TESTIN基因：原發(fā)性胃癌發(fā)生發(fā)展與預(yù)后評(píng)估的關(guān)鍵密碼一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)胃癌病例約120萬，死亡人數(shù)近70萬，我國(guó)每年新發(fā)胃癌人數(shù)約為42.4萬，死亡人數(shù)近30萬，發(fā)病和死亡人數(shù)約占全球胃癌發(fā)病和死亡人數(shù)的二分之一。胃癌在我國(guó)的發(fā)病率在消化道腫瘤中位居首位，在所有腫瘤中位居第二位，死亡率位居第三位，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和壽命。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、飲食、幽門螺桿菌感染等多種因素。雖然近年來胃癌的治療手段不斷發(fā)展，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但總體5年生存率仍較低，尤其是晚期胃癌患者的預(yù)后仍然較差。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟的復(fù)雜過程，涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活。尋找與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，深入研究其作用機(jī)制，對(duì)于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。TESTIN基因，又稱為TES基因，定位于染色體7q31.2脆性部位FRA7G。已有研究表明，TESTIN基因在多種正常組織中廣泛表達(dá)，如心臟、肝臟、肺、腎臟等，參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。然而，在多種原發(fā)腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中，TESTIN基因的表達(dá)常常缺失或下調(diào)，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等，提示其可能作為一個(gè)候選抑癌基因發(fā)揮作用。在胃癌的研究中，前期研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性胃癌組織中染色體7q31區(qū)域D7S486位點(diǎn)存在高頻雜合性缺失，而TESTIN基因正好位于該區(qū)域。這一發(fā)現(xiàn)為研究TESTIN基因與胃癌的關(guān)系提供了重要線索。進(jìn)一步研究TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，有望為胃癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義和應(yīng)用前景。1.2TESTIN基因概述TESTIN基因，也被稱作TES基因，在人類基因組中定位于染色體7q31.2脆性部位FRA7G。該基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，其編碼的蛋白質(zhì)包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了TESTIN蛋白參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程的能力。在正常組織中，TESTIN基因呈現(xiàn)廣泛表達(dá)的模式。在心臟組織中，TESTIN蛋白參與維持心肌細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于心肌的收縮和舒張起著重要的調(diào)節(jié)作用。通過與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，它能夠穩(wěn)定心肌細(xì)胞的形態(tài)，確保心臟的正常泵血功能。在肝臟中，TESTIN基因的表達(dá)有助于維持肝細(xì)胞的正常代謝和解毒功能，對(duì)于肝臟的生理穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在肺組織中，它參與肺泡上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)維持和氣體交換功能的調(diào)節(jié)，保障肺部的正常呼吸功能。在腎臟中，TESTIN基因的表達(dá)對(duì)于腎小管上皮細(xì)胞的功能發(fā)揮具有重要意義，參與腎臟的排泄和重吸收等生理過程。TESTIN基因被認(rèn)為是候選抑癌基因，有著多方面的依據(jù)。在多種原發(fā)腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等，均發(fā)現(xiàn)TESTIN基因的表達(dá)常常缺失或下調(diào)。在乳腺癌細(xì)胞系中，TESTIN基因的低表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。研究表明，通過恢復(fù)TESTIN基因的表達(dá)，可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在卵巢癌組織中，TESTIN基因的表達(dá)缺失與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后密切相關(guān)。對(duì)卵巢癌患者的臨床病理分析發(fā)現(xiàn)，TESTIN基因表達(dá)水平越低，患者的生存率越低，腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)越高。從細(xì)胞生物學(xué)功能角度來看，TESTIN蛋白參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要過程。在細(xì)胞骨架構(gòu)建方面，TESTIN蛋白與肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架成分相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組裝和穩(wěn)定性，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。當(dāng)TESTIN基因表達(dá)異常時(shí)，細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)改變和遷移能力增強(qiáng)，這是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)。在細(xì)胞粘附過程中，TESTIN蛋白通過與細(xì)胞粘附分子相互作用，維持細(xì)胞間的正常連接，抑制腫瘤細(xì)胞的脫離和轉(zhuǎn)移。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，TESTIN蛋白參與多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，如PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)TESTIN基因表達(dá)缺失或下調(diào)時(shí)，這些信號(hào)通路的平衡被打破，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。1.3原發(fā)性胃癌的研究現(xiàn)狀原發(fā)性胃癌作為一種起源于胃壁的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均處于較高水平。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，胃癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)108.9萬，位居全球所有惡性腫瘤的第5位；死亡病例數(shù)達(dá)76.9萬，位居第4位。在我國(guó)，胃癌同樣是嚴(yán)重威脅居民健康的重大疾病，每年新發(fā)病例數(shù)約為48萬，死亡病例數(shù)約為37萬。從地域分布來看，東亞地區(qū)是胃癌的高發(fā)區(qū)，我國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家的胃癌發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)。在發(fā)病機(jī)制研究方面，盡管目前尚未完全闡明原發(fā)性胃癌的發(fā)病機(jī)制，但已經(jīng)明確其是一個(gè)涉及多因素、多步驟的復(fù)雜過程。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染被公認(rèn)為是胃癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一。大量研究表明，長(zhǎng)期的Hp感染可引發(fā)慢性胃炎、胃潰瘍等疾病，進(jìn)而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)針對(duì)我國(guó)多個(gè)地區(qū)的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查顯示，Hp感染率與胃癌發(fā)病率呈正相關(guān)，Hp感染人群患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是未感染人群的3-6倍。不良飲食習(xí)慣在胃癌發(fā)生中也起著重要作用。長(zhǎng)期食用高鹽、腌制、熏制、油炸等食品，以及新鮮蔬菜、水果攝入不足，都可能導(dǎo)致胃黏膜損傷，增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。長(zhǎng)期高鹽飲食會(huì)破壞胃黏膜的保護(hù)屏障，使胃黏膜更容易受到其他致癌因素的侵害；腌制食品中含有大量的亞硝酸鹽，在胃內(nèi)可轉(zhuǎn)化為亞硝胺，而亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物。遺傳因素在胃癌發(fā)病中也占據(jù)重要地位。家族中有胃癌患者的人群，其患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于普通人群。研究發(fā)現(xiàn)，某些特定的基因變異與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，如CDH1、TP53等基因的突變，可導(dǎo)致細(xì)胞間連接喪失、細(xì)胞增殖和凋亡失衡，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生。環(huán)境因素如長(zhǎng)期暴露于含有高濃度硝酸鹽、亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)的環(huán)境中，也可能增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在胃癌的診斷方面，目前主要依靠胃鏡檢查、病理活檢、影像學(xué)檢查（如CT、MRI等）以及腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等方法。胃鏡檢查結(jié)合病理活檢是診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠直接觀察胃內(nèi)病變情況，并獲取組織進(jìn)行病理診斷。然而，胃鏡檢查屬于侵入性檢查，部分患者可能難以接受，且早期胃癌的病變往往較為隱匿，容易漏診。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等，雖然具有操作簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，但它們的特異性和敏感性有限，不能單獨(dú)用于胃癌的診斷，主要用于輔助診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。在治療方面，手術(shù)切除仍然是胃癌的主要治療方法，尤其是對(duì)于早期胃癌患者，手術(shù)切除有望達(dá)到根治的效果。然而，對(duì)于中晚期胃癌患者，單純手術(shù)治療的效果往往不理想，需要結(jié)合化療、放療、靶向治療和免疫治療等綜合治療手段?；熓侵型砥谖赴┚C合治療的重要組成部分，通過使用化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞，可在一定程度上控制腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。但化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。放療則是利用高能射線照射腫瘤組織，殺死癌細(xì)胞。放療可用于術(shù)前縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除率；也可用于術(shù)后輔助治療，降低腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。靶向治療和免疫治療是近年來胃癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重要進(jìn)展。靶向治療藥物能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞表面的靶點(diǎn)，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖信號(hào)通路，具有療效高、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。例如，抗人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）靶向藥物曲妥珠單抗，對(duì)于HER2陽性的胃癌患者，可顯著延長(zhǎng)患者的生存期。免疫治療則是通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，在胃癌治療中顯示出了一定的療效，為晚期胃癌患者帶來了新的治療選擇。盡管在胃癌的發(fā)病機(jī)制研究、診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但目前胃癌的總體5年生存率仍較低，尤其是晚期胃癌患者的預(yù)后仍然較差。這主要是由于胃癌早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)。此外，胃癌的異質(zhì)性強(qiáng)，不同患者對(duì)治療的反應(yīng)存在差異，也給治療帶來了挑戰(zhàn)。因此，尋找新的與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，深入研究其作用機(jī)制，對(duì)于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)更加有效的診斷方法和治療策略具有重要的意義。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討TESTIN基因在原發(fā)性胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在機(jī)制，為胃癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供理論依據(jù)和新的靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：檢測(cè)TESTIN基因在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）技術(shù)，對(duì)收集的胃癌組織和癌旁正常組織樣本中的TESTIN基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行精確測(cè)定，通過比較兩者的表達(dá)差異，明確TESTIN基因在胃癌組織中的表達(dá)變化趨勢(shì)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），檢測(cè)胃癌組織和癌旁正常組織中TESTIN蛋白的表達(dá)量，從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證TESTIN基因在胃癌中的表達(dá)情況，分析其與mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。利用免疫組織化學(xué)染色（IHC）技術(shù)，對(duì)胃癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行染色，觀察TESTIN蛋白在組織中的定位和分布情況，直觀地了解TESTIN基因在胃癌組織中的表達(dá)特征。分析TESTIN基因表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系：收集患者的詳細(xì)臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。將TESTIN基因的表達(dá)水平與這些臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，采用卡方檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法，明確TESTIN基因表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，探討TESTIN基因表達(dá)對(duì)胃癌生物學(xué)行為的影響。研究TESTIN基因表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系：通過對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，獲取患者的生存時(shí)間、復(fù)發(fā)情況等預(yù)后信息。運(yùn)用生存分析方法，如Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)比較不同TESTIN基因表達(dá)水平患者的生存率差異，評(píng)估TESTIN基因表達(dá)對(duì)胃癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。構(gòu)建Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，分析TESTIN基因表達(dá)以及其他臨床病理因素對(duì)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響，篩選出影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，為臨床預(yù)后評(píng)估提供更準(zhǔn)確的指標(biāo)。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1標(biāo)本來源本研究收集了2018年1月至2021年12月期間，于[醫(yī)院名稱]接受手術(shù)治療的140例原發(fā)性胃癌患者的癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織（距離癌組織邊緣至少5cm）標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，且臨床病理資料完整?；颊吣挲g范圍為35-75歲，平均年齡（55.5±10.2）歲，其中男性86例，女性54例。在手術(shù)過程中，新鮮的組織標(biāo)本獲取后，立即用冰冷的生理鹽水沖洗，以去除血液和雜質(zhì)。隨后，將部分組織切成約1cm×1cm×1cm大小的小塊，迅速放入液氮中速凍，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)；另一部分組織則放入10%中性福爾馬林溶液中固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（IHC）分析。所有標(biāo)本的采集均獲得了患者及其家屬的知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵循了相關(guān)的倫理準(zhǔn)則和規(guī)范。2.1.2主要試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)使用的主要試劑如下：TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取組織中的總RNA，其能夠有效裂解細(xì)胞，使RNA釋放并保持其完整性，從而滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA質(zhì)量的要求；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均來自TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒可將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒則用于對(duì)cDNA進(jìn)行定量擴(kuò)增，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來精確測(cè)定目的基因的表達(dá)量；兔抗人TESTIN多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，該抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確識(shí)別TESTIN蛋白，用于Westernblot和IHC實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)TESTIN蛋白的表達(dá)；鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，作為內(nèi)參抗體，用于校正目的蛋白的表達(dá)量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司，在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，它們分別與一抗結(jié)合，通過酶催化底物顯色來顯示目的蛋白條帶；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于IHC實(shí)驗(yàn)中的顯色反應(yīng)，使抗原抗體結(jié)合部位呈現(xiàn)出棕黃色，便于在顯微鏡下觀察；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司，在Westernblot實(shí)驗(yàn)中用于轉(zhuǎn)膜，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以便后續(xù)的抗體檢測(cè)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合后，能夠產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過曝光顯影來檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)用到的主要儀器有：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于組織勻漿的離心分離，能夠在低溫條件下快速分離細(xì)胞組分，保證RNA和蛋白質(zhì)的活性；PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行PCR反應(yīng)，精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)cDNA的高效擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司），可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)變化，對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶，通過拍攝凝膠圖像并進(jìn)行分析，獲取蛋白表達(dá)的相關(guān)信息；恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)和抗體孵育等實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境；顯微鏡（Olympus公司），用于觀察免疫組織化學(xué)染色后的切片，識(shí)別細(xì)胞形態(tài)和抗原表達(dá)情況。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1RNA提取與RT-PCR使用TRIzol試劑提取組織總RNA。取約100mg的胃癌組織或癌旁正常組織，放入含有1mlTRIzol試劑的無RNA酶的1.5ml離心管中，用組織勻漿器充分勻漿，使組織完全裂解。室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫孵育3min。4℃、12000×g離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色水相，RNA主要存在于該相中；中間層為白色蛋白層；下層為紅色酚氯仿相。小心吸取上層水相至新的離心管中，避免吸取到中間層和下層液體，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫孵育10min，以沉淀RNA。4℃、12000×g離心10min，可見管底部出現(xiàn)白色膠狀RNA沉淀。棄上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀，振蕩混勻，4℃、7500×g離心5min。棄上清，將離心管倒扣在濾紙上，盡量吸干殘留液體，室溫干燥5-10min，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。加入適量的無RNA酶水，用移液器反復(fù)吹打，使RNA充分溶解，-80℃保存?zhèn)溆?。使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。采用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在0.2mlPCR管中依次加入5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、Oligo(dT)Primer1μl、Random6-mers1μl、總RNA1-5μg，用RNaseFreedH?O補(bǔ)齊至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將PCR管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5s（逆轉(zhuǎn)錄酶失活），反應(yīng)結(jié)束后，cDNA產(chǎn)物可立即用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在0.2mlPCR管中依次加入2×TaqPCRMasterMix12.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、cDNA模板2μl，用ddH?O補(bǔ)齊至25μl。引物序列根據(jù)TESTIN基因和內(nèi)參基因β-actin的序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TESTIN基因上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；β-actin上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。將PCR管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，[退火溫度]退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析擴(kuò)增條帶的情況。2.2.2Westernblotting檢測(cè)蛋白表達(dá)將胃癌組織和癌旁正常組織從-80℃冰箱取出，放入含有RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）的1.5ml離心管中，用組織勻漿器充分勻漿，冰上裂解30min，使組織中的蛋白充分釋放。4℃、12000×g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品按照試劑盒說明書進(jìn)行稀釋和加樣，在96孔板中依次加入BCA工作液，37℃孵育30min，用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，使終濃度為1×，混勻后，100℃煮沸5min，使蛋白充分變性。冷卻至室溫后，短暫離心，將蛋白樣品上樣到10%的SDS凝膠加樣孔中，同時(shí)加入預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳槽中加入適量的電泳緩沖液，先80V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，改為120V恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。按照“三明治”結(jié)構(gòu)，將PVDF膜、凝膠、濾紙依次放置在轉(zhuǎn)膜裝置中，注意避免產(chǎn)生氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，300mA恒流轉(zhuǎn)膜90min，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，室溫?fù)u床封閉1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人TESTIN多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋）的混合液中，4℃孵育過夜，使抗體與膜上的目的蛋白充分結(jié)合。次日，將PVDF膜從抗體孵育液中取出，用TBST洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的抗體。將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋）和山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋）的混合液中，室溫?fù)u床孵育1h，使二抗與一抗充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的二抗。將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光試劑中，室溫孵育1-2min，使化學(xué)發(fā)光試劑與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，進(jìn)行曝光和顯影，分析目的蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算TESTIN蛋白的相對(duì)表達(dá)量。2.2.3免疫組化SP法檢測(cè)蛋白表達(dá)將石蠟包埋的胃癌組織和癌旁正常組織切片（厚度為4μm）置于60℃恒溫箱中烘烤2h，使切片牢固附著在載玻片上。將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min，進(jìn)行脫蠟處理；然后依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各浸泡5min，進(jìn)行水化處理，使組織恢復(fù)到含水狀態(tài)。將水化后的切片放入0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）中，用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)。將切片放入裝有枸櫞酸鈉緩沖液的容器中，微波爐高火加熱至沸騰，然后中火維持沸騰狀態(tài)10-15min，自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗容器，加快冷卻至室溫。修復(fù)后的切片用PBS沖洗3次，每次5min，以去除殘留的緩沖液。在切片上滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，避免非特異性染色。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次5min。在切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，以封閉組織中的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。甩去多余液體，不洗。在切片上滴加兔抗人TESTIN多克隆抗體（1:200稀釋），將切片放入濕盒中，4℃孵育過夜，使抗體與組織中的TESTIN蛋白充分結(jié)合。次日，將切片從濕盒中取出，用PBS沖洗3次，每次5min，以去除未結(jié)合的抗體。在切片上滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30min，使二抗與一抗充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次5min。在切片上滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液，室溫孵育30min，形成抗原-一抗-二抗-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次5min。在切片上滴加DAB顯色液，室溫顯色5-10min，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用自來水沖洗終止顯色反應(yīng)。將顯色后的切片用蘇木精復(fù)染2min，使細(xì)胞核染成藍(lán)色，然后用鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗10-15min，使細(xì)胞核顏色清晰。將復(fù)染后的切片依次放入70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各浸泡5min，進(jìn)行脫水處理；然后放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min，進(jìn)行透明處理。最后，在切片上滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，進(jìn)行封片。在顯微鏡下觀察切片，分析TESTIN蛋白在組織中的表達(dá)和定位情況。2.3數(shù)據(jù)分析方法本研究運(yùn)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于TESTIN基因mRNA和蛋白表達(dá)水平在胃癌組織與癌旁正常組織中的比較，由于是配對(duì)樣本，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以明確兩者之間是否存在顯著差異。在分析TESTIN基因表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)（如性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）的關(guān)系時(shí)，使用卡方檢驗(yàn)，判斷TESTIN基因表達(dá)水平在不同臨床病理特征組間的分布是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在研究TESTIN基因表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系時(shí)，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，直觀地展示不同TESTIN基因表達(dá)水平患者的生存情況。通過log-rank檢驗(yàn)比較生存曲線之間的差異，確定TESTIN基因表達(dá)對(duì)胃癌患者生存率的影響是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步構(gòu)建Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，將TESTIN基因表達(dá)以及其他可能影響預(yù)后的臨床病理因素納入模型，分析各因素對(duì)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響，篩選出影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果3.1RT-PCR檢測(cè)結(jié)果采用RT-PCR技術(shù)對(duì)140例原發(fā)性胃癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中TESTIN基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參基因，通過比較目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶灰度值，計(jì)算TESTIN基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在癌旁正常組織中，TESTIN基因mRNA的表達(dá)水平相對(duì)較高；而在胃癌組織中，TESTIN基因mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)。具體數(shù)據(jù)如表1所示：表1胃癌組織和癌旁正常組織中TESTIN基因mRNA表達(dá)水平比較（）組織類型nTESTIN基因mRNA相對(duì)表達(dá)量癌旁正常組織1401.02\pm0.25胃癌組織1400.35\pm0.12配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果表明，胃癌組織中TESTIN基因mRNA的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織（t=24.68，P<0.001）。以癌旁正常組織中TESTIN基因mRNA表達(dá)量的均值作為參照，將胃癌組織中TESTIN基因mRNA表達(dá)量低于參照均值50%的樣本定義為表達(dá)下調(diào)。在140例胃癌組織樣本中，有96例（68.6%）出現(xiàn)TESTIN基因mRNA表達(dá)下調(diào)。通過對(duì)胃癌組織和癌旁正常組織中TESTIN基因mRNA表達(dá)水平的散點(diǎn)圖分析（圖1），可以更直觀地看出兩組之間的差異。癌旁正常組織的TESTIN基因mRNA表達(dá)水平主要分布在0.7-1.3之間，而胃癌組織的表達(dá)水平則主要集中在0-0.6之間，兩組數(shù)據(jù)分布呈現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)。本研究結(jié)果與以往相關(guān)研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中存在mRNA水平的低表達(dá)，提示TESTIN基因可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。這種低表達(dá)可能導(dǎo)致TESTIN蛋白功能缺失，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生物學(xué)行為，如細(xì)胞粘附、遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，最終促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。3.2Westernblotting檢測(cè)結(jié)果為進(jìn)一步驗(yàn)證TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中的表達(dá)情況，采用Westernblotting技術(shù)對(duì)50例原發(fā)性胃癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中TESTIN蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過分析目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值，計(jì)算TESTIN蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在癌旁正常組織中，TESTIN蛋白呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)；而在胃癌組織中，TESTIN蛋白的表達(dá)水平明顯降低。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表2所示：表2胃癌組織和癌旁正常組織中TESTIN蛋白表達(dá)水平比較（）組織類型nTESTIN蛋白相對(duì)表達(dá)量癌旁正常組織500.85\pm0.18胃癌組織500.28\pm0.10配對(duì)t檢驗(yàn)分析表明，胃癌組織中TESTIN蛋白的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織（t=16.72，P<0.001）。在50例胃癌組織樣本中，有36例（72.0%）出現(xiàn)TESTIN蛋白表達(dá)降低。對(duì)胃癌組織和癌旁正常組織中TESTIN蛋白表達(dá)水平的Westernblotting結(jié)果進(jìn)行灰度分析，得到的典型蛋白條帶圖（圖2）清晰地展示了兩組之間的差異。癌旁正常組織中TESTIN蛋白條帶的灰度值明顯高于胃癌組織，直觀地反映出TESTIN蛋白在胃癌組織中的低表達(dá)情況。1-5：癌旁正常組織；6-10：胃癌組織；β-actin為內(nèi)參蛋白本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)TESTIN基因mRNA表達(dá)水平的結(jié)果具有一致性，均表明TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中存在明顯的低表達(dá)現(xiàn)象。從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實(shí)了TESTIN基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用，其蛋白表達(dá)的降低可能導(dǎo)致細(xì)胞正常生物學(xué)功能的改變，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性行為。3.3免疫組化檢測(cè)結(jié)果采用免疫組化SP法對(duì)140例原發(fā)性胃癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中TESTIN蛋白的表達(dá)及定位情況進(jìn)行了檢測(cè)。免疫組化染色結(jié)果顯示，在癌旁正常組織中，TESTIN蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)出明顯的棕黃色陽性染色，陽性表達(dá)率較高；而在胃癌組織中，大部分癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中TESTIN蛋白染色較淺或無染色，呈現(xiàn)陰性表達(dá)，僅少數(shù)癌細(xì)胞可見弱陽性染色。典型的免疫組化染色圖片如圖3所示：A：癌旁正常組織，TESTIN蛋白陽性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色；B：胃癌組織，TESTIN蛋白陰性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)無明顯染色對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行量化分析，統(tǒng)計(jì)TESTIN蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的陽性和陰性表達(dá)率，具體數(shù)據(jù)如表3所示：表3胃癌組織和癌旁正常組織中TESTIN蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果組織類型n陽性例數(shù)（%）陰性例數(shù)（%）癌旁正常組織140120（85.7%）20（14.3%）胃癌組織14032（22.9%）108（77.1%）卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，TESTIN蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織（\chi^2=112.45，P<0.001）。這一結(jié)果與RT-PCR和Westernblotting檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中存在明顯的低表達(dá)現(xiàn)象，且免疫組化染色能夠直觀地展示TESTIN蛋白在組織中的定位和表達(dá)差異，為深入研究TESTIN基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。四、TESTIN基因表達(dá)與原發(fā)性胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系4.1與患者基本信息的關(guān)系將140例原發(fā)性胃癌患者按照TESTIN基因表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中高表達(dá)組定義為TESTIN基因mRNA表達(dá)量高于所有樣本表達(dá)量中位數(shù)的樣本集合，低表達(dá)組則為低于中位數(shù)的樣本集合。通過卡方檢驗(yàn)分析TESTIN基因表達(dá)與患者年齡、性別等基本信息的關(guān)系，結(jié)果如表4所示：表4TESTIN基因表達(dá)與患者基本信息的關(guān)系基本信息例數(shù)TESTIN基因高表達(dá)（n，%）TESTIN基因低表達(dá)（n，%）\chi^2P年齡（歲）0.180.67≤557234（47.2%）38（52.8%）--＞556830（44.1%）38（55.9%）--性別0.050.82男8640（46.5%）46（53.5%）--女5424（44.4%）30（55.6%）--從表4可以看出，TESTIN基因表達(dá)水平在不同年齡組（以55歲為界）和不同性別患者之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這表明患者的年齡和性別因素與TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中的表達(dá)水平無明顯關(guān)聯(lián)。有研究表明，在某些腫瘤中，基因的表達(dá)可能會(huì)受到年齡和性別的影響。在乳腺癌中，雌激素受體相關(guān)基因的表達(dá)與患者年齡和月經(jīng)狀態(tài)密切相關(guān)，年輕患者和絕經(jīng)前患者的基因表達(dá)模式與老年患者和絕經(jīng)后患者存在顯著差異。然而，本研究中TESTIN基因在原發(fā)性胃癌中的表達(dá)未呈現(xiàn)出與年齡和性別相關(guān)的特征，提示TESTIN基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制在胃癌中可能具有獨(dú)特性，不受年齡和性別的直接影響，其表達(dá)變化可能更多地與腫瘤自身的生物學(xué)特性和發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)。4.2與腫瘤病理特征的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)分析TESTIN基因表達(dá)與胃癌分化程度、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征的關(guān)系，結(jié)果如表5所示：表5TESTIN基因表達(dá)與胃癌病理特征的關(guān)系病理特征例數(shù)TESTIN基因高表達(dá)（n，%）TESTIN基因低表達(dá)（n，%）\chi^2P分化程度7.860.005高分化3018（60.0%）12（40.0%）--中分化5626（46.4%）30（53.6%）--低分化5420（37.0%）34（63.0%）--腫瘤大?。╟m）3.210.073≤57638（50.0%）38（50.0%）--＞56426（40.6%）38（59.4%）--浸潤(rùn)深度10.250.001T1+T24224（57.1%）18（42.9%）--T3+T49840（40.8%）58（59.2%）--淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12.56＜0.001無5834（58.6%）24（41.4%）--有8230（36.6%）52（63.4%）--從表5可以看出，TESTIN基因表達(dá)與胃癌分化程度存在顯著相關(guān)性（P=0.005）。高分化胃癌組織中TESTIN基因高表達(dá)的比例為60.0%，中分化胃癌組織中為46.4%，低分化胃癌組織中為37.0%，隨著胃癌分化程度的降低，TESTIN基因高表達(dá)的比例逐漸下降，提示TESTIN基因表達(dá)可能與胃癌細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)，其高表達(dá)可能有助于維持胃癌細(xì)胞的分化狀態(tài)，抑制腫瘤的惡性進(jìn)展。在腫瘤大小方面，雖然TESTIN基因表達(dá)在腫瘤大小≤5cm和＞5cm組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.073），但腫瘤大?。?cm組中TESTIN基因低表達(dá)的比例相對(duì)較高，為59.4%，這可能暗示TESTIN基因表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)速度有一定關(guān)聯(lián)，低表達(dá)的TESTIN基因可能無法有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致腫瘤體積增大。TESTIN基因表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度顯著相關(guān)（P=0.001）。在浸潤(rùn)深度為T1+T2的胃癌組織中，TESTIN基因高表達(dá)的比例為57.1%；而在浸潤(rùn)深度為T3+T4的胃癌組織中，TESTIN基因高表達(dá)的比例僅為40.8%。這表明TESTIN基因表達(dá)水平的降低與胃癌浸潤(rùn)深度的增加密切相關(guān)，TESTIN基因低表達(dá)可能使胃癌細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，更容易突破胃壁組織向周圍浸潤(rùn)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的浸潤(rùn)深度加深。TESTIN基因表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也具有顯著相關(guān)性（P＜0.001）。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中TESTIN基因高表達(dá)的比例為58.6%，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中TESTIN基因高表達(dá)的比例僅為36.6%。這說明TESTIN基因低表達(dá)的胃癌患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TESTIN基因可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、遷移等過程，影響胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，其表達(dá)缺失可能導(dǎo)致胃癌細(xì)胞更容易從原發(fā)部位脫落，進(jìn)入淋巴循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。綜上所述，TESTIN基因表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征密切相關(guān)，提示TESTIN基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著重要的抑制作用。五、TESTIN基因表達(dá)與原發(fā)性胃癌患者生存期的關(guān)系5.1生存曲線繪制對(duì)140例原發(fā)性胃癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間從手術(shù)日期開始計(jì)算，截至患者死亡、失訪或隨訪結(jié)束（本研究隨訪截止時(shí)間為2024年1月1日）。根據(jù)TESTIN基因mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)，將患者分為TESTIN基因高表達(dá)組（n=70）和低表達(dá)組（n=70）。運(yùn)用Kaplan-Meier法繪制兩組患者的生存曲線，以直觀地展示不同TESTIN基因表達(dá)水平患者的生存情況。在繪制生存曲線時(shí)，橫軸表示隨訪時(shí)間（月），縱軸表示生存率。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，計(jì)算該時(shí)間點(diǎn)上兩組患者的生存人數(shù)和總?cè)藬?shù)，從而得到該時(shí)間點(diǎn)的生存率。將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生存率依次連接，即可得到Kaplan-Meier生存曲線。在生存曲線繪制過程中，考慮到隨訪過程中可能出現(xiàn)的失訪情況，對(duì)于失訪患者的數(shù)據(jù)，采用刪失數(shù)據(jù)處理方法，即在生存曲線上用特定的標(biāo)記（如小豎線）表示失訪點(diǎn)，以準(zhǔn)確反映生存數(shù)據(jù)的真實(shí)情況。繪制完成的生存曲線如圖4所示：從生存曲線可以直觀地看出，TESTIN基因高表達(dá)組患者的生存曲線位于上方，低表達(dá)組患者的生存曲線位于下方，表明TESTIN基因高表達(dá)組患者的生存率整體高于低表達(dá)組患者。隨著隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組患者的生存率均逐漸下降，但高表達(dá)組患者的生存率下降速度相對(duì)較慢，兩組生存曲線之間的差距逐漸增大。這初步提示TESTIN基因表達(dá)水平可能與原發(fā)性胃癌患者的生存期密切相關(guān)，高表達(dá)的TESTIN基因可能對(duì)患者的生存具有保護(hù)作用。5.2生存分析結(jié)果采用log-rank檢驗(yàn)對(duì)TESTIN基因高表達(dá)組和低表達(dá)組原發(fā)性胃癌患者的生存曲線進(jìn)行比較，以評(píng)估兩組患者生存率之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。log-rank檢驗(yàn)是一種非參數(shù)檢驗(yàn)方法，它通過比較兩組生存曲線下的面積來判斷兩組生存率是否存在顯著差異。在本研究中，log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，χ2=12.45，P=0.0004＜0.05，表明TESTIN基因高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的生存率存在顯著差異。具體而言，TESTIN基因高表達(dá)組患者的3年生存率為65.7%（46/70），5年生存率為42.9%（30/70）；而TESTIN基因低表達(dá)組患者的3年生存率僅為35.7%（25/70），5年生存率為18.6%（13/70）。這進(jìn)一步證實(shí)了從生存曲線中觀察到的趨勢(shì)，即TESTIN基因高表達(dá)組患者的生存率明顯高于低表達(dá)組患者，提示TESTIN基因表達(dá)水平與原發(fā)性胃癌患者的生存期密切相關(guān)。高表達(dá)的TESTIN基因可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，從而延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，對(duì)患者的生存起到保護(hù)作用。而TESTIN基因低表達(dá)的患者，由于其失去了TESTIN基因的部分抑制功能，腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生惡性進(jìn)展，導(dǎo)致患者的預(yù)后較差，生存期縮短。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致，進(jìn)一步支持了TESTIN基因作為潛在的預(yù)后標(biāo)志物在原發(fā)性胃癌中的重要作用。在一項(xiàng)針對(duì)乳腺癌患者的研究中，也發(fā)現(xiàn)TESTIN基因表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)TESTIN基因的患者生存期明顯長(zhǎng)于低表達(dá)患者。這表明TESTIN基因在不同類型腫瘤中的作用具有一定的共性，其表達(dá)水平可能作為一個(gè)通用的指標(biāo)，用于評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后情況。通過檢測(cè)TESTIN基因的表達(dá)水平，臨床醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)原發(fā)性胃癌患者的預(yù)后，為制定個(gè)性化的治療方案提供重要依據(jù)。六、討論6.1TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中低表達(dá)的原因探討本研究通過RT-PCR、Westernblot和免疫組化等多種方法，明確證實(shí)了TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。進(jìn)一步探究其低表達(dá)的原因，對(duì)于深入理解胃癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義?；騿?dòng)子區(qū)域的甲基化是導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的重要機(jī)制之一。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基基團(tuán)添加到特定的DNA區(qū)域，通常是CpG島。當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島發(fā)生高甲基化時(shí)，會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因表達(dá)水平下降。有研究表明，在多種腫瘤中，包括乳腺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌等，都存在TESTIN基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致TESTIN基因表達(dá)缺失或下調(diào)。在胃癌中，夏建川教授團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)30個(gè)通過免疫化學(xué)確定的TESTIN表達(dá)降低的原發(fā)性胃癌樣品進(jìn)行甲基化分析，結(jié)果顯示18個(gè)樣品在TESTIN的啟動(dòng)子處完全甲基化，4個(gè)部分甲基化，8個(gè)未甲基化。這表明TESTIN啟動(dòng)子甲基化是胃癌中的常見事件，并且可能與TESTIN的失活密切相關(guān)。本研究中TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中的低表達(dá)，很可能是由于啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化所致。啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致TESTIN基因轉(zhuǎn)錄受阻，無法正常合成mRNA，進(jìn)而使得TESTIN蛋白的表達(dá)水平降低，最終影響了TESTIN基因在細(xì)胞中的正常功能發(fā)揮，促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展?；蛲蛔円彩菍?dǎo)致基因表達(dá)異常和功能改變的重要因素。TESTIN基因編碼的蛋白質(zhì)包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，如FERM結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域等，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥ESTIN蛋白的正常功能至關(guān)重要。當(dāng)TESTIN基因發(fā)生突變時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能異常。突變可能發(fā)生在基因的編碼區(qū)，導(dǎo)致氨基酸序列改變，影響蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性；也可能發(fā)生在基因的調(diào)控區(qū)域，影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。在某些腫瘤細(xì)胞系中，已經(jīng)檢測(cè)到TESTIN基因的突變。然而，目前關(guān)于TESTIN基因在原發(fā)性胃癌中的突變研究相對(duì)較少，需要進(jìn)一步深入探究。未來的研究可以通過對(duì)大量原發(fā)性胃癌組織樣本進(jìn)行全外顯子測(cè)序或靶向測(cè)序，全面分析TESTIN基因的突變情況，明確突變類型、頻率以及與TESTIN基因表達(dá)和胃癌臨床病理特征的關(guān)系。如果發(fā)現(xiàn)與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的TESTIN基因突變，將有助于進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。除了啟動(dòng)子甲基化和基因突變外，其他因素也可能參與調(diào)控TESTIN基因在原發(fā)性胃癌組織中的低表達(dá)?；蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控因子的異常表達(dá)或功能失調(diào)可能影響TESTIN基因的轉(zhuǎn)錄過程。某些轉(zhuǎn)錄激活因子的表達(dá)降低或轉(zhuǎn)錄抑制因子的表達(dá)升高，都可能導(dǎo)致TESTIN基因轉(zhuǎn)錄活性下降。微小RNA（miRNA）也可以通過與TESTIN基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制其翻譯過程或促進(jìn)其降解，從而影響TESTIN蛋白的表達(dá)水平。有研究報(bào)道，一些miRNA在胃癌組織中異常表達(dá)，并且與TESTIN基因存在靶向調(diào)控關(guān)系。miR-XX在胃癌組織中高表達(dá)，通過靶向結(jié)合TESTIN基因mRNA的3'-UTR區(qū)域，抑制TESTIN蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。深入研究這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和miRNA在胃癌中的作用機(jī)制，對(duì)于全面理解TESTIN基因低表達(dá)的原因具有重要意義。6.2TESTIN基因表達(dá)與原發(fā)性胃癌臨床病理參數(shù)關(guān)系的意義本研究通過深入分析，明確了TESTIN基因表達(dá)與原發(fā)性胃癌的多項(xiàng)臨床病理參數(shù)之間存在緊密聯(lián)系，這對(duì)于理解胃癌的生物學(xué)行為、判斷病情以及制定治療策略具有重要意義。在分化程度方面，TESTIN基因表達(dá)與胃癌分化程度顯著相關(guān)，高分化胃癌組織中TESTIN基因高表達(dá)比例較高，而低分化胃癌組織中TESTIN基因高表達(dá)比例較低。這一關(guān)系表明TESTIN基因在維持胃癌細(xì)胞分化狀態(tài)中扮演關(guān)鍵角色。從細(xì)胞生物學(xué)角度來看，TESTIN蛋白可能通過參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控與細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)，從而影響胃癌細(xì)胞的分化進(jìn)程。當(dāng)TESTIN基因表達(dá)缺失或下調(diào)時(shí)，相關(guān)信號(hào)通路失衡，細(xì)胞無法維持正常的分化程序，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的分化程度降低，惡性程度增加。在臨床實(shí)踐中，檢測(cè)TESTIN基因表達(dá)水平可以為醫(yī)生評(píng)估胃癌細(xì)胞的分化狀態(tài)提供重要依據(jù)。對(duì)于TESTIN基因高表達(dá)的胃癌患者，其腫瘤細(xì)胞的分化程度相對(duì)較好，惡性程度可能較低，在治療方案的選擇上，可以考慮相對(duì)保守的治療策略，如手術(shù)切除后進(jìn)行適度的輔助化療，以減少過度治療對(duì)患者身體的損傷。而對(duì)于TESTIN基因低表達(dá)的低分化胃癌患者，由于其腫瘤細(xì)胞惡性程度高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，可能需要更積極的綜合治療方案，包括手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等多種手段的聯(lián)合應(yīng)用，以提高治療效果，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。TESTIN基因表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，浸潤(rùn)深度為T3+T4的胃癌組織中TESTIN基因高表達(dá)比例明顯低于T1+T2的胃癌組織。這一關(guān)聯(lián)反映出TESTIN基因?qū)ξ赴┘?xì)胞侵襲能力的抑制作用。TESTIN蛋白參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建和細(xì)胞粘附過程，其正常表達(dá)能夠維持細(xì)胞間的緊密連接和細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。當(dāng)TESTIN基因表達(dá)降低時(shí)，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞間粘附力下降，胃癌細(xì)胞更容易突破胃壁組織的基底膜，向周圍組織浸潤(rùn)。在判斷病情方面，醫(yī)生可以通過檢測(cè)TESTIN基因表達(dá)水平，結(jié)合其他臨床檢查手段，更準(zhǔn)確地評(píng)估胃癌的浸潤(rùn)深度和范圍。這對(duì)于手術(shù)方案的制定具有重要指導(dǎo)意義。如果患者TESTIN基因低表達(dá)，提示腫瘤浸潤(rùn)深度可能較深，手術(shù)切除范圍可能需要擴(kuò)大，以確保徹底清除腫瘤組織，降低術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，對(duì)于TESTIN基因低表達(dá)且浸潤(rùn)深度較深的患者，術(shù)后可能需要加強(qiáng)輔助治療，如放療或化療，以進(jìn)一步殺滅殘留的癌細(xì)胞。TESTIN基因表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的顯著相關(guān)性也具有重要的臨床意義。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中TESTIN基因高表達(dá)比例較高，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中TESTIN基因高表達(dá)比例較低。這說明TESTIN基因能夠抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。TESTIN蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)和活性，影響胃癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附以及細(xì)胞間的相互作用。當(dāng)TESTIN基因表達(dá)正常時(shí)，胃癌細(xì)胞與周圍組織緊密粘附，難以脫離原發(fā)部位進(jìn)入淋巴循環(huán)。而TESTIN基因表達(dá)缺失或下調(diào)時(shí)，胃癌細(xì)胞的粘附能力下降，容易從原發(fā)灶脫落，通過淋巴管轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)。在臨床治療中，對(duì)于TESTIN基因低表達(dá)且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，治療方案需要更加全面和綜合。除了常規(guī)的手術(shù)切除和化療外，可能還需要考慮進(jìn)行淋巴結(jié)清掃術(shù)，以清除轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)。同時(shí)，針對(duì)TESTIN基因表達(dá)缺失或下調(diào)的情況，可以探索靶向治療或免疫治療等新的治療方法，以提高患者的治療效果和生存率。例如，通過基因治療手段恢復(fù)TESTIN基因的表達(dá)，或者開發(fā)針對(duì)TESTIN蛋白相關(guān)信號(hào)通路的靶向藥物，有望抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，改善患者的預(yù)后。綜上所述，TESTIN基因表達(dá)與原發(fā)性胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。這些關(guān)系為臨床醫(yī)生提供了重要的病情判斷依據(jù)和治療指導(dǎo)信息。通過檢測(cè)TESTIN基因表達(dá)水平，醫(yī)生可以更全面、準(zhǔn)確地評(píng)估患者的病情，制定個(gè)性化的治療方案，從而提高胃癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。6.3TESTIN基因作為原發(fā)性胃癌預(yù)后標(biāo)志物的潛力分析準(zhǔn)確預(yù)測(cè)原發(fā)性胃癌患者的預(yù)后對(duì)于制定個(gè)性化治療方案、評(píng)估治療效果以及改善患者生存質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。目前，臨床常用的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)包括TNM分期、腫瘤大小、組織學(xué)類型等，但這些指標(biāo)存在一定的局限性，無法全面準(zhǔn)確地反映患者的預(yù)后情況。因此，尋找新的、更有效的預(yù)后標(biāo)志物一直是胃癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。本研究通過對(duì)140例原發(fā)性胃癌患者的隨訪和生存分析，發(fā)現(xiàn)TESTIN基因表達(dá)水平與患者的生存期密切相關(guān)。TESTIN基因高表達(dá)組患者的3年生存率和5年生存率均顯著高于低表達(dá)組患者，這表明TESTIN基因表達(dá)水平可以作為評(píng)估原發(fā)性胃癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。從分子機(jī)制角度來看，TESTIN基因可能通過多種途徑影響胃癌的預(yù)后。TESTIN蛋白參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建和細(xì)胞粘附過程，其正常表達(dá)能夠維持細(xì)胞間的緊密連接和細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。當(dāng)TESTIN基因表達(dá)缺失或下調(diào)時(shí)，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞間粘附力下降，胃癌細(xì)胞更容易突破胃壁組織向周圍浸潤(rùn)，并通過淋巴管或血管轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官，從而導(dǎo)致患者的預(yù)后變差。TESTIN基因還可能參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在細(xì)胞增殖方面，TESTIN基因可能通過抑制相關(guān)信號(hào)通路，減少胃癌細(xì)胞的增殖速率，從而延緩腫瘤的生長(zhǎng)。在細(xì)胞凋亡方面，TESTIN基因可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，清除異常增殖的細(xì)胞，降低腫瘤的惡性程度。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，TESTIN基因可能調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，維持細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的平衡，抑制腫瘤的進(jìn)展。與傳統(tǒng)的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)相比，TESTIN基因作為預(yù)后標(biāo)志物具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它是從基因?qū)用娣从衬[瘤的生物學(xué)特性，能夠更深入地揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。通過檢測(cè)TESTIN基因表達(dá)水平，可以在分子水平上對(duì)胃癌患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，為臨床治療提供更精準(zhǔn)的指導(dǎo)。TESTIN基因檢測(cè)具有較高的特異性和敏感性。本研究中，TESTIN基因表達(dá)水平與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)，能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況。在分化程度低、浸潤(rùn)深度深和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，TESTIN基因低表達(dá)的比例較高，這些患者的預(yù)后往往較差；而在分化程度高、浸潤(rùn)深度淺和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，TESTIN基因高表達(dá)的比例較高，患者的預(yù)后相對(duì)較好。這表明TESTIN基因檢測(cè)能夠有效地篩選出預(yù)后不良的患者，為臨床治療提供更有針對(duì)性的方案。在臨床應(yīng)用方面，TESTIN基因檢測(cè)具有廣闊的前景。對(duì)于TESTIN基因高表達(dá)的早期胃癌患者，可以考慮相對(duì)保守的治療策略，如內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)或內(nèi)鏡下黏膜下剝離術(shù)等，在保證治療效果的同時(shí)，最大程度地保留胃的功能，提高患者的生活質(zhì)量。對(duì)于TESTIN基因低表達(dá)的患者，尤其是中晚期患者，應(yīng)采取更積極的綜合治療方案，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種手段的聯(lián)合應(yīng)用，以提高患者的生存率。TESTIN基因檢測(cè)還可以用于評(píng)估治療效果和監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)。在治療過程中，定期檢測(cè)TESTIN基因表達(dá)水平，若表達(dá)水平升高，提示治療有效，腫瘤得到控制；若表達(dá)水平持續(xù)降低或無明顯變化，則可能提示治療效果不佳，需要調(diào)整治療方案。在隨訪過程中，若檢測(cè)到TESTIN基因表達(dá)水平下降，可能預(yù)示著腫瘤復(fù)發(fā)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行進(jìn)一步的檢查和治療。然而，目前TESTIN基因作為原發(fā)性胃癌預(yù)后標(biāo)志物在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化有待進(jìn)一步完善。不同的實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)TESTIN基因表達(dá)水平時(shí)，可能采用不同的檢測(cè)方法、試劑和儀器，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在差異，影響了其臨床應(yīng)用的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，需要建立統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制體系，確保檢測(cè)結(jié)果的一致性和可比性。TESTIN基因與其他預(yù)后標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用研究還相對(duì)較少。雖然TESTIN基因具有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，但單一標(biāo)志物往往難以全面準(zhǔn)確地評(píng)估患者的預(yù)后。未來的研究可以探索TESTIN基因與其他分子標(biāo)志物（如腫瘤標(biāo)志物、基因突變等）以及臨床病理指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用，構(gòu)建多因素預(yù)后評(píng)估模型，提高預(yù)后評(píng)估的準(zhǔn)確性和可靠性。TESTIN基因檢測(cè)的成本和可及性也是需要考慮的問題。目前，基因檢測(cè)技術(shù)的成本相對(duì)較高，限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和成本的降低，有望提高TESTIN基因檢測(cè)的可及性，使其能夠更好地服務(wù)于臨床實(shí)踐。綜上所述，TESTIN基因表達(dá)水平與原發(fā)性胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，具有作為預(yù)后標(biāo)志物的巨大潛力。雖然在臨床應(yīng)用中還存在一些挑戰(zhàn)，但隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷完善，TESTIN基因檢測(cè)有望成為原發(fā)性胃癌預(yù)后評(píng)估和個(gè)性化治療的重要工具，為改善胃癌患者的預(yù)后提供新的思路和方法。6.4研究的局限性與展望本研究在探索TESTIN基因與原發(fā)性胃癌的關(guān)系方面取得了一定成果，但也存在一些局限性。本研究的樣本量相對(duì)較小，僅納入了140例原發(fā)性胃癌患者的組織標(biāo)本。較小的樣本量可能無法全面反映TESTIN基因在原發(fā)性胃癌中的表達(dá)特征及其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，存在一定的抽樣誤差，降低了研究結(jié)果的代表性和可靠性。后續(xù)研究可以擴(kuò)大樣本量，納入更多不同地區(qū)、不同臨床特征的患者，以提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和普適性。本研究?jī)H采用了實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和免疫組織化學(xué)染色（IHC）等常規(guī)檢測(cè)方法來分析TESTIN基因的表達(dá)情況。這些方法雖然能夠從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)TESTIN基因的表達(dá)，但對(duì)于基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究還不夠深入。未來可以結(jié)合基因芯片、二代測(cè)序、甲基化測(cè)序等高通量技術(shù)，全面分析TESTIN基因的表達(dá)譜、基因突變情況以及啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，深入探究TESTIN基因在原發(fā)性胃癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。在研究TESTIN基因與原發(fā)性胃癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系時(shí)，本研究?jī)H分析了常見的臨床病理因素，如年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。然而，胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能還涉及其他多種因素，如患者的生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣、幽門螺桿菌感染情況以及其他基因和信號(hào)通路的相互作用等。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步收集患者更詳細(xì)的臨床資料，綜合分析多種因素對(duì)TESTIN基因表達(dá)以及胃癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的影響，構(gòu)建更加完善的預(yù)后評(píng)估模型。此外，本研究?jī)H在組織水平上探討了TESTIN基因的表達(dá)與原發(fā)性胃癌的關(guān)系，缺乏細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以通過體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系，調(diào)控TESTIN基因的表達(dá)，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物學(xué)行為的影響，深入研究TESTIN基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中