MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本：miR398生物合成調(diào)控與植物抗熱性機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義在真核生物的復(fù)雜生命進(jìn)程中，微小RNA（microRNA，miRNA）扮演著極為關(guān)鍵的角色。miRNA是一類長度約為21-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，其進(jìn)化上較為保守。自1993年首個(gè)miRNA在線蟲中被發(fā)現(xiàn)以來，科研人員陸續(xù)在多種動(dòng)植物體內(nèi)找到了它的蹤跡。miRNA主要通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)靶基因進(jìn)行翻譯抑制或者mRNA剪切，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。在植物里，miRNA基因的位置較為多樣，有的位于編碼基因之間，還有的來自內(nèi)含子、外顯子、轉(zhuǎn)座子，甚至是tRNA區(qū)域。它在RNA聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄形成具有帽子和polyA結(jié)構(gòu)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本pri-miRNA，pri-miRNA具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在Dicer-like1（DCL1）、雙鏈RNA結(jié)合蛋白Hyponasticleaves1（HYL1）、C2H2鋅指蛋白Serrate（SE）、細(xì)胞核capbindingcomplex（CBC）等蛋白形成的剪切復(fù)合體的作用下，在細(xì)胞核d-bodies內(nèi)被剪切形成前體pre-miRNA，隨后pre-miRNA進(jìn)一步被剪切形成成熟的miRNA/miRNA雙鏈體。在甲基轉(zhuǎn)移酶Huaenhancer1（HEN1）對(duì)其3’端核苷酸進(jìn)行甲基化修飾后，阻礙了它們的尿苷化和后續(xù)降解，甲基化的miRNA/miRNA在Hasty（HST）和其他未知因子的作用下從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。多數(shù)成熟的miRNA會(huì)進(jìn)入Argonaute（AGO）復(fù)合體，并通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶標(biāo)基因結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)。眾多研究表明，miRNA參與了植物生長發(fā)育的各個(gè)階段，如種子萌發(fā)、根的生長、葉的發(fā)育、花的形成以及果實(shí)的成熟等，同時(shí)在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。天然反義轉(zhuǎn)錄本（naturalantisensetranscripts，NATs）是一類廣泛存在于動(dòng)植物基因組中的編碼或非編碼的RNAs分子，其與正義基因互補(bǔ)，能夠在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)正義基因的表達(dá)。在植物中，NATs參與了眾多生理過程，包括對(duì)植物激素信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控、生長發(fā)育進(jìn)程的影響以及對(duì)各種逆境脅迫的響應(yīng)等。例如，在激素信號(hào)傳導(dǎo)方面，某些NATs可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)激素信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，來影響植物對(duì)激素的響應(yīng)；在生長發(fā)育過程中，NATs能夠調(diào)控與植物形態(tài)建成、器官發(fā)育等相關(guān)基因的表達(dá)；在應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)，NATs能夠幫助植物感知外界環(huán)境變化，并通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力。然而，盡管NATs在植物中具有重要作用，目前學(xué)界對(duì)于天然反義轉(zhuǎn)錄本與miRNA之間的調(diào)控關(guān)系卻知之甚少。近年來，隨著全球氣候變暖趨勢(shì)的加劇，高溫脅迫已成為影響植物生長、發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的主要環(huán)境因素之一。在高溫環(huán)境下，植物的生理生化過程會(huì)受到顯著影響，如光合作用受到抑制，導(dǎo)致植物無法正常合成有機(jī)物質(zhì)；呼吸作用增強(qiáng)，消耗過多的能量；細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲；蛋白質(zhì)變性和降解加速，影響細(xì)胞的正常功能；激素平衡被打破，干擾植物的生長調(diào)節(jié)等。這些變化最終會(huì)導(dǎo)致植物生長發(fā)育受阻，甚至死亡，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。因此，深入研究植物的抗熱機(jī)制，挖掘植物自身的抗熱潛力，對(duì)于提高植物的抗熱性、保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。miR398作為植物中廣泛存在的一種微小RNA，已被證實(shí)參與了植物對(duì)多種逆境脅迫的響應(yīng)過程，其中在植物熱逆境響應(yīng)中的作用備受關(guān)注。已有研究表明，miR398在植物受到熱脅迫時(shí)，其表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化，進(jìn)而通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，影響植物的抗熱能力。然而，目前關(guān)于miR398在植物抗熱性中的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。特別是MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本在這一過程中所扮演的角色以及它們之間的相互作用機(jī)制，仍然是植物逆境生物學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要科學(xué)問題。對(duì)MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控miR398生物合成及植物抗熱性機(jī)制的深入研究，不僅能夠豐富我們對(duì)植物體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為揭示植物抗熱的分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)，還能夠?yàn)橥ㄟ^生物技術(shù)手段改良作物的抗熱性提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入剖析MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本對(duì)miR398生物合成的調(diào)控機(jī)制，以及其在植物抗熱性方面所發(fā)揮的作用。具體而言，將通過一系列實(shí)驗(yàn)手段，確定MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本與miR398基因之間的相互作用模式，明確這種相互作用如何影響miR398的轉(zhuǎn)錄、加工以及成熟過程，進(jìn)而揭示其在植物應(yīng)對(duì)高溫脅迫過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，本研究還期望通過對(duì)MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本的研究，為開發(fā)基于基因調(diào)控的植物抗熱策略提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，助力解決全球氣候變暖背景下農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的高溫脅迫問題。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1miR398的研究進(jìn)展miR398作為植物中一類重要的miRNA，其功能研究一直是植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在國外，早在2002年，Llave等通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR398在擬南芥中的存在，開啟了對(duì)miR398研究的序幕。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，miR398主要靶向編碼銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）的基因CSD1和CSD2，以及參與銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的基因。例如，Sunkar等研究表明，在正常生長條件下，miR398通過對(duì)CSD1和CSD2的負(fù)調(diào)控，維持植物體內(nèi)銅離子的平衡和抗氧化防御系統(tǒng)的穩(wěn)定；當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，miR398的表達(dá)模式發(fā)生改變，進(jìn)而影響靶基因的表達(dá)，以幫助植物應(yīng)對(duì)逆境。在國內(nèi)，眾多科研團(tuán)隊(duì)也圍繞miR398展開了深入研究。王臺(tái)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在水稻中miR398的表達(dá)受到多種環(huán)境因素的調(diào)控，且其過表達(dá)或沉默會(huì)影響水稻的生長發(fā)育和對(duì)逆境的響應(yīng)。他們通過對(duì)miR398轉(zhuǎn)基因水稻的表型分析和生理生化指標(biāo)測(cè)定，揭示了miR398在水稻銅離子穩(wěn)態(tài)維持和抗逆過程中的重要作用。此外，在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與miR398的關(guān)聯(lián)研究方面，國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，miR398參與了生長素、脫落酸等激素信號(hào)通路，通過與激素信號(hào)相關(guān)基因的互作，調(diào)控植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)過程。例如，在擬南芥中，miR398通過調(diào)控生長素響應(yīng)因子ARF的表達(dá)，影響植物根的生長和發(fā)育，同時(shí)在脫落酸介導(dǎo)的植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)中，miR398也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。1.3.2天然反義轉(zhuǎn)錄本的研究進(jìn)展天然反義轉(zhuǎn)錄本（NATs）的研究起步相對(duì)較早，早在20世紀(jì)90年代，科研人員就在多種生物中發(fā)現(xiàn)了NATs的存在。國外對(duì)NATs的研究較為深入，在動(dòng)物模型中，如小鼠和果蠅，發(fā)現(xiàn)NATs參與了基因印記、胚胎發(fā)育等重要生理過程。在植物領(lǐng)域，對(duì)NATs的研究也逐漸增多，如在擬南芥中，發(fā)現(xiàn)一些NATs參與了植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)。例如，AtNAT-SiR1是由一對(duì)天然反義轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的小干擾RNA，它在擬南芥應(yīng)對(duì)鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的耐鹽性。國內(nèi)對(duì)植物NATs的研究也取得了一系列成果。中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/植物生理生態(tài)研究所何玉科研究組長期從事miRNA生物合成分子機(jī)制及其應(yīng)用技術(shù)研究，在模式植物擬南芥和蔬菜作物白菜中識(shí)別出大批miRNA基因的天然反義轉(zhuǎn)錄本。他們通過對(duì)白菜和擬南芥全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)以及相關(guān)數(shù)據(jù)庫的分析，發(fā)現(xiàn)了一系列MIRNA基因的順式天然反義轉(zhuǎn)錄本，包括白菜中的BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2以及擬南芥中的MIR398b和MIR398c，為進(jìn)一步研究NATs與miRNA之間的調(diào)控關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。1.3.3MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本與miR398生物合成及植物抗熱性的研究進(jìn)展目前，關(guān)于MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本與miR398生物合成及植物抗熱性之間關(guān)系的研究還相對(duì)較少，是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域。何玉科研究組在2020年發(fā)表的研究論文取得了開創(chuàng)性進(jìn)展，他們首次報(bào)道了miR398基因天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控miR398生物合成和植物抗熱性的新機(jī)制。通過分析MIR398b/c和NAT398b/c在擬南芥植株中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)MIR398b和MIR398c在維管束組織中分別與其反義基因NAT398b和NAT398c共表達(dá)。培育過表達(dá)NAT398b和NAT398c的轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因植株中pri-miR398b或pri-miR398c表達(dá)量和miR398水平顯著降低，miR398靶標(biāo)基因CSD1上調(diào)；人為降低其反義基因NAT398b和NAT398c表達(dá)水平，則分別增加pri-miR398b或pri-miR398c和miR398的積累，引起miR398靶標(biāo)基因的下調(diào)，結(jié)果表明MIR398反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控miR398的生物合成。RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，NAT398b和NAT398c轉(zhuǎn)錄本分別與pri-miR398b和pri-miR398c形成雙鏈結(jié)構(gòu)。若增加NAT398b/c的表達(dá)，植株葉片中pri-miR398b/c降解速率增加，pri-miR398b/c的表達(dá)量顯著降低，表明NAT398b和NAT398c分別降低pri-miR398b和pri-miR398c的穩(wěn)定性。通過sRNA深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)一些21nt的nat-siRNA，人工過表達(dá)nat-siR398-1抑制pri-miR398b/c的表達(dá)。為確認(rèn)miR398基因天然反義轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)效應(yīng)，檢測(cè)過表達(dá)和knockdownNAT398b和NAT398c轉(zhuǎn)基因植株的抗熱性，結(jié)果表明，過表達(dá)NAT398b和NAT398c基因減弱轉(zhuǎn)基因植株的抗熱性，人工降低NAT398b和NAT398c基因的表達(dá)量則增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗熱性，即MIR398b/c反義轉(zhuǎn)錄本的存在削弱植物的抗熱性，NAT398b/c通過調(diào)控miR398的生物合成來調(diào)控植物抗熱性。這一研究成果為深入探究生物體內(nèi)基因沉默和表達(dá)調(diào)控機(jī)制，在實(shí)踐中通過miRNA和天然反義轉(zhuǎn)錄本改良作物重要農(nóng)藝性狀提供了科學(xué)依據(jù)，但對(duì)于這一調(diào)控機(jī)制在其他植物物種中的普遍性以及更深入的分子作用細(xì)節(jié)，仍有待進(jìn)一步研究。二、MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本與miR398生物合成2.1miR398生物合成過程概述miR398的生物合成是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和多種蛋白質(zhì)的協(xié)同作用，這一過程高度有序，以確保miR398能夠準(zhǔn)確生成并發(fā)揮其生物學(xué)功能。miR398基因首先在RNA聚合酶II的催化作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，生成具有5'端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3'端多聚腺苷酸尾巴（polyA）的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本pri-miR398。RNA聚合酶II是一種關(guān)鍵的酶，它能夠識(shí)別miR398基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并沿著DNA模板鏈移動(dòng)，將核糖核苷酸逐個(gè)添加到正在合成的RNA鏈上，從而完成pri-miR398的轉(zhuǎn)錄過程。pri-miR398長度通常在幾百到數(shù)千個(gè)核苷酸不等，其序列中包含多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)于后續(xù)的加工過程至關(guān)重要。生成的pri-miR398需要在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的加工處理。在細(xì)胞核d-bodies（也稱為Dicingbodies）中，pri-miR398會(huì)與由Dicer-like1（DCL1）、雙鏈RNA結(jié)合蛋白Hyponasticleaves1（HYL1）、C2H2鋅指蛋白Serrate（SE）以及細(xì)胞核capbindingcomplex（CBC）等蛋白形成的剪切復(fù)合體相互作用。DCL1是一種核糖核酸酶III，它在pri-miR398的加工過程中發(fā)揮核心作用，能夠特異性地識(shí)別并切割pri-miR398的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將其剪切為長度約為70-90個(gè)核苷酸的前體pre-miR398，pre-miR398呈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，具有3'端2nt懸垂，這種結(jié)構(gòu)特征是其后續(xù)進(jìn)一步加工和功能發(fā)揮的基礎(chǔ)。HYL1含有兩個(gè)雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)核定位信號(hào)和一個(gè)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，它作為DCL1的分子伴侶，能夠與pri-miR398結(jié)合，增強(qiáng)DCL1對(duì)pri-miR398的識(shí)別和剪切效率，確保剪切過程的精確性；SE是一個(gè)C2H2鋅指蛋白，同樣也是DCL1的分子伴侶，與DCL1和HYL1相互作用，共定位在d-bodies中，輔助DCL1對(duì)pri-miR398進(jìn)行有效且精確的剪切；CBC則主要負(fù)責(zé)與pri-miR398的5'端帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合，參與pri-miR398的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，對(duì)維持pri-miR398的穩(wěn)定性以及促進(jìn)其與剪切復(fù)合體的相互作用具有重要意義。前體pre-miR398在完成細(xì)胞核內(nèi)的初次加工后，會(huì)在甲基轉(zhuǎn)移酶Huaenhancer1（HEN1）的作用下，對(duì)其3'端核苷酸進(jìn)行甲基化修飾。HEN1能夠?qū)⒓谆鶊F(tuán)添加到pre-miR398的3'端核糖的2'-羥基上，形成2'-O-甲基化修飾。這種甲基化修飾可以有效阻礙pre-miR398的尿苷化和后續(xù)的降解過程，增加其穩(wěn)定性，使其能夠順利進(jìn)入下一階段的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)。經(jīng)過甲基化修飾的pre-miR398在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Hasty（HST）以及其他一些目前尚未完全明確的因子的協(xié)助下，從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。HST屬于核轉(zhuǎn)運(yùn)受體家族的成員，它通過與Ran-GTP以及pre-miR398形成一個(gè)三聚體，借助細(xì)胞核孔復(fù)合體，將pre-miR398從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，Ran-GTP會(huì)水解為Ran-GDP，從而釋放出pre-miR398。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，pre-miR398會(huì)再次被DCL1等蛋白組成的剪切復(fù)合體識(shí)別并進(jìn)一步剪切，最終形成長度約為21-23個(gè)核苷酸的成熟miR398/miR398雙鏈體。成熟的miR398/miR398雙鏈體中，其中一條鏈（通常為miR398）會(huì)進(jìn)入Argonaute（AGO）復(fù)合體，另一條鏈（miR398*）則通常會(huì)被降解。進(jìn)入AGO復(fù)合體的miR398能夠通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶標(biāo)基因mRNA相結(jié)合，對(duì)靶標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，主要通過介導(dǎo)靶標(biāo)基因mRNA切割或翻譯抑制在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)，進(jìn)而參與植物的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)等多種生物學(xué)過程。2.2MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)與鑒定中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/植物生理生態(tài)研究所何玉科研究組在模式植物擬南芥和蔬菜作物白菜中，通過分析全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及相關(guān)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了一系列MIRNA基因的順式天然反義轉(zhuǎn)錄本，其中就包括與miR398相關(guān)的天然反義轉(zhuǎn)錄本。在擬南芥中，研究人員對(duì)其全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘，利用生物信息學(xué)分析手段，將基因組序列與已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，重點(diǎn)關(guān)注那些與已知miR398基因序列互補(bǔ)的區(qū)域。通過這種方法，成功發(fā)現(xiàn)了MIR398b和MIR398c的天然反義轉(zhuǎn)錄本NAT398b和NAT398c。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些天然反義轉(zhuǎn)錄本的存在，研究人員運(yùn)用了RT-PCR技術(shù)。首先提取擬南芥植株的總RNA，然后通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，引物的設(shè)計(jì)基于預(yù)測(cè)的NAT398b和NAT398c序列，引物的特異性經(jīng)過嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析驗(yàn)證，確保其能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出目標(biāo)片段。通過PCR擴(kuò)增，得到了與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增產(chǎn)物，將這些擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明擴(kuò)增得到的序列與預(yù)測(cè)的NAT398b和NAT398c序列一致，從而在實(shí)驗(yàn)層面證實(shí)了擬南芥中MIR398b和MIR398c天然反義轉(zhuǎn)錄本的存在。對(duì)于白菜，研究人員同樣采用了類似的方法。先對(duì)白菜進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得高質(zhì)量的基因組序列數(shù)據(jù)，同時(shí)對(duì)不同生長發(fā)育時(shí)期和不同組織部位的白菜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建全面的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。通過生物信息學(xué)分析軟件，在全基因組范圍內(nèi)搜索與白菜中miR398基因序列互補(bǔ)的潛在反義轉(zhuǎn)錄本區(qū)域。經(jīng)過篩選和分析，發(fā)現(xiàn)了BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2這兩個(gè)與miR398相關(guān)的天然反義轉(zhuǎn)錄本。為了確認(rèn)這些反義轉(zhuǎn)錄本的真實(shí)性，研究人員利用RNA原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。制備針對(duì)BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2的特異性探針，探針的制備采用地高辛或熒光素等標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。將白菜組織切片進(jìn)行預(yù)處理，使其能夠更好地與探針結(jié)合，然后在適宜的條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交結(jié)束后，通過顯微鏡觀察雜交信號(hào)的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在白菜的特定組織和細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯的雜交信號(hào)，表明BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2在白菜中真實(shí)存在并且具有特定的表達(dá)模式。在鑒定過程中，研究人員還對(duì)MIR398b/c和NAT398b/c在擬南芥植株中的表達(dá)模式進(jìn)行了深入分析。利用定量PCR技術(shù)，檢測(cè)不同組織和不同發(fā)育階段中MIR398b/c和NAT398b/c的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIR398b和MIR398c在維管束組織中分別與其反義基因NAT398b和NAT398c呈現(xiàn)出共表達(dá)的模式，這一結(jié)果暗示了它們之間可能存在緊密的調(diào)控關(guān)系，為后續(xù)深入研究MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本對(duì)miR398生物合成的調(diào)控機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。2.3MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本對(duì)miR398生物合成的調(diào)控方式2.3.1形成雙鏈結(jié)構(gòu)影響穩(wěn)定性MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本NAT398b和NAT398c對(duì)miR398生物合成的調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄后水平上，一個(gè)重要的方式是通過與pri-miR398b和pri-miR398c形成雙鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響它們的穩(wěn)定性。RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)為這一作用機(jī)制提供了關(guān)鍵證據(jù)。在實(shí)驗(yàn)過程中，將提取的含有NAT398b和NAT398c轉(zhuǎn)錄本以及pri-miR398b和pri-miR398c的植物細(xì)胞總RNA，與特定的RNA酶進(jìn)行孵育。這種RNA酶能夠特異性地識(shí)別并降解單鏈RNA，但對(duì)于雙鏈RNA結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，NAT398b轉(zhuǎn)錄本能夠與pri-miR398b特異性地結(jié)合，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)；同樣地，NAT398c轉(zhuǎn)錄本也能與pri-miR398c形成雙鏈結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果從實(shí)驗(yàn)層面證實(shí)了NAT398b和NAT398c與pri-miR398b和pri-miR398c之間存在直接的相互作用。當(dāng)NAT398b/c的表達(dá)量增加時(shí)，這種相互作用對(duì)pri-miR398b/c穩(wěn)定性的影響便凸顯出來。在植物體內(nèi)，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)NAT398b和NAT398c的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株的葉片進(jìn)行深入分析，利用放射性同位素標(biāo)記技術(shù)，將放射性標(biāo)記的核苷酸類似物添加到植物細(xì)胞的培養(yǎng)液中，使其參與到RNA的合成過程中，從而標(biāo)記pri-miR398b/c。經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，定期提取葉片中的RNA，并通過凝膠電泳和放射自顯影技術(shù)，追蹤標(biāo)記的pri-miR398b/c的降解情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型植株相比，過表達(dá)NAT398b/c的轉(zhuǎn)基因植株葉片中，pri-miR398b/c的降解速率明顯加快，在相同的時(shí)間內(nèi)，檢測(cè)到的pri-miR398b/c的含量顯著降低。這表明NAT398b和NAT398c與pri-miR398b和pri-miR398c形成的雙鏈結(jié)構(gòu)，使得pri-miR398b/c更容易受到細(xì)胞內(nèi)核酸酶的攻擊，從而降低了它們的穩(wěn)定性，阻礙了miR398的正常生物合成進(jìn)程。這種通過形成雙鏈結(jié)構(gòu)影響穩(wěn)定性的調(diào)控方式，在植物基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要意義，它為植物根據(jù)自身生長發(fā)育需求以及外界環(huán)境變化，精細(xì)調(diào)控miR398的合成提供了一種有效的途徑。2.3.2nat-siRNA的抑制作用通過先進(jìn)的sRNA深度測(cè)序技術(shù)，科研人員對(duì)植物體內(nèi)的小分子RNA進(jìn)行了全面而深入的分析，在此過程中，成功發(fā)現(xiàn)了一系列由MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的nat-siRNA。這些nat-siRNA的長度大多為21nt，它們?cè)谥参锛?xì)胞內(nèi)扮演著重要的基因表達(dá)調(diào)控角色。在眾多被發(fā)現(xiàn)的nat-siRNA中，nat-siR398-1展現(xiàn)出了對(duì)pri-miR398b/c表達(dá)的顯著抑制作用。為了深入探究nat-siR398-1的作用機(jī)制，科研人員運(yùn)用基因工程手段，構(gòu)建了人工過表達(dá)nat-siR398-1的轉(zhuǎn)基因植株。在構(gòu)建過程中，首先通過化學(xué)合成的方法獲得編碼nat-siR398-1的DNA序列，然后將其克隆到合適的植物表達(dá)載體中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將攜帶nat-siR398-1表達(dá)盒的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，使nat-siR398-1的編碼基因整合到植物基因組中。經(jīng)過篩選和鑒定，獲得穩(wěn)定過表達(dá)nat-siR398-1的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行詳細(xì)的分子生物學(xué)分析，利用定量PCR技術(shù)，精確測(cè)定pri-miR398b/c的表達(dá)水平。以β-actin等組成型表達(dá)基因作為內(nèi)參，通過設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)pri-miR398b/c進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，與野生型植株相比，人工過表達(dá)nat-siR398-1的轉(zhuǎn)基因植株中，pri-miR398b/c的表達(dá)量受到了明顯的抑制。進(jìn)一步的研究表明，nat-siR398-1主要通過與pri-miR398b/c的特定區(qū)域進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)。這種雙鏈結(jié)構(gòu)能夠被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶識(shí)別，進(jìn)而引發(fā)對(duì)pri-miR398b/c的切割和降解，從而抑制了pri-miR398b/c的表達(dá)。這一過程類似于RNA干擾（RNAi）機(jī)制，nat-siR398-1作為一種小分子干擾RNA，在植物體內(nèi)發(fā)揮著精準(zhǔn)調(diào)控基因表達(dá)的作用，為MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控miR398生物合成的機(jī)制增添了新的重要內(nèi)容，也為深入理解植物基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在應(yīng)對(duì)各種生理和環(huán)境變化時(shí)的復(fù)雜性和精細(xì)性提供了關(guān)鍵線索。三、MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控植物抗熱性的機(jī)制3.1植物抗熱性原理及相關(guān)因素植物抗熱性是植物在長期進(jìn)化過程中形成的一種對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)能力，其原理涉及到植物體內(nèi)多個(gè)生理過程和分子機(jī)制的協(xié)同作用，這些機(jī)制共同維持著植物在高溫環(huán)境下的正常生長和發(fā)育。生物膜穩(wěn)定性是植物抗熱性的重要基礎(chǔ)之一。生物膜主要由磷脂雙分子層和鑲嵌其中的蛋白質(zhì)組成，它不僅是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞的重要屏障，還參與了細(xì)胞內(nèi)許多重要的生理過程。在正常溫度條件下，生物膜具有良好的流動(dòng)性和完整性，能夠保證細(xì)胞內(nèi)各種生理活動(dòng)的有序進(jìn)行。然而，當(dāng)植物受到高溫脅迫時(shí)，生物膜的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到嚴(yán)重影響。高溫會(huì)導(dǎo)致生物膜中的磷脂分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，使膜的流動(dòng)性增加，從而破壞膜的穩(wěn)定性。同時(shí)，高溫還可能使膜蛋白變性，導(dǎo)致膜蛋白的功能喪失，進(jìn)而影響生物膜的選擇透性和物質(zhì)運(yùn)輸能力。例如，高溫可能使細(xì)胞膜上的離子通道蛋白失活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子平衡失調(diào)，影響細(xì)胞的正常生理功能。為了維持生物膜的穩(wěn)定性，植物在進(jìn)化過程中形成了一系列的保護(hù)機(jī)制。一些植物會(huì)增加生物膜中飽和脂肪酸的含量，飽和脂肪酸的碳鏈中沒有雙鍵，分子間排列緊密，能夠增強(qiáng)生物膜的穩(wěn)定性，使其在高溫下不易發(fā)生相變。某些植物還會(huì)合成一些特殊的膜保護(hù)物質(zhì)，如甾醇、磷脂酰膽堿等，這些物質(zhì)能夠與生物膜相互作用，增強(qiáng)膜的穩(wěn)定性，減少高溫對(duì)生物膜的損傷。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性在植物抗熱性中也起著關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)是植物細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行各種生理功能的重要生物大分子，其結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性直接影響著植物的正常生長和發(fā)育。高溫會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成破壞，使蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活。蛋白質(zhì)變性后，其原有的酶活性、運(yùn)輸功能、信號(hào)傳導(dǎo)功能等都會(huì)受到影響，從而干擾植物體內(nèi)的各種生理代謝過程。例如，參與光合作用的關(guān)鍵酶，如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco），在高溫下容易發(fā)生變性，導(dǎo)致光合作用效率降低，影響植物的碳同化能力。為了應(yīng)對(duì)高溫對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，植物進(jìn)化出了多種保護(hù)機(jī)制。熱激蛋白（HeatShockProteins，HSPs）是一類在高溫脅迫下大量表達(dá)的蛋白質(zhì)，它們能夠與變性的蛋白質(zhì)結(jié)合，幫助其重新折疊成正確的構(gòu)象，從而恢復(fù)蛋白質(zhì)的活性。HSPs還可以作為分子伴侶，協(xié)助新生蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝，防止蛋白質(zhì)在高溫下發(fā)生聚集和沉淀。植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)也能夠通過清除高溫脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），減少ROS對(duì)蛋白質(zhì)的氧化損傷，維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。熱激蛋白作為植物抗熱性的關(guān)鍵因素之一，具有多種重要的生物學(xué)功能。根據(jù)分子量的大小和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，熱激蛋白可以分為多個(gè)家族，如HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱激蛋白（sHSPs）等。不同家族的熱激蛋白在植物抗熱性中發(fā)揮著不同的作用。HSP100家族的熱激蛋白主要參與解聚高溫脅迫下形成的蛋白質(zhì)聚集體，幫助變性的蛋白質(zhì)重新恢復(fù)活性；HSP90家族的熱激蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)，它能夠與一些信號(hào)分子結(jié)合，調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)過程，從而使植物更好地適應(yīng)高溫環(huán)境；HSP70家族的熱激蛋白在蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解過程中發(fā)揮著重要作用，它能夠識(shí)別并結(jié)合新生的多肽鏈，協(xié)助其正確折疊，同時(shí)還參與了蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸和靶向定位；HSP60家族的熱激蛋白則主要存在于線粒體和葉綠體等細(xì)胞器中，參與細(xì)胞器內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和組裝，保證細(xì)胞器的正常功能；小分子熱激蛋白（sHSPs）是植物中含量最為豐富的熱激蛋白家族之一，它們能夠在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體等多個(gè)細(xì)胞部位發(fā)揮作用，通過與變性的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，防止蛋白質(zhì)的進(jìn)一步聚集和變性，從而保護(hù)細(xì)胞免受高溫傷害。熱激蛋白的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，在正常生長條件下，熱激蛋白的表達(dá)量較低，但當(dāng)植物受到高溫脅迫時(shí)，熱激轉(zhuǎn)錄因子（HeatShockTranscriptionFactors，HSFs）會(huì)被激活，HSFs能夠與熱激蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)熱激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，從而使熱激蛋白的表達(dá)量迅速增加，發(fā)揮其保護(hù)作用。3.2MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本與植物抗熱性的關(guān)系驗(yàn)證3.2.1過表達(dá)實(shí)驗(yàn)為了深入探究MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本與植物抗熱性之間的關(guān)系，科研人員精心設(shè)計(jì)并開展了過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，科研人員運(yùn)用先進(jìn)的基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建了過表達(dá)NAT398b和NAT398c的轉(zhuǎn)基因植株。以模式植物擬南芥為例，首先從擬南芥基因組中克隆出NAT398b和NAT398c基因的全長序列，利用限制性內(nèi)切酶將目的基因片段和表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，然后通過DNA連接酶將目的基因片段與經(jīng)過相同酶切處理的表達(dá)載體連接，構(gòu)建成重組表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入擬南芥細(xì)胞中，經(jīng)過篩選和鑒定，獲得穩(wěn)定過表達(dá)NAT398b和NAT398c的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗熱性檢測(cè)時(shí)，采用了嚴(yán)格控制溫度的人工氣候箱模擬高溫脅迫環(huán)境。將生長狀況一致的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株同時(shí)放入人工氣候箱中，設(shè)置高溫處理組的溫度為42℃，相對(duì)濕度為60%，光照強(qiáng)度為200μmol?m?2?s?1，處理時(shí)間為4小時(shí)；對(duì)照組則設(shè)置為25℃，其他條件與處理組相同。處理結(jié)束后，將植株移至正常生長環(huán)境下恢復(fù)24小時(shí)，然后觀察植株的生長狀態(tài)和表型變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高溫脅迫處理后，過表達(dá)NAT398b和NAT398c的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯的熱敏感癥狀。與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉片出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的萎蔫現(xiàn)象，葉片失水皺縮，顏色變黃，部分葉片甚至出現(xiàn)了壞死斑；植株的生長也受到了顯著抑制，生長速度明顯減緩，植株高度明顯低于野生型植株。對(duì)植株的生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)電導(dǎo)率顯著升高，這表明其細(xì)胞膜受到了更嚴(yán)重的損傷，膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲；丙二醛（MDA）含量也明顯上升，MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的增加進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)基因植株在高溫脅迫下細(xì)胞膜受到的氧化損傷更為嚴(yán)重；而抗氧化酶活性如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性則顯著低于野生型植株，這說明轉(zhuǎn)基因植株在應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)，自身的抗氧化防御系統(tǒng)受到了抑制，無法有效地清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧，從而導(dǎo)致細(xì)胞受到更嚴(yán)重的氧化損傷。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NAT398b和NAT398c的轉(zhuǎn)基因植株中，miR398的表達(dá)水平顯著降低。利用定量PCR技術(shù)對(duì)miR398的表達(dá)量進(jìn)行精確測(cè)定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中miR398的表達(dá)量相較于野生型植株降低了約50%。由于miR398在植物抗熱性中起著重要的調(diào)控作用，其表達(dá)量的降低直接影響了下游靶基因的表達(dá)。miR398的靶標(biāo)基因CSD1編碼銅/鋅超氧化物歧化酶，在植物抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在過表達(dá)NAT398b和NAT398c的轉(zhuǎn)基因植株中，CSD1的表達(dá)水平顯著上調(diào)，這是因?yàn)閙iR398對(duì)CSD1的負(fù)調(diào)控作用減弱，導(dǎo)致CSD1的表達(dá)量增加。然而，盡管CSD1表達(dá)量增加，但由于轉(zhuǎn)基因植株中miR398整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的失衡，使得植株的抗熱性并未得到增強(qiáng)，反而減弱。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，過表達(dá)NAT398b和NAT398c基因會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株抗熱性減弱，MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本在植物抗熱性調(diào)控中扮演著重要角色，其表達(dá)量的變化會(huì)通過影響miR398的生物合成和下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響植物的抗熱能力。3.2.2knockdown實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本對(duì)植物抗熱性的影響，在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，科研人員開展了knockdown實(shí)驗(yàn)，即人為降低NAT398b和NAT398c基因的表達(dá)量，以觀察其對(duì)植物抗熱性的作用。在實(shí)驗(yàn)操作中，科研人員運(yùn)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對(duì)NAT398b和NAT398c基因表達(dá)的抑制。同樣以擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)NAT398b和NAT398c基因的序列，設(shè)計(jì)并合成特異性的干擾片段。將干擾片段克隆到RNAi載體中，構(gòu)建成重組RNAi載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將重組RNAi載體導(dǎo)入擬南芥細(xì)胞中，經(jīng)過篩選和鑒定，獲得NAT398b和NAT398c基因表達(dá)量顯著降低的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗熱性檢測(cè)時(shí)，采用與過表達(dá)實(shí)驗(yàn)相同的高溫脅迫處理?xiàng)l件，即利用人工氣候箱設(shè)置高溫處理組溫度為42℃，相對(duì)濕度60%，光照強(qiáng)度200μmol?m?2?s?1，處理時(shí)間4小時(shí)；對(duì)照組溫度為25℃，其他條件與處理組相同。處理結(jié)束后，將植株移至正常生長環(huán)境下恢復(fù)24小時(shí)，然后觀察植株的生長狀態(tài)和表型變化，并測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人工降低NAT398b和NAT398c基因表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因植株在高溫脅迫下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗熱性。與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉片萎蔫程度明顯減輕，葉片基本保持舒展，顏色鮮綠，僅少數(shù)葉片出現(xiàn)輕微的失水癥狀；植株的生長受抑制程度較輕，生長速度雖然有所減緩，但仍顯著高于過表達(dá)NAT398b和NAT398c的轉(zhuǎn)基因植株，植株高度也更接近正常生長條件下的水平。對(duì)植株的生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于野生型植株，表明其細(xì)胞膜在高溫脅迫下受到的損傷較小，膜透性保持相對(duì)穩(wěn)定，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲較少；丙二醛（MDA）含量也明顯低于野生型植株，說明轉(zhuǎn)基因植株的膜脂過氧化程度較低，細(xì)胞膜受到的氧化損傷較輕；而抗氧化酶活性如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性則顯著高于野生型植株，這表明轉(zhuǎn)基因植株在應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)，自身的抗氧化防御系統(tǒng)被有效激活，能夠及時(shí)清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧，從而減輕氧化損傷，維持細(xì)胞的正常生理功能。在分子水平上，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人為降低NAT398b和NAT398c基因表達(dá)量后，轉(zhuǎn)基因植株中pri-miR398b或pri-miR398c的表達(dá)量以及miR398的積累量均顯著增加。利用定量PCR技術(shù)對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行精確測(cè)定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中pri-miR398b或pri-miR398c的表達(dá)量相較于野生型植株增加了約1.5倍，miR398的表達(dá)量也增加了約1倍。由于miR398表達(dá)量的增加，其對(duì)靶標(biāo)基因CSD1的負(fù)調(diào)控作用增強(qiáng)，導(dǎo)致CSD1的表達(dá)水平顯著下調(diào)。這種基因表達(dá)的變化使得植物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)和熱應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制得到了優(yōu)化，從而增強(qiáng)了植物的抗熱性。綜合knockdown實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得出，人為降低NAT398b和NAT398c基因的表達(dá)量能夠有效增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗熱性，進(jìn)一步證實(shí)了MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本通過調(diào)控miR398的生物合成來影響植物抗熱性的結(jié)論。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相互印證，為深入理解MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本在植物抗熱性調(diào)控中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為通過基因工程手段改良植物抗熱性提供了新的理論支持和技術(shù)策略。3.3MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控植物抗熱性的分子途徑MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本（NAT398b/c）對(duì)植物抗熱性的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過程，涉及到多個(gè)分子層面的相互作用，通過調(diào)控miR398生物合成，進(jìn)而影響其靶標(biāo)基因，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)植物抗熱性的調(diào)控。在正常生長條件下，植物體內(nèi)的MIR398基因正常轉(zhuǎn)錄形成pri-miR398，經(jīng)過一系列復(fù)雜的加工過程，最終生成成熟的miR398。成熟的miR398會(huì)進(jìn)入AGO復(fù)合體，并通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶標(biāo)基因mRNA相結(jié)合，對(duì)靶標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miR398的主要靶標(biāo)基因之一是編碼銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）的CSD1基因，在正常情況下，miR398能夠有效地抑制CSD1基因的表達(dá)，使其維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，從而保證植物體內(nèi)的氧化還原平衡和正常的生理代謝。當(dāng)植物受到高溫脅迫時(shí)，MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本NAT398b/c的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，從而啟動(dòng)對(duì)植物抗熱性的調(diào)控機(jī)制。NAT398b/c轉(zhuǎn)錄本會(huì)分別與pri-miR398b和pri-miR398c形成雙鏈結(jié)構(gòu)。這種雙鏈結(jié)構(gòu)的形成會(huì)降低pri-miR398b/c的穩(wěn)定性，使得它們更容易被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解。隨著pri-miR398b/c的降解加速，其進(jìn)一步加工生成成熟miR398的量也會(huì)顯著減少。與此同時(shí)，由MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的nat-siRNA，如nat-siR398-1，也會(huì)發(fā)揮重要作用。nat-siR398-1能夠通過與pri-miR398b/c的特定區(qū)域進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)核酸酶對(duì)pri-miR398b/c的切割和降解，進(jìn)一步抑制pri-miR398b/c的表達(dá)，減少成熟miR398的生成。由于miR398表達(dá)水平的降低，其對(duì)靶標(biāo)基因CSD1的負(fù)調(diào)控作用減弱。CSD1基因的表達(dá)不再受到miR398的有效抑制，從而導(dǎo)致CSD1的表達(dá)水平上調(diào)。CSD1編碼的銅/鋅超氧化物歧化酶是植物抗氧化防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，它能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過氧化氫，從而清除植物體內(nèi)在高溫脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧，減輕氧化損傷。然而，在MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控下，盡管CSD1表達(dá)量增加，但植物的抗熱性并未得到增強(qiáng)，反而減弱。這可能是因?yàn)橹参锏目篃徇^程是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，miR398除了調(diào)控CSD1基因外，還可能參與其他抗熱相關(guān)基因的調(diào)控。MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本對(duì)miR398生物合成的抑制，打破了植物體內(nèi)原本的抗熱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)平衡，使得植物無法有效地應(yīng)對(duì)高溫脅迫。例如，miR398可能還參與調(diào)控一些與熱激蛋白合成、細(xì)胞膜穩(wěn)定性維持等相關(guān)基因的表達(dá)，當(dāng)miR398表達(dá)量下降時(shí)，這些基因的表達(dá)也會(huì)受到影響，從而導(dǎo)致植物抗熱性減弱。綜上所述，MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本NAT398b/c通過與pri-miR398b/c形成雙鏈結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)生nat-siRNA抑制pri-miR398b/c表達(dá)這兩種方式，調(diào)控miR398的生物合成，進(jìn)而影響其靶標(biāo)基因CSD1等的表達(dá)，打破植物體內(nèi)抗熱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的平衡，最終導(dǎo)致植物抗熱性的改變。這一分子途徑的揭示，為深入理解植物抗熱機(jī)制以及通過基因工程手段改良植物抗熱性提供了重要的理論依據(jù)。四、基于MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控的應(yīng)用前景4.1在作物抗熱改良中的潛在應(yīng)用隨著全球氣候變暖趨勢(shì)的加劇，高溫脅迫對(duì)作物生長和產(chǎn)量的影響日益嚴(yán)重，成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。深入了解植物的抗熱機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)有效的抗熱改良策略，對(duì)于保障糧食安全和農(nóng)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展具有至關(guān)重要的意義。MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控miR398生物合成和植物抗熱性這一發(fā)現(xiàn)，為作物抗熱改良提供了全新的理論基礎(chǔ)和潛在的應(yīng)用途徑。從基因工程育種的角度來看，利用MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控機(jī)制培育抗熱性增強(qiáng)的作物品種具有廣闊的前景?？梢酝ㄟ^基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)作物中的MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本相關(guān)基因進(jìn)行精準(zhǔn)編輯。對(duì)于那些抗熱性較弱的作物品種，可以設(shè)計(jì)針對(duì)MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本基因（如NAT398b和NAT398c）的sgRNA，將CRISPR/Cas9表達(dá)載體導(dǎo)入作物細(xì)胞中。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9蛋白會(huì)在sgRNA的引導(dǎo)下，特異性地切割NAT398b和NAT398c基因，使其發(fā)生移碼突變或片段缺失，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)這些基因的敲除或表達(dá)量的大幅降低。這樣一來，pri-miR398b或pri-miR398c的穩(wěn)定性將得以提高，成熟miR398的積累量增加，進(jìn)而增強(qiáng)作物對(duì)高溫脅迫的耐受性。以水稻為例，若成功敲除水稻中的MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本基因，有望增強(qiáng)水稻在高溫季節(jié)的生長能力，減少高溫對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的負(fù)面影響，提高水稻在全球變暖背景下的適應(yīng)性。在傳統(tǒng)雜交育種中，MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控機(jī)制也能發(fā)揮重要作用?？梢院Y選那些天然存在MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量較低或功能缺失的作物種質(zhì)資源，將其作為親本與其他優(yōu)良性狀的品種進(jìn)行雜交。通過對(duì)雜交后代的遺傳分析和抗熱性鑒定，篩選出同時(shí)具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀和高抗熱性的新品種。假設(shè)在小麥中發(fā)現(xiàn)了一種MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量較低的野生種質(zhì)，它具有較強(qiáng)的抗熱性，但產(chǎn)量較低、品質(zhì)較差。將其與高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的栽培品種進(jìn)行雜交，在雜交后代中，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，檢測(cè)MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本基因的表達(dá)水平和遺傳背景，篩選出既繼承了野生種質(zhì)抗熱性，又具有栽培品種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)特性的小麥新品種，為小麥生產(chǎn)應(yīng)對(duì)高溫脅迫提供新的品種資源。除了直接改良作物品種，MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控機(jī)制還可以為作物栽培管理提供新的思路。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，可以通過調(diào)控作物生長環(huán)境中的某些因素，間接影響MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，從而提高作物的抗熱性。研究發(fā)現(xiàn)，一些植物激素如脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）等在植物逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，它們可能通過影響MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)來調(diào)節(jié)植物的抗熱性。在高溫脅迫來臨前，可以對(duì)作物噴施適量的ABA或SA，誘導(dǎo)作物自身的抗熱響應(yīng)機(jī)制，降低MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，增加miR398的積累，提高作物的抗熱能力。合理的施肥管理也可能對(duì)MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)產(chǎn)生影響。例如，適量增加銅肥的施用，可能會(huì)影響植物體內(nèi)銅離子的代謝和平衡，進(jìn)而影響miR398的生物合成和MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控作用，最終提高作物的抗熱性。4.2對(duì)植物基因表達(dá)調(diào)控研究的拓展意義本研究對(duì)于深入理解植物基因沉默和表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有多方面的重要意義，為植物基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域的研究開辟了新的方向，拓展了研究的深度和廣度。從基因沉默機(jī)制的角度來看，MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本通過與pri-miR398b/c形成雙鏈結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)生nat-siRNA抑制pri-miR398b/c表達(dá)，這種獨(dú)特的調(diào)控方式豐富了我們對(duì)植物基因沉默機(jī)制的認(rèn)識(shí)。傳統(tǒng)的基因沉默機(jī)制主要包括轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGS）和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS），其中PTGS主要是通過RNA干擾（RNAi）途徑實(shí)現(xiàn)的，即外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA（dsRNA）被核酸酶切割成小干擾RNA（siRNA），siRNA與相關(guān)蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），RISC識(shí)別并降解與siRNA互補(bǔ)的靶標(biāo)mRNA，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默。而本研究中發(fā)現(xiàn)的MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控機(jī)制，為PTGS提供了新的作用模式。NAT398b/c轉(zhuǎn)錄本與pri-miR398b/c形成的雙鏈結(jié)構(gòu)，直接影響了pri-miR398b/c的穩(wěn)定性，使其更容易被降解，這不同于傳統(tǒng)的RNAi途徑中siRNA對(duì)靶標(biāo)mRNA的作用方式；nat-siRNA雖然也是通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與pri-miR398b/c結(jié)合并引發(fā)降解，但它是由天然反義轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的，這為siRNA的來源和作用機(jī)制增添了新的內(nèi)容。這種新的基因沉默機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，有助于我們更全面地理解植物如何在轉(zhuǎn)錄后水平精確調(diào)控基因表達(dá)，為進(jìn)一步研究植物基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要的理論基礎(chǔ)。在植物基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究中，本研究也具有重要的拓展意義。植物的生長發(fā)育和對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到眾多基因的表達(dá)調(diào)控，這些基因之間相互作用，形成了一個(gè)龐大而復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR398作為植物中重要的調(diào)控因子，參與了植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)等多個(gè)過程，而MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)，揭示了miR398生物合成過程中的一個(gè)重要調(diào)控節(jié)點(diǎn)。NAT398b/c通過調(diào)控miR398的生物合成，進(jìn)而影響其靶標(biāo)基因CSD1等的表達(dá)，這表明MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本與miR398及其靶標(biāo)基因之間存在著緊密的調(diào)控關(guān)系，它們共同構(gòu)成了植物基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要模塊。深入研究這一模塊的調(diào)控機(jī)制，有助于我們更好地理解植物基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和整體性。通過解析MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本在不同環(huán)境條件下對(duì)miR398生物合成的調(diào)控變化，以及這種變化如何影響下游靶標(biāo)基因的表達(dá)和植物的生理響應(yīng)，我們可以進(jìn)一步揭示植物在應(yīng)對(duì)環(huán)境變化時(shí)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為研究植物適應(yīng)環(huán)境的分子機(jī)制提供新的線索。此外，本研究對(duì)于探索植物中其他天然反義轉(zhuǎn)錄本與miRNA之間的調(diào)控關(guān)系也具有重要的啟示作用。目前，雖然已經(jīng)在多種植物中發(fā)現(xiàn)了天然反義轉(zhuǎn)錄本的存在，但對(duì)于它們與miRNA之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制的研究還相對(duì)較少。MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)控miR398生物合成這一機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，為研究其他天然反義轉(zhuǎn)錄本與miRNA之間的關(guān)系提供了一個(gè)重要的范例。我們可以借鑒本研究中的實(shí)驗(yàn)方法和研究思路，對(duì)其他植物中的天然反義轉(zhuǎn)錄本與miRNA進(jìn)行深入研究，探討它們?cè)谥参锷L發(fā)育、逆境響應(yīng)等過程中的作用機(jī)制。這將有助于我們更全面地了解植物基因表達(dá)調(diào)控的多樣性和復(fù)雜性，豐富植物基因表達(dá)調(diào)控的理論體系。五、結(jié)論與展望5.1研究主要成果總結(jié)本研究圍繞MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本在miR398生物合成及植物抗熱性調(diào)控中的作用展開深入探究，取得了一系列重要成果。在MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本與miR398生物合成方面，成功發(fā)現(xiàn)并鑒定了擬南芥中MIR398b和MIR398c的天然反義轉(zhuǎn)錄本NAT398b和NAT398c，以及白菜中的BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2。通過分析它們?cè)跀M南芥植株中的表達(dá)模式，明確了MIR398b和MIR398c在維管束組織中分別與其反義基因NAT398b和NAT398c共表達(dá)。深入研究了MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本對(duì)miR398生物合成的調(diào)控方式，發(fā)現(xiàn)NAT398b和NAT398c轉(zhuǎn)錄本分別與pri-miR398b和pri-miR398c形成雙鏈結(jié)構(gòu)，降低了pri-miR398b和pri-miR398c的穩(wěn)定性，從而影響miR398的生物合成；通過sRNA深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)了由MIR398天然反義轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的nat-