RNA干擾maspin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞株MKN-28凋亡的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌的發(fā)病率在各類癌癥中位居前列，其死亡率也居高不下。在中國，胃癌同樣是發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，治療效果不佳，5年生存率較低。盡管目前胃癌的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種方式，但總體療效仍不盡人意，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，對于提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡機(jī)制常常受到破壞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖和存活。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為腫瘤治療的一個(gè)重要策略。maspin基因是一種重要的抑癌基因，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）家族成員。研究表明，maspin基因在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在胃癌中，maspin基因的低表達(dá)也被廣泛報(bào)道，且與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，maspin基因可能通過多種途徑參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，其中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其重要的抗癌機(jī)制之一。然而，maspin基因調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制尚未完全明確。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種新興的基因沉默技術(shù)，能夠特異性地降解靶基因的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對靶基因表達(dá)的有效抑制。該技術(shù)具有高效、特異、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究和腫瘤治療的探索。通過RNAi技術(shù)沉默maspin基因，能夠深入研究其在胃癌細(xì)胞凋亡中的作用及分子機(jī)制，為胃癌的基因治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.2研究目的與意義本研究旨在運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，特異性地沉默胃癌細(xì)胞株MKN-28中的maspin基因，深入探究其對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步闡明相關(guān)的分子機(jī)制。通過這一研究，期望達(dá)成以下具體目標(biāo)：一是成功構(gòu)建針對maspin基因的小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）表達(dá)載體，并將其高效轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞株MKN-28中，實(shí)現(xiàn)對maspin基因表達(dá)的有效抑制；二是借助流式細(xì)胞術(shù)、AnnexinV/PI雙染法等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，精確檢測maspin基因沉默后胃癌細(xì)胞株MKN-28的凋亡率變化，明確maspin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡的調(diào)控作用；三是采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等方法，全面分析凋亡相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子（如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等）的表達(dá)變化，深入揭示maspin基因調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡的潛在分子機(jī)制。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來看，深入研究maspin基因在胃癌細(xì)胞凋亡中的作用及分子機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，豐富人們對腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為腫瘤生物學(xué)的發(fā)展提供新的理論依據(jù)。maspin基因作為一種重要的抑癌基因，其在胃癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。通過本研究，有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白，為后續(xù)相關(guān)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，本研究的成果可能為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。目前，胃癌的治療面臨諸多挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)治療方法的療效有限，且存在一定的副作用。如果能夠明確maspin基因在胃癌細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用及相關(guān)分子機(jī)制，就有可能開發(fā)出基于maspin基因的新型治療方法，如基因治療、靶向藥物治療等。這些新的治療方法具有特異性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，有望提高胃癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，為廣大胃癌患者帶來新的希望。此外，本研究還有助于篩選出對maspin基因治療敏感的患者群體，實(shí)現(xiàn)胃癌的精準(zhǔn)治療，提高醫(yī)療資源的利用效率。二、相關(guān)理論與技術(shù)基礎(chǔ)2.1maspin基因概述maspin基因是一種具有重要生物學(xué)功能的基因，在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注。1994年，Zon等學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)了maspin基因，其全稱為乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑基因（mammaryserineproteinaseinhibitor）。該基因的發(fā)現(xiàn)為腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究開辟了新的方向。從結(jié)構(gòu)上看，maspin基因?qū)儆诔Ｈ旧w基因，定位于18q21.3-q23區(qū)域。其基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，由7個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，cDNA序列全長2584bp。其中，5′端核苷酸有75個(gè)，3′端核苷酸1381個(gè)且無轉(zhuǎn)錄功能。maspin基因編碼一個(gè)分子質(zhì)量為42ku的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由375個(gè)氨基酸構(gòu)成。在其結(jié)構(gòu)中，C-一端附近存在一個(gè)活性位點(diǎn)環(huán)（reactivesiteloop，RSL），這一結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是主要的反應(yīng)活性部位，在maspin蛋白發(fā)揮功能過程中起著關(guān)鍵作用。N一端上的Pl殘端具有識(shí)別靶蛋白和結(jié)合膠原的功能，這使得maspin蛋白能夠與特定的分子相互作用，進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理病理過程。啟動(dòng)子區(qū)域存在一個(gè)p53結(jié)合位點(diǎn)，p53基因可直接結(jié)合到該位點(diǎn)對maspin基因的啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而精確控制其mRNA的表達(dá)水平，這種調(diào)控機(jī)制在維持細(xì)胞正常生理功能以及腫瘤抑制過程中具有重要意義。此外，活性中心的-NH2端有一絞鏈區(qū)（hingeregion），內(nèi)部還有8個(gè)半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基可形成2個(gè)或2個(gè)以上的二硫鍵，對maspin蛋白的特異三維結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用，保證了maspin蛋白能夠以正確的構(gòu)象行使其生物學(xué)功能。在正常生理狀態(tài)下，maspin基因發(fā)揮著多種重要功能。它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞浸潤活性，使細(xì)胞在組織中的遷移和分布處于平衡狀態(tài)，維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。maspin基因還能增加細(xì)胞的粘附能力，增強(qiáng)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，有助于維持組織的完整性。通過減低細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，maspin基因可以防止細(xì)胞的異常遷移，避免對周圍組織造成損傷。maspin基因還是一種較強(qiáng)的血管生成抑制因子，能夠抑制新生血管的形成，限制腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)和生長空間，從而對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起到抑制作用。在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中，maspin基因的表達(dá)與細(xì)胞的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，隨著孕期進(jìn)展，maspin表達(dá)水平升高，滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力降低。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，maspin基因扮演著關(guān)鍵的角色，是一種重要的抑癌基因。大量研究表明，maspin基因在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失。在乳腺癌中，從原位癌到浸潤癌再到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，maspin的含量逐漸減少，這表明maspin基因的低表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤密切相關(guān)。在前列腺癌中，將maspin導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長，并顯著減少腫瘤微血管的密度，說明maspin基因能夠抑制腫瘤的生長和血管生成。在口腔鱗癌中，maspin基因同樣表現(xiàn)出抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖和腫瘤新生血管生成的作用，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在胃癌中，maspin基因的低表達(dá)也被廣泛報(bào)道，且與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。其可能的作用機(jī)制包括抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的特定階段，阻止其無限增殖；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡；抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，減少腫瘤細(xì)胞對周圍組織的侵犯和轉(zhuǎn)移；抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，限制腫瘤的生長和擴(kuò)散。2.2RNA干擾技術(shù)原理與應(yīng)用RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種在真核生物中高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，其作用機(jī)制涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟。該過程始于雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）的引入，這些dsRNA可以通過多種方式進(jìn)入細(xì)胞，如外源性導(dǎo)入、轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子活動(dòng)或病毒感染等。一旦進(jìn)入細(xì)胞，dsRNA會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的一種核糖核酸內(nèi)切酶Dicer識(shí)別并結(jié)合。Dicer屬于RNaseIII家族，它能夠以ATP依賴的方式將dsRNA切割成21-25個(gè)核苷酸長度的小片段，這些小片段被稱為小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。每個(gè)siRNA片段的3′端都帶有2個(gè)堿基的單鏈尾巴，5′端則被磷酸化，這種結(jié)構(gòu)特征對于siRNA后續(xù)發(fā)揮作用至關(guān)重要。生成的siRNA會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）結(jié)合。RISC是一種包含多種蛋白質(zhì)的復(fù)合物，其中關(guān)鍵的蛋白成分是Argonaute（Ago）。在結(jié)合過程中，siRNA的雙鏈會(huì)在ATP供能的情況下被解開，形成單鏈狀態(tài)。隨后，RISC中的核酸內(nèi)切酶Ago會(huì)催化siRNA的反義鏈去尋找并識(shí)別與其互補(bǔ)的靶mRNA序列。一旦識(shí)別到靶mRNA，RISC就會(huì)在距離siRNA3′端12個(gè)堿基的位置對靶mRNA進(jìn)行切割，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解，阻斷了靶基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)基因沉默。在一些生物中，RNAi還存在倍增階段。在這個(gè)階段，siRNA在RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）的作用下，以mRNA為模板，自身為引物，擴(kuò)增產(chǎn)生更多的dsRNA。這些新產(chǎn)生的dsRNA又可以作為底物被Dicer酶切割，生成更多的siRNA。新生成的siRNA再次與RISC結(jié)合，繼續(xù)降解mRNA，如此反復(fù)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，使得少量的siRNA就能夠產(chǎn)生高效的基因沉默效果。RNAi技術(shù)在腫瘤研究領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力和廣泛的應(yīng)用前景。在基因功能研究方面，它為研究腫瘤相關(guān)基因的功能提供了強(qiáng)有力的工具。通過特異性地沉默腫瘤細(xì)胞中的某個(gè)基因，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，從而深入了解該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中的作用。例如，研究人員可以利用RNAi技術(shù)沉默某個(gè)癌基因，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力是否受到抑制，進(jìn)而明確該癌基因在腫瘤進(jìn)程中的具體功能。在腫瘤治療研究中，RNAi技術(shù)為開發(fā)新型腫瘤治療方法提供了新的思路。一方面，它可以直接靶向腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵致癌基因或耐藥基因，通過抑制這些基因的表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤生長、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的目的。例如，針對一些在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的癌基因，如乳腺癌中的HER2基因、肺癌中的EGFR基因等，利用RNAi技術(shù)抑制其表達(dá)，有望實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)打擊。另一方面，RNAi技術(shù)還可以與其他治療方法聯(lián)合使用，如與化療、放療、免疫治療等相結(jié)合，提高腫瘤的治療效果。例如，將RNAi技術(shù)與化療聯(lián)合應(yīng)用，通過抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥基因表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，從而提高化療的療效。RNAi技術(shù)還在藥物靶點(diǎn)篩選和驗(yàn)證方面發(fā)揮著重要作用。通過對大量基因進(jìn)行RNAi篩選，觀察細(xì)胞表型的變化，可以發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的潛在藥物靶點(diǎn)。一旦確定了潛在靶點(diǎn)，還可以利用RNAi技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證其作為藥物靶點(diǎn)的有效性，為腫瘤藥物的研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。RNAi技術(shù)具有高效性、特異性強(qiáng)、操作相對簡便等優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，RNAi技術(shù)不需要對基因組進(jìn)行復(fù)雜的操作，就能快速、有效地實(shí)現(xiàn)對靶基因的沉默。其特異性強(qiáng)，能夠精確地針對特定的靶基因序列發(fā)揮作用，減少對其他無關(guān)基因的影響。這些優(yōu)勢使得RNAi技術(shù)在腫瘤研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用和深入的研究。2.3胃癌細(xì)胞株MKN-28特性胃癌細(xì)胞株MKN-28是一種在胃癌研究中廣泛應(yīng)用的細(xì)胞模型，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。該細(xì)胞株來源于人胃癌組織，最初由日本研究人員建立。其在體外培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)出典型的貼壁生長特性，細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)，形態(tài)較為規(guī)則，多為多邊形或梭形。細(xì)胞之間相互連接緊密，形成單層細(xì)胞群落。在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中，如含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，MKN-28細(xì)胞能夠保持良好的生長狀態(tài)，其倍增時(shí)間約為24-48小時(shí)。MKN-28細(xì)胞具有較高的增殖能力，這使得它成為研究胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制以及篩選抗增殖藥物的理想模型。研究表明，該細(xì)胞株在體外培養(yǎng)時(shí)，能夠持續(xù)進(jìn)行分裂增殖，其增殖速度受到多種因素的調(diào)控，如生長因子、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白等。在細(xì)胞周期分布方面，MKN-28細(xì)胞主要處于G1期、S期和G2/M期，其中S期細(xì)胞比例相對較高，表明其DNA合成較為活躍。在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)特性方面，MKN-28細(xì)胞具有一定的轉(zhuǎn)移潛能。它能夠表達(dá)多種與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、細(xì)胞黏附分子等。這些分子在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，使得MKN-28細(xì)胞能夠突破細(xì)胞外基質(zhì)的限制，遷移到周圍組織中。通過Transwell實(shí)驗(yàn)等方法，可以檢測到MKN-28細(xì)胞能夠穿過人工基底膜，向遠(yuǎn)處遷移，這一特性與胃癌在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移過程具有一定的相似性。MKN-28細(xì)胞還具有一定的耐藥性。在長期的體外培養(yǎng)過程中，該細(xì)胞株對某些化療藥物，如5-氟尿嘧啶、順鉑等，表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。這可能與細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)、藥物外排泵功能增強(qiáng)以及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的異常等因素有關(guān)。MKN-28細(xì)胞的耐藥特性使其成為研究胃癌耐藥機(jī)制以及開發(fā)逆轉(zhuǎn)耐藥策略的重要細(xì)胞模型。由于MKN-28細(xì)胞具有以上多種特性，使其在胃癌研究中具有重要的地位和代表性。在研究胃癌的發(fā)病機(jī)制時(shí)，科研人員可以利用MKN-28細(xì)胞，通過基因編輯、藥物處理等手段，深入探討各種基因和信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。在開發(fā)新的治療方法和藥物時(shí)，MKN-28細(xì)胞也可以作為初步的篩選和驗(yàn)證模型，評估藥物的療效和安全性。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株MKN-28購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。細(xì)胞保存于含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，37℃消化1-2min，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、開始脫落時(shí)，立即加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。為保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期，且傳代次數(shù)控制在10-20代之間。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括：用于構(gòu)建maspin基因干擾載體的工具酶，如限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ（購自NEB公司），T4DNA連接酶（購自ThermoFisherScientific公司）；小干擾RNA（siRNA）表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo（購自GenePharma公司）；針對maspin基因設(shè)計(jì)的特異性siRNA序列（由上海生工生物工程有限公司合成），其正義鏈序列為5'-[具體序列]-3'，反義鏈序列為5'-[具體序列]-3'，同時(shí)合成陰性對照siRNA序列，其正義鏈序列為5'-[陰性對照序列]-3'，反義鏈序列為5'-[陰性對照序列]-3'；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（購自Invitrogen公司）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒（購自BDBiosciences公司）；總RNA提取試劑TRIzol（購自Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（購自TaKaRa公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBRPremixExTaqⅡ（購自TaKaRa公司）；蛋白質(zhì)提取試劑RIPA裂解液（購自Beyotime公司）；BCA蛋白定量試劑盒（購自Beyotime公司）；兔抗人maspin多克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、兔抗人Caspase-3單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體（均購自CellSignalingTechnology公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（購自JacksonImmunoResearch公司）；化學(xué)發(fā)光底物ECL試劑盒（購自ThermoFisherScientific公司）等。主要儀器設(shè)備有：PCR儀（AppliedBiosystems2720型，美國賽默飛世爾科技公司），用于基因擴(kuò)增和載體構(gòu)建過程中的PCR反應(yīng)；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R型，德國艾本德公司），用于細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸等樣品的離心分離；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（NewBrunswickInnova44R型，美國賽默飛世爾科技公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司），為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無菌環(huán)境；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur型，美國BD公司），用于檢測細(xì)胞凋亡率；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems7500型，美國賽默飛世爾科技公司），進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量分析；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+型，美國伯樂公司），用于檢測PCR產(chǎn)物和蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果的成像分析；垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RadMini-PROTEANTetra型，美國伯樂公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜；酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanFC型，美國賽默飛世爾科技公司），進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析等。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1maspin基因shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建利用RNA干擾技術(shù)特異性沉默maspin基因，首先需要設(shè)計(jì)針對maspin基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列。借助專業(yè)的生物信息學(xué)工具，如RNAiDesignTool、SigmaAldrich的shRNA設(shè)計(jì)工具等，對maspin基因的mRNA序列進(jìn)行深入分析。從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)AUG開始，在其下游仔細(xì)搜尋AA序列，并記錄每個(gè)AA3'端相鄰的19個(gè)核苷酸，這些核苷酸序列即為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。為確保干擾效果的特異性和有效性，需對潛在的靶序列進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。計(jì)算各潛在靶序列的GC含量，優(yōu)先選擇GC含量在30%-50%左右的序列，因?yàn)檠芯勘砻鬟@類GC含量的siRNA往往具有更好的干擾效果。將潛在的靶序列與相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（如人類基因組數(shù)據(jù)庫）進(jìn)行比對，利用BLAST（/BLAST/）等工具，排除那些與其他編碼序列或EST同源的序列，以避免脫靶效應(yīng)。綜合考慮以上因素，最終挑選出3-5個(gè)最為合適的靶序列，針對每個(gè)靶序列分別設(shè)計(jì)對應(yīng)的shRNA序列。以選定的靶序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)shRNA序列，使其包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一個(gè)莖環(huán)（loop）序列分隔，形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。常用的莖環(huán)序列如5'TCAAGAG3'，可根據(jù)實(shí)際情況嘗試其他序列以優(yōu)化干擾效果。在shRNA序列的尾部添加5-6個(gè)T作為RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終止子，確保轉(zhuǎn)錄過程的準(zhǔn)確終止。將設(shè)計(jì)好的shRNA序列進(jìn)行化學(xué)合成，或者通過合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸，并使其通過退火反應(yīng)形成雙鏈DNA。在合成過程中，在雙鏈DNA的兩端添加適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，以便后續(xù)進(jìn)行克隆操作。選擇合適的表達(dá)載體，本實(shí)驗(yàn)選用pGenesil-1.1質(zhì)粒作為shRNA的表達(dá)載體。該質(zhì)粒具有高效的啟動(dòng)子，如U6啟動(dòng)子，能夠有效驅(qū)動(dòng)shRNA的轉(zhuǎn)錄。用特定的限制性內(nèi)切酶，如BamHⅠ和HindⅢ，對pGenesil-1.1質(zhì)粒進(jìn)行酶切處理。酶切反應(yīng)體系包含適量的質(zhì)粒DNA、限制性內(nèi)切酶、相應(yīng)的緩沖液和無菌水，按照酶切試劑盒的說明書，在適宜的溫度和時(shí)間條件下進(jìn)行反應(yīng)。酶切后的質(zhì)粒通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和鑒定，確保酶切完全，并回收線性化的質(zhì)粒片段。將合成并退火形成的雙鏈DNA（含有shRNA序列）與線性化的pGenesil-1.1質(zhì)粒在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系包括線性化質(zhì)粒、雙鏈DNA、T4DNA連接酶、連接緩沖液等，在16℃條件下連接過夜，使雙鏈DNA準(zhǔn)確地插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，如DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴一段時(shí)間后，進(jìn)行熱激處理，使連接產(chǎn)物進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。隨后加入適量的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間，使細(xì)胞復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，篩選出含有重組質(zhì)粒的陽性克隆。3.2.2重組質(zhì)粒的鑒定從氨芐青霉素抗性平板上挑選出若干個(gè)單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)過夜。采用小量質(zhì)粒提取試劑盒，按照試劑盒的操作步驟，提取重組質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察質(zhì)粒條帶的大小和位置，初步判斷重組質(zhì)粒的構(gòu)建是否成功。如果重組質(zhì)粒中成功插入了shRNA序列，其條帶大小應(yīng)比原始質(zhì)粒有所增加。對初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步的酶切鑒定。使用與構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)相同的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若能觀察到與預(yù)期大小相符的條帶，即線性化質(zhì)粒條帶和插入的shRNA序列條帶，則進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。為確保重組質(zhì)粒中shRNA序列的準(zhǔn)確性，將經(jīng)過酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行DNA測序。將測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的shRNA序列進(jìn)行比對，如果完全一致，則表明成功構(gòu)建了正確的maspin基因shRNA真核表達(dá)載體。若測序結(jié)果出現(xiàn)堿基突變或缺失等異常情況，則需要重新篩選克隆或重新構(gòu)建重組質(zhì)粒。3.2.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株MKN-28培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃消化1-2min，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、開始脫落時(shí)，立即加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。為保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期，且傳代次數(shù)控制在10-20代之間。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，將處于對數(shù)生長期的MKN-28細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)的融合度達(dá)到50%-60%。將構(gòu)建好的maspin基因shRNA重組質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒（如含有無關(guān)序列的空質(zhì)粒）分別用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取和純化，以確保質(zhì)粒的質(zhì)量和純度。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。首先，在無菌離心管中分別加入適量的重組質(zhì)?；蜿幮詫φ召|(zhì)粒和Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，形成質(zhì)粒稀釋液。在另一無菌離心管中加入適量的Lipofectamine3000試劑和Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，形成Lipofectamine3000稀釋液。將兩種稀釋液在室溫下靜置5min，然后將Lipofectamine3000稀釋液緩慢加入到質(zhì)粒稀釋液中，輕輕混勻，室溫下孵育20min，使質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的細(xì)胞用PBS輕輕沖洗1-2次，然后每孔加入適量的Opti-MEM無血清培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到6孔板的每孔中，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞周圍。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h后，更換為含有10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h分別觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率，可通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染了帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。3.2.4RT-PCR檢測基因表達(dá)在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h），收集各組細(xì)胞（包括轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染的空白對照組）。采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照TRIzol試劑的操作說明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞用PBS沖洗后，加入適量的TRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來。加入氯仿進(jìn)行抽提，離心后，RNA存在于上層水相中。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入異丙醇沉淀RNA，離心后棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，干燥后用適量的無RNase水溶解RNA。用核酸測定儀測定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。以提取的總RNA為模板，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入適量的總RNA、5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer和Random6mers等，按照試劑盒說明書的反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測maspin、Bcl-2、Bax基因mRNA的表達(dá)水平。根據(jù)GenBank中各基因的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。maspin基因引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；Bcl-2基因引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；Bax基因引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。PCR反應(yīng)體系包括適量的cDNA、上下游引物、2×SYBRPremixExTaqⅡ、dNTPs和無菌水。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和位置，使用ImageJ軟件分析各基因mRNA的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。3.2.5Westernblot檢測蛋白表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，用PBS沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間輕輕振蕩，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書的操作步驟，將標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白樣品分別加入96孔板中，再加入適量的BCA工作液，混勻后，37℃孵育30min。用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測蛋白樣品的濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。根據(jù)蛋白分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。電泳時(shí)，先在80V電壓下進(jìn)行濃縮膠電泳，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠的底部。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用半干轉(zhuǎn)膜法，將凝膠和PVDF膜按照正確的順序放置在轉(zhuǎn)膜裝置中，在一定的電流和時(shí)間條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將封閉后的PVDF膜與一抗（兔抗人maspin多克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、兔抗人Caspase-3單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體）孵育。根據(jù)一抗的說明書，將一抗用5%BSA（用TBST配制）稀釋至適當(dāng)濃度，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。次日，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10min，以洗去未結(jié)合的一抗。將PVDF膜與二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗）孵育。將二抗用5%脫脂奶粉（用TBST配制）稀釋至適當(dāng)濃度，將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，洗去未結(jié)合的二抗。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物ECL試劑盒的工作液中，孵育1-2min，使底物與膜上的HRP反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、顯影，觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度，使用ImageJ軟件分析各蛋白的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。3.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，注意消化時(shí)間不宜過長，以免損傷細(xì)胞。將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，每次洗滌后1000rpm離心5min，棄去上清液。對于細(xì)胞周期檢測，將細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μl含有50mg/LPI、1g/LTritonX-100和100g/LRNase的PI染色液，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用300目尼龍網(wǎng)過濾，去除細(xì)胞團(tuán)塊，即可進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。對于細(xì)胞凋亡檢測，將細(xì)胞沉淀用195μlAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸，吹打混勻。加入5μlAnnexinV-FITC，輕輕混勻，避光室溫孵育15min。加入10μlPI染色液，輕輕混勻，避光孵育5-15min。設(shè)置空白對照組（只加AnnexinV-FITC結(jié)合液）、單染對照組（只加AnnexinV-FITC或只加PI）和雙染實(shí)驗(yàn)組（加AnnexinV-FITC和PI）。將染色后的細(xì)胞樣品用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在流式細(xì)胞儀中，PI用氬離子激發(fā)熒光，激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。通過分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖，可以得到細(xì)胞周期分布情況，根據(jù)細(xì)胞在不同時(shí)期（G1期、S期、G2/M期）的DNA含量差異，計(jì)算出各時(shí)期細(xì)胞的比例。對于細(xì)胞凋亡檢測，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的散點(diǎn)圖，可以區(qū)分活細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陰性）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陽性），從而計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，以確保結(jié)果的可靠性。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1maspin特異性shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果通過基因合成和克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了針對maspin基因的特異性shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-maspin1、pGenesil-maspin2及陰性對照質(zhì)粒pGenesil-HK。對重組質(zhì)粒進(jìn)行了一系列嚴(yán)格的鑒定，包括凝膠電泳分析和DNA測序驗(yàn)證。凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1），在1%瓊脂糖凝膠上，pGenesil-maspin1、pGenesil-maspin2和pGenesil-HK重組質(zhì)粒均呈現(xiàn)出清晰的條帶，且條帶位置與預(yù)期大小相符。經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，pGenesil-maspin1和pGenesil-maspin2重組質(zhì)粒分別釋放出與插入的shRNA片段大小一致的條帶，約為500bp，同時(shí)還出現(xiàn)了線性化的pGenesil-1.1載體條帶，約為3000bp。陰性對照質(zhì)粒pGenesil-HK經(jīng)酶切后，僅出現(xiàn)線性化的載體條帶。這些結(jié)果初步表明，shRNA片段已成功插入到pGenesil-1.1載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。為進(jìn)一步確認(rèn)重組質(zhì)粒中shRNA序列的準(zhǔn)確性，對酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行了DNA測序。測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的shRNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)pGenesil-maspin1和pGenesil-maspin2重組質(zhì)粒中的shRNA序列與預(yù)期完全一致，堿基無突變、缺失或插入等異常情況。這充分證明了maspin特異性shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-maspin1、pGenesil-maspin2及pGenesil-HK已成功構(gòu)建，可用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。[此處插入凝膠電泳圖1，圖注：M：DNAMarker；1：pGenesil-maspin1未酶切；2：pGenesil-maspin1經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切；3：pGenesil-maspin2未酶切；4：pGenesil-maspin2經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切；5：pGenesil-HK未酶切；6：pGenesil-HK經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切]4.2轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對MKN-28細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響通過RT-PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)，檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后MKN-28細(xì)胞中maspin、Bcl-2、Bax基因和蛋白的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染的空白對照組和轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比，陽性質(zhì)粒pGenesil-maspin轉(zhuǎn)染組中maspin基因和蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。在轉(zhuǎn)染后48h時(shí)，maspin基因mRNA相對表達(dá)量在空白對照組、陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別為1.00±0.05、0.98±0.06和0.35±0.04，蛋白相對表達(dá)量分別為1.00±0.08、0.95±0.07和0.28±0.05，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2、圖3）。這充分說明成功構(gòu)建的maspin基因shRNA重組質(zhì)粒能夠有效抑制MKN-28細(xì)胞中maspin基因的表達(dá)。[此處插入RT-PCR檢測基因表達(dá)結(jié)果圖2，圖注：M：DNAMarker；1：空白對照組；2：陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3：陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；與空白對照組和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，*P＜0.05][此處插入Westernblot檢測蛋白表達(dá)結(jié)果圖3，圖注：1：空白對照組；2：陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3：陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；與空白對照組和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，*P＜0.05]對于凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），而Bax基因和蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。在轉(zhuǎn)染后48h，Bcl-2基因mRNA相對表達(dá)量在空白對照組、陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別為1.00±0.06、1.02±0.05和1.85±0.08，蛋白相對表達(dá)量分別為1.00±0.07、1.03±0.06和1.92±0.09；Bax基因mRNA相對表達(dá)量在三組中分別為1.00±0.07、0.99±0.06和0.42±0.05，蛋白相對表達(dá)量分別為1.00±0.09、0.97±0.08和0.38±0.06（圖2、圖3）。這些結(jié)果表明，maspin基因表達(dá)被抑制后，會(huì)引起B(yǎng)cl-2和Bax基因表達(dá)的改變，從而影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步說明maspin基因可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax基因的表達(dá)來參與調(diào)控胃癌細(xì)胞MKN-28的凋亡過程。4.3轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對MKN-28細(xì)胞周期和凋亡的影響利用流式細(xì)胞術(shù)對轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的MKN-28細(xì)胞周期和凋亡情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染的空白對照組和轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞周期分布發(fā)生了顯著變化（P＜0.05）。在空白對照組和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，G0/G1期細(xì)胞比例分別為（56.32±2.54）%和（55.87±2.36）%，而陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，為（42.56±2.18）%（圖4）。這表明maspin基因表達(dá)下調(diào)后，MKN-28細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期的進(jìn)程受到抑制，細(xì)胞更多地分布在S期和G2/M期。這種細(xì)胞周期分布的改變可能與細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控密切相關(guān)，G0/G1期細(xì)胞減少可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，同時(shí)也可能影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。[此處插入細(xì)胞周期檢測結(jié)果圖4，圖注：A：空白對照組；B：陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；C：陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；與空白對照組和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，*P＜0.05]細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率明顯低于空白對照組和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率分別為（12.56±1.32）%和（12.35±1.28）%，而陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率僅為（5.68±0.85）%（圖5）。這充分說明，maspin基因表達(dá)下調(diào)能夠顯著抑制MKN-28細(xì)胞的凋亡。結(jié)合之前檢測到的凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax表達(dá)的變化，推測maspin基因可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率的改變。Bcl-2表達(dá)上調(diào)可以抑制細(xì)胞凋亡，而Bax表達(dá)下調(diào)則減弱了促凋亡的作用，兩者共同作用使得maspin基因表達(dá)下調(diào)后的MKN-28細(xì)胞凋亡受到抑制。[此處插入細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果圖5，圖注：A：空白對照組；B：陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；C：陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；與空白對照組和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，*P＜0.05]五、討論5.1RNA干擾maspin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡的抑制作用本研究通過構(gòu)建maspin基因的shRNA真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞株MKN-28中，成功實(shí)現(xiàn)了對maspin基因表達(dá)的下調(diào)。在此基礎(chǔ)上，深入探討了maspin基因表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒pGenesil-maspin的MKN-28細(xì)胞中，maspin基因和蛋白的表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡率明顯減少。這一結(jié)果明確表明，maspin基因表達(dá)下調(diào)能夠抑制胃癌細(xì)胞株MKN-28的凋亡。maspin基因作為一種重要的抑癌基因，在正常組織細(xì)胞中，它能夠維持細(xì)胞的正常生理功能，保證細(xì)胞的增殖、分化和凋亡處于平衡狀態(tài)。在腫瘤細(xì)胞中，maspin基因的表達(dá)下調(diào)或缺失，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡機(jī)制受到破壞，腫瘤細(xì)胞獲得生存優(yōu)勢，進(jìn)而異常增殖和擴(kuò)散。本研究中，通過RNA干擾技術(shù)人為地降低maspin基因的表達(dá)，模擬了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中maspin基因低表達(dá)的狀態(tài)，結(jié)果觀察到胃癌細(xì)胞凋亡受到抑制，進(jìn)一步證實(shí)了maspin基因在維持胃癌細(xì)胞正常凋亡過程中的關(guān)鍵作用。從細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制角度來看，細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到多種基因和信號(hào)通路精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜過程。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著核心作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而阻止Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，抑制細(xì)胞凋亡；而Bax是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的表達(dá)水平保持相對平衡，以維持細(xì)胞的正常生存和凋亡狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或發(fā)生病變時(shí)，這種平衡被打破，細(xì)胞凋亡進(jìn)程發(fā)生改變。在本研究中，maspin基因表達(dá)下調(diào)后，Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而Bax基因和蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)。這一變化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值升高，使得細(xì)胞更傾向于存活，凋亡受到抑制。說明maspin基因可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，來影響細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的凋亡。這種抑制作用在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義。腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要因素之一。maspin基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡抑制，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，持續(xù)增殖并形成腫瘤。隨著腫瘤的發(fā)展，凋亡抑制的腫瘤細(xì)胞還可能獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步惡化患者的病情。了解maspin基因表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞凋亡的抑制作用及其分子機(jī)制，為胃癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路?？梢酝ㄟ^恢復(fù)maspin基因的表達(dá)，或者調(diào)節(jié)其下游相關(guān)基因（如Bcl-2和Bax）的表達(dá)，來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療胃癌的目的。5.2作用機(jī)制探討進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果中Bcl-2和Bax基因表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡抑制之間的內(nèi)在聯(lián)系，有助于深入探討RNA干擾maspin基因抑制胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)核心地位，其中Bcl-2作為抗凋亡蛋白，能夠通過多種方式抑制細(xì)胞凋亡。它可以與促凋亡蛋白Bax競爭結(jié)合，阻止Bax在線粒體外膜上形成孔道，從而抑制細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c的釋放是激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)一旦被激活，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入凋亡程序。Bcl-2還可以通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位、抑制活性氧（ROS）的產(chǎn)生等途徑，維持細(xì)胞的生存狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡。Bax則是一種促凋亡蛋白，其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，Bax會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上。在線粒體膜上，Bax可以通過寡聚化形成孔道結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP等結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活Caspase-9，Caspase-9又可以激活下游的Caspase-3等效應(yīng)Caspase，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在本研究中，RNA干擾maspin基因后，胃癌細(xì)胞株MKN-28中Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而Bax基因和蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)。這種變化使得細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值升高，打破了細(xì)胞內(nèi)原有的凋亡平衡。高表達(dá)的Bcl-2能夠更有效地抑制Bax的促凋亡作用，減少細(xì)胞色素c的釋放，從而抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，最終導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡受到抑制。從分子調(diào)控層面來看，maspin基因可能通過直接或間接的方式調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax基因的表達(dá)。一方面，maspin基因可能直接與Bcl-2和Bax基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，或者通過與相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響B(tài)cl-2和Bax基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸過程，從而調(diào)控它們的表達(dá)水平。另一方面，maspin基因可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，間接影響B(tài)cl-2和Bax基因的表達(dá)。PI3K/Akt信號(hào)通路是一條經(jīng)典的細(xì)胞存活信號(hào)通路，激活該通路可以促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，maspin基因可以通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，降低Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)maspin基因表達(dá)被抑制時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路可能被激活，導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡受到抑制。除了Bcl-2和Bax基因，細(xì)胞凋亡還受到其他多種基因和信號(hào)通路的調(diào)控。Caspase家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵的執(zhí)行作用。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白酶，它可以被上游的起始Caspase（如Caspase-8、Caspase-9等）激活，進(jìn)而切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在本研究中，雖然沒有直接檢測Caspase-3的活性，但由于Bcl-2和Bax基因表達(dá)的改變會(huì)影響Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，因此推測maspin基因表達(dá)下調(diào)可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax基因的表達(dá)，間接影響Caspase-3的活性，從而抑制胃癌細(xì)胞凋亡。綜上所述，RNA干擾maspin基因抑制胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能是通過上調(diào)Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax基因和蛋白的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值，抑制細(xì)胞色素c的釋放和Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受到抑制。這一機(jī)制的揭示為深入理解胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的視角，也為胃癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和策略。未來的研究可以進(jìn)一步探討maspin基因與其他凋亡相關(guān)基因和信號(hào)通路之間的相互作用，以及如何通過調(diào)節(jié)這些基因和信號(hào)通路來增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的凋亡敏感性，提高胃癌的治療效果。5.3研究的局限性與展望本研究在揭示RNA干擾maspin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞株MKN-28凋亡影響方面取得了一定成果，但不可避免地存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，僅選擇了胃癌細(xì)胞株MKN-28作為研究對象，雖然該細(xì)胞株在胃癌研究中具有代表性，但單一細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在局限性，無法全面反映maspin基因在不同類型胃癌細(xì)胞中的作用差異。不同的胃癌細(xì)胞株可能具有不同的遺傳背景和生物學(xué)特性，maspin基因在這些細(xì)胞株中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及對細(xì)胞凋亡的影響可能不盡相同。因此，未來研究應(yīng)納入更多種類的胃癌細(xì)胞株，如SGC-7901、BGC-823等，進(jìn)行深入研究，以更全面地了解maspin基因在胃癌中的作用。本研究主要聚焦于maspin基因?qū)cl-2和Bax基因表達(dá)的影響，雖然初步揭示了其可能的作用機(jī)制，但細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及眾多基因和信號(hào)通路的相互作用。maspin基因可能還通過其他途徑或與其他基因協(xié)同作用來調(diào)控胃癌細(xì)胞的凋亡，如與p53基因、NF-κB信號(hào)通路等。本研究未能對這些潛在的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探討，限制了對maspin基因調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的全面理解。在樣本數(shù)量方面，本研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量相對較少，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)效力和可靠性。在后續(xù)研究中，應(yīng)適當(dāng)增加樣本數(shù)量，進(jìn)行多批次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度?？梢栽O(shè)置不同的干擾時(shí)間點(diǎn)和干擾濃度梯度，更全面地分析maspin基因表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)影響。盡管存在上述局限性，本研究為RNA干擾maspin基因在胃癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，也為未來相關(guān)研究指明了方向。在未來的研究中，可以進(jìn)一步探索maspin基因與其他相關(guān)基因之間的相互作用。研究maspin基因與p53基因的協(xié)同作用，p53基因作為一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。探討maspin基因與p53基因在胃癌細(xì)胞凋亡過程中的相互調(diào)節(jié)機(jī)制，可能為揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的線索。研究maspin基因與其他凋亡相關(guān)基因（如Caspase家族成員、Survivin等）之間的關(guān)系，有助于更全面地了解細(xì)胞凋亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步深入研究maspin基因調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路也是未來研究的重點(diǎn)方向。除了本研究中涉及的Bcl-2和Bax相關(guān)信號(hào)通路外，maspin基