miR-21：解鎖胃癌發(fā)生與進展分子奧秘的關鍵密碼一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據顯示，每年新增胃癌病例數(shù)眾多，且因胃癌死亡的人數(shù)也十分可觀。在我國，胃癌同樣是消化道惡性腫瘤中的“頭號殺手”，發(fā)病率和死亡率均位居前列。胃癌的發(fā)病與多種因素相關，如飲食習慣、幽門螺桿菌感染、遺傳因素以及環(huán)境因素等。早期胃癌患者通常缺乏典型癥狀，這導致大部分患者確診時已處于中晚期，錯失了最佳治療時機，五年生存率較低。傳統(tǒng)的治療手段，如手術、化療和放療，對于晚期胃癌患者的療效有限，且存在較大的副作用，患者生活質量難以保障。因此，深入探究胃癌發(fā)生及進展的分子機制，尋找有效的早期診斷標志物和治療靶點，成為當前胃癌研究領域的迫切任務。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，微小RNA（miRNA）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用逐漸被揭示。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA分子，其主要通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，進而實現(xiàn)對基因表達的調控。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移等多個關鍵過程中，miRNA都發(fā)揮著不可或缺的作用，其表達水平的異常變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在眾多miRNA中，miR-21因其在幾乎所有實體腫瘤中都呈現(xiàn)高表達的特性而備受關注，它在腫瘤進程中發(fā)揮著類似原癌基因的作用。在胃癌中，大量研究已證實miR-21的表達顯著上調，并且其高表達與胃癌的腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移等惡性生物學行為緊密相關。然而，目前對于miR-21在胃癌發(fā)生及進展中作用的分子機制尚未完全明確，仍存在諸多有待深入研究的問題。例如，miR-21具體通過哪些信號通路和靶基因來調控胃癌細胞的生物學行為？其表達異常的上游調控機制是什么？深入研究這些問題，不僅有助于我們全面揭示胃癌發(fā)生及進展的分子機制，為胃癌的早期診斷和治療提供全新的理論依據，還可能為開發(fā)針對miR-21的靶向治療策略奠定基礎，具有重要的科學意義和臨床應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究miR-21在胃癌發(fā)生及進展中作用的分子機制，通過一系列實驗，明確miR-21在胃癌發(fā)生及發(fā)展進程中的具體作用機制，篩選出miR-21的直接作用靶點和相關信號通路，揭示其調控胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等生物學行為的分子機制，從而為胃癌的早期診斷、治療及預后評估提供理論依據和潛在的生物標志物。胃癌作為嚴重威脅人類健康的重大疾病，其高發(fā)病率和死亡率給患者及其家庭帶來了沉重負擔。深入研究miR-21在胃癌發(fā)生及進展中的分子機制，具有極為重要的意義。從理論層面來看，有助于全面揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制，為胃癌的基礎研究提供新的方向和思路，進一步豐富腫瘤分子生物學的理論體系。在臨床實踐方面，若能明確miR-21在胃癌中的作用機制，可將其作為胃癌早期診斷的新型生物標志物，有助于實現(xiàn)胃癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，提高患者的生存率。此外，以miR-21為靶點，開發(fā)新型的靶向治療藥物，能夠為胃癌患者提供更精準、有效的治療手段，降低傳統(tǒng)治療方法的副作用，改善患者的生活質量。在預后評估中，miR-21的表達水平及相關分子機制的研究結果，可作為評估胃癌患者預后的重要指標，幫助醫(yī)生制定更合理的治療方案和隨訪計劃。二、miR-21與胃癌的關聯(lián)基礎2.1miR-21概述miR-21是一種內源性非編碼單鏈RNA分子，由位于人類17號染色體17q23.2位點的MIR21基因編碼。其成熟序列長度約為22個核苷酸，在進化過程中高度保守，廣泛存在于多種生物體內，在不同物種間具有相似的生物學功能。miR-21的生成過程是一個復雜且受到精細調控的生物學過程。首先，在細胞核內，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成初級轉錄本（pri-miR-21），pri-miR-21長度較長，包含多個莖環(huán)結構。隨后，在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復合體的作用下，pri-miR-21被剪切加工成約70-100個核苷酸長度的前體miRNA（pre-miR-21），pre-miR-21呈發(fā)夾狀結構。接著，pre-miR-21在轉運蛋白Exportin-5的協(xié)助下，從細胞核轉運至細胞質中。在細胞質中，核酸酶Dicer進一步對pre-miR-21進行切割，將其加工為成熟的miR-21雙鏈RNA。隨后，雙鏈中的一條鏈被降解，另一條鏈則與AGO蛋白等組裝形成RNA誘導沉默復合體（RISC）。miR-21主要通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）特異性互補配對來發(fā)揮其生物學功能。當miR-21與RISC結合形成復合體后，該復合體能夠識別并結合靶mRNA的3'-UTR區(qū)域。如果miR-21與靶mRNA的堿基互補配對程度較高，RISC中的核酸酶活性會被激活，直接切割靶mRNA，導致其降解，從而實現(xiàn)對基因表達的負調控；若miR-21與靶mRNA的互補配對程度相對較低，RISC則主要通過抑制靶mRNA的翻譯過程，阻礙蛋白質的合成，進而影響基因的表達水平。通過這種方式，miR-21參與調控細胞內眾多生物學過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、代謝以及信號傳導等。2.2miR-21在胃癌中的表達情況大量研究表明，miR-21在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。鄒衛(wèi)華等人采用莖環(huán)實時定量PCR法對117份胃癌組織標本和癌旁正常組織標本進行檢測，結果顯示，miR-21在胃癌組織中的相對表達水平顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）。張磊等人通過實時熒光定量PCR檢測30例胃癌手術切除組織和周圍正常組織中miR-21的表達情況，同樣發(fā)現(xiàn)miR-21在胃癌組織中高表達。在胃癌細胞株方面，多項研究也證實了miR-21的高表達。例如，有研究選取了SGC-7901、BGC-823等多種常見的胃癌細胞株，運用實時熒光定量PCR技術檢測miR-21的表達水平，結果表明這些胃癌細胞株中miR-21的表達量均明顯高于正常胃黏膜上皮細胞株。miR-21在胃癌組織和細胞株中的高表達，提示其可能在胃癌的發(fā)生及進展過程中發(fā)揮著關鍵作用，為后續(xù)深入探究其分子機制奠定了基礎。2.3miR-21與幽門螺桿菌感染的關系幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）是一種革蘭氏陰性微需氧菌，主要定植于人類胃黏膜上皮表面，與多種胃部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，被國際癌癥研究機構（IARC）列為第Ⅰ類生物致癌因子。大量研究表明，幽門螺桿菌感染是胃癌發(fā)生的重要危險因素，長期感染幽門螺桿菌可使患胃癌的風險增加數(shù)倍。幽門螺桿菌感染導致胃癌發(fā)生的機制較為復雜，其中一個重要的環(huán)節(jié)是其能夠引起胃黏膜上皮細胞內miR-21表達升高。當幽門螺桿菌感染胃黏膜上皮細胞后，會通過其毒力因子如細胞毒素相關基因A（CagA）、空泡毒素A（VacA）等與宿主細胞表面受體相互作用，激活細胞內多條信號傳導通路，進而誘導miR-21表達上調。有研究表明，CagA蛋白可以通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入胃上皮細胞內，在Src和Abl蛋白激酶的作用下發(fā)生磷酸化，磷酸化的CagA蛋白能夠與細胞內的多種信號分子相互作用，激活核因子κB（NF-κB）信號通路。NF-κB作為一種重要的轉錄因子，被激活后可以進入細胞核，結合到miR-21基因的啟動子區(qū)域，促進miR-21的轉錄，從而導致miR-21表達水平升高。此外，幽門螺桿菌感染還能引起胃黏膜局部炎癥反應，炎癥細胞分泌的多種細胞因子和趨化因子也參與了miR-21表達的調控。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等炎癥因子在幽門螺桿菌感染引發(fā)的炎癥微環(huán)境中大量釋放，這些炎癥因子可以作用于胃黏膜上皮細胞，通過激活細胞內的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，間接上調miR-21的表達。升高的miR-21在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。miR-21可以通過靶向作用于多個抑癌基因，抑制其表達，從而促進胃癌細胞的增殖、抑制細胞凋亡、增強細胞的侵襲和轉移能力。研究證實，miR-21的靶基因包括程序性細胞死亡4（PDCD4）、磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）等。PDCD4是一種重要的抑癌基因，在細胞增殖、凋亡及腫瘤轉移等過程中發(fā)揮關鍵作用。miR-21可以與PDCD4mRNA的3'-UTR互補配對，抑制其翻譯過程，導致PDCD4蛋白表達水平降低，進而解除對細胞增殖和侵襲的抑制作用，促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。PTEN同樣具有抑癌功能，能夠負向調控磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。miR-21對PTEN的靶向抑制作用，使得PI3K/Akt信號通路被過度激活，促進胃癌細胞的存活、增殖和遷移。幽門螺桿菌感染通過多種機制導致胃黏膜上皮細胞內miR-21表達升高，而miR-21又通過靶向調控多個抑癌基因，參與胃癌的發(fā)生及進展過程，這一過程為深入理解胃癌的發(fā)病機制提供了重要線索，也為胃癌的防治提供了新的潛在靶點。三、miR-21對胃癌細胞生物學行為的影響3.1miR-21對胃癌細胞增殖的影響眾多研究表明，miR-21在胃癌細胞增殖過程中扮演著重要角色，發(fā)揮著促進細胞增殖的作用。通過一系列嚴謹?shù)膶嶒炘O計和研究方法，科研人員獲得了豐富的實驗證據，有力地證實了這一結論。在細胞實驗方面，諸多研究采用了細胞轉染技術，將miR-21模擬物或抑制劑導入胃癌細胞中，以此改變細胞內miR-21的表達水平，進而觀察細胞增殖能力的變化。張磊等人將miR-21前體（pre-miR-21）轉染至胃癌細胞株BGC-823中，使miR-21過表達，隨后運用CCK8法檢測細胞增殖能力。實驗結果顯示，過表達miR-21的BGC-823細胞在培養(yǎng)的各個時間點，其吸光度值均顯著高于對照組，表明細胞增殖能力明顯提高，與Negative組和Control組對比差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這一實驗結果直觀地表明，miR-21的過表達能夠促進胃癌細胞BGC-823的增殖。相反，當抑制胃癌細胞內miR-21的表達時，細胞的增殖能力受到顯著抑制。張保貴等人應用細胞瞬轉的方法將miR-21inhibitor轉染至miR-21高表達的胃癌細胞株中，采用細胞增殖試驗（CCK8方法）檢測發(fā)現(xiàn)，下調miR-21后對胃癌細胞株的增殖抑制作用明顯（P＜0.05）。該實驗從反向進一步驗證了miR-21在胃癌細胞增殖過程中的促進作用，即miR-21表達水平的降低會導致胃癌細胞增殖能力的減弱。miR-21促進胃癌細胞增殖的作用主要通過靶向調控多個關鍵基因和信號通路來實現(xiàn)。其中，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路是miR-21發(fā)揮促增殖作用的重要信號通路之一。PTEN是一種具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，能夠負向調控PI3K/Akt信號通路。大量研究已證實，PTEN是miR-21的直接靶基因。miR-21可以通過與PTENmRNA的3'-UTR互補配對，抑制其翻譯過程，導致PTEN蛋白表達水平降低。當PTEN蛋白表達下降時，對PI3K的抑制作用減弱，使得PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種重要的第二信使，能夠招募Akt蛋白至細胞膜，并在磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）等的作用下，使Akt蛋白的Thr308和Ser473位點發(fā)生磷酸化，從而激活Akt。激活的Akt可以進一步磷酸化其下游的多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等。mTOR被激活后，能夠促進蛋白質合成、細胞周期進程和細胞生長，從而促進胃癌細胞的增殖。GSK-3β的磷酸化使其活性受到抑制，解除了對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制作用，導致CyclinD1表達上調，促進細胞從G1期進入S期，加速細胞增殖。此外，miR-21還可以通過靶向作用于程序性細胞死亡4（PDCD4）來促進胃癌細胞增殖。PDCD4是一種重要的抑癌基因，在細胞增殖、凋亡及腫瘤轉移等過程中發(fā)揮關鍵作用。miR-21與PDCD4mRNA的3'-UTR結合，抑制其翻譯，使PDCD4蛋白表達減少。PDCD4蛋白能夠抑制真核起始因子4A（eIF4A）的活性，eIF4A是一種RNA解旋酶，在蛋白質翻譯起始過程中發(fā)揮重要作用。當PDCD4蛋白表達降低時，對eIF4A的抑制作用減弱，使得eIF4A能夠正常發(fā)揮其解旋酶活性，促進mRNA的翻譯起始，從而增加細胞內蛋白質的合成，為細胞增殖提供物質基礎，最終促進胃癌細胞的增殖。miR-21通過靶向PTEN激活PI3K/Akt信號通路，以及靶向PDCD4促進蛋白質翻譯等機制，在胃癌細胞增殖過程中發(fā)揮著關鍵的促進作用，深入了解這些分子機制，為進一步探索胃癌的治療靶點提供了重要的理論依據。3.2miR-21對胃癌細胞凋亡的影響細胞凋亡是一種由基因調控的程序性細胞死亡過程，在維持機體細胞穩(wěn)態(tài)、組織發(fā)育和免疫監(jiān)視等方面發(fā)揮著關鍵作用。正常情況下，細胞凋亡機制能夠及時清除體內受損、老化或發(fā)生癌變的細胞，從而保障機體的健康。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡往往受到抑制，導致腫瘤細胞得以持續(xù)增殖、存活并逃避機體的免疫清除。在胃癌中，細胞凋亡的異常抑制是其發(fā)生及進展的重要特征之一，深入探究影響胃癌細胞凋亡的分子機制，對于揭示胃癌的發(fā)病機制及尋找有效的治療靶點具有重要意義。眾多研究表明，miR-21在胃癌細胞凋亡過程中扮演著關鍵角色，發(fā)揮著抑制細胞凋亡的作用。張保貴等人將miR-21inhibitor轉染至miR-21高表達的胃癌細胞株中，通過流式細胞技術（Annexin-Ⅴ標記）檢測細胞凋亡情況，結果顯示，下調miR-21表達后，胃癌細胞株的凋亡率顯著增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這表明miR-21表達的降低能夠促進胃癌細胞凋亡。miR-21抑制胃癌細胞凋亡的分子機制較為復雜，主要通過靶向調控多個關鍵基因和信號通路來實現(xiàn)。其中，PTEN/PI3K/Akt信號通路在這一過程中發(fā)揮著核心作用。PTEN作為一種重要的抑癌基因，能夠負向調控PI3K/Akt信號通路。當PTEN正常表達時，它可以通過其磷酸酶活性，將PIP3去磷酸化生成PIP2，從而阻斷Akt的激活，抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。然而，miR-21可以通過與PTENmRNA的3'-UTR互補配對，抑制其翻譯過程，導致PTEN蛋白表達水平降低。PTEN蛋白表達的下降使得對PI3K的抑制作用減弱，PI3K被激活后催化PIP2生成PIP3，進而激活Akt。激活的Akt可以磷酸化其下游的多種凋亡相關蛋白，如Bad、caspase-9等。Bad是一種促凋亡蛋白，在非磷酸化狀態(tài)下，它可以與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL結合，形成異二聚體，從而促進細胞凋亡。當Akt磷酸化Bad后，Bad與14-3-3蛋白結合，被隔離在細胞質中，無法與Bcl-2或Bcl-XL相互作用，從而抑制細胞凋亡。caspase-9是細胞凋亡級聯(lián)反應中的關鍵蛋白酶，處于凋亡信號通路的上游，Akt對caspase-9的磷酸化使其活性受到抑制，阻斷了凋亡信號的傳遞，進而抑制胃癌細胞凋亡。此外，miR-21還可以通過靶向作用于程序性細胞死亡4（PDCD4）來抑制胃癌細胞凋亡。PDCD4是一種重要的抑癌基因，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著促進作用。miR-21與PDCD4mRNA的3'-UTR結合，抑制其翻譯，使PDCD4蛋白表達減少。PDCD4蛋白能夠通過與死亡相關蛋白激酶1（DAPK1）相互作用，激活DAPK1，進而激活下游的凋亡信號通路，促進細胞凋亡。當PDCD4蛋白表達降低時，對DAPK1的激活作用減弱，導致凋亡信號通路受阻，從而抑制胃癌細胞凋亡。miR-21通過靶向PTEN激活PI3K/Akt信號通路，以及靶向PDCD4抑制凋亡信號通路等機制，在胃癌細胞凋亡過程中發(fā)揮著關鍵的抑制作用，深入研究這些分子機制，為進一步探索胃癌的治療靶點提供了重要的理論依據。3.3miR-21對胃癌細胞遷移和侵襲的影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力是其發(fā)生遠處轉移的重要基礎，也是導致腫瘤患者預后不良的關鍵因素之一。在胃癌的發(fā)展進程中，癌細胞獲得遷移和侵襲能力，能夠突破基底膜，侵入周圍組織和血管、淋巴管，進而發(fā)生遠處轉移。眾多研究表明，miR-21在胃癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要的促進作用。在細胞實驗中，研究人員通過細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗來探究miR-21對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響。張磊等人將miR-21前體（pre-miR-21）轉染至胃癌細胞株BGC-823中，使miR-21過表達，隨后進行細胞劃痕實驗。結果顯示，過表達miR-21的BGC-823細胞在創(chuàng)傷愈合模型中愈合速度明顯加快，劃痕寬度顯著減小，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這表明miR-21過表達能夠顯著增強胃癌細胞BGC-823的遷移能力。張保貴等人應用細胞瞬轉的方法將miR-21inhibitor轉染至miR-21高表達的胃癌細胞株中，采用Transwell試驗檢測抑制胃癌細胞株中miR-21表達后對其遷移的影響。結果表明，下調miR-21表達后，穿過Transwell小室聚碳酸酯膜的胃癌細胞數(shù)量明顯減少，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這說明抑制miR-21表達能夠有效降低胃癌細胞的遷移能力。在侵襲能力方面，同樣有大量實驗證實了miR-21的促進作用。張保貴等人在上述實驗中，通過在Transwell小室的聚碳酸酯膜上預先鋪好Matrigel基質膠，模擬體內細胞外基質，檢測胃癌細胞的侵襲能力。結果顯示，下調miR-21表達后，穿過Matrigel基質膠的胃癌細胞數(shù)量顯著減少，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這表明抑制miR-21表達能夠明顯抑制胃癌細胞的侵襲能力。相反，當胃癌細胞中miR-21過表達時，其侵襲能力顯著增強。miR-21促進胃癌細胞遷移和侵襲的分子機制主要與上皮-間質轉化（EMT）過程以及多條信號通路的調控有關。EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下向間質細胞轉化的過程，在這個過程中，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得遷移和侵襲能力。在胃癌中，miR-21可以通過靶向調控多個關鍵基因，促進EMT過程，從而增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。其中，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是上皮細胞的重要標志物，其表達水平的降低是EMT發(fā)生的重要標志之一。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可以通過靶向作用于鋅指轉錄因子Snail和ZEB1，間接抑制E-cadherin的表達。Snail和ZEB1是EMT過程中的關鍵轉錄因子，它們能夠結合到E-cadherin基因的啟動子區(qū)域，抑制其轉錄。miR-21通過抑制Snail和ZEB1的表達，解除對E-cadherin基因的抑制，導致E-cadherin表達水平降低，進而促進胃癌細胞發(fā)生EMT，增強其遷移和侵襲能力。此外，miR-21還可以通過激活PI3K/Akt信號通路來促進胃癌細胞的遷移和侵襲。如前文所述，miR-21可以通過靶向抑制PTEN的表達，激活PI3K/Akt信號通路。激活的Akt可以磷酸化其下游的多種底物，如糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、核因子κB（NF-κB）等。GSK-3β被磷酸化后失活，解除了對Snail的抑制作用，使得Snail表達上調，促進EMT過程和胃癌細胞的遷移、侵襲。NF-κB被激活后進入細胞核，結合到一系列與細胞遷移和侵襲相關基因的啟動子區(qū)域，促進其轉錄表達，從而增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。miR-21通過促進EMT過程以及激活PI3K/Akt等信號通路，在胃癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著關鍵的促進作用，深入了解這些分子機制，為進一步探索胃癌的治療靶點提供了重要的理論依據。四、miR-21在胃癌發(fā)生及進展中作用的分子機制4.1miR-21的靶基因及相關信號通路4.1.1PTEN基因PTEN基因，全稱為磷酸酶及張力蛋白同源物基因，定位于人類染色體10q23.3，其編碼的PTEN蛋白是一種具有雙重特異性磷酸酶活性的蛋白質。PTEN蛋白在細胞內發(fā)揮著重要的抑癌作用，主要通過負向調控磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路來維持細胞的正常生物學功能。在正常細胞中，PTEN蛋白能夠利用其磷酸酶活性，將磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化生成磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）。PIP3是PI3K/Akt信號通路中的關鍵第二信使，PTEN對PIP3的去磷酸化作用，使得Akt無法被招募至細胞膜并激活，從而阻斷了PI3K/Akt信號通路的傳導。PI3K/Akt信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著重要的調控作用，PTEN通過抑制該信號通路，能夠抑制細胞的過度增殖、促進細胞凋亡、抑制細胞的遷移和侵襲，進而維持細胞的穩(wěn)態(tài)和正常生理功能。大量研究已證實，PTEN是miR-21的直接靶基因。miR-21可以通過與PTENmRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，抑制其翻譯過程，導致PTEN蛋白表達水平降低。張保貴等人應用細胞瞬轉的方法將miR-21inhibitor轉染至miR-21高表達的胃癌細胞株中，通過Western印跡技術檢測發(fā)現(xiàn)，下調miR-21表達后，胃癌細胞株中PTEN蛋白表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這表明miR-21對PTEN蛋白表達具有負向調控作用。當miR-21高表達時，其對PTEN的靶向抑制作用增強，導致PTEN蛋白表達顯著下降。PTEN蛋白表達的降低使得對PI3K的抑制作用減弱，PI3K被激活后催化PIP2生成PIP3，大量生成的PIP3能夠招募Akt蛋白至細胞膜，并在磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）等的作用下，使Akt蛋白的Thr308和Ser473位點發(fā)生磷酸化，從而激活Akt。激活的Akt可以進一步磷酸化其下游的多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等。mTOR被激活后，能夠促進蛋白質合成、細胞周期進程和細胞生長，從而促進胃癌細胞的增殖。GSK-3β的磷酸化使其活性受到抑制，解除了對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制作用，導致CyclinD1表達上調，促進細胞從G1期進入S期，加速細胞增殖。同時，激活的Akt還可以通過磷酸化其下游的多種凋亡相關蛋白，如Bad、caspase-9等，抑制胃癌細胞凋亡。Bad是一種促凋亡蛋白，在非磷酸化狀態(tài)下，它可以與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL結合，形成異二聚體，從而促進細胞凋亡。當Akt磷酸化Bad后，Bad與14-3-3蛋白結合，被隔離在細胞質中，無法與Bcl-2或Bcl-XL相互作用，從而抑制細胞凋亡。caspase-9是細胞凋亡級聯(lián)反應中的關鍵蛋白酶，處于凋亡信號通路的上游，Akt對caspase-9的磷酸化使其活性受到抑制，阻斷了凋亡信號的傳遞，進而抑制胃癌細胞凋亡。此外，激活的Akt還能通過調節(jié)多種與細胞遷移和侵襲相關的蛋白，如基質金屬蛋白酶（MMPs）等，增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。MMPs能夠降解細胞外基質和基底膜，為癌細胞的遷移和侵襲提供便利條件。miR-21通過靶向抑制PTEN基因的表達，激活PI3K/Akt信號通路，在胃癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的調控中發(fā)揮著關鍵作用，深入研究這一調控機制，為胃癌的治療提供了重要的潛在靶點。4.1.2其他潛在靶基因除了PTEN基因外，研究還發(fā)現(xiàn)了多種miR-21的潛在靶基因，它們在胃癌的發(fā)生及進展過程中也發(fā)揮著重要作用，與miR-21共同構成了復雜的調控網絡。程序性細胞死亡4（PDCD4）是miR-21的另一個重要靶基因。PDCD4基因位于人類染色體10q24.1，其編碼的PDCD4蛋白是一種重要的抑癌蛋白。PDCD4蛋白在細胞內主要通過抑制蛋白質翻譯起始過程來發(fā)揮抑癌作用。在正常細胞中，PDCD4蛋白能夠與真核起始因子4A（eIF4A）相互作用，eIF4A是一種RNA解旋酶，在蛋白質翻譯起始過程中發(fā)揮關鍵作用。PDCD4與eIF4A結合后，能夠抑制eIF4A的解旋酶活性，阻礙mRNA的翻譯起始，從而抑制蛋白質的合成，進而抑制細胞的增殖和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，在胃癌中，miR-21可以通過與PDCD4mRNA的3'-UTR互補配對，抑制其翻譯過程，導致PDCD4蛋白表達水平降低。當PDCD4蛋白表達減少時，對eIF4A的抑制作用減弱，eIF4A能夠正常發(fā)揮其解旋酶活性，促進mRNA的翻譯起始，使得細胞內蛋白質合成增加，為細胞增殖提供物質基礎，從而促進胃癌細胞的增殖。此外，PDCD4蛋白還能夠通過與死亡相關蛋白激酶1（DAPK1）相互作用，激活DAPK1，進而激活下游的凋亡信號通路，促進細胞凋亡。miR-21對PDCD4的靶向抑制作用，使得PDCD4蛋白表達降低，對DAPK1的激活作用減弱，導致凋亡信號通路受阻，從而抑制胃癌細胞凋亡。同時，PDCD4蛋白表達的降低還與胃癌細胞的侵襲和轉移能力增強有關，其具體機制可能與PDCD4對某些與細胞遷移和侵襲相關基因的調控有關，但目前這方面的研究還相對較少，有待進一步深入探究。富含亮氨酸重復序列和免疫球蛋白樣結構域蛋白1（LRIG1）也是miR-21的潛在靶基因之一。LRIG1基因位于人類染色體3p14.3，其編碼的LRIG1蛋白是一種跨膜蛋白，在細胞生長、增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著重要的調控作用。在正常細胞中，LRIG1蛋白能夠通過與多種受體酪氨酸激酶（RTKs）相互作用，抑制RTKs的活性，從而阻斷下游信號通路的傳導，抑制細胞的增殖和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如，LRIG1可以與表皮生長因子受體（EGFR）結合，促進EGFR的內吞和降解，降低EGFR的表達水平，從而抑制EGFR信號通路的激活。EGFR信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著重要作用，LRIG1對EGFR信號通路的抑制作用，有助于維持細胞的正常生物學功能。然而，在胃癌中，miR-21可以通過靶向LRIG1，抑制其表達。當LRIG1表達降低時，對RTKs的抑制作用減弱，RTKs信號通路被激活，促進胃癌細胞的增殖、存活、遷移和侵襲。研究表明，LRIG1表達水平的降低與胃癌的臨床分期、淋巴結轉移和患者預后密切相關，LRIG1低表達的胃癌患者往往具有更差的預后。鋅指E盒結合同源盒1（ZEB1）同樣被發(fā)現(xiàn)是miR-21的潛在靶基因。ZEB1是一種轉錄因子，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在正常上皮細胞中，ZEB1的表達水平較低，細胞保持上皮細胞的特性，具有極性和緊密的細胞間連接。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，特別是在腫瘤細胞發(fā)生上皮-間質轉化（EMT）時，ZEB1的表達會顯著上調。ZEB1能夠結合到E-鈣黏蛋白（E-cadherin）基因的啟動子區(qū)域，抑制其轉錄，導致E-cadherin表達水平降低。E-cadherin是上皮細胞的重要標志物，其表達水平的降低是EMT發(fā)生的重要標志之一。當E-cadherin表達減少時，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，如遷移和侵襲能力增強，從而促進腫瘤細胞的轉移。在胃癌中，miR-21可以通過靶向ZEB1，調節(jié)其表達水平。一方面，miR-21可能通過直接與ZEB1mRNA的3'-UTR互補配對，抑制其翻譯過程，降低ZEB1蛋白表達水平。另一方面，miR-21也可能通過調節(jié)其他信號通路，間接影響ZEB1的表達。例如，miR-21可以通過激活PI3K/Akt信號通路，促進ZEB1的表達。激活的Akt可以磷酸化其下游的多種轉錄因子，其中一些轉錄因子可能參與ZEB1基因的轉錄調控，從而促進ZEB1的表達。miR-21對ZEB1的復雜調控機制，進一步影響了胃癌細胞的EMT過程和遷移、侵襲能力。miR-21通過靶向PDCD4、LRIG1、ZEB1等多種潛在靶基因，在胃癌的發(fā)生及進展過程中發(fā)揮著多方面的調控作用，這些靶基因與miR-21之間相互作用，共同構成了復雜的分子調控網絡，深入研究這一網絡，對于揭示胃癌的發(fā)病機制和尋找有效的治療靶點具有重要意義。4.2miR-21與胃癌相關的分子網絡在胃癌的發(fā)生及進展過程中，miR-21并非孤立地發(fā)揮作用，而是與其他非編碼RNA、蛋白質等相互作用，共同構成了一個復雜的分子網絡，精細地調控著胃癌細胞的生物學行為。在非編碼RNA層面，長鏈非編碼RNA（lncRNA）與miR-21的相互作用備受關注。LncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA分子，其在基因表達調控、細胞分化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，某些lncRNA可以通過競爭性內源RNA（ceRNA）機制與miR-21相互作用。例如，lncRNAH19在胃癌組織中高表達，它可以通過其分子結構中的特定序列與miR-21競爭性結合，從而減弱miR-21對其靶基因的抑制作用。具體來說，H19通過與miR-21競爭性結合，使得miR-21無法有效地與PTENmRNA的3'-UTR互補配對，導致PTEN蛋白表達上調受到抑制。PTEN蛋白表達的降低，使得PI3K/Akt信號通路被激活，進而促進胃癌細胞的增殖、抑制細胞凋亡、增強細胞的遷移和侵襲能力。這種lncRNA與miR-21之間通過ceRNA機制形成的相互調控關系，在胃癌的發(fā)生及進展中發(fā)揮著重要作用，進一步豐富了胃癌分子調控網絡的復雜性。環(huán)狀RNA（circRNA）也與miR-21存在著密切的相互作用。CircRNA是一類特殊的非編碼RNA，其分子呈閉合環(huán)狀結構，具有高度的穩(wěn)定性。在胃癌中，circRNA-0001649被發(fā)現(xiàn)能夠作為miR-21的海綿分子，通過與miR-21結合，影響miR-21的功能。研究表明，circRNA-0001649高表達時，能夠吸附大量的miR-21，使得miR-21對其靶基因PDCD4的抑制作用減弱。PDCD4蛋白表達的增加，抑制了胃癌細胞的增殖和遷移能力，促進細胞凋亡。這一研究結果揭示了circRNA-0001649通過調控miR-21/PDCD4軸，在胃癌發(fā)生及進展中發(fā)揮著重要的調控作用。在蛋白質層面，miR-21與多種蛋白質之間存在著復雜的相互作用關系。例如，轉錄因子核因子κB（NF-κB）與miR-21之間存在著正反饋調控關系。當細胞受到外界刺激，如幽門螺桿菌感染等，NF-κB信號通路被激活，激活的NF-κB可以結合到miR-21基因的啟動子區(qū)域，促進miR-21的轉錄，導致miR-21表達水平升高。而升高的miR-21又可以通過靶向作用于多個基因，進一步激活NF-κB信號通路。miR-21可以通過抑制PTEN的表達，激活PI3K/Akt信號通路，而激活的Akt可以磷酸化IκB激酶（IKK），使得IκBα磷酸化并降解，從而釋放NF-κB，使其進入細胞核，激活下游基因的轉錄，形成一個正反饋調控環(huán)路。這種正反饋調控關系使得NF-κB和miR-21的表達水平持續(xù)升高，進一步促進胃癌細胞的增殖、存活、遷移和侵襲。此外，miR-21還可以與一些蛋白質形成復合物，共同調控基因表達。AGO2蛋白是RNA誘導沉默復合體（RISC）的核心組成部分，miR-21與AGO2蛋白結合形成RISC后，能夠識別并結合靶mRNA的3'-UTR區(qū)域，實現(xiàn)對基因表達的調控。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞中，miR-21與AGO2蛋白的結合能力增強，使得miR-21對其靶基因的調控作用更加有效。miR-21/AGO2復合物對PTEN基因的靶向抑制作用增強，導致PTEN蛋白表達水平進一步降低，從而促進PI3K/Akt信號通路的激活，推動胃癌的發(fā)生及進展。miR-21與其他非編碼RNA、蛋白質等在胃癌中形成了復雜的分子網絡，通過多種機制相互作用、相互調控，共同影響著胃癌細胞的生物學行為，深入研究這一分子網絡，對于全面揭示胃癌發(fā)生及進展的分子機制具有重要意義。五、基于miR-21的胃癌治療與診斷研究5.1miR-21作為胃癌治療靶點的研究進展鑒于miR-21在胃癌發(fā)生及進展中發(fā)揮的關鍵作用，其作為胃癌治療靶點的研究逐漸成為熱點。目前，針對miR-21的治療策略主要集中在抑制miR-21的表達或活性，以阻斷其對下游靶基因的調控，從而抑制胃癌細胞的增殖、促進細胞凋亡、抑制細胞的遷移和侵襲，達到治療胃癌的目的。在眾多抑制miR-21表達的方法中，反義寡核苷酸（ASO）技術備受關注。ASO是一種人工合成的短鏈核酸分子，其序列與miR-21互補，能夠特異性地與miR-21結合，形成雙鏈結構，從而阻斷miR-21與靶mRNA的相互作用，抑制其功能發(fā)揮。研究人員通過細胞實驗和動物實驗，對ASO抑制miR-21表達的效果及對胃癌細胞生物學行為的影響進行了深入探究。在細胞實驗中，將miR-21ASO轉染至胃癌細胞株中，結果顯示，miR-21的表達水平顯著降低，胃癌細胞的增殖能力受到明顯抑制，細胞凋亡率顯著增加，遷移和侵襲能力也明顯減弱。在動物實驗中，構建胃癌小鼠模型，通過尾靜脈注射等方式將miR-21ASO導入小鼠體內，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯縮小，腫瘤生長速度減緩，小鼠的生存期得到延長。這些研究結果表明，miR-21ASO在抑制胃癌細胞生長和轉移方面具有顯著效果，為胃癌的治療提供了新的策略。除了ASO技術，小分子抑制劑也是研究的重點之一。小分子抑制劑能夠通過與miR-21或其相關蛋白相互作用，抑制miR-21的功能。研究發(fā)現(xiàn)，某些小分子化合物能夠特異性地結合到miR-21的成熟序列上，改變其空間構象，使其無法與靶mRNA結合，從而抑制miR-21的活性。還有一些小分子抑制劑可以通過干擾miR-21的生成過程，如抑制Dicer酶的活性，減少miR-21的成熟，進而降低其表達水平。在細胞實驗中，使用小分子抑制劑處理胃癌細胞，能夠顯著抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進細胞凋亡。動物實驗也證實，小分子抑制劑能夠有效抑制胃癌腫瘤的生長和轉移。小分子抑制劑具有分子量小、細胞通透性好、易于合成和修飾等優(yōu)點，為miR-21靶向治療藥物的開發(fā)提供了新的方向。在臨床試驗方面，目前已有一些針對miR-21的臨床試驗正在開展。部分臨床試驗采用miR-21ASO作為治療藥物，評估其在胃癌患者中的安全性和有效性。這些臨床試驗通常會招募一定數(shù)量的晚期胃癌患者，將患者隨機分為實驗組和對照組，實驗組患者接受miR-21ASO治療，對照組患者接受傳統(tǒng)治療或安慰劑治療。在試驗過程中，密切監(jiān)測患者的不良反應、腫瘤大小變化、生存期等指標。初步的臨床試驗結果顯示，miR-21ASO在部分患者中表現(xiàn)出一定的治療效果，能夠在一定程度上抑制腫瘤的生長，延長患者的生存期，且不良反應相對較輕，患者耐受性較好。然而，這些臨床試驗仍處于早期階段，樣本量相對較小，研究時間較短，還需要進一步擴大樣本量、延長研究時間，以全面評估m(xù)iR-21ASO的治療效果和安全性。miR-21作為胃癌治療靶點具有廣闊的研究前景和應用潛力。雖然目前針對miR-21的治療策略在實驗室研究和早期臨床試驗中取得了一定的進展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如如何提高治療藥物的靶向性和遞送效率，降低其副作用等。未來，需要進一步深入研究，不斷優(yōu)化治療策略，以推動miR-21靶向治療在胃癌臨床治療中的廣泛應用。5.2miR-21在胃癌診斷和預后評估中的應用潛力由于miR-21在胃癌組織和細胞中呈現(xiàn)高表達，且與胃癌的多種惡性生物學行為密切相關，使其在胃癌的診斷和預后評估方面展現(xiàn)出巨大的應用潛力。在胃癌的早期診斷中，檢測miR-21的表達水平具有重要意義。胃癌早期癥狀隱匿，缺乏典型臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過最佳治療時機。傳統(tǒng)的診斷方法如胃鏡檢查雖然是診斷胃癌的金標準，但屬于侵入性檢查，患者依從性較差，且對于早期微小病變的檢測存在一定局限性。血清腫瘤標志物檢測雖具有操作簡便、創(chuàng)傷小等優(yōu)點，但常用的腫瘤標志物如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等對胃癌早期診斷的敏感性和特異性并不理想。而miR-21作為一種新型的生物標志物，在胃癌早期診斷方面具有獨特優(yōu)勢。研究表明，胃癌患者血清和組織中的miR-21表達水平顯著高于健康人群，且與腫瘤的大小、分期等密切相關。通過檢測血清或組織中的miR-21表達水平，有望實現(xiàn)對胃癌的早期篩查和診斷。例如，有研究對100例胃癌患者和50例健康對照者的血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中miR-21的表達水平明顯高于健康對照者，以特定的表達水平為臨界值，其診斷胃癌的敏感性可達70%，特異性可達80%。將miR-21與其他腫瘤標志物或診斷方法聯(lián)合應用，能夠進一步提高診斷的準確性。有研究將miR-21與CEA、CA19-9聯(lián)合檢測，結果顯示，聯(lián)合檢測診斷胃癌的敏感性和特異性分別提高到85%和88%。這表明miR-21在胃癌早期診斷中具有重要的應用價值，可為臨床醫(yī)生提供更有效的診斷依據，有助于實現(xiàn)胃癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。在預后評估方面，miR-21的表達水平同樣能夠為臨床醫(yī)生提供重要的參考信息。大量研究表明，miR-21高表達與胃癌患者的不良預后密切相關。周航等人對60例進展期胃癌患者進行研究，采用實時定量PCR方法檢測miR-21在胃癌組織及其癌旁正常組織中的表達量，并根據miR-21表達將患者分為高表達組和低表達組進行預后分析。結果顯示，進展期胃癌癌組織較相應癌旁正常組織中的miR-21表達高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）；單因素分析患者臨床預后，miR-21高表達、組織分化差、pTNM分期晚、淋巴結轉移個數(shù)多、術后未行輔助治療均與胃癌預后不良相關；多變量Cox比例風險回歸模型分析顯示腫瘤分期、miR-21表達狀況、組織類型及術后輔助治療是影響胃癌預后的獨立因素。這表明miR-21表達水平可作為評估進展期胃癌患者預后的重要指標之一，對于預測患者的生存情況和制定個性化治療方案具有重要的指導意義。臨床醫(yī)生可根據患者miR-21的表達水平，對患者的預后進行準確評估，對于miR-21高表達的患者，提示其預后較差，需要加強隨訪和采取更積極的治療措施，以提高患者的生存率和生活質量。miR-21在胃癌的診斷和預后評估中具有顯著的應用潛力，有望成為胃癌早期診斷和預后評估的重要生物標志物，為胃癌的臨床診療提供新的思路和方法。然而，目前將miR-21應用于臨床診斷和預后評估仍面臨一些挑戰(zhàn)，如檢測方法的標準化、檢測樣本的選擇以及如何提高檢測的準確性和可靠性等，需要進一步深入研究和完善。六、研究總結與展望6.1研究總結本研究圍繞miR-21在胃癌發(fā)生及進展中作用的分子機制展開，通過多方面的研究，取得了較為豐富的成果。在胃癌發(fā)生及進展的過程中，miR-21發(fā)揮著極為關鍵的作用，其在胃癌組織和細胞株中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且這種高表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展進程緊密相關。在細胞生物學行為方面，miR-21對胃癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力均有顯著影響。實驗結果表明，miR-21能夠促進胃癌細胞的增殖，通過靶向抑制PTEN基因的表達，激活PI3K/Akt信號通路，進而促進細胞周期進程和蛋白質合成，加速胃癌細胞的增殖。在細胞凋亡方面，miR-21抑制胃癌細胞凋亡，其作用機制主要是通過靶向PTEN激活PI3K/Akt信號通路，使Akt磷酸化下游的凋亡相關蛋白，如Bad、caspase-9等，從而抑制細胞凋亡。在遷移和侵襲能力上，miR-21促進胃癌細胞的遷移和侵襲，一方面通過靶向調控多個關鍵基因，促進上皮-間質轉化（EMT）過程，增強細胞的遷移和侵襲能力；另一方面，通過激活PI3K/Akt信號通路，調節(jié)多種與細胞遷移和侵襲相關的蛋白，如基質金屬蛋白酶（MMPs）等，為癌細胞的遷移和侵襲提供便利條件。在分子機制層面，本研究明確了miR-21的多個靶基因及相關信號通路。PTEN作為miR-21的直接靶基因，在miR-21調控胃癌細胞生物學行為的過程中發(fā)揮著核心作用。miR-21還存在多種潛在靶基因，如程序性細胞死亡4（PDCD4）、富含亮氨酸重復序列和免疫球蛋白樣結構域蛋白1（