VEGF與NSE：良惡性嗜鉻細胞瘤鑒別的關鍵分子標志物探究一、引言1.1研究背景嗜鉻細胞瘤（Pheochromocytoma）是一種起源于嗜鉻細胞的神經(jīng)內分泌腫瘤，主要發(fā)生部位為腎上腺髓質，但在交感神經(jīng)系統(tǒng)其他部位，如主動脈旁的交感神經(jīng)節(jié)、頸動脈體、嗜鉻體等處也可發(fā)生。嗜鉻細胞瘤在全球范圍內發(fā)生率約為0.1/10萬人口，在普通高血壓門診患者中，約占0.2%-0.6%，在兒童高血壓患者中為1.7%，在腎上腺意外瘤中約占5%。該腫瘤能夠持續(xù)或間斷地釋放大量兒茶酚胺，從而引起患者持續(xù)性或陣發(fā)性的高血壓，其典型表現(xiàn)為陣發(fā)性高血壓，同時伴有“頭痛、心悸、出汗”三聯(lián)征。嚴重高血壓患者，可在短時間內出現(xiàn)失明、心力衰竭、高血壓腦病等危及生命的情況。此外，它還會對患者的消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)產(chǎn)生影響，導致患者出現(xiàn)便秘、血尿、白細胞增多等異常表現(xiàn)，同時影響患者正常代謝，出現(xiàn)發(fā)熱、消瘦、血糖增高、血脂增高等癥狀。臨床上，嗜鉻細胞瘤可分為良性和惡性，過去認為約10%的腫瘤為惡性，但近期研究發(fā)現(xiàn)惡性的比例可能更高。目前臨床上判斷良、惡性嗜鉻細胞瘤的標準主要為腫瘤是否復發(fā)或出現(xiàn)轉移病灶。然而，良、惡性嗜鉻細胞瘤在臨床癥狀、影像學、實驗室檢查等方面并無特異性差異；在組織病理上，傳統(tǒng)的有助于鑒別良、惡性腫瘤的組織學標準，如核增大、深染、核內假包涵體、核分裂、包膜或血管浸潤等，均可出現(xiàn)在良性和惡性嗜鉻細胞瘤中，即使有局部浸潤亦不足以診斷其為惡性。這使得早期確診嗜鉻細胞瘤的性質變得極為困難，而一旦通過腫瘤復發(fā)或轉移病灶判斷為惡性時，腫瘤多已進展到晚期，臨床治療較為困難。因此，早期鑒別嗜鉻細胞瘤的良惡性，對于選擇正確的治療手段、判斷患者預后具有至關重要的意義。尋找能區(qū)別良、惡性嗜鉻細胞瘤或能預測腫瘤惡性潛能的生物學指標，成為了醫(yī)學領域中亟待解決的問題。血管內皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）是一種刺激血管生成的細胞因子，在腫瘤生長、轉移過程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管提供營養(yǎng)和轉移途徑，VEGF能夠特異性地作用于血管內皮細胞，促進其增殖、遷移，增加血管通透性，從而為腫瘤的生長和轉移創(chuàng)造有利條件，是腫瘤學領域中的熱點研究對象之一。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron-SpecificEnolase，NSE）為一種神經(jīng)特異性酶，主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤組織中，且與惡性腫瘤的侵襲性、預后密切相關。在神經(jīng)內分泌腫瘤中，NSE的表達水平可能反映了腫瘤細胞的分化程度和生物學行為。然而，當前關于VEGF、NSE在嗜鉻細胞瘤中的表達水平和意義尚缺乏深入的研究。通過研究VEGF、NSE在嗜鉻細胞瘤組織中的表達及其相關性，將有助于深入了解嗜鉻細胞瘤生長發(fā)展的分子機制，為嗜鉻細胞瘤的診療提供更精準的理論依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究VEGF和NSE在良惡性嗜鉻細胞瘤組織中的表達水平，明確兩者在不同性質腫瘤組織中的表達差異，并分析它們之間的相關性。通過對大量臨床樣本的檢測和分析，運用免疫組織化學等技術手段，精準地獲取VEGF和NSE在不同組織中的表達信息，為后續(xù)的結果討論提供堅實的數(shù)據(jù)基礎。臨床上，早期準確鑒別嗜鉻細胞瘤的良惡性，對于患者治療方案的選擇和預后評估至關重要。本研究通過揭示VEGF和NSE在良惡性嗜鉻細胞瘤組織中的表達特征，有助于為臨床提供新的鑒別指標。當臨床醫(yī)生面對疑似嗜鉻細胞瘤患者時，除了傳統(tǒng)的診斷方法外，還可檢測VEGF和NSE的表達水平，輔助判斷腫瘤性質，避免誤診和漏診。此外，深入了解VEGF和NSE在嗜鉻細胞瘤生長發(fā)展中的作用機制，能夠為開發(fā)新的治療靶點提供理論依據(jù)。若發(fā)現(xiàn)VEGF在惡性嗜鉻細胞瘤中高表達且對腫瘤血管生成起關鍵作用，那么就可針對VEGF及其相關信號通路研發(fā)靶向藥物，為患者提供更精準、有效的治療策略，改善患者預后，提高其生活質量。二、嗜鉻細胞瘤及VEGF、NSE概述2.1嗜鉻細胞瘤2.1.1定義與分類嗜鉻細胞瘤是一種起源于腎上腺髓質、交感神經(jīng)節(jié)或其他部位嗜鉻組織的神經(jīng)內分泌腫瘤。該腫瘤能夠持續(xù)或間斷地釋放大量兒茶酚胺，包括去甲腎上腺素、腎上腺素以及多巴胺，從而引發(fā)一系列復雜的臨床癥狀。根據(jù)腫瘤的生物學行為和臨床轉歸，嗜鉻細胞瘤主要分為良性和惡性兩類。良性嗜鉻細胞瘤約占總數(shù)的90%，其腫瘤細胞通常局限于原發(fā)部位，不侵犯周圍組織和遠處器官，無侵襲性生長和遠處轉移的特征。在組織學上，良性嗜鉻細胞瘤細胞形態(tài)相對規(guī)則，核分裂象少見，無血管、包膜浸潤等惡性指征。手術完整切除后，患者預后良好，一般可達到臨床治愈，5年生存率較高。然而，惡性嗜鉻細胞瘤雖相對少見，但危害極大，約占嗜鉻細胞瘤的10%，近期研究發(fā)現(xiàn)其比例可能更高。惡性嗜鉻細胞瘤具有明顯的侵襲性，腫瘤細胞可侵犯周圍組織和脈管系統(tǒng)，如血管、淋巴管等。常見的轉移部位包括淋巴結、肺、骨、肝、腦等器官，一旦發(fā)生轉移，病情往往迅速進展，治療難度顯著增加。在組織學上，惡性嗜鉻細胞瘤表現(xiàn)出細胞核增大、深染、核分裂象增多、包膜和血管浸潤等特征，DNA倍體常為非整倍體或四倍體。由于惡性嗜鉻細胞瘤對放化療的敏感性較低，即使經(jīng)過積極治療，患者的預后仍然較差，5年生存率較低，部分患者可能在數(shù)個月內死亡。2.1.2發(fā)病機制與臨床特征嗜鉻細胞瘤的發(fā)病機制較為復雜，目前尚未完全明確。研究表明，遺傳因素在嗜鉻細胞瘤的發(fā)病中起著重要作用，約30%的患者存在相關基因突變，如RET、VHL、SDHB、SDHC、SDHD等基因的突變，這些基因突變可導致細胞生長調控異常，進而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。此外，環(huán)境因素、內分泌失調等也可能與嗜鉻細胞瘤的發(fā)病有關，但具體機制仍有待進一步深入研究。嗜鉻細胞瘤患者的臨床癥狀多樣，最典型的表現(xiàn)為陣發(fā)性高血壓，同時伴有“頭痛、心悸、出汗”三聯(lián)征。陣發(fā)性高血壓發(fā)作時，血壓可急劇升高，收縮壓可達200-300mmHg，舒張壓可達130-180mmHg，持續(xù)數(shù)分鐘至數(shù)小時不等，發(fā)作間歇期血壓可正常。頭痛通常較為劇烈，呈搏動性，多位于前額、枕部或顳部；心悸表現(xiàn)為心跳加快、心慌，患者可自覺心臟跳動異常；出汗多為大汗淋漓，可濕透衣物。除上述典型癥狀外，患者還可能出現(xiàn)面色蒼白或潮紅、惡心、嘔吐、腹痛、視力模糊、焦慮、恐懼等癥狀。部分患者可表現(xiàn)為持續(xù)性高血壓，與原發(fā)性高血壓相似，容易被誤診。此外，嗜鉻細胞瘤還可影響患者的多個系統(tǒng)。在心血管系統(tǒng)，可導致兒茶酚胺性心肌病、心律失常、心力衰竭等；在消化系統(tǒng)，可引起便秘、腸擴張、腸梗阻等；在泌尿系統(tǒng)，可出現(xiàn)血尿、蛋白尿等；在代謝方面，可導致血糖升高、血脂異常、發(fā)熱、消瘦等。臨床上，鑒別嗜鉻細胞瘤的良惡性是一個極具挑戰(zhàn)性的問題。如前文所述，目前主要依據(jù)腫瘤是否復發(fā)或出現(xiàn)轉移病灶來判斷良惡性。然而，在疾病早期，良、惡性嗜鉻細胞瘤在臨床癥狀、影像學表現(xiàn)以及實驗室檢查等方面往往缺乏特異性差異。在影像學檢查中，良性和惡性嗜鉻細胞瘤均可表現(xiàn)為腎上腺區(qū)或其他部位的占位性病變，難以通過腫瘤的大小、形態(tài)、密度等特征準確判斷其性質。在實驗室檢查方面，兩者的兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物水平也可能相似，無法作為可靠的鑒別指標。在組織病理上，傳統(tǒng)的用于鑒別良、惡性腫瘤的組織學標準，如核增大、深染、核內假包涵體、核分裂、包膜或血管浸潤等，均可出現(xiàn)在良性和惡性嗜鉻細胞瘤中，即使有局部浸潤亦不足以診斷其為惡性。這種現(xiàn)狀使得早期準確鑒別嗜鉻細胞瘤的良惡性變得極為困難，嚴重影響了患者的治療和預后。2.2VEGF（血管內皮生長因子）2.2.1結構與功能血管內皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF），又被稱作血管通透因子（VascularPermeabilityFactor，VPF），是一種對血管內皮細胞具有高度特異性的生長因子。VEGF家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD以及胎盤生長因子（PlacentalGrowthFactor，PGF）等成員，它們均為同源二聚體糖蛋白，具有相似的空間結構。其中，通常所說的VEGF指的是VEGFA。VEGF通過與細胞表面的特異性受體結合發(fā)揮其生物學功能，目前已發(fā)現(xiàn)的VEGF受體有三種，分別為Flt1（Fms-liketyrosinekinase1）、KDR（Kinaseinsertdomain-containingreceptor），也被稱為Flk1（Fetalliverkinase1）和Flt4（Fms-liketyrosinekinase4）。這些受體均屬于酪氨酸蛋白激酶受體，其胞外區(qū)含有7個免疫球蛋白（Ig）樣結構域，負責與VEGF結合；胞內區(qū)含有酪氨酸激酶結構域（TyrosineKinaseDomain，KD），但被一段插入序列（KinaseInsert，KI）間隔開，當VEGF與受體結合后，可激活受體的酪氨酸激酶活性，進而啟動細胞內的信號轉導通路。在正常生理狀態(tài)下，VEGF在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵作用，它參與了血管系統(tǒng)的形成，促進了血管內皮細胞的增殖、遷移和分化，使得胚胎能夠獲得充足的血液供應，以滿足其生長和發(fā)育的需求。在成人機體中，VEGF在維持血管穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用，它能夠調節(jié)血管的通透性，確保組織和器官得到適宜的營養(yǎng)物質和氧氣供應。此外，在傷口愈合、組織修復等過程中，VEGF也會被誘導表達，促進新生血管的生成，加速傷口的愈合和組織的修復。在腫瘤生長過程中，VEGF同樣扮演著至關重要的角色。腫瘤細胞由于快速增殖，對營養(yǎng)物質和氧氣的需求急劇增加，而腫瘤組織內部原有的血管無法滿足這種需求。此時，腫瘤細胞會分泌大量的VEGF，以促進腫瘤血管的生成。VEGF能夠特異性地作用于血管內皮細胞，促使內皮細胞從周圍組織中遷移到腫瘤部位，并不斷增殖，形成新的血管網(wǎng)絡。這些新生血管不僅為腫瘤細胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣，還為腫瘤細胞進入血液循環(huán)并發(fā)生遠處轉移提供了途徑。研究表明，許多實體腫瘤，如乳腺癌、肺癌、結直腸癌等，其組織中VEGF的表達水平均明顯高于正常組織，且VEGF的高表達與腫瘤的大小、分期、轉移以及患者的不良預后密切相關。2.2.2在腫瘤中的作用機制VEGF在腫瘤生長和轉移過程中發(fā)揮著多方面的作用，其作用機制主要包括以下幾個方面。首先，VEGF能夠增加血管通透性。VEGF與血管內皮細胞表面的受體結合后，可激活一系列細胞內信號通路，促使內皮細胞之間的緊密連接發(fā)生改變，從而增加血管的通透性。血管通透性的增加使得血漿蛋白等大分子物質能夠滲出到血管外，在腫瘤組織周圍形成富含纖維蛋白的基質，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供了有利的微環(huán)境。同時，滲出的血漿蛋白還可以為腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質，進一步促進腫瘤的生長。例如，在動物實驗中，給予腫瘤模型注射VEGF抗體，阻斷VEGF的作用后，可觀察到腫瘤組織內血管通透性明顯降低，腫瘤細胞的生長和轉移也受到抑制。其次，VEGF可促進內皮細胞的增殖和遷移。VEGF與受體結合后，激活受體的酪氨酸激酶活性，進而激活下游的多個信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-Akt通路等。這些信號通路能夠調節(jié)內皮細胞的基因表達，促進細胞周期進程，促使內皮細胞從靜止期進入增殖期，從而實現(xiàn)內皮細胞的大量增殖。同時，VEGF還能夠誘導內皮細胞表達多種細胞粘附分子和趨化因子，增強內皮細胞與細胞外基質的粘附能力，并促使內皮細胞向腫瘤組織遷移，最終形成新的血管。研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的血管內皮細胞中添加VEGF，可顯著促進內皮細胞的增殖和遷移能力；而使用VEGF受體抑制劑阻斷VEGF信號通路后，內皮細胞的增殖和遷移明顯受到抑制。此外，VEGF還能夠調節(jié)腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，包含腫瘤細胞、血管內皮細胞、免疫細胞、成纖維細胞以及細胞外基質等多種成分。VEGF不僅可以直接作用于腫瘤細胞，促進其增殖和存活，還可以通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的其他細胞和分子，間接影響腫瘤的生長和轉移。例如，VEGF可以抑制免疫細胞的功能，如抑制T細胞、NK細胞的活性，促進調節(jié)性T細胞的產(chǎn)生，從而幫助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。同時，VEGF還可以刺激成纖維細胞分泌細胞外基質成分，改變腫瘤組織的硬度和結構，為腫瘤細胞的侵襲和轉移創(chuàng)造有利條件。2.3NSE（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）2.3.1生物學特性神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron-SpecificEnolase，NSE），又稱烯醇化酶2（Enolase2，ENO2），是一種特異性存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內分泌細胞中的酸性蛋白酶，預測分子量約為47kDa。在自然界中，烯醇化酶存在五種同工酶，分別為αα、ββ、γγ、αβ和αγ型，其中γγ型即為NSE。NSE在細胞糖酵解過程中發(fā)揮著關鍵作用，它能夠催化2-磷酸甘油轉化為磷酸烯醇式丙酮酸，為細胞提供能量。NSE在人體組織中的分布具有明顯的特異性，其在人腦組織中的含量最為豐富，尤其是在大腦皮質、海馬、小腦等區(qū)域。此外，NSE還存在于神經(jīng)內分泌細胞中，如腎上腺髓質的嗜鉻細胞、胰島細胞、甲狀腺C細胞等。在少突膠質細胞內也有少量分布，但在其他臟器及腦脊液中的分布水平極低，通常不及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的1%。除了在糖酵解中的作用外，NSE還具有保護神經(jīng)、營養(yǎng)神經(jīng)的功能。它能夠以鈣依賴的方式與新皮質神經(jīng)元結合，促進腦間質細胞、髓索神經(jīng)元、腦皮質神經(jīng)元等多種神經(jīng)細胞的存活，參與神經(jīng)細胞的生長、增殖以及凋亡過程。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，NSE的表達水平會發(fā)生動態(tài)變化，其在胚胎期和新生兒期的表達較高，隨著年齡的增長，表達水平逐漸降低并趨于穩(wěn)定。2.3.2與腫瘤的關系在腫瘤領域，NSE被廣泛認為是一種重要的腫瘤標志物，尤其在神經(jīng)內分泌腫瘤中具有重要的臨床意義。許多研究表明，NSE的表達水平與惡性腫瘤的侵襲性密切相關。以小細胞肺癌為例，小細胞肺癌是一種具有高度侵襲性和轉移性的神經(jīng)內分泌腫瘤，其細胞中NSE的表達水平顯著高于其他類型的肺癌細胞。高水平的NSE表達不僅與小細胞肺癌的腫瘤大小、分期相關，還與腫瘤的遠處轉移密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，當小細胞肺癌患者血清中的NSE水平升高時，提示腫瘤可能已經(jīng)發(fā)生了轉移，患者的預后往往較差。對于神經(jīng)母細胞瘤，NSE同樣是一個重要的標志物。神經(jīng)母細胞瘤是兒童最常見的顱外實體腫瘤，起源于神經(jīng)嵴細胞。在神經(jīng)母細胞瘤患者中，發(fā)病時NSE水平明顯升高，且隨著病情的發(fā)展，NSE水平會持續(xù)上升。當患者接受有效的治療后，NSE水平會顯著降低；而當腫瘤復發(fā)時，NSE水平又會再次升高。此外，對于兒童高分化的神經(jīng)母細胞瘤，NSE升高往往意味著預后較差，提示腫瘤細胞具有較強的侵襲性和不良的生物學行為。在嗜鉻細胞瘤中，NSE也可能發(fā)揮著重要作用。嗜鉻細胞瘤作為一種神經(jīng)內分泌腫瘤，其細胞來源與神經(jīng)內分泌系統(tǒng)密切相關。已有研究報道，部分嗜鉻細胞瘤患者的腫瘤組織中NSE表達水平升高。NSE在嗜鉻細胞瘤中的高表達可能反映了腫瘤細胞的神經(jīng)內分泌特性以及其增殖、侵襲能力。一方面，NSE的表達可能與嗜鉻細胞瘤細胞的分化程度有關，分化程度較低的腫瘤細胞可能會表達更高水平的NSE；另一方面，NSE可能參與了嗜鉻細胞瘤細胞的某些生物學過程，如細胞增殖、遷移和侵襲等，從而影響腫瘤的生長和發(fā)展。然而，目前關于NSE在嗜鉻細胞瘤中的具體作用機制尚未完全明確，仍需要進一步深入研究。三、研究設計與方法3.1研究對象本研究的病例均來源于[醫(yī)院名稱]20[起始年份]年1月至20[結束年份]年12月期間收治的患者。所有患者均經(jīng)手術切除腫瘤，并經(jīng)病理組織學檢查確診為嗜鉻細胞瘤。納入標準為：經(jīng)手術及病理證實為嗜鉻細胞瘤；患者術前未接受過放化療、免疫治療及靶向治療等可能影響腫瘤組織中VEGF和NSE表達的治療措施；患者臨床資料完整，包括年齡、性別、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查結果、影像學檢查資料以及手術和病理相關信息等。排除標準如下：合并其他惡性腫瘤的患者，以避免其他腫瘤對研究指標的干擾；標本質量不佳，如組織切片存在嚴重的自溶、壞死或固定不充分等情況，影響免疫組化檢測結果的準確性；患者存在嚴重的全身性疾病，如嚴重的心、肝、腎功能不全，自身免疫性疾病等，可能影響研究結果的解讀。經(jīng)過嚴格篩選，最終納入本研究的良性嗜鉻細胞瘤患者共[X]例，惡性嗜鉻細胞瘤患者[X]例。同時，選取了[X]例因其他疾?。ㄈ缒I上腺皮質腺瘤、腎腫瘤等）行手術切除，且經(jīng)病理證實腎上腺髓質組織正常的標本作為對照。3.2實驗材料與試劑本實驗所使用的主要儀器設備包括：石蠟切片機（型號[切片機型號]），由[生產(chǎn)廠家]生產(chǎn)，用于將組織樣本切成厚度均勻的石蠟切片，以滿足后續(xù)免疫組化檢測的需求；蘇木精-伊紅（HE）染色機（型號[染色機型號]），[生產(chǎn)廠家]制造，可實現(xiàn)對切片的自動染色，保證染色效果的穩(wěn)定性和一致性；光學顯微鏡（型號[顯微鏡型號]），[生產(chǎn)廠家]出品，具備高分辨率和清晰的成像效果，用于觀察組織切片的形態(tài)結構以及免疫組化染色結果；圖像分析系統(tǒng)（型號[圖像分析系統(tǒng)型號]），由[生產(chǎn)廠家]研發(fā)，能夠對顯微鏡下獲取的圖像進行定量分析，準確測量陽性染色區(qū)域的面積、光密度等參數(shù)，為實驗結果的分析提供客觀數(shù)據(jù)。免疫組化檢測所用的VEGF抗體為鼠抗人VEGF單克隆抗體，購自[抗體生產(chǎn)公司1]，該抗體經(jīng)過嚴格的質量控制和驗證，具有高度的特異性和敏感性，能夠準確識別組織中的VEGF抗原；NSE抗體則選用兔抗人NSE多克隆抗體，來自[抗體生產(chǎn)公司2]，其在免疫組化實驗中表現(xiàn)出良好的性能，可與NSE特異性結合，呈現(xiàn)出清晰的染色效果。實驗過程中還用到了一系列其他試劑，如枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0），用于抗原修復，通過高溫處理使抗原決定簇重新暴露，增強抗體與抗原的結合能力；3%過氧化氫溶液，主要用于滅活內源性過氧化物酶，避免其對免疫組化染色結果產(chǎn)生干擾；正常山羊血清封閉液，購自[試劑公司]，在滴加一抗前使用，可封閉非特異性結合位點，減少背景染色；生物素標記的二抗以及辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，均為免疫組化檢測中的關鍵試劑，用于信號放大，增強染色強度，使陽性結果更易于觀察；DAB顯色試劑盒（[品牌名稱]），用于顯色反應，DAB在辣根過氧化物酶的作用下發(fā)生氧化反應，生成棕色產(chǎn)物，從而使陽性部位在顯微鏡下呈現(xiàn)出明顯的棕色，便于判斷和分析；蘇木精染液，用于細胞核復染，使細胞核呈現(xiàn)出藍色，與陽性部位的棕色形成鮮明對比，更清晰地顯示組織細胞的形態(tài)結構。3.3實驗方法3.3.1樣本處理手術切除的腫瘤標本在離體后，迅速置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，固定時間為12-24小時，以確保組織細胞的形態(tài)和抗原性得以良好保存。固定后的標本依次經(jīng)過不同濃度的酒精進行脫水處理，即50%酒精沖洗2次，每次15分鐘；70%酒精浸泡1天；80%酒精過夜；95%酒精浸泡3小時；無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各浸泡2小時。通過梯度酒精脫水，使組織中的水分被完全去除，為后續(xù)的透明和包埋步驟做好準備。脫水后的標本進行透明處理，將其先置于1:1無水酒精與二甲苯混合液中浸泡45分鐘，隨后依次放入二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）中各浸泡30分鐘，二甲苯能夠使組織變得透明，便于石蠟的浸入。完成透明的標本進行石蠟包埋，將標本浸入石蠟中，先在1:1二甲苯與石蠟（58℃）混合液中浸泡45分鐘，然后依次在石蠟（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）中分別浸泡，總時長為2.5小時，最后用石蠟（Ⅲ）對組織進行包埋，使組織被石蠟完全包裹，形成質地均勻、便于切片的石蠟塊。使用石蠟切片機將包埋好的石蠟塊切成厚度為4-5μm的連續(xù)切片，將切好的切片置于50℃溫水中展平，然后用經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片撈片，確保切片牢固地黏附在載玻片上。撈片后的切片在68℃恒溫箱內烤片2小時，進一步增強切片與載玻片的黏附性，防止在后續(xù)實驗過程中切片脫落。3.3.2免疫組織化學染色本實驗采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（SP法）進行染色。將烤片后的載玻片取出，室溫放置30分鐘后進行脫蠟處理，依次將切片放入二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）中各浸泡15分鐘，以去除石蠟。脫蠟后的切片進行水化，依次通過無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各浸泡2分鐘；95%酒精浸泡2分鐘；80%酒精浸泡2分鐘；70%酒精浸泡2分鐘，使組織恢復到含水狀態(tài)。水化后用PBS緩沖液沖洗切片2-3次，每次5分鐘，以去除殘留的酒精。為了消除內源性過氧化物酶的活性，將切片置于3%過氧化氫溶液中，37℃孵育10分鐘，隨后用PBS沖洗2-3次，每次5分鐘。采用高溫高壓抗原修復法進行抗原修復，將切片置于0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，放入高壓鍋中，加熱至噴氣后維持2-3分鐘，然后自然冷卻20分鐘以上，再用冷水沖洗切片，加速冷卻至室溫，之后用PBS沖洗2-3次，每次5分鐘?？乖迯湍軌蚴贡谎谏w的抗原決定簇重新暴露，增強抗原與抗體的結合能力，提高免疫組化染色的敏感性。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，以封閉組織切片上的非特異性結合位點，減少背景染色。封閉結束后，甩去多余液體，不進行沖洗。按照抗體說明書的推薦稀釋比例，將鼠抗人VEGF單克隆抗體和兔抗人NSE多克隆抗體分別稀釋，然后滴加在切片上，每張切片滴加50μl，將切片置于濕盒中，4℃冰箱孵育過夜。孵育結束后，將切片從冰箱取出，37℃復溫45分鐘，然后用PBS沖洗2-3次，每次5分鐘。滴加生物素標記的二抗，每張切片滴加40-50μl，室溫靜置1小時，或37℃孵育30分鐘，使二抗與一抗特異性結合。之后用PBS沖洗2-3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（SP），室溫或37℃孵育30-60分鐘，SP能夠與二抗上的生物素結合，形成抗原-一抗-二抗-SP復合物，從而實現(xiàn)信號放大。孵育結束后，用PBS沖洗2-3次，每次5分鐘。采用DAB顯色試劑盒進行顯色反應，在1ml蒸餾水中依次加入1滴顯色劑A、1滴顯色劑B、1滴顯色劑C，充分搖勻后，滴加在切片上，顯色時間為5-10分鐘，在顯微鏡下密切觀察染色程度，當陽性部位呈現(xiàn)出明顯的棕色時，立即用自來水沖洗10分鐘，終止顯色反應。DAB在辣根過氧化物酶的催化作用下，會發(fā)生氧化反應，生成棕色的不溶性產(chǎn)物，從而使陽性部位在顯微鏡下可見。顯色后的切片用蘇木精染液復染細胞核2分鐘，使細胞核呈現(xiàn)出藍色，與陽性部位的棕色形成鮮明對比。復染后，將切片放入1%鹽酸酒精溶液中分化數(shù)秒，然后用自來水沖洗10-15分鐘，以去除多余的蘇木精染液，使細胞核染色清晰。將復染后的切片依次經(jīng)過梯度酒精脫水，即70%酒精、80%酒精、95%酒精、無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各浸泡2分鐘，然后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）透明各5分鐘，最后用中性樹膠封片。封片后的切片可長期保存，便于在顯微鏡下觀察。3.3.3結果判定在光學顯微鏡下，選取切片中細胞分布均勻、染色效果良好的區(qū)域，觀察VEGF和NSE的表達情況。陽性染色表現(xiàn)為細胞漿或細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，陰性對照切片則無棕黃色顆粒出現(xiàn)。對于陽性結果的判斷，采用半定量積分法，從染色強度和陽性細胞百分比兩個方面進行評估。染色強度分為4級：0分為陰性，無棕黃色顆粒；1分為淡黃色，染色較淺；2分為棕黃色，染色適中；3分為棕褐色，染色較深。陽性細胞百分比也分為4級：1分表示陽性細胞數(shù)占全部細胞數(shù)的0-25%；2分表示陽性細胞數(shù)占26-50%；3分表示陽性細胞數(shù)占51-75%；4分表示陽性細胞數(shù)占76-100%。將染色強度得分與陽性細胞百分比得分相乘，得到最終的免疫組化染色積分。例如，某切片中VEGF染色強度為2分，陽性細胞百分比為3分，則其免疫組化染色積分為2×3=6分。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野（400×）進行觀察和評分，取其平均值作為該切片的最終得分。3.4數(shù)據(jù)分析方法本研究使用SPSS26.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。對于計量資料，如免疫組化染色積分，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標準差（x±s）進行描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較則采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差分析結果顯示存在組間差異，進一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進行兩兩比較。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]描述，兩組間比較使用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。對于計數(shù)資料，如不同組別的病例數(shù)、陽性例數(shù)等，采用例數(shù)（n）和率（%）進行描述，組間比較采用χ2檢驗；當理論頻數(shù)小于5時，采用Fisher確切概率法。在相關性分析方面，對于VEGF和NSE表達水平的相關性，若兩者數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用Pearson相關分析；若有一方不符合正態(tài)分布，則采用Spearman秩相關分析。所有統(tǒng)計檢驗均以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。通過合理運用這些統(tǒng)計方法，能夠準確揭示VEGF和NSE在良惡性嗜鉻細胞瘤組織中的表達差異以及兩者之間的相關性，為研究結論的得出提供可靠的統(tǒng)計學依據(jù)。四、研究結果4.1VEGF在不同組織中的表達通過免疫組織化學染色及結果判定方法，對正常腎上腺髓質、良性和惡性嗜鉻細胞瘤組織中VEGF的表達進行檢測和分析，得到VEGF在三組組織中的陽性表達情況。在本研究納入的[X]例正常腎上腺髓質組織中，VEGF陽性表達的例數(shù)為[X]例，陽性表達率為[具體百分比]；在[X]例良性嗜鉻細胞瘤組織中，VEGF陽性表達的有[X]例，陽性表達率為[具體百分比]；而在[X]例惡性嗜鉻細胞瘤組織中，VEGF陽性表達的達到[X]例，陽性表達率為[具體百分比]。具體數(shù)據(jù)見表1。表1：VEGF在不同組織中的陽性表達率（略）進一步對三組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗比較組間差異。結果顯示，惡性嗜鉻細胞瘤組織中VEGF的陽性表達率顯著高于正常腎上腺髓質組織（χ2=[具體卡方值]，P<0.01），也明顯高于良性嗜鉻細胞瘤組織（χ2=[具體卡方值]，P<0.01）。然而，良性嗜鉻細胞瘤組織與正常腎上腺髓質組織之間VEGF的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=[具體卡方值]，P>0.05）。這表明VEGF在惡性嗜鉻細胞瘤組織中的表達明顯增強，可能在惡性嗜鉻細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。為了更深入地分析VEGF在不同組織中的表達差異，對VEGF的強陽性表達情況進行統(tǒng)計。在正常腎上腺髓質組織中，VEGF強陽性表達的例數(shù)為[X]例，強陽性率為[具體百分比]；良性嗜鉻細胞瘤組織中，VEGF強陽性表達的有[X]例，強陽性率為[具體百分比]；惡性嗜鉻細胞瘤組織中，VEGF強陽性表達的例數(shù)為[X]例，強陽性率為[具體百分比]。具體數(shù)據(jù)見表2。表2：VEGF在不同組織中的強陽性表達率（略）經(jīng)統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗比較組間差異，結果表明惡性嗜鉻細胞瘤組織中VEGF的強陽性率顯著高于良性嗜鉻細胞瘤組織（χ2=[具體卡方值]，P<0.01）。這進一步說明，與良性嗜鉻細胞瘤相比，VEGF在惡性嗜鉻細胞瘤組織中的表達不僅在陽性率上更高，而且強陽性表達更為明顯，提示VEGF的高表達強度可能與嗜鉻細胞瘤的惡性程度密切相關。4.2NSE在不同組織中的表達對正常腎上腺髓質、良性和惡性嗜鉻細胞瘤組織中NSE的表達進行檢測，統(tǒng)計結果顯示，在正常腎上腺髓質組織中，NSE陽性表達的例數(shù)為[X]例，陽性表達率為[具體百分比]；在良性嗜鉻細胞瘤組織中，NSE陽性表達的有[X]例，陽性表達率為[具體百分比]；在惡性嗜鉻細胞瘤組織中，NSE陽性表達的例數(shù)為[X]例，陽性表達率為[具體百分比]。具體數(shù)據(jù)見表3。表3：NSE在不同組織中的陽性表達率（略）采用χ2檢驗對三組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，結果表明，良、惡性嗜鉻細胞瘤NSE表達差異有顯著性意義（χ2=[具體卡方值]，P<0.05）。進一步比較發(fā)現(xiàn)，良性嗜鉻細胞瘤NSE的表達高于正常腎上腺髓質的NSE表達（χ2=[具體卡方值]，P<0.05）。這說明隨著組織從正常狀態(tài)向良性腫瘤、惡性腫瘤轉變，NSE的陽性表達率逐漸升高，提示NSE可能參與了嗜鉻細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程，且在腫瘤的惡性轉化中發(fā)揮作用。在強陽性表達方面，正常腎上腺髓質組織中NSE強陽性表達的例數(shù)為[X]例，強陽性率為[具體百分比]；良性嗜鉻細胞瘤組織中NSE強陽性表達的有[X]例，強陽性率為[具體百分比]；惡性嗜鉻細胞瘤組織中NSE強陽性表達的例數(shù)為[X]例，強陽性率為[具體百分比]。具體數(shù)據(jù)見表4。表4：NSE在不同組織中的強陽性表達率（略）經(jīng)χ2檢驗，惡性嗜鉻細胞瘤強陽性率高于良性嗜鉻細胞瘤（χ2=[具體卡方值]，P<0.05）。這進一步表明，與良性嗜鉻細胞瘤相比，NSE在惡性嗜鉻細胞瘤組織中的表達強度更高，提示NSE表達強度的增加可能與嗜鉻細胞瘤的惡性程度密切相關，可作為評估腫瘤惡性程度的潛在指標之一。4.3VEGF和NSE的相關性分析對VEGF和NSE在良惡性嗜鉻細胞瘤組織中的表達進行相關性分析，采用Spearman秩相關分析方法。結果顯示，在所有嗜鉻細胞瘤組織樣本中，VEGF和NSE的表達呈顯著正相關（r=[相關系數(shù)]，P<0.01）。具體數(shù)據(jù)見表5。表5：VEGF和NSE在嗜鉻細胞瘤組織中表達的相關性分析（略）進一步對良、惡性嗜鉻細胞瘤組織分別進行分析，在良性嗜鉻細胞瘤組織中，VEGF和NSE的表達也存在正相關趨勢（r=[相關系數(shù)]，P<0.05）；在惡性嗜鉻細胞瘤組織中，兩者的正相關關系更為明顯（r=[相關系數(shù)]，P<0.01）。這表明VEGF和NSE在嗜鉻細胞瘤組織中的表達存在密切關聯(lián)，且這種關聯(lián)在惡性嗜鉻細胞瘤中更為顯著。同時，統(tǒng)計VEGF和NSE在良惡性嗜鉻細胞瘤組織中的共同陽性表達情況。在良性嗜鉻細胞瘤組織中，VEGF和NSE共同陽性表達的例數(shù)為[X]例，共同陽性表達率為[具體百分比]；在惡性嗜鉻細胞瘤組織中，VEGF和NSE共同陽性表達的例數(shù)為[X]例，共同陽性表達率為[具體百分比]。經(jīng)χ2檢驗，兩者在良惡性嗜鉻細胞瘤組織中的共同陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=[具體卡方值]，P<0.01）。這進一步說明，VEGF和NSE的共同高表達與嗜鉻細胞瘤的惡性程度密切相關，在惡性嗜鉻細胞瘤組織中，兩者同時高表達的情況更為常見。五、討論5.1VEGF表達與嗜鉻細胞瘤良惡性的關系本研究結果顯示，VEGF在惡性嗜鉻細胞瘤組織中的陽性表達率及強陽性率均顯著高于良性嗜鉻細胞瘤組織，且與正常腎上腺髓質組織相比，差異也具有統(tǒng)計學意義。這一結果表明，VEGF在惡性嗜鉻細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管的形成，而VEGF是目前已知的作用最強的促血管生成因子之一。在惡性嗜鉻細胞瘤中，腫瘤細胞處于快速增殖狀態(tài)，對氧氣和營養(yǎng)物質的需求急劇增加。腫瘤細胞為了滿足自身生長的需要，會大量分泌VEGF。VEGF與其受體結合后，通過激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK、PI3K-Akt等信號通路，發(fā)揮一系列促進腫瘤血管生成的作用。一方面，VEGF能夠增加血管通透性。它可促使血管內皮細胞之間的緊密連接發(fā)生改變，使得血漿蛋白等大分子物質滲出到血管外。這些滲出的物質在腫瘤組織周圍形成富含纖維蛋白的基質，不僅為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供了便利的微環(huán)境，還能為腫瘤細胞提供額外的營養(yǎng)支持。例如，有研究表明，在腫瘤模型中，阻斷VEGF的作用后，腫瘤組織內血管通透性明顯降低，腫瘤細胞的生長和遷移也受到顯著抑制。另一方面，VEGF能夠促進內皮細胞的增殖和遷移。它誘導內皮細胞表達多種細胞粘附分子和趨化因子，增強內皮細胞與細胞外基質的粘附能力，同時促使內皮細胞從周圍組織遷移到腫瘤部位，并不斷增殖，最終形成新的血管網(wǎng)絡。新生的血管為腫瘤細胞提供了充足的氧氣和營養(yǎng)物質，滿足了腫瘤細胞快速生長的需求。相關研究顯示，在體外培養(yǎng)的血管內皮細胞中添加VEGF，內皮細胞的增殖和遷移能力顯著增強；而使用VEGF受體抑制劑阻斷VEGF信號通路后，內皮細胞的增殖和遷移明顯受到抑制。此外，VEGF還可以調節(jié)腫瘤微環(huán)境。它可以抑制免疫細胞的功能，如抑制T細胞、NK細胞的活性，促進調節(jié)性T細胞的產(chǎn)生，幫助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。同時，VEGF還能刺激成纖維細胞分泌細胞外基質成分，改變腫瘤組織的硬度和結構，為腫瘤細胞的侵襲和轉移創(chuàng)造有利條件。綜上所述，VEGF在惡性嗜鉻細胞瘤中的高表達，通過促進腫瘤血管生成、調節(jié)腫瘤微環(huán)境等多種途徑，為腫瘤的生長和轉移提供了必要條件。因此，VEGF有可能作為鑒別嗜鉻細胞瘤良惡性的輔助生物學指標。在臨床實踐中，對于疑似嗜鉻細胞瘤的患者，檢測其腫瘤組織中VEGF的表達水平，或許能夠為判斷腫瘤的性質提供重要的參考依據(jù)。5.2NSE表達與嗜鉻細胞瘤良惡性的關系本研究發(fā)現(xiàn)，NSE在惡性嗜鉻細胞瘤組織中的陽性表達率及強陽性率均顯著高于良性嗜鉻細胞瘤組織，且良性嗜鉻細胞瘤組織中NSE的表達也高于正常腎上腺髓質組織。這表明NSE在嗜鉻細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，尤其與腫瘤的惡性程度密切相關。NSE作為一種神經(jīng)特異性酶，主要存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內分泌細胞中。在嗜鉻細胞瘤中，腫瘤細胞起源于神經(jīng)內分泌細胞，這使得NSE在嗜鉻細胞瘤的研究中具有重要意義。隨著腫瘤從良性向惡性轉變，NSE表達水平的升高可能反映了腫瘤細胞的生物學行為改變。一方面，NSE表達的增加可能與腫瘤細胞的分化程度有關。惡性嗜鉻細胞瘤細胞的分化程度往往較低，表現(xiàn)出更強的增殖和侵襲能力。而NSE在低分化的腫瘤細胞中高表達，可能參與了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學過程。例如，在一些神經(jīng)內分泌腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，低分化的腫瘤細胞中NSE表達明顯上調，且NSE的高表達與腫瘤細胞的增殖活性呈正相關。另一方面，NSE可能在腫瘤細胞的代謝過程中發(fā)揮作用。NSE參與細胞糖酵解過程，催化2-磷酸甘油轉化為磷酸烯醇式丙酮酸，為細胞提供能量。在惡性嗜鉻細胞瘤中，腫瘤細胞的代謝活動異?；钴S，對能量的需求大幅增加。NSE表達的升高可能為腫瘤細胞提供了更多的能量，以滿足其快速增殖和侵襲的需要。有研究表明，抑制NSE的活性可以降低腫瘤細胞的能量供應，從而抑制腫瘤細胞的生長和遷移能力。此外，NSE還可能與腫瘤的神經(jīng)內分泌特性相關。嗜鉻細胞瘤作為神經(jīng)內分泌腫瘤，具有分泌兒茶酚胺等生物活性物質的能力。NSE在腫瘤細胞中的高表達，可能與腫瘤細胞的神經(jīng)內分泌功能密切相關。一些研究發(fā)現(xiàn)，NSE的表達水平與腫瘤細胞分泌兒茶酚胺的能力呈正相關。高表達NSE的腫瘤細胞可能具有更強的神經(jīng)內分泌活性，這也可能在一定程度上促進了腫瘤的惡性發(fā)展。綜上所述，NSE在惡性嗜鉻細胞瘤中的高表達，可能通過多種機制促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移。因此，NSE有望作為鑒別嗜鉻細胞瘤良惡性的潛在生物學指標。在臨床實踐中，檢測腫瘤組織中NSE的表達水平，對于判斷嗜鉻細胞瘤的性質、評估患者的預后具有重要的參考價值。同時，深入研究NSE在嗜鉻細胞瘤中的作用機制，也有助于為嗜鉻細胞瘤的治療提供新的靶點和策略。5.3VEGF和NSE聯(lián)合檢測的意義本研究結果顯示，VEGF和NSE在嗜鉻細胞瘤組織中的表達呈顯著正相關，且在惡性嗜鉻細胞瘤組織中，兩者的共同陽性表達率顯著高于良性嗜鉻細胞瘤組織。這表明聯(lián)合檢測VEGF和NSE在嗜鉻細胞瘤良惡性鑒別中具有重要意義。在臨床實踐中，單一標志物的檢測往往存在一定的局限性。對于嗜鉻細胞瘤，僅檢測VEGF或NSE，可能會出現(xiàn)誤診或漏診的情況。例如，部分良性嗜鉻細胞瘤可能會出現(xiàn)VEGF的低水平表達，但同時NSE表達升高；而有些惡性嗜鉻細胞瘤可能在某一特定階段，VEGF表達升高但NSE表達不明顯。若僅依據(jù)單一標志物進行判斷，可能會導致對腫瘤性質的錯誤評估。而聯(lián)合檢測VEGF和NSE能夠綜合兩者的信息，提高診斷的準確性。當VEGF和NSE同時高表達時，提示腫瘤更有可能為惡性。這是因為VEGF促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和轉移途徑；NSE則與腫瘤細胞的增殖、侵襲能力相關。兩者同時高表達，意味著腫瘤細胞既具備活躍的血管生成能力，又具有較強的增殖和侵襲活性，更符合惡性腫瘤的生物學特征。相關研究表明，在多種腫瘤的診斷中，聯(lián)合檢測多個標志物能夠顯著提高診斷的敏感性和特異性。例如，在肺癌的診斷中，聯(lián)合檢測癌胚抗原（CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和細胞角蛋白19片段（CYFRA21-1），其診斷準確性明顯高于單一標志物檢測。此外，聯(lián)合檢測VEGF和NSE還可以為臨床治療方案的選擇提供更全面的依據(jù)。對于VEGF和NSE均高表達的惡性嗜鉻細胞瘤患者，在手術切除腫瘤的基礎上，