節(jié)E-cadherin等細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)和功能，增強(qiáng)細(xì)胞之間的黏附力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，Syk能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞間黏附分子，其表達(dá)的增加可以增強(qiáng)細(xì)胞之間的黏附作用，使腫瘤細(xì)胞難以脫離原發(fā)灶并發(fā)生轉(zhuǎn)移。在大腸癌細(xì)胞系中，過表達(dá)Syk可使E-cadherin的表達(dá)水平升高，細(xì)胞之間的黏附力增強(qiáng)，細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯降低。細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，Syk可以通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。研究表明，Syk可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)MMP-2、MMP-9等的表達(dá)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其激活可以促進(jìn)MMPs的表達(dá)。Syk通過抑制NF-κB的活性，減少了MMPs的產(chǎn)生，從而降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在大腸癌細(xì)胞系中，干擾Syk的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致NF-κB的活性升高，MMP-2、MMP-9的表達(dá)增加，細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)；而過表達(dá)Syk則會(huì)使NF-κB的活性受到抑制，MMP-2、MMP-9的表達(dá)降低，細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱。6.2nm23-H1影響大腸癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制6.2.1調(diào)節(jié)信號(hào)通路nm23-H1可能通過調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路來影響大腸癌的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H1可以抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的激活。在正常細(xì)胞中，Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化和存活等過程，但在腫瘤細(xì)胞中，該信號(hào)通路常常被過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。nm23-H1能夠與Ras蛋白相互作用，抑制Ras的活性，從而阻斷Raf/MEK/ERK信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在大腸癌細(xì)胞系中，過表達(dá)nm23-H1可使Ras的活性降低，ERK的磷酸化水平下降，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。nm23-H1還可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的存活、增殖和遷移等過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，nm23-H1可以與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，抑制PI3K的活性，進(jìn)而阻斷AKT的磷酸化和激活，使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。在大腸癌細(xì)胞中，干擾nm23-H1的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路激活，細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)；而過表達(dá)nm23-H1則會(huì)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，使細(xì)胞的增殖和遷移能力減弱。6.2.2影響腫瘤血管生成腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，nm23-H1在抑制腫瘤血管生成方面發(fā)揮著重要作用。腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，而血管生成能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并帶走代謝廢物。研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H1可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)和活性，來抑制腫瘤血管生成。VEGF是一種強(qiáng)效的血管生成因子，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。nm23-H1可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低VEGF的表達(dá)水平。nm23-H1還可能通過與VEGF受體相互作用，阻斷VEGF信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)nm23-H1的腫瘤組織中，血管生成明顯減少，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移受到抑制。6.2.3抑制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲nm23-H1在抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲方面具有重要作用，其機(jī)制主要與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附分子有關(guān)。細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的改變是腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲的關(guān)鍵步驟。研究表明，nm23-H1可以通過調(diào)節(jié)微管蛋白的聚合和解聚，影響細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。nm23-H1能夠與微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管的聚合，使細(xì)胞骨架更加穩(wěn)定，減少腫瘤細(xì)胞的變形和遷移能力。在大腸癌細(xì)胞系中，過表達(dá)nm23-H1可使細(xì)胞內(nèi)微管的數(shù)量增加，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力明顯降低。nm23-H1還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和功能，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞間黏附分子，其表達(dá)的降低與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H1可以上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞之間的黏附力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。nm23-H1還可能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。在大腸癌細(xì)胞系中，過表達(dá)nm23-H1可使E-cadherin的表達(dá)水平升高，MMP-2、MMP-9等的表達(dá)降低，細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。6.3Syk和nm23-H1協(xié)同作用機(jī)制的推測基于前面所述Syk和nm23-H1各自的功能及信號(hào)通路，推測二者可能通過以下協(xié)同作用機(jī)制來抑制大腸癌的發(fā)生發(fā)展。在信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)控方面，Syk能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，而nm23-H1同樣可以通過與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，抑制PI3K的活性。二者可能在這條信號(hào)通路上形成協(xié)同效應(yīng)，共同抑制PI3K的活性，阻斷AKT的磷酸化和激活，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期，更有效地抑制大腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。在大腸癌細(xì)胞系中，過表達(dá)Syk和nm23-H1可能會(huì)導(dǎo)致PI3K的活性被進(jìn)一步抑制，AKT的磷酸化水平顯著降低，細(xì)胞的增殖和遷移能力受到更強(qiáng)的抑制。Syk可以激活p38MAPK，上調(diào)p21的表達(dá)，抑制CyclinD1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期。nm23-H1能夠抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的激活，減少細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。這兩條細(xì)胞周期調(diào)控途徑可能相互協(xié)同，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻止腫瘤細(xì)胞的異常增殖。在大腸癌組織中，當(dāng)Syk和nm23-H1同時(shí)高表達(dá)時(shí)，p21的表達(dá)可能會(huì)進(jìn)一步升高，CyclinD1以及Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)會(huì)顯著降低，細(xì)胞周期被更有效地阻滯在G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，Syk通過調(diào)節(jié)E-cadherin等細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)和功能，增強(qiáng)細(xì)胞之間的黏附力，同時(shí)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解。nm23-H1也可以通過調(diào)節(jié)微管蛋白的聚合和解聚，影響細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，還能上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，抑制MMPs的表達(dá)和活性。二者在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)降解方面可能發(fā)揮協(xié)同作用，共同抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在大腸癌細(xì)胞系中，同時(shí)過表達(dá)Syk和nm23-H1可能會(huì)使E-cadherin的表達(dá)大幅升高，MMP-2、MMP-9等的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞骨架更加穩(wěn)定，細(xì)胞之間的黏附力增強(qiáng)，細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力受到更明顯的抑制。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，Syk可以通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。nm23-H1雖然在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的研究相對(duì)較少，但有研究表明其可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)等機(jī)制，影響細(xì)胞的生存和凋亡。二者可能在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中相互協(xié)同，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。在大腸癌細(xì)胞中，Syk通過激活JNK信號(hào)通路，磷酸化Bcl-2，上調(diào)Bax的表達(dá)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。nm23-H1可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，增強(qiáng)Syk對(duì)線粒體途徑的調(diào)節(jié)作用，或者與Syk共同調(diào)節(jié)死亡受體途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而更有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。七、結(jié)論與展望7.1研究主要結(jié)論本研究通過免疫組化和RT-PCR技術(shù)，對(duì)Syk和nm23-H1在大腸癌組織及正常大腸黏膜組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測，并分析了它們與大腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，初步探討了其作用機(jī)制，得出以下主要結(jié)論：表達(dá)情況：Syk和nm23-H1在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率均顯著低于正常大腸黏膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明Syk和nm23-H1的表達(dá)缺失或降低可能與大腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，它們可能在大腸癌的發(fā)生過程中起到抑制作用。與臨床病理特征的關(guān)系：Syk和nm23-H1的表達(dá)與大腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。隨著腫瘤分化程度的降低、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期的升高，Syk和nm23-H1的表達(dá)逐漸減少。在低分化腺癌組織中，Syk和nm23-H1的陽性表達(dá)率明顯低于高、中分化腺癌組織；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中，二者的表達(dá)水平顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織；臨床分期越晚，Syk和nm23-H1的表達(dá)越低。這說明Syk和nm23-H1的低表達(dá)可能促進(jìn)了大腸癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及病情進(jìn)展，檢測它們的表達(dá)水平對(duì)于評(píng)估大腸癌的惡性程度和病情進(jìn)展具有重要價(jià)值。對(duì)預(yù)后的影響：生存分析結(jié)果顯示，Syk和nm23-H1陽性表達(dá)組患者的5年生存率明顯高于陰性表達(dá)組。多因素分析表明，Syk和nm23-H1均是大腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。Syk和nm23-H1陽性表達(dá)的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)更低，預(yù)后相對(duì)較好。這提示在臨床實(shí)踐中，檢測Syk和nm23-H1的表達(dá)水平可以作為評(píng)估大腸癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，為制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。作用機(jī)制：Syk可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞增殖；通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附和細(xì)胞外基質(zhì)降解來抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。nm23-H1可能通過抑制Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移；通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)和活性來抑制腫瘤血管生成；通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附分子來抑制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲。推測Syk和nm23-H1可能在信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)