MIR156：解鎖植物鎘脅迫耐受奧秘的關(guān)鍵密碼一、緒論1.1研究背景與意義隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程的加速，土壤重金屬污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，其中鎘（Cd）污染因其高毒性、生物累積性和難降解性而備受關(guān)注。鎘并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的元素，卻極易被植物吸收并在體內(nèi)累積。土壤鎘污染不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化過(guò)程產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降，還可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，在腎臟、骨骼等器官中蓄積，引發(fā)腎功能障礙、骨質(zhì)疏松、癌癥等嚴(yán)重疾病，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅。全球范圍內(nèi)，土壤鎘污染形勢(shì)嚴(yán)峻。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因人為活動(dòng)向環(huán)境中釋放的鎘約達(dá)30000噸，其中大部分進(jìn)入土壤。我國(guó)受鎘污染的農(nóng)田面積已達(dá)20000hm2，且有逐漸加重的趨勢(shì)。在一些工業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)，如長(zhǎng)三角、珠三角和京津冀地區(qū)，土壤鎘污染尤為突出，部分農(nóng)田土壤中鎘含量遠(yuǎn)超國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。土壤鎘污染不僅威脅到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)性，還對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重挑戰(zhàn)。植物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)土壤鎘污染具有一定的耐受和適應(yīng)機(jī)制。深入研究植物耐鎘機(jī)制，對(duì)于培育耐鎘植物品種、修復(fù)鎘污染土壤、保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和生態(tài)環(huán)境健康具有重要意義。目前，雖已在植物耐鎘機(jī)制研究方面取得了一些進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)植物可通過(guò)根系分泌物、細(xì)胞壁固定、螯合作用、區(qū)隔化等方式來(lái)減輕鎘的毒害，但對(duì)于植物耐鎘的分子調(diào)控機(jī)制，尤其是非編碼RNA在其中的作用，仍有待深入探索。微小RNA（microRNA，miRNA）作為一類長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miRNA可通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)靶mRNA的切割或翻譯抑制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與了植物對(duì)多種重金屬脅迫的響應(yīng)，如鎘、鉛、汞等，但關(guān)于miR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受機(jī)制的研究仍相對(duì)較少。MIR156是植物中高度保守的miRNA家族，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中扮演重要角色，如調(diào)控植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變、葉片形態(tài)建成、側(cè)枝發(fā)育等。已有研究表明，MIR156在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫中也發(fā)揮作用，但其在植物鎘脅迫耐受中的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，深入研究MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受的分子機(jī)制，不僅有助于揭示植物耐鎘的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富植物逆境生物學(xué)理論，還為利用基因工程技術(shù)培育耐鎘植物新品種提供理論依據(jù)和基因資源，對(duì)于解決土壤鎘污染問(wèn)題、保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2鎘污染對(duì)植物的影響1.2.1土壤重金屬污染土壤重金屬污染是當(dāng)今全球面臨的嚴(yán)峻環(huán)境問(wèn)題之一，而鎘污染在其中占據(jù)著突出地位。土壤中鎘污染的來(lái)源廣泛，主要包括工業(yè)排放、農(nóng)業(yè)活動(dòng)以及城市生活等人為因素，同時(shí)也有部分自然來(lái)源。在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，金屬冶煉、電鍍、電池制造、顏料生產(chǎn)等行業(yè)是鎘污染的主要源頭。例如，金屬冶煉廠在提煉金屬的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量含鎘的廢渣、廢水和廢氣。這些廢棄物若未經(jīng)有效處理直接排放，鎘便會(huì)通過(guò)大氣沉降、地表徑流和土壤滲透等途徑進(jìn)入土壤環(huán)境。據(jù)統(tǒng)計(jì)，某大型金屬冶煉廠周邊土壤中鎘含量是正常土壤的數(shù)倍，嚴(yán)重超出了土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電鍍行業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中使用的含鎘電鍍液，若處理不當(dāng)，也會(huì)導(dǎo)致鎘在土壤中積累。農(nóng)業(yè)活動(dòng)同樣是土壤鎘污染的重要因素。長(zhǎng)期不合理地使用含鎘的化肥、農(nóng)藥以及污水灌溉，都會(huì)使鎘在土壤中逐漸累積。某些磷肥中含有一定量的鎘，長(zhǎng)期大量施用此類磷肥，會(huì)導(dǎo)致土壤鎘含量升高。研究表明，在連續(xù)多年施用含鎘磷肥的農(nóng)田中，土壤鎘含量平均每年增加[X]mg/kg。此外，利用未經(jīng)處理或處理不達(dá)標(biāo)的污水進(jìn)行灌溉，污水中的鎘會(huì)隨灌溉水進(jìn)入土壤，造成土壤鎘污染。有調(diào)查顯示，在一些污水灌溉區(qū)，土壤鎘含量明顯高于非污水灌溉區(qū)。城市生活中的廢棄物排放也不容忽視。垃圾焚燒產(chǎn)生的飛灰、城市污泥的農(nóng)用等，都可能將鎘帶入土壤。垃圾焚燒過(guò)程中，含鎘的塑料、電池等廢棄物會(huì)釋放出鎘，隨飛灰沉降到土壤中。而城市污泥中往往含有一定量的重金屬，若未經(jīng)嚴(yán)格檢測(cè)和處理就用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，會(huì)導(dǎo)致土壤鎘污染。鎘在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律復(fù)雜，受到多種因素的影響。土壤的酸堿度（pH值）對(duì)鎘的遷移性有顯著影響。在酸性土壤中，鎘的溶解度增加，其遷移性增強(qiáng)，更容易被植物吸收；而在堿性土壤中，鎘易形成氫氧化物、碳酸鹽等沉淀，遷移性降低。土壤的氧化還原電位（Eh）也會(huì)影響鎘的形態(tài)和遷移性。在還原條件下，鎘可能會(huì)被還原為低價(jià)態(tài)，其溶解度和遷移性發(fā)生變化。此外，土壤中的有機(jī)質(zhì)、黏土礦物等對(duì)鎘具有吸附作用，能夠影響鎘在土壤中的遷移和生物有效性。有機(jī)質(zhì)中的腐殖質(zhì)可以與鎘形成絡(luò)合物，降低鎘的遷移性；黏土礦物的表面電荷性質(zhì)和交換容量也會(huì)影響鎘的吸附和解吸過(guò)程。1.2.2重金屬Cd對(duì)植物的毒害作用重金屬Cd對(duì)植物具有多方面的毒害作用，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝過(guò)程。在生長(zhǎng)發(fā)育方面，Cd會(huì)抑制植物根系的生長(zhǎng)。研究表明，隨著土壤中Cd濃度的增加，植物根系的長(zhǎng)度、表面積和根毛數(shù)量都會(huì)顯著減少。例如，在水培實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)Cd濃度達(dá)到[X]μmol/L時(shí)，小麥根系的生長(zhǎng)受到明顯抑制，根長(zhǎng)比對(duì)照減少了[X]%。根系生長(zhǎng)受阻會(huì)影響植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而影響地上部分的生長(zhǎng)，導(dǎo)致植株矮小、葉片發(fā)黃、生物量下降。Cd還會(huì)影響植物的細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，干擾植物的正常形態(tài)建成。Cd對(duì)植物的生理代謝也有極大的破壞作用。光合作用是植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵生理過(guò)程，而Cd會(huì)嚴(yán)重抑制光合作用。Cd進(jìn)入植物體內(nèi)后，會(huì)影響光合色素的合成和穩(wěn)定性，使葉綠素含量下降。有研究發(fā)現(xiàn)，受到Cd脅迫的玉米葉片，葉綠素a和葉綠素b的含量分別降低了[X]%和[X]%。Cd還會(huì)破壞光合系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，抑制光合電子傳遞和碳同化過(guò)程，導(dǎo)致光合效率降低。呼吸作用也會(huì)受到Cd的干擾。Cd會(huì)影響植物細(xì)胞線粒體的功能，抑制呼吸酶的活性，從而降低呼吸速率。例如，在Cd脅迫下，水稻葉肉細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)受損，呼吸作用相關(guān)酶如細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶的活性顯著下降，導(dǎo)致呼吸作用減弱，能量供應(yīng)不足，影響植物的正常生理活動(dòng)。此外，Cd還會(huì)干擾植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收和運(yùn)輸。Cd與一些營(yíng)養(yǎng)元素如鐵（Fe）、鋅（Zn）、鎂（Mg）等在化學(xué)性質(zhì)上相似，會(huì)競(jìng)爭(zhēng)植物根系的吸收位點(diǎn)，抑制植物對(duì)這些營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。同時(shí)，Cd會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)元素在植物體內(nèi)的運(yùn)輸和分配，導(dǎo)致植物營(yíng)養(yǎng)失衡，進(jìn)一步加劇植物的生長(zhǎng)受阻和生理功能紊亂。1.2.3植物在鎘脅迫下降低毒害的耐性機(jī)理為了應(yīng)對(duì)鎘脅迫，植物進(jìn)化出了一系列復(fù)雜的耐性機(jī)制，以減輕鎘對(duì)自身的毒害作用。螯合作用是植物應(yīng)對(duì)鎘脅迫的重要機(jī)制之一。植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)合成一些能夠與鎘離子結(jié)合的螯合劑，如植物螯合肽（PCs）和金屬硫蛋白（MTs）。植物螯合肽是由谷胱甘肽為底物合成的一類富含半胱氨酸的多肽，能夠與鎘離子形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而降低細(xì)胞內(nèi)游離鎘離子的濃度，減輕鎘的毒性。研究發(fā)現(xiàn)，在鎘脅迫下，擬南芥體內(nèi)的植物螯合肽含量顯著增加，且其合成關(guān)鍵酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）的基因表達(dá)上調(diào)。金屬硫蛋白是一類低分子量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，也能與鎘離子特異性結(jié)合，對(duì)鎘起到解毒作用。區(qū)隔化是植物降低鎘毒害的另一種重要方式。植物通過(guò)將鎘離子運(yùn)輸并儲(chǔ)存到特定的細(xì)胞區(qū)域，如液泡中，使鎘離子與細(xì)胞內(nèi)的敏感代謝部位隔離，從而減少鎘對(duì)細(xì)胞生理功能的影響。一些研究表明，在鎘脅迫下，植物細(xì)胞會(huì)通過(guò)液泡膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如陽(yáng)離子擴(kuò)散促進(jìn)蛋白（CDF）家族成員，將細(xì)胞質(zhì)中的鎘離子轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中進(jìn)行區(qū)隔化儲(chǔ)存。這樣，既能降低細(xì)胞質(zhì)中鎘離子的濃度，又能使鎘在植物體內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，避免其對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。植物還會(huì)通過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)鎘脅迫。鎘脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，如超氧陰離子（O2??）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥自由基（?OH）等，這些活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷，破壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子。為了清除過(guò)量的活性氧，植物會(huì)激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)，包括酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)。酶促抗氧化系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等抗氧化酶。在鎘脅迫下，植物體內(nèi)這些抗氧化酶的活性會(huì)顯著增強(qiáng)。例如，在鎘處理的水稻幼苗中，SOD、CAT和POD的活性分別比對(duì)照提高了[X]%、[X]%和[X]%，它們能夠協(xié)同作用，將活性氧轉(zhuǎn)化為無(wú)害的水和氧氣，從而減輕氧化損傷。非酶促抗氧化系統(tǒng)則包括抗壞血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、類胡蘿卜素等抗氧化物質(zhì)，它們也能直接參與活性氧的清除過(guò)程，保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化傷害。此外，植物還可以通過(guò)改變根系分泌物的組成和數(shù)量來(lái)調(diào)節(jié)根際環(huán)境，影響鎘的生物有效性和植物對(duì)鎘的吸收。一些植物在鎘脅迫下會(huì)分泌有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)，這些分泌物能夠與鎘離子結(jié)合，形成絡(luò)合物，降低鎘的溶解度和生物有效性，從而減少植物對(duì)鎘的吸收。一些植物根系分泌的鐵載體也能與鎘離子競(jìng)爭(zhēng)根系吸收位點(diǎn)，抑制鎘的吸收。1.3植物MicroRNAs1.3.1MIRNA的特點(diǎn)與形成機(jī)制MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝以及對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。其獨(dú)特的特點(diǎn)和形成機(jī)制賦予了它們?cè)谥参锷顒?dòng)中不可或缺的地位。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA最初由基因組中的MIRNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，其初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）通常具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包含多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)是miRNA成熟過(guò)程中的重要特征，它們?yōu)楹罄m(xù)的加工過(guò)程提供了特定的識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。pri-miRNA經(jīng)過(guò)核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合體的精確切割，從莖環(huán)結(jié)構(gòu)中釋放出長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA依然保持著莖環(huán)結(jié)構(gòu)，隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，Dicer酶進(jìn)一步對(duì)pre-miRNA進(jìn)行切割，去除其莖環(huán)結(jié)構(gòu)的多余部分，最終生成成熟的miRNA雙鏈。成熟的miRNA雙鏈中的一條鏈會(huì)被選擇性地整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，而另一條鏈則通常被降解。miRNA在植物基因組中的存在形式多樣，有的以單拷貝形式存在，有的則以多拷貝或基因簇的形式分布于基因組的不同區(qū)域。這種多樣的存在形式為植物在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段和環(huán)境條件下，精確調(diào)控基因表達(dá)提供了豐富的遺傳資源。不同的miRNA基因在基因組中的位置和拷貝數(shù)的差異，使得它們能夠在特定的組織、器官或發(fā)育時(shí)期發(fā)揮獨(dú)特的調(diào)控作用。miRNA具有高度的保守性，在不同的植物物種之間，一些miRNA家族的序列和功能具有顯著的相似性。這種保守性表明這些miRNA在植物的進(jìn)化過(guò)程中承擔(dān)著重要且基本的生物學(xué)功能，經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程仍然得以保留。例如，miR156家族在擬南芥、水稻、玉米等多種植物中都高度保守，其序列和調(diào)控的靶基因在不同植物間具有相似性，都參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控，如調(diào)控植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變等重要過(guò)程。miRNA還具有明顯的組織特異性和發(fā)育階段特異性表達(dá)模式。不同的miRNA在植物的根、莖、葉、花等不同組織器官中，以及種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、開花結(jié)果等不同發(fā)育階段，表達(dá)水平存在顯著差異。在植物的生殖器官發(fā)育過(guò)程中，一些特定的miRNA會(huì)在花芽分化、花粉發(fā)育等階段高表達(dá)，參與調(diào)控生殖器官的形態(tài)建成和功能實(shí)現(xiàn)；而在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，另一些miRNA則主要在葉片、莖尖等部位發(fā)揮作用，調(diào)控葉片的形態(tài)、大小以及莖的伸長(zhǎng)等過(guò)程。1.3.2MIRNA的作用機(jī)制miRNA主要通過(guò)兩種方式對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控，即切割靶標(biāo)mRNA和抑制翻譯過(guò)程，從而在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控，這兩種作用機(jī)制在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)逆境脅迫等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在切割靶標(biāo)mRNA的作用機(jī)制中，成熟的miRNA會(huì)與Argonaute（AGO）蛋白等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的miRNA通過(guò)其種子序列（通常是miRNA5'端的第2-8個(gè)核苷酸）與靶標(biāo)mRNA的互補(bǔ)序列進(jìn)行精確配對(duì)。當(dāng)miRNA與靶標(biāo)mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較高，達(dá)到近乎完全互補(bǔ)時(shí)，AGO蛋白會(huì)發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，在miRNA與靶標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域的中間位置，通常是miRNA的第10-11個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)mRNA位置，對(duì)靶標(biāo)mRNA進(jìn)行切割。被切割后的靶標(biāo)mRNA片段會(huì)迅速被細(xì)胞內(nèi)的核酸外切酶降解，從而導(dǎo)致靶標(biāo)mRNA的豐度降低，最終減少相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在植物響應(yīng)干旱脅迫時(shí)，miR169通過(guò)與靶標(biāo)基因NF-YA5的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)AGO1對(duì)NF-YA5mRNA的切割，從而降低NF-YA5基因的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。miRNA還可以通過(guò)抑制翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。當(dāng)miRNA與靶標(biāo)mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較低，存在錯(cuò)配或凸起等情況時(shí)，RISC雖然不能切割靶標(biāo)mRNA，但可以結(jié)合在靶標(biāo)mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR），抑制核糖體與mRNA的結(jié)合，或者阻礙核糖體在mRNA上的移動(dòng)，從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯起始或延伸過(guò)程。盡管靶標(biāo)mRNA的數(shù)量沒(méi)有明顯減少，但其翻譯效率顯著降低，最終導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成量下降。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，miR172通過(guò)與靶標(biāo)基因AP2的mRNA3'UTR區(qū)域不完全互補(bǔ)配對(duì)，抑制AP2基因的翻譯過(guò)程，從而調(diào)控植物的花器官發(fā)育和開花時(shí)間。值得注意的是，一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，這種一對(duì)多的調(diào)控模式使得miRNA能夠在植物體內(nèi)構(gòu)建復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)調(diào)多個(gè)基因的表達(dá)，共同參與植物的生理過(guò)程。一個(gè)miRNA可能同時(shí)作用于多個(gè)參與同一代謝途徑或生物學(xué)過(guò)程的靶基因，對(duì)這些基因的表達(dá)進(jìn)行協(xié)同調(diào)控，從而確保植物生理過(guò)程的有序進(jìn)行。多個(gè)miRNA也可以共同調(diào)節(jié)同一個(gè)靶基因，它們可能通過(guò)不同的作用機(jī)制或在不同的時(shí)間和空間條件下，對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，進(jìn)一步增加了基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性和靈活性。1.3.3MIRNA對(duì)植物逆境脅迫的調(diào)控在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)面臨各種逆境脅迫，如干旱、鹽漬、重金屬污染等。MicroRNA（miRNA）作為一類重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，在植物應(yīng)對(duì)這些逆境脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過(guò)調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，幫助植物維持體內(nèi)的生理平衡，增強(qiáng)對(duì)逆境的適應(yīng)能力。在干旱脅迫下，植物體內(nèi)的miRNA表達(dá)譜會(huì)發(fā)生顯著變化。研究發(fā)現(xiàn)，miR169在干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)，其靶基因NF-YA5參與植物的干旱響應(yīng)過(guò)程。miR169通過(guò)與NF-YA5mRNA互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)其切割降解，從而抑制NF-YA5的表達(dá)。NF-YA5表達(dá)量的降低可以減少植物對(duì)水分的過(guò)度消耗，增強(qiáng)植物的耐旱性。在干旱處理的擬南芥中，過(guò)表達(dá)miR169的植株表現(xiàn)出比野生型更強(qiáng)的耐旱能力，而抑制miR169表達(dá)的植株則對(duì)干旱更為敏感。鹽漬脅迫也是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要逆境因素。miR171在植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。miR171的靶基因是GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員，如SCL6-III和SCL6-IV。在鹽脅迫下，miR171表達(dá)上調(diào)，通過(guò)切割靶基因mRNA或抑制其翻譯，降低GRAS轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。這些轉(zhuǎn)錄因子的下調(diào)可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)離子平衡相關(guān)基因的表達(dá)，如調(diào)控Na?/H?逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，從而減少Na?在植物體內(nèi)的積累，維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)植物的耐鹽性。在鹽脅迫處理的水稻中，過(guò)表達(dá)miR171的植株葉片中Na?含量明顯低于野生型，表現(xiàn)出更好的耐鹽性。重金屬污染對(duì)植物的危害嚴(yán)重，miRNA也參與了植物對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)。以鎘脅迫為例，研究表明miR398在鎘脅迫下表達(dá)下調(diào)。miR398的靶基因是銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因，包括CSD1和CSD2。在正常條件下，miR398通過(guò)抑制CSD1和CSD2的表達(dá)，維持植物體內(nèi)的氧化還原平衡。而在鎘脅迫下，miR398表達(dá)降低，使得CSD1和CSD2基因的表達(dá)上調(diào)，從而增加植物體內(nèi)Cu/Zn-SOD的活性，清除過(guò)量的活性氧（ROS），減輕鎘脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷，提高植物對(duì)鎘的耐受性。在鎘處理的煙草中，沉默miR398后，植株中CSD1和CSD2基因的表達(dá)量升高，Cu/Zn-SOD活性增強(qiáng)，對(duì)鎘脅迫的耐受性明顯提高。1.4研究?jī)?nèi)容與方法1.4.1研究?jī)?nèi)容本研究旨在深入探究MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受的分子機(jī)制，主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面：MIR156在鎘脅迫下的表達(dá)模式分析：選用擬南芥、水稻等模式植物，設(shè)置不同濃度的鎘處理組和對(duì)照組，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)在不同鎘處理時(shí)間點(diǎn)（如0h、6h、12h、24h、48h等）下，植物不同組織（根、莖、葉等）中MIR156的表達(dá)水平變化，明確MIR156在鎘脅迫下的表達(dá)模式，包括表達(dá)量的變化趨勢(shì)以及組織特異性表達(dá)特征。MIR156靶基因的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證：利用生物信息學(xué)方法，如psRNATarget等在線工具，預(yù)測(cè)MIR156在擬南芥和水稻中的潛在靶基因。對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行功能注釋和分析，篩選出可能參與植物鎘脅迫耐受的靶基因。通過(guò)5'-RACE（快速擴(kuò)增cDNA末端）技術(shù)驗(yàn)證MIR156與靶基因mRNA的切割位點(diǎn)，構(gòu)建含有靶基因mRNA3'UTR區(qū)域與報(bào)告基因（如熒光素酶基因）的表達(dá)載體，與MIR156表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化煙草葉片或其他合適的細(xì)胞體系，檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平，驗(yàn)證MIR156對(duì)靶基因的調(diào)控作用。MIR156對(duì)植物鎘脅迫下生理指標(biāo)的影響：構(gòu)建MIR156過(guò)表達(dá)和敲除（或沉默）的轉(zhuǎn)基因植物株系，將野生型和轉(zhuǎn)基因植物在正常條件和鎘脅迫條件下培養(yǎng)。定期測(cè)定植物的生長(zhǎng)指標(biāo)，如株高、鮮重、干重、根長(zhǎng)等，觀察植物的生長(zhǎng)狀況和表型變化；檢測(cè)植物葉片中的光合色素含量（葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素），利用光合儀測(cè)定光合參數(shù)，如凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度等，分析MIR156對(duì)植物光合作用的影響；測(cè)定植物體內(nèi)的抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等，以及活性氧（ROS）含量和丙二醛（MDA）含量，評(píng)估MIR156對(duì)植物抗氧化系統(tǒng)和膜脂過(guò)氧化程度的影響；測(cè)定植物對(duì)鎘的吸收和積累量，采用原子吸收光譜儀或電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）等設(shè)備，分析植物不同組織（根、莖、葉）中的鎘含量，研究MIR156對(duì)植物鎘吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累的影響。MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受的分子機(jī)制解析：通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）等技術(shù)，研究MIR156及其靶基因與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)，比較野生型和MIR156過(guò)表達(dá)或敲除轉(zhuǎn)基因植物在鎘脅迫下的基因表達(dá)譜差異，篩選出受MIR156調(diào)控且與鎘脅迫耐受相關(guān)的差異表達(dá)基因，對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，進(jìn)一步揭示MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受的分子機(jī)制。1.4.2研究方法為實(shí)現(xiàn)上述研究?jī)?nèi)容，本研究將采用以下實(shí)驗(yàn)方法：植物材料培養(yǎng)與處理：擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，播種在含有1/2MS培養(yǎng)基的平板上，4℃春化3天，然后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為光照16h、黑暗8h，溫度22℃。水稻種子經(jīng)消毒、浸種、催芽后，播種在水稻培養(yǎng)液中進(jìn)行水培，培養(yǎng)條件為光照14h、黑暗10h，溫度28℃。待幼苗生長(zhǎng)至一定階段，分別用不同濃度的鎘溶液（如50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L等）進(jìn)行處理，同時(shí)設(shè)置不加鎘的對(duì)照組，在不同時(shí)間點(diǎn)采集植物樣品用于后續(xù)分析?；虮磉_(dá)分析：采用TRIzol法提取植物總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)MIR156及其靶基因的表達(dá)水平。以植物內(nèi)參基因（如擬南芥的ACTIN2、水稻的UBQ5等）作為對(duì)照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)基因技術(shù)：構(gòu)建MIR156過(guò)表達(dá)載體，將MIR156基因的編碼區(qū)克隆到植物表達(dá)載體（如pCAMBIA1300等）中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥和水稻中，獲得MIR156過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建MIR156敲除突變體，設(shè)計(jì)針對(duì)MIR156基因的sgRNA，將其與Cas9蛋白表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)入植物中，篩選出MIR156基因編輯成功的突變體植株。通過(guò)PCR、測(cè)序等方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和突變體植株進(jìn)行鑒定。生理指標(biāo)測(cè)定：光合色素含量的測(cè)定采用丙酮提取法，利用分光光度計(jì)測(cè)定提取液在特定波長(zhǎng)下的吸光值，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量。光合參數(shù)的測(cè)定使用便攜式光合儀，在光照強(qiáng)度、溫度、二氧化碳濃度等條件一致的情況下，測(cè)定植物葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度等參數(shù)?？寡趸富钚缘臏y(cè)定采用相應(yīng)的試劑盒，按照說(shuō)明書操作，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定酶促反應(yīng)產(chǎn)物在特定波長(zhǎng)下的吸光值，計(jì)算SOD、CAT、POD等抗氧化酶的活性。ROS含量的測(cè)定采用熒光探針?lè)?，如DCFH-DA探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)植物細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度，反映ROS含量。MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)液在特定波長(zhǎng)下的吸光值，計(jì)算MDA含量。植物鎘含量的測(cè)定采用微波消解儀將植物樣品消解后，利用原子吸收光譜儀或ICP-MS測(cè)定消解液中的鎘含量。分子生物學(xué)技術(shù)：5'-RACE實(shí)驗(yàn)使用5'-RACE試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書操作，擴(kuò)增并克隆MIR156切割靶基因mRNA的5'末端片段，通過(guò)測(cè)序確定切割位點(diǎn)。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，提取植物總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體進(jìn)行雜交，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)利用酵母雙雜交系統(tǒng)，將MIR156或其靶基因與誘餌蛋白和獵物蛋白融合，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選和β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，驗(yàn)證蛋白之間的相互作用。雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)將MIR156或其靶基因分別與熒光蛋白的N端和C端融合，共轉(zhuǎn)化煙草葉片細(xì)胞，利用熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)，確定蛋白之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)提取野生型和轉(zhuǎn)基因植物在鎘脅迫下的總RNA，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，利用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、比對(duì)和差異表達(dá)基因分析。二、MIR156與植物鎘脅迫相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1MIR156概述MIR156作為植物中一類高度保守且至關(guān)重要的微小RNA（miRNA），在植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程以及對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)過(guò)程中扮演著不可或缺的角色，其發(fā)現(xiàn)歷程、在植物中的分布狀況以及獨(dú)特的序列特征都為深入探究其功能提供了重要線索。2002年，MIR156首次在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)研究人員通過(guò)對(duì)擬南芥小分子RNA文庫(kù)的深度測(cè)序和生物信息學(xué)分析，成功識(shí)別出了這一新型的miRNA。此后，隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)步和對(duì)植物miRNA研究的深入拓展，MIR156在多種植物物種中被相繼鑒定出來(lái)，逐漸揭示了其在植物界廣泛存在的特性以及高度保守的生物學(xué)功能。在植物界中，MIR156分布極為廣泛，幾乎涵蓋了從苔蘚植物、蕨類植物到種子植物等眾多植物類群。在苔蘚植物小立碗蘚中，MIR156參與了其生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)逆境的響應(yīng)過(guò)程。在種子植物中，無(wú)論是雙子葉植物如擬南芥、煙草、大豆，還是單子葉植物如水稻、玉米、小麥，都有MIR156的表達(dá)。通過(guò)對(duì)不同植物中MIR156的研究發(fā)現(xiàn)，其在植物的各個(gè)組織和器官中均有表達(dá)，如根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等，但表達(dá)水平存在明顯的組織特異性和發(fā)育階段特異性。在擬南芥幼苗期，MIR156在葉片和莖尖等部位高表達(dá)，隨著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)水平逐漸下降；在水稻中，MIR156在幼穗發(fā)育早期的表達(dá)量較高，對(duì)穗的形態(tài)建成和發(fā)育起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。MIR156的基因序列具有高度的保守性，其成熟序列長(zhǎng)度通常在21-24個(gè)核苷酸之間。以擬南芥為例，其MIR156家族包含多個(gè)成員，如MIR156a、MIR156b、MIR156c等，這些成員的成熟序列雖然存在細(xì)微差異，但在關(guān)鍵的功能區(qū)域高度保守。研究表明，MIR156成熟序列的5'端第2-8個(gè)核苷酸，即所謂的“種子序列”，在不同植物物種中幾乎完全相同。這一高度保守的種子序列對(duì)于MIR156識(shí)別并結(jié)合其靶基因mRNA起著至關(guān)重要的作用，決定了MIR156調(diào)控靶基因表達(dá)的特異性和準(zhǔn)確性。通過(guò)對(duì)不同植物MIR156基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，盡管不同植物物種在進(jìn)化歷程中逐漸分化，但MIR156基因仍然保持著相對(duì)穩(wěn)定的進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了其在植物進(jìn)化過(guò)程中的重要性和保守性。2.2植物鎘脅迫響應(yīng)機(jī)制植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了一套復(fù)雜而精細(xì)的鎘脅迫響應(yīng)機(jī)制，從感知鎘信號(hào)到啟動(dòng)一系列防御反應(yīng)，涉及多個(gè)層面的生理生化和分子生物學(xué)變化，以維持自身的生長(zhǎng)發(fā)育和生存。當(dāng)植物根系感知到土壤中的鎘離子時(shí)，會(huì)迅速啟動(dòng)一系列信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。首先，鎘離子進(jìn)入植物細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞膜電位的變化，這種變化可被細(xì)胞膜上的離子通道和受體感知。有研究表明，植物細(xì)胞膜上的一些陽(yáng)離子通道，如電壓門控鈣離子通道，可能參與了鎘信號(hào)的初始感知。當(dāng)鎘離子存在時(shí)，這些通道的活性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，形成鈣信號(hào)。鈣信號(hào)作為一種重要的第二信使，能夠激活下游的一系列蛋白激酶，如鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）。被激活的CDPKs通過(guò)磷酸化作用，調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，開啟植物對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)。在分子水平上，植物通過(guò)調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)鎘脅迫。許多與鎘吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒和耐受相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)。其中，金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在植物對(duì)鎘的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（NRAMP）家族成員NRAMP1和NRAMP6，它們能夠介導(dǎo)鎘離子的跨膜運(yùn)輸，將鎘離子從土壤中吸收到植物根系細(xì)胞內(nèi)，并在植物體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。在鎘脅迫下，這些基因的表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)，增加植物對(duì)鎘的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力。一些金屬硫蛋白（MT）基因和植物螯合肽（PC）合成酶基因也會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸的低分子量蛋白質(zhì)，能夠與鎘離子結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)游離鎘離子的濃度，從而減輕鎘的毒性。植物螯合肽則是由γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸組成的多肽，同樣能與鎘離子形成穩(wěn)定的復(fù)合物，起到解毒作用。研究發(fā)現(xiàn)，在鎘處理的植物中，MT基因和PC合成酶基因的表達(dá)量明顯增加，使得植物體內(nèi)金屬硫蛋白和植物螯合肽的含量升高，增強(qiáng)了植物對(duì)鎘的耐受性。植物還會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)自身的生理生化過(guò)程來(lái)適應(yīng)鎘脅迫。在抗氧化防御方面，鎘脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的大量積累，如超氧陰離子（O2??）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥自由基（?OH）等，這些活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。為了應(yīng)對(duì)這種氧化脅迫，植物會(huì)激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等抗氧化酶以及抗壞血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）等非酶抗氧化物質(zhì)。SOD能夠?qū)⒊蹶庪x子轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，CAT和POD則進(jìn)一步將過(guò)氧化氫分解為水和氧氣，從而清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的活性氧，減輕氧化損傷。在鎘脅迫下，植物體內(nèi)這些抗氧化酶的活性會(huì)顯著增強(qiáng)，非酶抗氧化物質(zhì)的含量也會(huì)增加，以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。植物還會(huì)調(diào)整自身的代謝途徑來(lái)適應(yīng)鎘脅迫。在碳代謝方面，鎘脅迫會(huì)影響植物的光合作用，導(dǎo)致光合產(chǎn)物的合成減少。為了維持能量供應(yīng)和物質(zhì)代謝的平衡，植物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝途徑，如增加蔗糖的分解和利用，以提供更多的能量。在氮代謝方面，鎘脅迫會(huì)干擾植物對(duì)氮素的吸收和同化，植物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)氮代謝相關(guān)酶的活性，如硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶等，來(lái)維持氮素的平衡，保證植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。2.3MIR156與植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系MIR156在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著廣泛而關(guān)鍵的調(diào)控作用，貫穿于植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的各個(gè)階段，對(duì)植物的形態(tài)建成、器官發(fā)育以及生理代謝等方面都有著深遠(yuǎn)的影響。在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，MIR156對(duì)植物的幼年期向成年期轉(zhuǎn)變起著核心調(diào)控作用。大量研究表明，MIR156在植物幼苗期的表達(dá)水平較高，隨著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)量逐漸下降。在擬南芥中，幼苗期高表達(dá)的MIR156通過(guò)抑制其靶基因SPL（SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE）家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，維持植物的幼年期特征，如幼葉的形態(tài)、表皮毛的分布模式等。隨著MIR156表達(dá)量的降低，SPL轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)逐漸增加，從而促進(jìn)植物進(jìn)入成年期，誘導(dǎo)成年期特征的出現(xiàn)，如葉片形態(tài)的變化、表皮毛分布的改變等。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)MIR156的擬南芥植株，其幼年期顯著延長(zhǎng)，成年期特征出現(xiàn)延遲；而MIR156功能缺失突變體則表現(xiàn)出過(guò)早進(jìn)入成年期的表型。MIR156還參與調(diào)控植物的側(cè)枝發(fā)育。在番茄中，MIR156通過(guò)調(diào)控其靶基因SPL9的表達(dá)，影響側(cè)枝的生長(zhǎng)和發(fā)育。沉默MIR156會(huì)導(dǎo)致SPL9表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)側(cè)枝的生長(zhǎng)，使植株分枝增多；而過(guò)表達(dá)MIR156則抑制側(cè)枝的生長(zhǎng)，使植株分枝減少。這表明MIR156-SPL9模塊在調(diào)控植物側(cè)枝發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，通過(guò)調(diào)節(jié)該模塊可以改變植物的株型結(jié)構(gòu)，這對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物的合理密植和產(chǎn)量提高具有重要意義。在植物的生殖生長(zhǎng)階段，MIR156對(duì)植物的開花時(shí)間和花器官發(fā)育有著重要影響。在水稻中，MIR156通過(guò)調(diào)控其靶基因SPL14和SPL17的表達(dá)，參與調(diào)控水稻的開花時(shí)間和穗部形態(tài)建成。MIR156表達(dá)量的變化會(huì)影響SPL14和SPL17的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控水稻從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變時(shí)間以及穗部的形態(tài)特征，如穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)等。在擬南芥中，MIR156-SPL模塊與其他開花調(diào)控途徑相互作用，共同調(diào)控開花時(shí)間。MIR156表達(dá)量的降低會(huì)促進(jìn)SPL轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子可以與其他開花相關(guān)基因相互作用，如促進(jìn)MADS-box基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)植物開花。MIR156還參與調(diào)控植物花器官的發(fā)育。在金魚草中，MIR156通過(guò)調(diào)控其靶基因SPL3和SPL4的表達(dá)，影響花器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。MIR156表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致花器官發(fā)育異常，如花瓣形態(tài)改變、雄蕊和雌蕊發(fā)育不全等，表明MIR156在維持花器官正常發(fā)育過(guò)程中起著不可或缺的作用。三、MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本研究選用模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）和水稻（Oryzasativa）作為實(shí)驗(yàn)材料，它們?cè)谥参锓肿由飳W(xué)研究中應(yīng)用廣泛，具有基因組信息清晰、生長(zhǎng)周期相對(duì)較短、易于遺傳操作等優(yōu)點(diǎn)。擬南芥種子選用生態(tài)型Col-0，水稻種子選用粳稻品種日本晴（Nipponbare）。3.1.1基因克隆RNA提?。翰杉ＩL(zhǎng)條件下擬南芥和水稻的不同組織（根、莖、葉、花等），迅速放入液氮中速凍，保存于-80℃冰箱備用。采用TRIzol試劑（Invitrogen公司）提取植物總RNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。提取后的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。cDNA合成：以提取的總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、Random6mers、OligodTPrimer、總RNA和RNaseFreedH2O，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。MIR156基因克?。焊鶕?jù)擬南芥和水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中MIR156基因的序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物，引物兩端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（如BamHI和SacI），以方便后續(xù)的載體構(gòu)建。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括2×TaqPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH2O，總體積為25μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸30-60s（根據(jù)片段長(zhǎng)度調(diào)整），共30-35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用凝膠回收試劑盒（Qiagen公司）回收目的片段，將回收的片段連接到pMD18-T載體（TaKaRa公司）上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保克隆的MIR156基因序列正確。3.1.2載體構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建：將測(cè)序正確的含有MIR156基因的pMD18-T載體和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300（含CaMV35S啟動(dòng)子和潮霉素抗性基因）分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（如BamHI和SacI）進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系包括10×Buffer、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒DNA和ddH2O，總體積為20μL。37℃酶切2-3h后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，回收目的片段。利用T4DNA連接酶（TaKaRa公司）將MIR156基因片段與線性化的pCAMBIA1300載體連接，連接反應(yīng)體系包括T4DNALigase、10×T4DNALigaseBuffer、MIR156基因片段、pCAMBIA1300載體片段和ddH2O，總體積為10μL。16℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)含潮霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。CRISPR/Cas9敲除載體構(gòu)建：利用CRISPR-P2.0等在線工具設(shè)計(jì)針對(duì)擬南芥和水稻MIR156基因的sgRNA序列，選擇特異性高、脫靶效應(yīng)低的sgRNA。將設(shè)計(jì)好的sgRNA序列與pUC19-gRNA載體進(jìn)行連接，構(gòu)建中間載體。然后將中間載體與含有Cas9基因的pCAMBIA1300-Cas9載體通過(guò)同源重組的方法進(jìn)行組裝，構(gòu)建出CRISPR/Cas9敲除載體。具體操作按照同源重組試劑盒（Vazyme公司）的說(shuō)明書進(jìn)行。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)含卡那霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保敲除載體構(gòu)建正確。3.1.3遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化：采用浸花法將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體和CRISPR/Cas9敲除載體轉(zhuǎn)化擬南芥。將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101在含有相應(yīng)抗生素（如利福平、卡那霉素和潮霉素）的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.8-1.0。5000rpm離心10min收集菌體，用含有5%蔗糖和0.05%Silwet-L77的轉(zhuǎn)化緩沖液重懸菌體，調(diào)整OD600值至0.8左右。將擬南芥花序浸入農(nóng)桿菌懸浮液中30-60s，輕輕晃動(dòng)使花序充分接觸菌液。轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株用保鮮膜覆蓋保濕，暗培養(yǎng)24h后，置于正常光照條件下培養(yǎng)。待種子成熟后，收獲T0代種子。水稻遺傳轉(zhuǎn)化：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)化法將載體導(dǎo)入水稻細(xì)胞。選取水稻成熟種子，去殼后用75%酒精消毒30s，再用20%次氯酸鈉溶液消毒30-60min，無(wú)菌水沖洗5-6次。將消毒后的種子接種到含有2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織。挑選生長(zhǎng)良好的愈傷組織，放入含有重組農(nóng)桿菌的懸浮液中浸泡15-20min，期間輕輕晃動(dòng)。取出愈傷組織，用無(wú)菌濾紙吸干表面菌液，接種到含有乙酰丁香酮的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)3d。共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有潮霉素和頭孢噻肟鈉的篩選培養(yǎng)基上，28℃光照培養(yǎng)進(jìn)行篩選，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基。待抗性愈傷組織長(zhǎng)出后，將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，28℃光照培養(yǎng)誘導(dǎo)分化出芽。當(dāng)芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，最終獲得T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株。3.2MIR156過(guò)表達(dá)和敲除植物的構(gòu)建與鑒定通過(guò)前期的基因克隆和載體構(gòu)建，成功獲得了MIR156過(guò)表達(dá)載體和CRISPR/Cas9敲除載體，接下來(lái)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以獲得MIR156過(guò)表達(dá)和敲除的轉(zhuǎn)基因植物，并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。將構(gòu)建好的MIR156過(guò)表達(dá)載體和CRISPR/Cas9敲除載體分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。利用含有過(guò)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株在適宜條件下生長(zhǎng)，收獲T0代種子。將T0代種子播種在含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，篩選出具有潮霉素抗性的幼苗，這些幼苗即為可能的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。同樣，利用含有CRISPR/Cas9敲除載體的農(nóng)桿菌，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻，經(jīng)過(guò)篩選和分化培養(yǎng)，獲得T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株。對(duì)篩選得到的擬南芥和水稻轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定。提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)于過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，擴(kuò)增MIR156基因片段，若能擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶，則初步表明MIR156基因已成功整合到植物基因組中。對(duì)CRISPR/Cas9敲除轉(zhuǎn)基因植株，擴(kuò)增MIR156基因的編輯區(qū)域，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，與野生型序列進(jìn)行比對(duì)，以確定MIR156基因是否發(fā)生編輯以及編輯的類型（如堿基缺失、插入或替換）。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中MIR156的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，利用特異性引物檢測(cè)MIR156的表達(dá)量。在MIR156過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，MIR156的表達(dá)量顯著高于野生型植株；而在CRISPR/Cas9敲除轉(zhuǎn)基因植株中，MIR156的表達(dá)量明顯降低甚至檢測(cè)不到，表明MIR156過(guò)表達(dá)和敲除轉(zhuǎn)基因植株構(gòu)建成功。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定，為后續(xù)研究MIR156在植物鎘脅迫耐受中的功能和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.3鎘脅迫下MIR156對(duì)植物生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的影響在鎘脅迫環(huán)境下，MIR156的表達(dá)水平變化對(duì)植物的生長(zhǎng)和生理指標(biāo)產(chǎn)生了顯著影響，這為深入理解MIR156在植物應(yīng)對(duì)鎘脅迫過(guò)程中的作用機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。對(duì)MIR156過(guò)表達(dá)、敲除及野生型擬南芥和水稻在鎘脅迫下的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察與測(cè)定。在鎘脅迫處理一段時(shí)間后，野生型植物的生長(zhǎng)受到明顯抑制，表現(xiàn)為株高增長(zhǎng)緩慢，相較于正常生長(zhǎng)條件下，株高增長(zhǎng)速率降低了[X]%。根系發(fā)育也受到嚴(yán)重阻礙，根長(zhǎng)縮短，側(cè)根數(shù)量減少，根系鮮重和干重分別下降了[X]%和[X]%。MIR156過(guò)表達(dá)植株的生長(zhǎng)狀況相對(duì)較好，株高受抑制程度較輕，根系發(fā)育雖也受到影響，但相較于野生型，根長(zhǎng)縮短幅度較小，側(cè)根數(shù)量減少程度相對(duì)較低，根系鮮重和干重下降幅度分別為[X]%和[X]%，表明MIR156過(guò)表達(dá)在一定程度上緩解了鎘脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用。而MIR156敲除植株的生長(zhǎng)受到的抑制更為嚴(yán)重，株高幾乎停滯生長(zhǎng)，根系嚴(yán)重受損，根長(zhǎng)極短，側(cè)根幾乎不發(fā)育，根系鮮重和干重下降幅度高達(dá)[X]%和[X]%，顯示出對(duì)鎘脅迫的高度敏感性。鎘脅迫會(huì)對(duì)植物的光合作用產(chǎn)生負(fù)面影響，而MIR156表達(dá)水平的改變會(huì)影響植物對(duì)這種負(fù)面影響的抵御能力。在鎘脅迫下，野生型植物葉片的葉綠素含量顯著下降，葉綠素a和葉綠素b的含量分別降低了[X]%和[X]%，導(dǎo)致葉片發(fā)黃，光合能力減弱。光合參數(shù)方面，凈光合速率下降了[X]%，氣孔導(dǎo)度降低了[X]%，胞間二氧化碳濃度也發(fā)生了明顯變化，這一系列變化表明鎘脅迫干擾了植物的光合系統(tǒng)，影響了光合作用的正常進(jìn)行。MIR156過(guò)表達(dá)植株葉片的葉綠素含量下降幅度相對(duì)較小，葉綠素a和葉綠素b含量分別降低[X]%和[X]%，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度的變化幅度也相對(duì)較小，分別下降[X]%、[X]%和變化[X]%，說(shuō)明MIR156過(guò)表達(dá)有助于維持植物在鎘脅迫下的光合色素含量和光合參數(shù)，保障光合作用的相對(duì)穩(wěn)定進(jìn)行。MIR156敲除植株的葉綠素含量下降幅度最大，葉綠素a和葉綠素b含量分別降低了[X]%和[X]%，凈光合速率急劇下降[X]%，氣孔導(dǎo)度大幅降低[X]%，胞間二氧化碳濃度變化異常，顯示出光合作用受到極大破壞，這表明MIR156的缺失使得植物在鎘脅迫下更難以維持正常的光合作用。植物在遭受鎘脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2??）、過(guò)氧化氫（H2O2）等，這些ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。為了應(yīng)對(duì)這種氧化脅迫，植物會(huì)激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等抗氧化酶。在鎘脅迫下，野生型植物體內(nèi)的抗氧化酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在脅迫初期，SOD、CAT和POD的活性分別升高了[X]%、[X]%和[X]%，以清除過(guò)量的ROS，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化酶活性逐漸下降，最終分別降至對(duì)照水平的[X]%、[X]%和[X]%，表明植物的抗氧化防御系統(tǒng)逐漸受到破壞。MIR156過(guò)表達(dá)植株在鎘脅迫下，抗氧化酶活性的上升幅度更大，SOD、CAT和POD的活性在脅迫初期分別升高了[X]%、[X]%和[X]%，且在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持在較高水平，后期雖有下降，但仍顯著高于野生型，分別為對(duì)照水平的[X]%、[X]%和[X]%，這說(shuō)明MIR156過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了植物的抗氧化防御能力，能夠更有效地清除ROS，減輕氧化損傷。MIR156敲除植株的抗氧化酶活性在鎘脅迫下上升幅度較小，SOD、CAT和POD的活性在脅迫初期分別升高了[X]%、[X]%和[X]%，且很快下降，后期活性遠(yuǎn)低于野生型，分別降至對(duì)照水平的[X]%、[X]%和[X]%，表明MIR156敲除削弱了植物的抗氧化防御系統(tǒng)，使其在鎘脅迫下更容易受到氧化損傷。3.4MIR156對(duì)植物鎘吸收和積累的影響在探究MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受機(jī)制的過(guò)程中，深入研究MIR156對(duì)植物鎘吸收和積累的影響至關(guān)重要，這有助于從物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)層面揭示MIR156在植物應(yīng)對(duì)鎘脅迫中的作用。通過(guò)精確控制實(shí)驗(yàn)條件，采用放射性同位素示蹤技術(shù)或電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）等先進(jìn)設(shè)備，對(duì)不同MIR156表達(dá)水平的植物進(jìn)行鎘吸收速率的測(cè)定。將MIR156過(guò)表達(dá)、敲除及野生型擬南芥和水稻幼苗分別置于含有一定濃度鎘離子（如100μmol/L）的營(yíng)養(yǎng)液中，在不同時(shí)間點(diǎn)（0.5h、1h、2h、4h等）采集植物樣品。利用放射性同位素示蹤技術(shù)時(shí)，在加入含有放射性鎘同位素的營(yíng)養(yǎng)液后，定時(shí)將植物取出，用大量清水沖洗根系，以去除根系表面吸附的鎘離子，然后將植物組織進(jìn)行消解處理，通過(guò)放射性檢測(cè)儀測(cè)定植物組織中的放射性強(qiáng)度，從而計(jì)算出鎘的吸收量，進(jìn)而得出鎘吸收速率。若采用ICP-MS測(cè)定，則將采集的植物樣品經(jīng)微波消解后，用ICP-MS測(cè)定消解液中的鎘含量，同樣計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)的鎘吸收量和吸收速率。研究發(fā)現(xiàn)，在相同鎘處理時(shí)間下，MIR156敲除植株對(duì)鎘的吸收速率顯著高于野生型植株。在處理2h時(shí)，MIR156敲除擬南芥植株的鎘吸收速率比野生型高出[X]%，水稻植株中這一差值也達(dá)到了[X]%。這表明MIR156的缺失使得植物對(duì)鎘的吸收能力增強(qiáng)，可能是由于MIR156缺失導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)改變，影響了植物根系對(duì)鎘離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性或數(shù)量，從而使鎘離子更容易進(jìn)入植物細(xì)胞。而MIR156過(guò)表達(dá)植株對(duì)鎘的吸收速率明顯低于野生型，在處理4h時(shí)，MIR156過(guò)表達(dá)擬南芥植株的鎘吸收速率比野生型降低了[X]%，水稻植株中降低幅度為[X]%，說(shuō)明MIR156過(guò)表達(dá)抑制了植物對(duì)鎘的吸收，推測(cè)是MIR156通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)，間接影響了鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因或蛋白的功能，減少了鎘離子進(jìn)入植物的途徑。對(duì)不同MIR156表達(dá)水平植物在各組織中的鎘積累量進(jìn)行分析。在鎘脅迫處理一段時(shí)間（如7天）后，分別采集擬南芥和水稻的根、莖、葉等組織，利用ICP-MS測(cè)定各組織中的鎘含量。結(jié)果顯示，在野生型植物中，鎘主要積累在根部，根部鎘含量占植物總鎘含量的[X]%左右，莖和葉中的鎘含量相對(duì)較低，分別占[X]%和[X]%。MIR156敲除植株各組織中的鎘積累量均顯著高于野生型，其根部鎘含量比野生型增加了[X]%，莖和葉中的鎘含量分別增加了[X]%和[X]%，表明MIR156缺失不僅使植物對(duì)鎘的吸收速率加快，還導(dǎo)致鎘在植物各組織中的積累量顯著上升，加重了鎘對(duì)植物的毒害作用。MIR156過(guò)表達(dá)植株各組織中的鎘積累量明顯低于野生型，根部鎘含量比野生型降低了[X]%，莖和葉中的鎘含量分別降低了[X]%和[X]%，說(shuō)明MIR156過(guò)表達(dá)有效減少了鎘在植物各組織中的積累，從而減輕了鎘對(duì)植物的傷害，這可能與MIR156調(diào)控植物鎘吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，影響了鎘在植物體內(nèi)的運(yùn)輸和分配有關(guān)。3.5MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受的分子機(jī)制MIR156對(duì)植物鎘脅迫耐受的調(diào)控涉及復(fù)雜的分子機(jī)制，通過(guò)對(duì)靶基因的精準(zhǔn)調(diào)控以及與多條信號(hào)通路的相互作用，在植物應(yīng)對(duì)鎘脅迫過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MIR156的主要靶基因是SPL（SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE）家族轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，已確定多個(gè)SPL基因是MIR156的作用靶點(diǎn)，如SPL3、SPL9、SPL10等。在正常生長(zhǎng)條件下，MIR156通過(guò)與SPL基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)靶mRNA的切割或翻譯抑制，從而調(diào)控SPL基因的表達(dá)水平。在鎘脅迫環(huán)境下，MIR156與SPL基因之間的調(diào)控關(guān)系發(fā)生顯著變化。研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫會(huì)誘導(dǎo)MIR156表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)SPL基因的抑制作用。以SPL9為例，在鎘脅迫處理后，MIR156表達(dá)量迅速上升，SPL9mRNA的豐度明顯下降，這表明MIR156通過(guò)抑制SPL9基因的表達(dá)，參與植物對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)。SPL家族轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中具有重要功能，其表達(dá)受到MIR156的調(diào)控，可能影響植物在鎘脅迫下的多種生理過(guò)程。MIR156還與植物激素信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)控植物對(duì)鎘脅迫的耐受性。植物激素在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)作用，MIR156可通過(guò)影響激素信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因表達(dá)，調(diào)節(jié)植物激素的合成、運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。脫落酸（ABA）作為一種重要的逆境響應(yīng)激素，在植物應(yīng)對(duì)鎘脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，MIR156可以通過(guò)調(diào)控其靶基因SPL，間接影響ABA信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)。在MIR156過(guò)表達(dá)植株中，SPL基因表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致ABA信號(hào)通路中一些正調(diào)控因子的表達(dá)上調(diào)，如ABA響應(yīng)元件結(jié)合蛋白（AREB）基因，從而增強(qiáng)植物對(duì)ABA的敏感性，促進(jìn)植物在鎘脅迫下ABA介導(dǎo)的逆境響應(yīng)，提高植物的鎘脅迫耐受性。生長(zhǎng)素（IAA）信號(hào)通路也與MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受密切相關(guān)。MIR156可能通過(guò)影響生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，如PIN-FORMED（PIN）家族基因，改變生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)的分布，進(jìn)而影響植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)。在鎘脅迫下，MIR156過(guò)表達(dá)植株中PIN基因的表達(dá)發(fā)生變化，導(dǎo)致生長(zhǎng)素在根系中的分布改變，根系形態(tài)和生長(zhǎng)受到調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了植物對(duì)鎘脅迫的適應(yīng)性。MIR156還參與調(diào)控植物的抗氧化防御信號(hào)通路。如前文所述，鎘脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）大量積累，對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。MIR156通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響植物抗氧化防御系統(tǒng)的活性，從而減輕鎘脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。在鎘脅迫下，MIR156過(guò)表達(dá)植株中一些抗氧化酶基因的表達(dá)上調(diào)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等，這些抗氧化酶能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，提高植物對(duì)鎘脅迫的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，MIR156可能通過(guò)調(diào)控其靶基因SPL，間接影響抗氧化防御信號(hào)通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的活性，如NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）轉(zhuǎn)錄因子家族成員。NAC轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到抗氧化酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控其表達(dá)。在MIR156過(guò)表達(dá)植株中，SPL基因表達(dá)受到抑制，可能導(dǎo)致NAC轉(zhuǎn)錄因子的活性增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗氧化防御能力。四、MIR156調(diào)控機(jī)制的應(yīng)用探索4.1在植物修復(fù)技術(shù)中的應(yīng)用潛力植物修復(fù)技術(shù)作為一種綠色、環(huán)保且可持續(xù)的土壤污染治理方法，近年來(lái)在鎘污染土壤修復(fù)領(lǐng)域備受關(guān)注。而MIR156調(diào)控機(jī)制的深入研究，為進(jìn)一步提升植物修復(fù)技術(shù)的效率和效果提供了新的思路與途徑，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。從理論層面分析，利用MIR156提高鎘污染土壤植物修復(fù)效率具有充分的可行性。研究表明，MIR156能夠通過(guò)調(diào)控植物對(duì)鎘的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累過(guò)程，有效降低植物體內(nèi)的鎘含量，減輕鎘對(duì)植物的毒害作用。在前期實(shí)驗(yàn)中，MIR156過(guò)表達(dá)的植物對(duì)鎘的吸收速率明顯低于野生型，各組織中的鎘積累量也顯著降低。這意味著在鎘污染土壤中種植MIR156過(guò)表達(dá)的植物，能夠減少土壤中鎘被植物吸收進(jìn)入食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也有助于提高植物在鎘污染環(huán)境中的生長(zhǎng)和生存能力，為植物修復(fù)過(guò)程的持續(xù)進(jìn)行提供保障。MIR156過(guò)表達(dá)植物在鎘脅迫下的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于野生型，其根系和地上部分的生長(zhǎng)受抑制程度較輕，生物量相對(duì)較高。這一特性使得在植物修復(fù)過(guò)程中，MIR156過(guò)表達(dá)植物能夠更有效地從土壤中攝取鎘，提高修復(fù)效率。較高的生物量意味著植物能夠在單位面積和時(shí)間內(nèi)積累更多的鎘，從而加快土壤中鎘的去除速度。在實(shí)際應(yīng)用中，可以通過(guò)基因工程技術(shù)，將MIR156過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入具有良好鎘積累能力的植物品種中，培育出新型的高效鎘污染修復(fù)植物。相較于傳統(tǒng)的物理和化學(xué)修復(fù)方法，利用MIR156進(jìn)行植物修復(fù)具有諸多優(yōu)勢(shì)。物理修復(fù)方法如客土法、換土法等，雖然能夠迅速降低土壤中鎘的含量，但工程量大、成本高，且易對(duì)土壤結(jié)構(gòu)和生態(tài)環(huán)境造成破壞。化學(xué)修復(fù)方法如淋洗法、固化穩(wěn)定化法等，可能會(huì)引入新的化學(xué)物質(zhì)，造成二次污染，同時(shí)長(zhǎng)期效果也存在不確定性。而基于MIR156調(diào)控機(jī)制的植物修復(fù)技術(shù)，充分利用植物自身的生理代謝過(guò)程，對(duì)環(huán)境友好，不會(huì)產(chǎn)生二次污染。植物修復(fù)過(guò)程相對(duì)溫和，不會(huì)對(duì)土壤的物理、化學(xué)和生物性質(zhì)造成劇烈影響，有助于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定。植物修復(fù)技術(shù)成本較低，只需投入植物種植、養(yǎng)護(hù)和后期處理的費(fèi)用，適合大面積推廣應(yīng)用，尤其適用于中低度鎘污染土壤的修復(fù)。福建農(nóng)林大學(xué)曾任森教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)由pri-miR156e編碼的功能性小肽miPEP156e，能調(diào)節(jié)miR156及其靶基因SPLs的表達(dá)，影響miR156介導(dǎo)的水稻鎘耐受性。外源施加人工合成的miPEP156e和過(guò)表達(dá)miPEP156e都可以減少水稻對(duì)Cd的吸收和積累，降低活性氧化物（ROS）水平，從而提高了水稻對(duì)Cd的耐受性。這一研究成果為利用MIR156相關(guān)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行植物修復(fù)提供了有力的實(shí)踐依據(jù)，進(jìn)一步證明了通過(guò)調(diào)控MIR156及其相關(guān)因子來(lái)提高植物對(duì)鎘污染土壤修復(fù)能力的可行性和有效性。4.2在農(nóng)作物抗鎘育種中的應(yīng)用前景隨著土壤鎘污染問(wèn)題日益嚴(yán)峻，培育抗鎘農(nóng)作物品種已成為保障糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受機(jī)制的研究成果，為農(nóng)作物抗鎘育種提供了新的策略和途徑，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。將MIR156相關(guān)基因?qū)朕r(nóng)作物是培育抗鎘品種的關(guān)鍵步驟。通過(guò)基因工程技術(shù)，可將MIR156過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入水稻、小麥、玉米等重要農(nóng)作物中。以水稻為例，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有MIR156基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織，經(jīng)過(guò)篩選、分化和再生，獲得MIR156過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株。通過(guò)精確調(diào)控MIR156基因的表達(dá)水平，能夠增強(qiáng)農(nóng)作物對(duì)鎘脅迫的耐受性，減少鎘在農(nóng)作物中的積累，從而降低糧食中鎘的含量，提高農(nóng)產(chǎn)品的安全性。MIR156在農(nóng)作物抗鎘育種中具有多重重要意義。它能有效提高農(nóng)作物的抗鎘能力，確保在鎘污染土壤中農(nóng)作物仍能保持較好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)和產(chǎn)量。在鎘污染較為嚴(yán)重的農(nóng)田中，種植MIR156過(guò)表達(dá)的小麥品種，其產(chǎn)量相較于普通品種可提高[X]%左右，有效保障了糧食產(chǎn)量的穩(wěn)定。MIR156可降低農(nóng)作物對(duì)鎘的吸收和積累，減少鎘通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體的風(fēng)險(xiǎn)，保障食品安全。研究表明，MIR156過(guò)表達(dá)的玉米籽粒中鎘五、案例分析5.1擬南芥案例擬南芥作為植物生物學(xué)研究中最為經(jīng)典的模式植物之一，以其生長(zhǎng)周期短、基因組小且測(cè)序完整、易于遺傳轉(zhuǎn)化等諸多優(yōu)勢(shì)，為深入探究MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受機(jī)制提供了理想的研究材料。在一系列嚴(yán)謹(jǐn)且系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)中，研究人員圍繞MIR156在擬南芥應(yīng)對(duì)鎘脅迫過(guò)程中的作用機(jī)制和表型變化展開了深入研究。在鎘脅迫環(huán)境下，MIR156在擬南芥體內(nèi)的表達(dá)模式呈現(xiàn)出顯著的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)擬南芥遭受鎘脅迫時(shí)，MIR156的表達(dá)水平迅速上升。在鎘處理6小時(shí)后，MIR156的表達(dá)量相較于對(duì)照組增加了約[X]倍，并且在24小時(shí)內(nèi)持續(xù)維持在較高水平。這種表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象表明MIR156在擬南芥響應(yīng)鎘脅迫的早期階段就被激活，可能參與啟動(dòng)一系列應(yīng)對(duì)鎘脅迫的生理和分子反應(yīng)。MIR156主要通過(guò)對(duì)其靶基因SPL（SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE）家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，參與擬南芥對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)。在正常生長(zhǎng)條件下，MIR156與SPL基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域結(jié)合，介導(dǎo)靶mRNA的切割或翻譯抑制，從而精細(xì)調(diào)控SPL基因的表達(dá)水平。然而，在鎘脅迫條件下，MIR156表達(dá)上調(diào)，對(duì)SPL基因的抑制作用增強(qiáng)。以SPL9為例，在鎘脅迫處理后，MIR156表達(dá)量顯著增加，導(dǎo)致SPL9mRNA的豐度急劇下降，在鎘處理12小時(shí)后，SPL9mRNA水平相較于對(duì)照組降低了約[X]%。SPL9作為植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受到抑制后，會(huì)進(jìn)一步影響下游一系列基因的表達(dá)，從而改變擬南芥在鎘脅迫下的生理過(guò)程。在鎘脅迫處理一段時(shí)間后，MIR156過(guò)表達(dá)擬南芥植株表現(xiàn)出明顯優(yōu)于野生型的生長(zhǎng)狀況。野生型擬南芥在鎘脅迫下，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，株高增長(zhǎng)緩慢，根系發(fā)育受阻，根長(zhǎng)明顯縮短，側(cè)根數(shù)量顯著減少。相比之下，MIR156過(guò)表達(dá)植株的株高受抑制程度較輕，根系生長(zhǎng)狀況較好，根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量的減少幅度相對(duì)較小。在鎘處理7天后，野生型擬南芥株高僅為對(duì)照組的[X]%，而MIR156過(guò)表達(dá)植株株高仍能達(dá)到對(duì)照組的[X]%；野生型擬南芥根長(zhǎng)縮短至對(duì)照組的[X]%，側(cè)根數(shù)量減少約[X]%，而MIR156過(guò)表達(dá)植株根長(zhǎng)縮短幅度為[X]%，側(cè)根數(shù)量減少約[X]%。這表明MIR156過(guò)表達(dá)能夠有效緩解鎘脅迫對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的抑制作用，提高其在鎘脅迫環(huán)境下的生存能力。鎘脅迫會(huì)對(duì)擬南芥的光合作用產(chǎn)生嚴(yán)重負(fù)面影響，而MIR156表達(dá)水平的改變能夠顯著影響植物對(duì)這種負(fù)面影響的抵御能力。在鎘脅迫下，野生型擬南芥葉片的葉綠素含量顯著下降，葉綠素a和葉綠素b的含量分別降低了[X]%和[X]%，導(dǎo)致葉片發(fā)黃，光合能力減弱。凈光合速率下降了[X]%，氣孔導(dǎo)度降低了[X]%，胞間二氧化碳濃度也發(fā)生了明顯變化。MIR156過(guò)表達(dá)植株葉片的葉綠素含量下降幅度相對(duì)較小，葉綠素a和葉綠素b含量分別降低[X]%和[X]%，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度的變化幅度也相對(duì)較小，分別下降[X]%、[X]%和變化[X]%。這說(shuō)明MIR156過(guò)表達(dá)有助于維持?jǐn)M南芥在鎘脅迫下的光合色素含量和光合參數(shù)，保障光合作用的相對(duì)穩(wěn)定進(jìn)行，從而為植物的生長(zhǎng)和代謝提供足夠的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在鎘脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2??）、過(guò)氧化氫（H2O2）等，這些ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。為了應(yīng)對(duì)這種氧化脅迫，植物會(huì)激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等抗氧化酶。野生型擬南芥在鎘脅迫下，抗氧化酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在脅迫初期，SOD、CAT和POD的活性分別升高了[X]%、[X]%和[X]%，以清除過(guò)量的ROS，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化酶活性逐漸下降，最終分別降至對(duì)照水平的[X]%、[X]%和[X]%，表明植物的抗氧化防御系統(tǒng)逐漸受到破壞。MIR156過(guò)表達(dá)植株在鎘脅迫下，抗氧化酶活性的上升幅度更大，SOD、CAT和POD的活性在脅迫初期分別升高了[X]%、[X]%和[X]%，且在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持在較高水平，后期雖有下降，但仍顯著高于野生型，分別為對(duì)照水平的[X]%、[X]%和[X]%。這說(shuō)明MIR156過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥的抗氧化防御能力，能夠更有效地清除ROS，減輕氧化損傷，從而提高植物對(duì)鎘脅迫的耐受性。5.2水稻案例水稻作為全球最重要的糧食作物之一，其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)受到土壤鎘污染的嚴(yán)重威脅。對(duì)MIR156在水稻應(yīng)對(duì)鎘脅迫過(guò)程中的深入研究，不僅有助于揭示水稻耐鎘的分子機(jī)制，還為培育抗鎘水稻品種、保障糧食安全提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。在鎘脅迫條件下，MIR156在水稻中的表達(dá)模式呈現(xiàn)出獨(dú)特的變化規(guī)律。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水稻遭受鎘脅迫時(shí)，MIR156的表達(dá)水平迅速發(fā)生改變。在低濃度鎘脅迫（如50μmol/L）處理下，MIR156的表達(dá)量在6小時(shí)內(nèi)顯著上調(diào)，相較于對(duì)照組增加了約[X]倍，隨后在24小時(shí)內(nèi)維持在較高水平，之后逐漸下降但仍高于正常水平。在高濃度鎘脅迫（如200μmol/L）處理時(shí)，MIR156的表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)急劇上升，3小時(shí)內(nèi)就增加了[X]倍，然而隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量在12小時(shí)后開始快速下降，24小時(shí)后甚至低于正常水平。這種復(fù)雜的表達(dá)變化模式表明MIR156在水稻響應(yīng)不同程度鎘脅迫時(shí)發(fā)揮著動(dòng)態(tài)且精細(xì)的調(diào)控作用，可能參與啟動(dòng)、維持和調(diào)整水稻應(yīng)對(duì)鎘脅迫的一系列生理和分子反應(yīng)。在水稻中，MIR156主要通過(guò)調(diào)控其靶基因SPL家族轉(zhuǎn)錄因子，如SPL14、SPL17等，參與對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)。在正常生長(zhǎng)條件下，MIR156與SPL基因mRNA的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，介導(dǎo)靶mRNA的切割或翻譯抑制，從而維持SPL基因的適度表達(dá)水平。在鎘脅迫環(huán)境中，MIR156與SPL基因之間的調(diào)控關(guān)系發(fā)生顯著變化。當(dāng)受到鎘脅迫時(shí)，MIR156表達(dá)上調(diào)，對(duì)SPL14和SPL17基因的抑制作用增強(qiáng)。以SPL14為例，在鎘脅迫處理12小時(shí)后，MIR156表達(dá)量顯著增加，導(dǎo)致SPL14mRNA的豐度急劇下降，相較于對(duì)照組降低了約[X]%。SPL14作為水稻生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受到抑制后，會(huì)進(jìn)一步影響下游一系列基因的表達(dá)，如參與生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等相關(guān)基因，從而改變水稻在鎘脅迫下的生理過(guò)程，包括根系發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收和代謝調(diào)節(jié)等。在鎘脅迫處理一段時(shí)間后，MIR156過(guò)表達(dá)水稻植株表現(xiàn)出明顯優(yōu)于野生型的生長(zhǎng)和生理特性。野生型水稻在鎘脅迫下，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，株高增長(zhǎng)緩慢，在鎘處理10天后，株高相較于正常條件下僅增長(zhǎng)了[X]%，且根系發(fā)育受阻，根長(zhǎng)縮短，側(cè)根數(shù)量減少，根系活力顯著下降。MIR156過(guò)表達(dá)植株的株高受抑制程度較輕，在相同鎘處理時(shí)間下，株高增長(zhǎng)幅度為[X]%，根系生長(zhǎng)狀況較好，根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量的減少幅度相對(duì)較小，根系活力也能維持在較高水平。這表明MIR156過(guò)表達(dá)能夠有效緩解鎘脅迫對(duì)水稻生長(zhǎng)的抑制作用，提高其在鎘脅迫環(huán)境下的生存和生長(zhǎng)能力。鎘脅迫會(huì)對(duì)水稻的光合作用產(chǎn)生嚴(yán)重負(fù)面影響，而MIR156表達(dá)水平的改變能夠顯著影響水稻對(duì)這種負(fù)面影響的抵御能力。在鎘脅迫下，野生型水稻葉片的葉綠素含量顯著下降，葉綠素a和葉綠素b的含量分別降低了[X]%和[X]%，導(dǎo)致葉片發(fā)黃，光合能力減弱。凈光合速率下降了[X]%，氣孔導(dǎo)度降低了[X]%，胞間二氧化碳濃度也發(fā)生了明顯變化。MIR156過(guò)表達(dá)植株葉片的葉綠素含量下降幅度相對(duì)較小，葉綠素a和葉綠素b含量分別降低[X]%和[X]%，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度的變化幅度也相對(duì)較小，分別下降[X]%、[X]%和變化[X]%。這說(shuō)明MIR156過(guò)表達(dá)有助于維持水稻在鎘脅迫下的光合色素含量和光合參數(shù)，保障光合作用的相對(duì)穩(wěn)定進(jìn)行，從而為水稻的生長(zhǎng)和代謝提供足夠的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在鎘脅迫下，水稻細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2??）、過(guò)氧化氫（H2O2）等，這些ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。為了應(yīng)對(duì)這種氧化脅迫，水稻會(huì)激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等抗氧化酶。野生型水稻在鎘脅迫下，抗氧化酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在脅迫初期，SOD、CAT和POD的活性分別升高了[X]%、[X]%和[X]%，以清除過(guò)量的ROS，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化酶活性逐漸下降，最終分別降至對(duì)照水平的[X]%、[X]%和[X]%，表明水稻的抗氧化防御系統(tǒng)逐漸受到破壞。MIR156過(guò)表達(dá)植株在鎘脅迫下，抗氧化酶活性的上升幅度更大，SOD、CAT和POD的活性在脅迫初期分別升高了[X]%、[X]%和[X]%，且在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持在較高水平，后期雖有下降，但仍顯著高于野生型，分別為對(duì)照水平的[X]%、[X]%和[X]%。這說(shuō)明MIR156過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了水稻的抗氧化防御能力，能夠更有效地清除ROS，減輕氧化損傷，從而提高水稻對(duì)鎘脅迫的耐受性。福建農(nóng)林大學(xué)曾任森教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)的由pri-miR156e編碼的功能性小肽miPEP156e，在水稻應(yīng)對(duì)鎘脅迫中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。外源施加人工合成的miPEP156e和過(guò)表達(dá)miPEP156e都可以顯著減少水稻對(duì)Cd的吸收和積累。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步揭示，miPEP156e通過(guò)調(diào)節(jié)Cd關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，如抑制水稻鎘吸收關(guān)鍵基因OsNramp5的表達(dá)，減少鎘離子進(jìn)入水稻細(xì)胞的途徑，從而降低水稻對(duì)鎘的吸收；同時(shí)，miPEP156e還能調(diào)節(jié)ROS清除基因的表達(dá)，增