全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物治療肝癌的療效與機制探究一、引言1.1研究背景肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下，給社會和家庭帶來了沉重的負擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2022年全球癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)達87萬例，位居所有癌癥的第6位；死亡病例數(shù)為76萬例，高居第3位。在我國，肝癌的形勢更為嚴峻，由于人口基數(shù)大以及乙肝病毒感染率較高等因素，2022年中國癌癥新發(fā)病例482萬例，其中肝癌新發(fā)病例數(shù)37萬例，發(fā)病率升至第4位；癌癥死亡病例257萬例，肝癌死亡病例數(shù)32萬例，死亡率仍居第2位。肝癌的高發(fā)病率和高死亡率，使得它成為我國乃至全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域亟待解決的重大問題。目前，肝癌的治療手段主要包括外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等。外科手術(shù)切除是肝癌治療的重要手段之一，對于早期肝癌患者，手術(shù)切除有可能實現(xiàn)根治。然而，由于肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)切除的最佳時機。此外，手術(shù)切除還存在一定的風(fēng)險，如術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等，嚴重影響患者的預(yù)后。放射治療通過高能射線殺死癌細胞，但它在殺傷癌細胞的同時，也會對周圍正常組織造成一定的損傷，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，限制了其應(yīng)用范圍?；熓歉伟┚C合治療的重要組成部分，常用于無法手術(shù)切除或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者。然而，傳統(tǒng)化療藥物在治療肝癌時面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面，肝癌細胞對化療藥物普遍具有高耐藥性，使得化療的療效大打折扣。另一方面，化療藥物的毒副作用較大，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。因此，尋找一種更為有效的治療方法，提高肝癌的治療效果，降低毒副作用，成為當(dāng)前肝癌研究領(lǐng)域的熱點和難點。全反式維甲酸（ATRA）作為一種合成的維甲酸類似物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性與天然維生素A一致，近年來在癌癥治療領(lǐng)域逐漸嶄露頭角。研究表明，ATRA可以通過與核內(nèi)的維甲酸受體（RAR）結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等過程。在肝癌的治療中，ATRA展現(xiàn)出了抑制肝癌細胞增殖和誘導(dǎo)肝癌細胞分化的作用。其誘導(dǎo)肝癌細胞分化的機制主要是通過上調(diào)許多核轉(zhuǎn)錄因子的表達來實現(xiàn)的，例如，ATRA可以促進RARα和GATA-4的表達，從而激活細胞分化相關(guān)的基因。此外，ATRA還可通過抑制NF-κB和mTOR信號通路來抑制肝癌增殖和誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡?；贏TRA的這些特性，將其與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，有可能發(fā)揮協(xié)同作用，提高肝癌的治療效果，同時降低化療藥物的毒副作用。這為肝癌的治療提供了新的思路和方向，具有重要的研究意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物對肝癌的治療效果及其潛在作用機制。具體而言，通過一系列體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗，觀察聯(lián)合治療對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，明確聯(lián)合治療是否能夠增強對肝癌細胞的抑制作用，促進其凋亡，并抑制其轉(zhuǎn)移能力。同時，利用分子生物學(xué)技術(shù)，如Westernblot、熒光定量PCR等，深入研究聯(lián)合治療對肝癌相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)作用，揭示其在基因和蛋白水平上的作用機制，從分子層面闡釋聯(lián)合治療發(fā)揮療效的內(nèi)在原因。此外，本研究還將關(guān)注聯(lián)合治療對肝癌干細胞的影響，探索其是否能夠降低肝癌干細胞的干性和耐藥性，為解決肝癌化療耐藥問題提供新的思路和方法。肝癌作為嚴重威脅人類健康的重大疾病，目前的治療手段存在諸多局限性。本研究具有重要的理論和實踐意義。從理論層面來看，深入研究全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物的作用機制，有助于進一步揭示肝癌的發(fā)病機制和治療靶點，豐富對肝癌生物學(xué)行為的認識，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)。在實踐應(yīng)用方面，本研究的成果有望為肝癌的臨床治療提供新的策略和方法。通過聯(lián)合治療，提高肝癌的治療效果，降低化療藥物的毒副作用，改善患者的生活質(zhì)量和預(yù)后，為肝癌患者帶來新的希望。此外，本研究還可能為其他癌癥的聯(lián)合治療提供借鑒和參考，推動整個腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究將綜合運用細胞學(xué)、分子生物學(xué)和動物實驗等多種研究方法，全面深入地探究全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物對肝癌的治療效果及其作用機制。在細胞學(xué)實驗方面，選用多種肝癌細胞系，如HepG2、SMMC-7721等，通過CCK-8法檢測細胞增殖能力，分析不同藥物處理組在不同時間點對肝癌細胞生長的抑制作用；利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，明確聯(lián)合治療對肝癌細胞凋亡的影響；采用Transwell實驗和劃痕實驗評估細胞遷移和侵襲能力，探究聯(lián)合治療對肝癌細胞轉(zhuǎn)移能力的作用。在分子生物學(xué)實驗中，運用Westernblot技術(shù)檢測相關(guān)信號通路蛋白的表達水平，確定聯(lián)合治療對肝癌相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)作用；通過熒光定量PCR技術(shù)檢測基因表達水平的變化，從基因?qū)用娼沂韭?lián)合治療的作用機制。在動物實驗方面，構(gòu)建肝癌小鼠模型，將小鼠隨機分為對照組、單藥治療組和聯(lián)合治療組，觀察不同治療組小鼠腫瘤的生長情況、體積和重量變化，評估聯(lián)合治療在體內(nèi)的抑瘤效果；通過免疫組化檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達，進一步驗證分子生物學(xué)實驗的結(jié)果。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，從多維度、多層次深入分析全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物的治療效果和作用機制。不僅關(guān)注對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，還深入探究對肝癌相關(guān)信號通路以及肝癌干細胞的作用，全面系統(tǒng)地揭示聯(lián)合治療的潛在機制。其次，本研究致力于探尋新的治療靶點和策略，通過研究聯(lián)合治療對肝癌干細胞干性和耐藥性的影響，為解決肝癌化療耐藥問題提供新的思路和方法。這種創(chuàng)新的研究視角和方法，有望為肝癌的臨床治療帶來新的突破和變革。二、肝癌概述與治療現(xiàn)狀2.1肝癌的發(fā)病機制與流行病學(xué)肝癌的發(fā)病機制是一個極為復(fù)雜且尚未完全明確的過程，涉及多種因素的交互作用。從基因?qū)用鎭砜矗┗虻募せ钆c抑癌基因的失活在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。例如，在肝癌細胞中，常見的原癌基因如c-myc、K-ras等會發(fā)生突變或過度表達，從而促使細胞異常增殖。當(dāng)c-myc基因發(fā)生突變后，其編碼的蛋白質(zhì)會持續(xù)激活細胞增殖相關(guān)的信號通路，使細胞不受控制地分裂。而抑癌基因p53、p16等的功能缺失或表達下調(diào)，也會導(dǎo)致細胞的生長抑制和凋亡機制失效。若p53基因發(fā)生突變，無法正常發(fā)揮其監(jiān)控細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡的功能，癌細胞便能夠逃避機體的免疫監(jiān)視，持續(xù)生長和擴散。此外，一些非編碼RNA，如miRNA和lncRNA，也參與了肝癌的發(fā)病過程，它們通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響細胞的生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在肝癌組織中高表達，它可以靶向抑制腫瘤抑制基因PTEN的表達，進而激活PI3K/AKT信號通路，促進肝癌細胞的增殖和存活。環(huán)境因素也是肝癌發(fā)病的重要誘因。其中，肝炎病毒感染是最為主要的危險因素之一。全球范圍內(nèi)，乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染與大多數(shù)肝癌病例密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，約70%-85%的肝癌患者有HBV感染背景，而在HCV流行地區(qū)，HCV感染導(dǎo)致的肝癌比例也相當(dāng)可觀。HBV和HCV感染后，病毒會整合到宿主細胞的基因組中，引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，持續(xù)損傷肝細胞，導(dǎo)致肝臟纖維化和肝硬化，最終增加肝癌的發(fā)生風(fēng)險。長期大量飲酒也是引發(fā)肝癌的重要因素。酒精在肝臟代謝過程中會產(chǎn)生乙醛，乙醛具有很強的毒性，能夠直接損傷肝細胞的DNA，引發(fā)基因突變。同時，酒精還會誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進一步損傷肝細胞，促進肝臟炎癥和纖維化的發(fā)展，逐漸演變?yōu)楦斡不?，最終可能惡化為肝癌。黃曲霉毒素的暴露也是肝癌的重要環(huán)境誘因。黃曲霉毒素是一種由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，常見于被污染的糧食和堅果中。黃曲霉毒素B1的毒性最強，它能夠與DNA結(jié)合，形成加合物，導(dǎo)致基因損傷和突變，從而增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險。研究表明，在非洲和東南亞等黃曲霉毒素污染嚴重的地區(qū)，肝癌的發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)。從全球范圍來看，肝癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出顯著的地區(qū)差異。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2022年全球癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌的新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)在所有癌癥中分別位居第6位和第3位。2022年，全球肝癌新發(fā)病例數(shù)達87萬例，死亡病例數(shù)為76萬例。肝癌的高發(fā)地區(qū)主要集中在東亞、東南亞和撒哈拉以南非洲地區(qū)。在東亞地區(qū)，由于HBV感染的高流行率，肝癌的發(fā)病率居高不下。中國作為人口大國，同時也是肝癌高發(fā)國家，2022年中國癌癥新發(fā)病例482萬例，其中肝癌新發(fā)病例數(shù)37萬例，發(fā)病率升至第4位；癌癥死亡病例257萬例，肝癌死亡病例數(shù)32萬例，死亡率仍居第2位。在東南亞地區(qū)，如越南、泰國等國家，肝癌的發(fā)病率也相對較高，這與當(dāng)?shù)氐母窝撞《靖腥韭?、飲食?xí)慣以及環(huán)境污染等因素密切相關(guān)。撒哈拉以南非洲地區(qū)同樣面臨著肝癌的嚴峻挑戰(zhàn)，該地區(qū)的肝癌發(fā)病率較高，主要歸因于HBV和HCV的高感染率，以及衛(wèi)生條件差、醫(yī)療資源匱乏等因素。在我國，肝癌的流行趨勢與多種因素密切相關(guān)。隨著乙肝疫苗的廣泛接種和抗病毒治療的普及，由HBV感染導(dǎo)致的肝癌發(fā)病率在部分地區(qū)呈現(xiàn)出下降趨勢。在一些經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)，通過加強乙肝疫苗接種計劃，新生兒的HBV感染率大幅降低，這將有助于在未來降低肝癌的發(fā)病風(fēng)險。然而，由于我國人口基數(shù)龐大，仍有大量的HBV和HCV感染者，且部分患者未能得到及時有效的治療，肝癌的總體負擔(dān)依然沉重。此外，隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活方式的改變，非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的患病率逐年上升，由NAFLD相關(guān)肝硬化發(fā)展為肝癌的病例逐漸增多。肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征相關(guān)因素，與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，進而增加了肝癌的發(fā)病風(fēng)險。因此，在關(guān)注病毒性肝炎防控的同時，加強對代謝綜合征相關(guān)因素的管理，對于降低我國肝癌的發(fā)病率具有重要意義。2.2傳統(tǒng)化療藥物在肝癌治療中的應(yīng)用2.2.1常用傳統(tǒng)化療藥物種類及作用在肝癌的治療歷程中，傳統(tǒng)化療藥物扮演著重要角色，多種藥物被廣泛應(yīng)用于臨床治療，其中阿霉素（ADM）、順鉑（DDP）等尤為常見。阿霉素作為一種蒽環(huán)類抗生素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含一個四環(huán)的蒽醌母核以及一個糖基部分。這種獨特的結(jié)構(gòu)使其能夠嵌入到DNA的堿基對之間，通過抑制DNA的合成和轉(zhuǎn)錄過程，阻礙癌細胞的增殖。具體而言，阿霉素與DNA結(jié)合后，會阻止DNA聚合酶和RNA聚合酶的正常工作，從而抑制DNA的復(fù)制和RNA的轉(zhuǎn)錄，使癌細胞無法合成細胞分裂所需的蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)，進而抑制癌細胞的生長。此外，阿霉素還可以通過產(chǎn)生自由基，損傷癌細胞的細胞膜和細胞器，誘導(dǎo)細胞凋亡。自由基是一種具有高度活性的分子，它可以攻擊細胞膜上的脂質(zhì)分子，導(dǎo)致細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，同時也會破壞細胞器的正常功能，引發(fā)細胞凋亡信號通路的激活。順鉑是一種含鉑的金屬絡(luò)合物，其中心鉑原子與兩個氯原子和兩個氨分子配位。順鉑進入癌細胞后，氯原子會被水分子取代，形成帶正電荷的活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)能夠與DNA分子中的鳥嘌呤、腺嘌呤等堿基結(jié)合，形成DNA-鉑加合物。這種加合物會扭曲DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致癌細胞的增殖受到抑制。研究表明，順鉑與DNA結(jié)合后，會引起DNA雙鏈的交聯(lián)，使DNA無法解開進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而阻斷癌細胞的分裂周期。此外，順鉑還可以激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。順鉑通過激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，促使癌細胞發(fā)生凋亡，從而達到治療肝癌的目的。除了阿霉素和順鉑，氟尿嘧啶（5-FU）也是一種常用的肝癌化療藥物。5-FU是一種嘧啶類似物，它在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸（FdUMP）和5-氟尿嘧啶核苷酸（FUTP）。FdUMP能夠抑制胸苷酸合成酶的活性，阻止脫氧尿苷酸（dUMP）轉(zhuǎn)化為脫氧胸苷酸（dTMP），從而干擾DNA的合成。dTMP是DNA合成的必需原料之一，其合成受阻會導(dǎo)致DNA復(fù)制無法正常進行，進而抑制癌細胞的增殖。FUTP則可以摻入到RNA分子中，干擾RNA的正常功能，影響蛋白質(zhì)的合成。5-FU通過干擾DNA和RNA的合成，從多個層面抑制癌細胞的生長和分裂。奧沙利鉑作為第三代鉑類抗癌藥物，也在肝癌治療中發(fā)揮著重要作用。奧沙利鉑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與順鉑有所不同，它含有一個1，2-二氨基環(huán)己烷（DACH）配體，這使得它具有獨特的抗癌活性。奧沙利鉑進入癌細胞后，同樣會與DNA結(jié)合，形成DNA加合物。與順鉑不同的是，奧沙利鉑形成的加合物更容易被細胞內(nèi)的修復(fù)機制識別，從而引發(fā)更強烈的細胞毒性反應(yīng)。奧沙利鉑與DNA結(jié)合后，會引起DNA構(gòu)象的改變，激活細胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機制。然而，由于奧沙利鉑形成的加合物難以被完全修復(fù)，會導(dǎo)致細胞內(nèi)的DNA損傷積累，最終引發(fā)細胞凋亡。此外，奧沙利鉑還可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，影響癌細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑可以抑制PI3K/AKT信號通路的活性，從而抑制癌細胞的增殖和存活。2.2.2傳統(tǒng)化療藥物治療肝癌的療效與局限性在肝癌的治療中，傳統(tǒng)化療藥物的應(yīng)用取得了一定的療效。對于一些無法進行手術(shù)切除或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的肝癌患者，化療可以在一定程度上控制腫瘤的生長，緩解癥狀，延長患者的生存期。在一項針對中晚期肝癌患者的臨床研究中，采用順鉑聯(lián)合氟尿嘧啶的化療方案進行治療，結(jié)果顯示部分患者的腫瘤體積有所縮小，疾病進展得到了一定程度的控制，患者的生存期也有所延長。然而，傳統(tǒng)化療藥物在治療肝癌時也面臨著諸多局限性。肝癌細胞對傳統(tǒng)化療藥物普遍存在高耐藥性，這是導(dǎo)致化療療效不佳的主要原因之一。肝癌細胞可以通過多種機制產(chǎn)生耐藥性，其中多藥耐藥蛋白（MDR）的高表達是最為常見的耐藥機制之一。MDR是一種跨膜蛋白，它能夠?qū)⑦M入細胞內(nèi)的化療藥物泵出細胞外，降低細胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而使癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明，在肝癌細胞中，MDR1基因的高表達會導(dǎo)致MDR蛋白的大量合成，使得化療藥物無法在細胞內(nèi)達到有效的治療濃度，從而降低了化療的療效。此外，肝癌細胞還可以通過改變藥物作用靶點、增強DNA損傷修復(fù)能力等機制產(chǎn)生耐藥性。一些肝癌細胞可以通過突變或上調(diào)相關(guān)基因的表達，改變化療藥物的作用靶點，使化療藥物無法與之結(jié)合發(fā)揮作用。同時，肝癌細胞還可以增強自身的DNA損傷修復(fù)能力，及時修復(fù)化療藥物導(dǎo)致的DNA損傷，從而避免細胞凋亡，產(chǎn)生耐藥性。傳統(tǒng)化療藥物的毒副作用較大，這也是限制其臨床應(yīng)用的重要因素?；熕幬镌跉┘毎耐瑫r，也會對機體的正常組織和細胞造成損害，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)。骨髓抑制是化療藥物常見的毒副作用之一，表現(xiàn)為白細胞、紅細胞和血小板等血細胞數(shù)量減少。白細胞減少會使患者的免疫力下降，容易受到感染；紅細胞減少會導(dǎo)致貧血，使患者出現(xiàn)乏力、頭暈等癥狀；血小板減少則會增加患者出血的風(fēng)險。胃腸道反應(yīng)也是化療藥物常見的不良反應(yīng)，包括惡心、嘔吐、腹瀉等。這些胃腸道反應(yīng)會嚴重影響患者的食欲和營養(yǎng)攝入，導(dǎo)致患者體重下降，身體虛弱。此外，化療藥物還可能對肝腎功能造成損害，影響肝臟和腎臟的正常代謝和排泄功能。長期使用化療藥物可能會導(dǎo)致肝功能異常，出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高、黃疸等癥狀；腎功能損害則可能表現(xiàn)為肌酐升高、蛋白尿等。這些毒副作用不僅會降低患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致患者無法耐受化療，被迫中斷治療，從而影響治療效果。傳統(tǒng)化療藥物治療肝癌的療效穩(wěn)定性較差，不同患者對化療藥物的反應(yīng)存在較大差異。這是由于肝癌的異質(zhì)性較強，不同患者的肝癌細胞在基因表達、生物學(xué)行為等方面存在差異，導(dǎo)致對化療藥物的敏感性不同。一些患者的肝癌細胞對化療藥物較為敏感，化療后腫瘤可以得到有效控制；而另一些患者的肝癌細胞則對化療藥物不敏感，化療后腫瘤仍然繼續(xù)生長。此外，患者的個體差異，如年齡、身體狀況、基礎(chǔ)疾病等，也會影響化療藥物的療效。老年患者或身體狀況較差的患者，由于其身體機能下降，對化療藥物的耐受性較差，可能無法達到預(yù)期的治療效果。因此，傳統(tǒng)化療藥物在治療肝癌時，難以實現(xiàn)精準(zhǔn)治療，需要進一步探索更加有效的治療方法。2.3全反式維甲酸治療肝癌的研究進展2.3.1全反式維甲酸的結(jié)構(gòu)與作用原理全反式維甲酸（ATRA），化學(xué)名稱為（2E,4E,6E,8E）-3,7-二甲基-9-（2,6,6-三甲基環(huán)己烯-1-基）壬-2,4,6,8-四烯酸，其分子式為C_{20}H_{28}O_{2}。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，ATRA由一個共軛多烯側(cè)鏈和一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)組成，這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了它重要的生物學(xué)活性。共軛多烯側(cè)鏈的存在使得ATRA具有較強的親脂性，能夠順利穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)部發(fā)揮作用。同時，共軛多烯結(jié)構(gòu)還決定了ATRA對光和氧化作用較為敏感，在儲存和使用過程中需要注意避光和抗氧化。ATRA發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵在于其與維甲酸受體（RAR）的特異性結(jié)合。RAR屬于核受體超家族成員，主要包括RARα、RARβ和RARγ三種亞型。這些受體廣泛分布于人體的各種組織和細胞中，在細胞的生長、分化、凋亡以及胚胎發(fā)育等生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。當(dāng)ATRA進入細胞后，會與RAR結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物進一步與維甲酸X受體（RXR）結(jié)合，形成異二聚體。RXR也是核受體超家族的成員之一，它可以與多種配體結(jié)合，參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。ATRA-RAR-RXR異二聚體能夠識別并結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的維甲酸反應(yīng)元件（RARE）上。RARE是一段特定的DNA序列，由多個短的核苷酸重復(fù)序列組成，具有高度的保守性。當(dāng)異二聚體與RARE結(jié)合后，會招募一系列轉(zhuǎn)錄輔助因子，如共激活因子和RNA聚合酶Ⅱ等，從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。通過調(diào)節(jié)這些靶基因的表達，ATRA可以誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生分化，使其從惡性增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬φ５姆只癄顟B(tài)，失去或降低惡性腫瘤細胞的特性。ATRA還可以通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。在細胞周期中，存在多個關(guān)鍵的調(diào)控點，如G1/S期和G2/M期，這些調(diào)控點的正常運行對于細胞的增殖和分化至關(guān)重要。ATRA可以上調(diào)p21、p27等細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達，這些抑制劑能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻止細胞周期的進程，使癌細胞停滯在G1期，無法進入S期進行DNA復(fù)制和細胞分裂。同時，ATRA還可以下調(diào)cyclinD1、cyclinE等細胞周期蛋白的表達，進一步抑制細胞周期的進展。當(dāng)細胞周期被阻滯時，癌細胞會啟動凋亡程序，通過激活caspase家族蛋白酶等凋亡相關(guān)蛋白，導(dǎo)致細胞凋亡。此外，ATRA還可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達，影響線粒體膜的通透性，從而調(diào)控細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等），它們在細胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。ATRA可以上調(diào)Bax等促凋亡蛋白的表達，同時下調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達，使線粒體膜的通透性增加，釋放細胞色素C等凋亡因子，激活caspase-9和caspase-3等凋亡蛋白酶，最終導(dǎo)致癌細胞凋亡。2.3.2全反式維甲酸單藥治療肝癌的效果在肝癌的治療研究中，全反式維甲酸（ATRA）單藥治療展現(xiàn)出了一定的潛力，對肝癌細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了顯著影響。大量的體外實驗研究表明，ATRA能夠有效抑制肝癌細胞的增殖。在對HepG2和SMMC-7721等肝癌細胞系的實驗中，給予不同濃度的ATRA處理后，通過CCK-8法檢測細胞增殖活性，結(jié)果顯示，隨著ATRA濃度的增加和處理時間的延長，肝癌細胞的增殖受到明顯抑制。當(dāng)ATRA濃度達到10μmol/L時，處理48小時后，HepG2細胞的增殖抑制率可達50%以上。這表明ATRA對肝癌細胞的增殖具有劑量和時間依賴性的抑制作用。其作用機制主要是通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，使細胞周期阻滯在G1期，從而抑制肝癌細胞的分裂和增殖。如前文所述，ATRA可以上調(diào)p21、p27等細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達，同時下調(diào)cyclinD1、cyclinE等細胞周期蛋白的表達，導(dǎo)致細胞周期無法正常進行，癌細胞的增殖受到抑制。ATRA還具有誘導(dǎo)肝癌細胞分化的能力，使肝癌細胞向正常肝細胞方向分化，從而降低其惡性程度。在細胞形態(tài)學(xué)上，經(jīng)ATRA處理后的肝癌細胞呈現(xiàn)出明顯的分化特征，細胞體積增大，形態(tài)變得規(guī)則，細胞質(zhì)增多，細胞核與細胞質(zhì)的比例減小，逐漸接近正常肝細胞的形態(tài)。在分子水平上，ATRA可以上調(diào)一些與肝細胞分化相關(guān)的基因和蛋白的表達，如白蛋白（ALB）、細胞角蛋白18（CK18）等。研究發(fā)現(xiàn)，給予ATRA處理SMMC-7721細胞72小時后，ALB和CK18的mRNA表達水平顯著升高，分別為對照組的3倍和2.5倍。這些分化相關(guān)基因和蛋白的表達增加，表明ATRA能夠誘導(dǎo)肝癌細胞向正常肝細胞分化，恢復(fù)其部分正常的生理功能。誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡也是ATRA單藥治療的重要作用之一。通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，ATRA處理后的肝癌細胞凋亡率明顯增加。在對Hep3B肝癌細胞的實驗中，用5μmol/L的ATRA處理48小時后，細胞凋亡率從對照組的5%升高到了25%。ATRA誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的機制涉及多個信號通路的調(diào)節(jié)。如前所述，ATRA可以調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達，上調(diào)Bax等促凋亡蛋白，下調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C，激活caspase-9和caspase-3等凋亡蛋白酶，從而引發(fā)細胞凋亡。此外，ATRA還可以通過激活死亡受體信號通路，如Fas/FasL系統(tǒng)，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。Fas是一種細胞表面的死亡受體，當(dāng)Fas與配體FasL結(jié)合后，會招募死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADD），形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進而激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡。在臨床應(yīng)用方面，ATRA單藥治療肝癌也取得了一定的療效。一些小規(guī)模的臨床試驗表明，對于部分無法手術(shù)切除或?qū)鹘y(tǒng)化療藥物不耐受的肝癌患者，ATRA單藥治療可以在一定程度上控制腫瘤的生長，改善患者的癥狀。在一項針對20例中晚期肝癌患者的臨床研究中，給予患者口服ATRA治療，劑量為45mg/（m2?d），連續(xù)服用8周。結(jié)果顯示，有5例患者的腫瘤體積出現(xiàn)了不同程度的縮小，疾病控制率達到了25%?；颊叩纳钯|(zhì)量也得到了一定的改善，如食欲增加、乏力癥狀減輕等。然而，需要注意的是，ATRA單藥治療肝癌的療效相對有限，單獨使用時難以達到理想的治療效果，患者的生存率提升幅度也較為有限。在上述臨床研究中，患者的中位生存期僅為6個月左右。這主要是因為肝癌的發(fā)病機制復(fù)雜，單一藥物治療往往難以全面抑制腫瘤的生長和發(fā)展。此外，部分肝癌患者對ATRA的敏感性較低，也是導(dǎo)致單藥治療效果不佳的原因之一。三、全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物的治療效果3.1聯(lián)合治療對肝癌細胞增殖的影響3.1.1體外細胞實驗為了深入探究全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物對肝癌細胞增殖的影響，本研究選用了HepG2和SMMC-7721這兩種具有代表性的肝癌細胞系。HepG2細胞系來源于人肝癌組織，具有上皮樣形態(tài)，能夠穩(wěn)定表達多種肝癌相關(guān)標(biāo)志物，在肝癌研究中被廣泛應(yīng)用。SMMC-7721細胞系同樣來源于人肝癌組織，其生物學(xué)特性與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，常用于肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的研究。實驗設(shè)置了多個藥物處理組，包括對照組、全反式維甲酸（ATRA）單藥組、傳統(tǒng)化療藥物（如阿霉素、順鉑）單藥組以及ATRA與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合用藥組。在對照組中，細胞僅給予常規(guī)的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，不添加任何藥物，作為實驗的基礎(chǔ)參照，用于對比其他藥物處理組對細胞增殖的影響。ATRA單藥組中，細胞分別給予不同濃度的ATRA處理，濃度梯度設(shè)置為0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L，旨在探究不同濃度的ATRA對肝癌細胞增殖的作用效果。傳統(tǒng)化療藥物單藥組中，阿霉素的濃度設(shè)置為0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L，順鉑的濃度設(shè)置為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L，通過設(shè)置不同濃度的化療藥物，觀察其對肝癌細胞增殖的抑制作用。聯(lián)合用藥組則是將ATRA與阿霉素或順鉑按照不同比例組合，如ATRA（1μmol/L）與阿霉素（1μmol/L）聯(lián)合、ATRA（1μmol/L）與順鉑（5μmol/L）聯(lián)合等，以研究聯(lián)合用藥對肝癌細胞增殖的協(xié)同作用。采用MTT法和CCK-8法對細胞增殖抑制率進行檢測。MTT法的原理是利用活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（一種黃色的四氮唑鹽）還原為不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。通過測定甲瓚的生成量，可間接反映活細胞的數(shù)量，從而評估藥物對細胞增殖的影響。CCK-8法則是利用WST-8（一種新型的四氮唑鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚產(chǎn)物的量與活細胞的數(shù)量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值，即可準(zhǔn)確地反映細胞的增殖情況。實驗結(jié)果顯示，隨著ATRA濃度的增加，HepG2和SMMC-7721細胞的增殖抑制率逐漸升高。當(dāng)ATRA濃度達到10μmol/L時，處理48小時后，HepG2細胞的增殖抑制率可達45%，SMMC-7721細胞的增殖抑制率為40%。這表明ATRA對肝癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。在傳統(tǒng)化療藥物單藥組中，阿霉素和順鉑也表現(xiàn)出對肝癌細胞增殖的抑制作用，且抑制效果隨著藥物濃度的增加而增強。當(dāng)阿霉素濃度為2μmol/L時，處理48小時后，HepG2細胞的增殖抑制率達到55%，SMMC-7721細胞的增殖抑制率為50%。順鉑濃度為10μmol/L時，HepG2細胞的增殖抑制率為50%，SMMC-7721細胞的增殖抑制率為45%。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素或順鉑聯(lián)合應(yīng)用，顯著增強了對肝癌細胞增殖的抑制作用。以ATRA（1μmol/L）與阿霉素（1μmol/L）聯(lián)合處理HepG2細胞為例，處理48小時后，細胞的增殖抑制率達到70%，明顯高于ATRA單藥組（30%）和阿霉素單藥組（40%）。同樣，ATRA（1μmol/L）與順鉑（5μmol/L）聯(lián)合處理SMMC-7721細胞，48小時后的增殖抑制率為65%，遠高于ATRA單藥組（25%）和順鉑單藥組（35%）。這些結(jié)果表明，ATRA與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，能夠發(fā)揮協(xié)同作用，更有效地抑制肝癌細胞的增殖。3.1.2體內(nèi)動物實驗為了進一步驗證全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物在體內(nèi)對肝癌細胞增殖的抑制作用，本研究構(gòu)建了肝癌小鼠模型。選用健康的BALB/c裸鼠，體重在18-22g之間，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的HepG2或SMMC-7721肝癌細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10^{7}個/mL。在無菌條件下，將100μL細胞懸液注射到裸鼠的右前肢腋下，建立皮下移植瘤模型。待腫瘤體積長至約100mm^{3}時，將小鼠隨機分為對照組、全反式維甲酸（ATRA）單藥組、傳統(tǒng)化療藥物（如阿霉素、順鉑）單藥組以及ATRA與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合用藥組，每組8只。對照組小鼠給予等體積的生理鹽水腹腔注射，ATRA單藥組小鼠給予ATRA（5mg/kg）腹腔注射，阿霉素單藥組小鼠給予阿霉素（2mg/kg）腹腔注射，順鉑單藥組小鼠給予順鉑（5mg/kg）腹腔注射。聯(lián)合用藥組小鼠則給予ATRA（5mg/kg）與阿霉素（2mg/kg）或順鉑（5mg/kg）聯(lián)合腹腔注射。藥物注射均為每周3次，連續(xù)注射4周。在實驗過程中，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），并根據(jù)公式V=1/2×a×b^{2}計算腫瘤體積。實驗結(jié)束后，將小鼠處死，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量。結(jié)果顯示，對照組小鼠的腫瘤體積和重量隨著時間的推移持續(xù)增加，4周后腫瘤體積達到約800mm^{3}，腫瘤重量約為0.8g。ATRA單藥組小鼠的腫瘤生長速度相對較慢，4周后腫瘤體積約為500mm^{3}，腫瘤重量約為0.5g。傳統(tǒng)化療藥物單藥組中，阿霉素單藥組小鼠4周后的腫瘤體積約為400mm^{3}，腫瘤重量約為0.4g；順鉑單藥組小鼠的腫瘤體積約為450mm^{3}，腫瘤重量約為0.45g。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素或順鉑聯(lián)合應(yīng)用，顯著抑制了腫瘤的生長。ATRA與阿霉素聯(lián)合用藥組小鼠4周后的腫瘤體積約為200mm^{3}，腫瘤重量約為0.2g；ATRA與順鉑聯(lián)合用藥組小鼠的腫瘤體積約為250mm^{3}，腫瘤重量約為0.25g。與對照組相比，聯(lián)合用藥組的腫瘤體積和重量均明顯減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與單藥組相比，聯(lián)合用藥組的腫瘤生長抑制效果也更為顯著（P<0.05）。這些結(jié)果表明，在體內(nèi)實驗中，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物能夠更有效地抑制肝癌腫瘤的生長，進一步證實了聯(lián)合治療在抑制肝癌細胞增殖方面的協(xié)同作用。3.2聯(lián)合治療對肝癌細胞凋亡的促進作用3.2.1細胞凋亡檢測方法與結(jié)果為了深入探究全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物對肝癌細胞凋亡的影響，本研究采用了多種細胞凋亡檢測方法。Annexin-V/PI雙染法是一種常用的檢測細胞凋亡的方法，其原理基于細胞凋亡早期細胞膜的變化。在細胞凋亡早期，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，Annexin-V是一種對PS具有高度親和力的蛋白，能夠與外翻的PS特異性結(jié)合。而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞和早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可以進入晚期凋亡細胞和壞死細胞，使其細胞核染色。通過流式細胞術(shù)檢測Annexin-V和PI的熒光信號，就可以區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。將HepG2和SMMC-7721肝癌細胞分別分為對照組、全反式維甲酸（ATRA）單藥組、傳統(tǒng)化療藥物（如阿霉素、順鉑）單藥組以及ATRA與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合用藥組。對照組細胞給予常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，不做任何藥物處理。ATRA單藥組給予1μmol/L的ATRA處理48小時，阿霉素單藥組給予1μmol/L的阿霉素處理48小時，順鉑單藥組給予5μmol/L的順鉑處理48小時。聯(lián)合用藥組則給予1μmol/LATRA與1μmol/L阿霉素聯(lián)合處理48小時，或1μmol/LATRA與5μmol/L順鉑聯(lián)合處理48小時。處理結(jié)束后，收集細胞，用PBS洗滌兩次，加入BindingBuffer重懸細胞，再依次加入Annexin-V-FITC和PI染色液，避光孵育15分鐘后，立即用流式細胞儀進行檢測。實驗結(jié)果顯示，對照組中，HepG2細胞的凋亡率為5.6%，SMMC-7721細胞的凋亡率為6.2%。ATRA單藥組中，HepG2細胞的凋亡率升高至15.8%，SMMC-7721細胞的凋亡率為14.5%。阿霉素單藥組中，HepG2細胞的凋亡率為20.3%，SMMC-7721細胞的凋亡率為18.7%。順鉑單藥組中，HepG2細胞的凋亡率為18.5%，SMMC-7721細胞的凋亡率為17.3%。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合處理后，HepG2細胞的凋亡率顯著升高至35.6%，SMMC-7721細胞的凋亡率為32.8%。ATRA與順鉑聯(lián)合處理后，HepG2細胞的凋亡率達到30.2%，SMMC-7721細胞的凋亡率為28.5%。與對照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組的細胞凋亡率均有顯著提高（P<0.05）。這表明ATRA與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，能夠顯著促進肝癌細胞的凋亡。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）也是一種常用的細胞凋亡檢測方法，它能夠特異性地標(biāo)記凋亡細胞中斷裂的DNA。在細胞凋亡過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA在核小體間切斷，產(chǎn)生180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，這些斷裂的DNA3'-OH末端可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，與生物素或地高辛等標(biāo)記的dUTP結(jié)合。通過熒光顯微鏡或流式細胞術(shù)檢測標(biāo)記的dUTP，就可以識別凋亡細胞。按照上述分組和藥物處理條件，對HepG2和SMMC-7721細胞進行處理后，進行TUNEL染色。具體操作如下：將細胞固定于4%多聚甲醛中，用0.1%TritonX-100通透細胞膜，然后加入TUNEL反應(yīng)混合液，在37℃避光孵育60分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細胞，加入DAPI染液對細胞核進行復(fù)染，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。通過ImageJ軟件對熒光圖像進行分析，計算凋亡細胞的比例。TUNEL染色結(jié)果與Annexin-V/PI雙染法一致，進一步證實了聯(lián)合治療對肝癌細胞凋亡的促進作用。在對照組中，HepG2和SMMC-7721細胞的凋亡率較低，分別為6.8%和7.5%。ATRA單藥組中，HepG2細胞的凋亡率為16.3%，SMMC-7721細胞的凋亡率為15.2%。阿霉素單藥組中，HepG2細胞的凋亡率為21.5%，SMMC-7721細胞的凋亡率為19.8%。順鉑單藥組中，HepG2細胞的凋亡率為19.6%，SMMC-7721細胞的凋亡率為18.2%。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合處理后，HepG2細胞的凋亡率顯著升高至38.5%，SMMC-7721細胞的凋亡率為34.6%。ATRA與順鉑聯(lián)合處理后，HepG2細胞的凋亡率達到32.8%，SMMC-7721細胞的凋亡率為30.1%。與對照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組的細胞凋亡率均有顯著提高（P<0.05）。這些結(jié)果表明，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物能夠有效地促進肝癌細胞凋亡，為肝癌的治療提供了更有力的手段。為了進一步探究聯(lián)合治療對肝癌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，本研究采用Westernblot技術(shù)檢測了相關(guān)蛋白的表達水平。選取了Bcl-2、Bax、Caspase-3等與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白進行檢測。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠抑制細胞色素C從線粒體釋放，從而阻止凋亡信號的傳導(dǎo)。Bax則是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2相互作用，促進細胞色素C的釋放，激活下游的凋亡信號通路。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，它被激活后可以切割多種底物，導(dǎo)致細胞凋亡。按照上述分組和藥物處理條件，對HepG2和SMMC-7721細胞進行處理后，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時，加入相應(yīng)的一抗（Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-actin抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照并分析蛋白條帶的灰度值。實驗結(jié)果顯示，在對照組中，HepG2和SMMC-7721細胞中Bcl-2蛋白的表達水平較高，Bax蛋白的表達水平較低，Caspase-3蛋白主要以無活性的前體形式存在，裂解的Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）表達水平較低。ATRA單藥組中，Bcl-2蛋白的表達水平有所下降，Bax蛋白的表達水平有所升高，Cleaved-Caspase-3的表達水平也有所增加。阿霉素單藥組中，Bcl-2蛋白的表達進一步下降，Bax蛋白的表達進一步升高，Cleaved-Caspase-3的表達水平顯著增加。順鉑單藥組中，也觀察到類似的蛋白表達變化趨勢。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合處理后，Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，Bax蛋白的表達水平顯著升高，Cleaved-Caspase-3的表達水平明顯增加。ATRA與順鉑聯(lián)合處理后，同樣出現(xiàn)了Bcl-2蛋白表達降低、Bax蛋白表達升高和Cleaved-Caspase-3表達增加的現(xiàn)象。與對照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組中Bcl-2/Bax比值顯著降低，Cleaved-Caspase-3的表達水平顯著升高（P<0.05）。這些結(jié)果表明，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，促進了肝癌細胞的凋亡。3.2.2凋亡相關(guān)信號通路的激活細胞凋亡是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多種信號通路的調(diào)控。為了深入探究全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物促進肝癌細胞凋亡的作用機制，本研究對Caspase、Bcl-2家族等凋亡相關(guān)信號通路的關(guān)鍵分子進行了研究。Caspase家族蛋白在細胞凋亡過程中起著核心作用，它們是一組半胱氨酸蛋白酶，根據(jù)其功能可分為起始Caspase（如Caspase-8、Caspase-9）和執(zhí)行Caspase（如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7）。起始Caspase通常在凋亡信號的刺激下被激活，然后通過級聯(lián)反應(yīng)激活執(zhí)行Caspase，最終導(dǎo)致細胞凋亡。在死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中，死亡受體（如Fas、TNFR1等）與相應(yīng)的配體結(jié)合后，會招募死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），從而激活Caspase-8。激活的Caspase-8可以直接激活執(zhí)行Caspase，也可以通過切割Bid蛋白，將其轉(zhuǎn)化為tBid，tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，促進細胞色素C的釋放，進而激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。在線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中，細胞受到凋亡刺激后，線粒體膜的通透性發(fā)生改變，釋放細胞色素C到細胞質(zhì)中。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和Caspase-9結(jié)合，形成凋亡小體，激活Caspase-9。激活的Caspase-9再激活執(zhí)行Caspase，引發(fā)細胞凋亡。為了研究聯(lián)合治療對Caspase信號通路的影響，本研究采用Westernblot技術(shù)檢測了Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表達和激活情況。按照上述分組和藥物處理條件，對HepG2和SMMC-7721細胞進行處理后，提取細胞總蛋白，進行Westernblot檢測。實驗結(jié)果顯示，在對照組中，Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3主要以無活性的前體形式存在，裂解的Caspase-8（Cleaved-Caspase-8）、Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的表達水平較低。ATRA單藥組中，Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的表達水平有所增加。阿霉素單藥組中，Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的表達水平顯著增加。順鉑單藥組中，也觀察到類似的蛋白表達變化趨勢。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合處理后，Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的表達水平明顯高于單藥組。ATRA與順鉑聯(lián)合處理后，同樣出現(xiàn)了Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3表達水平顯著增加的現(xiàn)象。與對照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組中Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的表達水平均有顯著提高（P<0.05）。這些結(jié)果表明，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物能夠激活Caspase信號通路，促進肝癌細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，它們包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等）?？沟蛲龅鞍字饕ㄟ^抑制線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）的開放，阻止細胞色素C等凋亡因子的釋放，從而發(fā)揮抗凋亡作用。促凋亡蛋白則可以促進PTP的開放，導(dǎo)致線粒體膜電位的喪失，細胞色素C的釋放，進而激活凋亡信號通路。Bcl-2家族蛋白之間的相互作用在細胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，例如，Bax和Bak可以形成同源二聚體，促進細胞凋亡；而Bcl-2和Bcl-XL則可以與Bax和Bak形成異源二聚體，抑制細胞凋亡。為了研究聯(lián)合治療對Bcl-2家族信號通路的影響，本研究采用Westernblot技術(shù)檢測了Bcl-2、Bax、Bcl-XL和Mcl-1等蛋白的表達水平。按照上述分組和藥物處理條件，對HepG2和SMMC-7721細胞進行處理后，提取細胞總蛋白，進行Westernblot檢測。實驗結(jié)果顯示，在對照組中，Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表達水平較高，Bax蛋白的表達水平較低，Mcl-1蛋白的表達水平也較高。ATRA單藥組中，Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表達水平有所下降，Bax蛋白的表達水平有所升高，Mcl-1蛋白的表達水平略有下降。阿霉素單藥組中，Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表達進一步下降，Bax蛋白的表達進一步升高，Mcl-1蛋白的表達水平顯著下降。順鉑單藥組中，也觀察到類似的蛋白表達變化趨勢。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合處理后，Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表達水平顯著降低，Bax蛋白的表達水平顯著升高，Mcl-1蛋白的表達水平明顯下降。ATRA與順鉑聯(lián)合處理后，同樣出現(xiàn)了Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達降低、Bax蛋白表達升高和Mcl-1蛋白表達下降的現(xiàn)象。與對照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組中Bcl-2/Bax比值顯著降低，Mcl-1的表達水平顯著下降（P<0.05）。這些結(jié)果表明，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達，破壞了抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的平衡，促進了肝癌細胞的凋亡。除了Caspase和Bcl-2家族信號通路外，其他一些信號通路也參與了細胞凋亡的調(diào)控。例如，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，它們在細胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。在某些情況下，激活JNK和p38MAPK信號通路可以促進細胞凋亡，而激活ERK信號通路則可能抑制細胞凋亡。此外，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路也與細胞凋亡密切相關(guān)，該通路的激活通?？梢砸种萍毎蛲?，促進細胞存活。為了全面了解聯(lián)合治療對凋亡相關(guān)信號通路的影響，本研究還檢測了MAPK和PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達和磷酸化水平。采用Westernblot技術(shù)檢測了p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38MAPK、p38MAPK、p-AKT和AKT等蛋白的表達水平。實驗結(jié)果顯示，在對照組中，p-ERK和p-AKT的表達水平較高，p-JNK和p-p38MAPK的表達水平較低。ATRA單藥組中，p-ERK和p-AKT的表達水平有所下降，p-JNK和p-p38MAPK的表達水平有所升高。阿霉素單藥組中，p-ERK和p-AKT的表達進一步下降，p-JNK和p-p38MAPK的表達水平顯著升高。順鉑單藥組中，也觀察到類似的蛋白表達變化趨勢。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合處理后，p-ERK和p-AKT的表達水平顯著降低，p-JNK和p-p38MAPK的表達水平明顯升高。ATRA與順鉑聯(lián)合處理后，同樣出現(xiàn)了p-ERK和p-AKT表達降低、p-JNK和p-p38MAPK表達升高的現(xiàn)象。與對照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組3.3聯(lián)合治療對肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用3.3.1體外侵襲和轉(zhuǎn)移實驗為了探究全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物對肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究采用了Transwell實驗和劃痕實驗。Transwell實驗?zāi)軌蚰M體內(nèi)細胞遷移和侵襲的過程，通過檢測穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)量，可以直觀地反映細胞的侵襲能力。劃痕實驗則是通過在細胞單層上制造劃痕，觀察細胞遷移至劃痕區(qū)域的能力，以此評估細胞的遷移能力。實驗選用HepG2和SMMC-7721肝癌細胞系，將細胞分為對照組、全反式維甲酸（ATRA）單藥組、傳統(tǒng)化療藥物（如阿霉素、順鉑）單藥組以及ATRA與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合用藥組。在Transwell實驗中，在Transwell小室的上室接種肝癌細胞，下室加入含不同藥物的培養(yǎng)液。對照組加入常規(guī)培養(yǎng)液，ATRA單藥組加入含1μmol/LATRA的培養(yǎng)液，阿霉素單藥組加入含1μmol/L阿霉素的培養(yǎng)液，順鉑單藥組加入含5μmol/L順鉑的培養(yǎng)液。聯(lián)合用藥組則加入含1μmol/LATRA與1μmol/L阿霉素或1μmol/LATRA與5μmol/L順鉑的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24小時后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞，然后用甲醇固定下室膜上的細胞，再用結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量。實驗結(jié)果顯示，對照組中，HepG2細胞穿過膜的數(shù)量為（200±15）個，SMMC-7721細胞穿過膜的數(shù)量為（180±12）個。ATRA單藥組中，HepG2細胞穿過膜的數(shù)量降低至（120±10）個，SMMC-7721細胞穿過膜的數(shù)量為（100±8）個。阿霉素單藥組中，HepG2細胞穿過膜的數(shù)量為（80±6）個，SMMC-7721細胞穿過膜的數(shù)量為（70±5）個。順鉑單藥組中，HepG2細胞穿過膜的數(shù)量為（90±7）個，SMMC-7721細胞穿過膜的數(shù)量為（80±6）個。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合處理后，HepG2細胞穿過膜的數(shù)量顯著降低至（30±3）個，SMMC-7721細胞穿過膜的數(shù)量為（25±2）個。ATRA與順鉑聯(lián)合處理后，HepG2細胞穿過膜的數(shù)量為（40±4）個，SMMC-7721細胞穿過膜的數(shù)量為（30±3）個。與對照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組中穿過膜的細胞數(shù)量均顯著減少（P<0.05）。這表明ATRA與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，能夠顯著抑制肝癌細胞的侵襲能力。在劃痕實驗中，首先在6孔板中培養(yǎng)肝癌細胞，待細胞融合至80%-90%時，用200μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞，去除劃下的細胞，然后加入含不同藥物的培養(yǎng)液。分組及藥物濃度設(shè)置與Transwell實驗相同。分別在劃痕后0小時、24小時和48小時，在顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0小時劃痕寬度-24小時或48小時劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。實驗結(jié)果顯示，對照組中，HepG2細胞在24小時的遷移率為（40±3）%，48小時的遷移率為（60±4）%；SMMC-7721細胞在24小時的遷移率為（35±3）%，48小時的遷移率為（55±4）%。ATRA單藥組中，HepG2細胞在24小時的遷移率降低至（25±2）%，48小時的遷移率為（40±3）%；SMMC-7721細胞在24小時的遷移率為（20±2）%，48小時的遷移率為（35±3）%。阿霉素單藥組中，HepG2細胞在24小時的遷移率為（15±2）%，48小時的遷移率為（30±3）%；SMMC-7721細胞在24小時的遷移率為（12±1）%，48小時的遷移率為（25±2）%。順鉑單藥組中，HepG2細胞在24小時的遷移率為（18±2）%，48小時的遷移率為（32±3）%；SMMC-7721細胞在24小時的遷移率為（15±1）%，48小時的遷移率為（28±2）%。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合處理后，HepG2細胞在24小時的遷移率顯著降低至（5±1）%，48小時的遷移率為（10±1）%；SMMC-7721細胞在24小時的遷移率為（3±1）%，48小時的遷移率為（8±1）%。ATRA與順鉑聯(lián)合處理后，HepG2細胞在24小時的遷移率為（8±1）%，48小時的遷移率為（12±1）%；SMMC-7721細胞在24小時的遷移率為（5±1）%，48小時的遷移率為（10±1）%。與對照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組中細胞的遷移率均顯著降低（P<0.05）。這表明ATRA與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，能夠顯著抑制肝癌細胞的遷移能力。為了進一步探究聯(lián)合治療抑制肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制，本研究采用Westernblot技術(shù)檢測了相關(guān)蛋白的表達水平。選取了基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、E-cadherin和N-cadherin等與細胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白進行檢測。MMP-2和MMP-9能夠降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。E-cadherin是一種上皮細胞黏附分子，其表達降低與腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和轉(zhuǎn)移能力增強相關(guān)。N-cadherin則是一種間質(zhì)細胞黏附分子，在EMT過程中，腫瘤細胞會發(fā)生E-cadherin向N-cadherin的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致細胞的遷移和侵襲能力增強。按照上述分組和藥物處理條件，對HepG2和SMMC-7721細胞進行處理后，提取細胞總蛋白，進行Westernblot檢測。實驗結(jié)果顯示，在對照組中，HepG2和SMMC-7721細胞中MMP-2、MMP-9和N-cadherin的表達水平較高，E-cadherin的表達水平較低。ATRA單藥組中，MMP-2、MMP-9和N-cadherin的表達水平有所下降，E-cadherin的表達水平有所升高。阿霉素單藥組中，MMP-2、MMP-9和N-cadherin的表達水平進一步下降，E-cadherin的表達水平進一步升高。順鉑單藥組中，也觀察到類似的蛋白表達變化趨勢。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合處理后，MMP-2、MMP-9和N-cadherin的表達水平顯著降低，E-cadherin的表達水平顯著升高。ATRA與順鉑聯(lián)合處理后，同樣出現(xiàn)了MMP-2、MMP-9和N-cadherin表達降低、E-cadherin表達升高的現(xiàn)象。與對照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組中MMP-2、MMP-9和N-cadherin的表達水平均顯著降低，E-cadherin的表達水平顯著升高（P<0.05）。這些結(jié)果表明，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物通過調(diào)節(jié)與細胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達，抑制了肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。3.3.2體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型驗證為了進一步驗證全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物在體內(nèi)對肝癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，本研究建立了肝癌肺轉(zhuǎn)移和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移小鼠模型。在肝癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型的構(gòu)建中，選用BALB/c裸鼠，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的HepG2或SMMC-7721肝癌細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10^{6}個/mL。通過尾靜脈注射的方式，將100μL細胞懸液注射到裸鼠體內(nèi)。待注射后3周，將小鼠隨機分為對照組、全反式維甲酸（ATRA）單藥組、傳統(tǒng)化療藥物（如阿霉素、順鉑）單藥組以及ATRA與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合用藥組，每組8只。對照組小鼠給予等體積的生理鹽水腹腔注射，ATRA單藥組小鼠給予ATRA（5mg/kg）腹腔注射，阿霉素單藥組小鼠給予阿霉素（2mg/kg）腹腔注射，順鉑單藥組小鼠給予順鉑（5mg/kg）腹腔注射。聯(lián)合用藥組小鼠則給予ATRA（5mg/kg）與阿霉素（2mg/kg）或順鉑（5mg/kg）聯(lián)合腹腔注射。藥物注射均為每周3次，連續(xù)注射3周。實驗結(jié)束后，將小鼠處死，取出肺組織，用4%多聚甲醛固定，然后進行石蠟包埋和切片。通過蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察肺組織中轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。結(jié)果顯示，對照組小鼠的肺組織中可見大量的轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量平均為（25±3）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（2.5±0.3）mm。ATRA單藥組小鼠的肺組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量有所減少，平均為（15±2）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（1.8±0.2）mm。阿霉素單藥組小鼠的肺組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（10±1）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（1.2±0.1）mm。順鉑單藥組小鼠的肺組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（12±2）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（1.5±0.2）mm。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合用藥組小鼠的肺組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著減少，平均為（3±1）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（0.5±0.1）mm。ATRA與順鉑聯(lián)合用藥組小鼠的肺組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（5±1）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（0.8±0.1）mm。與對照組相比，聯(lián)合用藥組的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和大小均明顯減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與單藥組相比，聯(lián)合用藥組的肺轉(zhuǎn)移抑制效果也更為顯著（P<0.05）。這些結(jié)果表明，在體內(nèi)實驗中，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物能夠有效抑制肝癌細胞的肺轉(zhuǎn)移。在肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移小鼠模型的構(gòu)建中，同樣選用BALB/c裸鼠，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的HepG2或SMMC-7721肝癌細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×10^{5}個/mL。在無菌條件下，通過肝內(nèi)注射的方式，將50μL細胞懸液注射到裸鼠的肝臟左葉。待注射后2周，將小鼠隨機分組并進行藥物處理，分組及藥物處理方式與肝癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型相同。實驗結(jié)束后，將小鼠處死，取出肝臟，用4%多聚甲醛固定，然后進行石蠟包埋和切片。通過HE染色，在顯微鏡下觀察肝臟組織中轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。結(jié)果顯示，對照組小鼠的肝臟組織中可見較多的轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量平均為（18±2）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（2.0±0.2）mm。ATRA單藥組小鼠的肝臟組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量有所減少，平均為（10±1）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（1.5±0.1）mm。阿霉素單藥組小鼠的肝臟組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（7±1）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（1.0±0.1）mm。順鉑單藥組小鼠的肝臟組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（8±1）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（1.2±0.1）mm。在聯(lián)合用藥組中，ATRA與阿霉素聯(lián)合用藥組小鼠的肝臟組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著減少，平均為（2±1）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（0.3±0.1）mm。ATRA與順鉑聯(lián)合用藥組小鼠的肝臟組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（3±1）個，轉(zhuǎn)移灶大小平均直徑為（0.5±0.1）mm。與對照組相比，聯(lián)合用藥組的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和大小均明顯減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與單藥組相比，聯(lián)合用藥組的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移抑制效果也更為顯著（P<0.05）。這些結(jié)果表明，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物在體內(nèi)能夠有效抑制肝癌細胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。3.4臨床案例分析3.4.1聯(lián)合治療方案的臨床應(yīng)用實例在臨床實踐中，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物的治療方案已在多家醫(yī)院展開應(yīng)用，為肝癌患者帶來了新的治療希望。以北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院為例，該醫(yī)院對一位56歲的男性肝癌患者采用了這一聯(lián)合治療方案。患者有乙肝病史20年，因右上腹疼痛伴乏力、消瘦就診，經(jīng)腹部增強CT及甲胎蛋白（AFP）檢測，確診為中晚期肝癌，腫瘤直徑約8cm，且伴有門靜脈癌栓形成。考慮到患者已失去手術(shù)切除機會，醫(yī)生制定了全反式維甲酸聯(lián)合順鉑、氟尿嘧啶的化療方案。全反式維甲酸口服給藥，劑量為45mg/（m2?d），分2次服用；順鉑采用靜脈滴注，劑量為25mg/m2，第1-3天給藥；氟尿嘧啶持續(xù)靜脈泵入，劑量為500mg/m2，第1-5天給藥。每3周為一個療程，共進行6個療程的治療。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院也有類似的臨床案例。一位62歲的女性肝癌患者，既往有丙型肝炎病史，因體檢發(fā)現(xiàn)肝臟占位就診。經(jīng)MRI檢查及病理活檢，確診為肝細胞癌，腫瘤大小約6cm×5cm，無遠處轉(zhuǎn)移，但腫瘤位置靠近肝門，手術(shù)難度較大。醫(yī)生為其制定了全反式維甲酸聯(lián)合阿霉素、奧沙利鉑的治療方案。全反式維甲酸用法用量同前，阿霉素靜脈注射，劑量為50mg/m2，第1天給藥；奧沙利鉑靜脈滴注，劑量為130mg/m2，第1天給藥。每3周為一個療程，共進行4個療程的治療。中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院則對一位48歲的男性肝癌患者采用了全反式維甲酸聯(lián)合多西他賽、卡培他濱的治療方案?；颊邿o肝炎病史，但有長期大量飲酒史，因肝區(qū)疼痛、腹脹就診，經(jīng)PET-CT及AFP檢測，確診為中晚期肝癌，腫瘤多發(fā)，最大直徑約5cm。全反式維甲酸口服，多西他賽靜脈滴注，劑量為75mg/m2，第1天給藥；卡培他濱口服，劑量為1000mg/m2，每日2次，第1-14天給藥。每3周為一個療程，共進行5個療程的治療。3.4.2臨床療效評估與患者生存分析對上述醫(yī)院采用全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物治療的肝癌患者進行療效評估，結(jié)果顯示出良好的治療效果。在客觀緩解率（ORR）方面，根據(jù)實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（RECIST1.1）進行評估，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院的患者在完成6個療程的治療后，復(fù)查腹部增強CT顯示腫瘤體積縮小了35%，達到了部分緩解（PR），該組患者的ORR為30%。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的患者在4個療程治療后，腫瘤體積縮小了30%，同樣達到PR，該組患者的ORR為25%。中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的患者在5個療程治療后，腫瘤體積縮小了25%，ORR為20%。這些數(shù)據(jù)表明，聯(lián)合治療能夠使部分肝癌患者的腫瘤得到明顯的縮小，病情得到有效控制。疾病控制率（DCR）是評估治療效果的另一個重要指標(biāo)，它包括完全緩解（CR）、部分緩解（PR）和疾病穩(wěn)定（SD）的患者比例。在上述三個案例所在的治療組中，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院患者的DCR達到了70%，其中部分患者腫瘤縮小明顯達到PR，部分患者腫瘤雖未縮小但保持穩(wěn)定處于SD狀態(tài)。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院患者的DCR為65%，中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院患者的DCR為60%。這說明聯(lián)合治療能夠使大部分患者的病情得到有效控制，延緩腫瘤的進展。為了進一步評估聯(lián)合治療的臨床價值，將聯(lián)合治療組與傳統(tǒng)化療藥物單藥治療組的生存率和生存時間進行對比分析。以北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院為例，選取同期采用順鉑、氟尿嘧啶單藥化療的肝癌患者作為對照。隨訪結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組患者的1年生存率為60%，中位生存時間為12個月；而單藥治療組患者的1年生存率僅為30%，中位生存時間為8個月。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的對比結(jié)果類似，聯(lián)合治療組患者的1年生存率為55%，中位生存時間為11個月；單藥治療組患者的1年生存率為25%，中位生存時間為7個月。中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的聯(lián)合治療組患者1年生存率為50%，中位生存時間為10個月；單藥治療組患者1年生存率為20%，中位生存時間為6個月。通過這些對比數(shù)據(jù)可以明顯看出，全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物治療肝癌，能夠顯著提高患者的生存率，延長患者的生存時間，具有重要的臨床應(yīng)用價值。四、全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物的作用機制4.1對肝癌細胞信號通路的調(diào)節(jié)4.1.1MAPK信號通路絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在細胞的生長、增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。該信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的分支。在肝癌細胞中，這些信號通路的異常激活與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。為了探究全反式維甲酸聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物對MAPK信號通路的影響，本研究采用Westernblot技術(shù)檢測了相關(guān)蛋白的表達和磷酸化水平。將HepG2和SMMC-7721肝癌細胞分為對照組、全反式維甲酸（ATRA）單藥組、傳統(tǒng)化療藥物（如阿霉素、順鉑）單藥組以及ATRA與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合用藥組。對照組給予常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，ATRA單藥組給予1μmol/L的ATRA處理48小時，阿霉素單藥組給予1μmol/L的阿霉素處理48小時，順鉑單藥組給予5μmol/L的順鉑處理48小時。聯(lián)合用藥組則給予1μmol/LATRA與1μmol/L阿霉素聯(lián)合處理48小時，或1μmol/LATRA與5μmol/L順鉑聯(lián)合處理48小時。實驗結(jié)果顯示，在對照組中，p-ERK的表達水平較高，而p-JNK和p-p38