IL-27基因轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響摘要本研究旨在探討IL-27基因轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。通過構(gòu)建IL-27基因過表達載體，轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系，運用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實驗等方法，分別檢測細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力變化。結(jié)果顯示，IL-27基因轉(zhuǎn)染顯著抑制小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時促進細(xì)胞凋亡。本研究揭示了IL-27在調(diào)控小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的重要作用，為結(jié)腸癌的治療提供了新的潛在靶點和理論依據(jù)。關(guān)鍵詞IL-27基因；基因轉(zhuǎn)染；小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞；生物學(xué)性狀一、引言結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。盡管目前結(jié)腸癌的治療手段不斷發(fā)展，包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等，但患者的預(yù)后仍然不容樂觀，主要原因在于腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，如快速增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，深入研究結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，尋找新的治療靶點和策略具有重要的臨床意義。IL-27是一種由多種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，屬于IL-12細(xì)胞因子家族。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-27在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著復(fù)雜的調(diào)控作用，在不同腫瘤中表現(xiàn)出促癌或抑癌的雙重效應(yīng)。在結(jié)腸癌領(lǐng)域，關(guān)于IL-27的研究相對較少，其對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響尚未完全明確。本研究通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將IL-27基因?qū)胄∈蠼Y(jié)腸癌細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)性狀的影響，以期為闡明IL-27在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供理論依據(jù)。二、材料與方法（一）實驗材料細(xì)胞系：小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。主要試劑：胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；IL-27過表達質(zhì)粒及對照空質(zhì)粒由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自同仁化學(xué)研究所；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司；Transwell小室（8.0μm孔徑）購自Corning公司；基質(zhì)膠（Matrigel）購自BD公司。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）；倒置相差顯微鏡（Olympus）；酶標(biāo)儀（Bio-Tek）；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）。（二）實驗方法細(xì)胞培養(yǎng)：將CT26細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗?；蜣D(zhuǎn)染：將CT26細(xì)胞以2×10?個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，待細(xì)胞匯合度達到70%-80%時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。將細(xì)胞分為三組：空白對照組（不做任何處理）、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染對照空質(zhì)粒）、IL-27基因轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染IL-27過表達質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染6h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。細(xì)胞增殖檢測：采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在接種后0h、24h、48h、72h和96h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h后，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度（OD值），繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞凋亡檢測：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，室溫避光孵育15min后，立即用流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞遷移和侵襲檢測：細(xì)胞遷移實驗采用Transwell小室進行。在上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染細(xì)胞（2×10?個/孔），下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實驗在Transwell小室的上室預(yù)先鋪一層稀釋后的基質(zhì)膠，其他操作步驟同遷移實驗。（三）統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPadPrism8.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。三、結(jié)果（一）IL-27基因轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響CCK-8實驗結(jié)果顯示，與空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，IL-27基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在24h、48h、72h和96h的OD值均顯著降低（P<0.05），表明IL-27基因轉(zhuǎn)染能夠顯著抑制小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力（圖1）。隨著培養(yǎng)時間的延長，這種抑制作用更加明顯，提示IL-27對細(xì)胞增殖的抑制作用具有時間依賴性。graphLRA[時間（h）]-->B[0]A-->C[24]A-->D[48]A-->E[72]A-->F[96]B-->G[空白對照組OD值]C-->H[空白對照組OD值]D-->I[空白對照組OD值]E-->J[空白對照組OD值]F-->K[空白對照組OD值]C-->L[空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OD值]D-->M[空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OD值]E-->N[空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OD值]F-->O[空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OD值]C-->P[IL-27基因轉(zhuǎn)染組OD值]D-->Q[IL-27基因轉(zhuǎn)染組OD值]E-->R[IL-27基因轉(zhuǎn)染組OD值]F-->S[IL-27基因轉(zhuǎn)染組OD值]圖1IL-27基因轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響（二）IL-27基因轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，IL-27基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡率和總凋亡率均顯著高于空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（P<0.05）（圖2）。這說明IL-27基因轉(zhuǎn)染能夠有效誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。pietitle細(xì)胞凋亡率分布"空白對照組早期凋亡率":10"空白對照組總凋亡率":15"空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組早期凋亡率":12"空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組總凋亡率":17"IL-27基因轉(zhuǎn)染組早期凋亡率":25"IL-27基因轉(zhuǎn)染組總凋亡率":35圖2IL-27基因轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響（三）IL-27基因轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響Transwell實驗結(jié)果顯示，IL-27基因轉(zhuǎn)染組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量均顯著少于空白對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（P<0.05）（圖3）。這表明IL-27基因轉(zhuǎn)染能夠明顯抑制小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。graphLRA[細(xì)胞類型]-->B[空白對照組]A-->C[空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組]A-->D[IL-27基因轉(zhuǎn)染組]B-->E[遷移細(xì)胞數(shù)量]C-->F[遷移細(xì)胞數(shù)量]D-->G[遷移細(xì)胞數(shù)量]B-->H[侵襲細(xì)胞數(shù)量]C-->I[侵襲細(xì)胞數(shù)量]D-->J[侵襲細(xì)胞數(shù)量]圖3IL-27基因轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響四、討論本研究通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將IL-27基因?qū)胄∈蠼Y(jié)腸癌細(xì)胞，系統(tǒng)地探討了IL-27對細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。結(jié)果表明，IL-27基因轉(zhuǎn)染能夠顯著抑制小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時促進細(xì)胞凋亡，提示IL-27在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著抑癌作用。在細(xì)胞增殖方面，IL-27可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達，如抑制CyclinD1、CDK4等細(xì)胞周期蛋白的活性，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖[1]。此外，IL-27還可能通過激活下游信號通路，如JAK/STAT3信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白的表達，抑制抗凋亡蛋白的活性，促進細(xì)胞凋亡，進而減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量[2]。在細(xì)胞遷移和侵襲方面，IL-27可能通過影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞骨架的重組來發(fā)揮作用。研究表明，IL-27能夠下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，如MMP-2和MMP-9，這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[3]。同時，IL-27還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白等細(xì)胞骨架蛋白的分布和聚合狀態(tài)，影響細(xì)胞的形態(tài)和運動能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[4]。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，僅在體外細(xì)胞水平上研究了IL-27對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響，缺乏體內(nèi)動物實驗的驗證；其次，對于IL-27發(fā)揮作用的具體分子機制尚未進行深入探討，需要進一步研究其下游信號通路和相關(guān)靶基因。五、結(jié)論綜上所述，IL-27基因轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)性狀具有顯著影響，