1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了一種基于細(xì)胞薄膜技術(shù)的三維體外評價(jià)模型試驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于骨修復(fù)材料的細(xì)胞毒性和成骨性能評價(jià)。2.規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T16886.5醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)GB/T16886.12醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第12部分：樣品制備與參照樣品YY/T0127.9-2009口腔醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第2單元：試驗(yàn)方法細(xì)胞毒性試驗(yàn):瓊脂擴(kuò)散法及濾膜擴(kuò)散法YY/T0511-2009多孔生物陶瓷體內(nèi)降解和成骨性能評價(jià)試驗(yàn)方法YY/T1616-2018組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品生物材料支架的性能和測試指南YY/T1477.5-2020接觸性創(chuàng)面敷料性能評價(jià)用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?部分：評價(jià)止血性能的體外模型YY/T1680-2020脫礦骨材料的成骨誘導(dǎo)功能評價(jià)YY/T1575-2017組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品修復(fù)和替代骨組織植入物骨形成活性的體內(nèi)評價(jià)指南3.術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。骨修復(fù)材料BoneReplacementMaterial骨修復(fù)材料是一類由人工合成、具有多種優(yōu)良理化特性（能自固化成型、機(jī)械強(qiáng)度高、使用方便等）和生物學(xué)特性（無毒副作用、可以吸收和降解、生物相容性好、能誘導(dǎo)骨細(xì)胞和血管生長等）的骨修復(fù)材料。3.2成骨osteogenic成骨細(xì)胞移行至將要合成骨組織的部位,分泌、合成骨膠原及骨蛋白纖維,將鈣、磷吸收到纖維的孔隙中進(jìn)行沉淀結(jié)晶,形成骨組織的過程。本試驗(yàn)利用三維體外骨組織模型評價(jià)骨修復(fù)材料的細(xì)胞毒性與成骨性能。適用于大部分骨修復(fù)材料，包括顆粒和支架。25.試驗(yàn)方法5.1三維體外骨組織模型制備5.1.1細(xì)胞系選用小鼠成骨前體細(xì)胞系[如來源自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1]，具有成骨誘導(dǎo)后形成成骨細(xì)胞的能力。5.1.2培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基：含有10v/v%胎牛血清（FBS）的DMEM（Dulbecco'smodifiedeaglemedium）培養(yǎng)基，內(nèi)含10v/v%青鏈霉素，用于細(xì)胞生長。成膜培養(yǎng)基：具體成分如下表格，用于細(xì)胞成膜培養(yǎng)。5.1.3制備方法成薄膜培養(yǎng)基組分含量DMEM500mL地塞米松抗壞血酸0.05g/LFicoll40025g/LITS細(xì)胞培養(yǎng)添加物1w/v%青鏈霉素10v/v%FBS1w/v%5.1.3.1細(xì)胞薄膜培養(yǎng)輔助環(huán)制備利用雙組份食品級硅膠制備細(xì)胞薄膜培養(yǎng)輔助環(huán)。將硅膠雙組份按1:1混合均勻，使用真空泵除去硅膠中的氣泡后，將硅膠澆筑于內(nèi)徑為15.5mm，外徑為28mm，高度為8mm的環(huán)形模具中，應(yīng)使硅膠填充至與環(huán)形模具邊緣平齊，在記錄中注明模具的材質(zhì)。再次使用真空泵除去硅膠中的氣泡，70℃的烘箱中交聯(lián)24h，脫模具，獲得細(xì)胞薄膜培養(yǎng)輔助環(huán)。輔助環(huán)一面平整光滑以保證可以緊貼培養(yǎng)皿。注1：合適的惰性模具材料可以是聚甲基丙烯5.1.3.2體外三維模型制備裁剪直徑5mm的圓形封口膜，將其貼于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的正中間，再將細(xì)胞薄膜培養(yǎng)輔助環(huán)放在培養(yǎng)皿上，保證封口膜在其環(huán)形中央位置。用成膜培養(yǎng)基配制成4×105-8×105細(xì)胞/mL細(xì)胞懸液，每個輔助環(huán)內(nèi)加入0.5mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)4-8天，每2天換液一次，促進(jìn)細(xì)胞成膜。取下輔助環(huán)，然后沿側(cè)壁使用1mL移液槍輕輕吹打細(xì)胞薄膜邊緣，使其剝離，獲得中間帶孔（直徑5mm的圓形孔）的細(xì)胞薄膜；將剝離的細(xì)胞薄膜用5ml移液管轉(zhuǎn)移到35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，吸干周圍的培養(yǎng)基，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)放置30min，使細(xì)胞薄膜粘接到培養(yǎng)皿上。將第二片剝離的細(xì)胞薄膜通過移液管轉(zhuǎn)移到第一片之上，鋪展并重疊，吸干周圍的培養(yǎng)基，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)放置30min，使兩片細(xì)胞薄膜充分粘接。重復(fù)以上操作，堆疊三層中間帶孔的細(xì)胞薄膜，獲得中間帶有圓形孔缺損的三層細(xì)胞薄膜仿生骨組織，構(gòu)建三維體外骨組織模型。3注2：常用的實(shí)驗(yàn)室封口膜即可，提前通過紫外線或酒精對封5.2測試方法5.2.1樣品準(zhǔn)備樣品應(yīng)無菌。a)支架：制成直徑約5mm的圓形試樣，厚度2mm。b)顆粒：將材料填入內(nèi)徑5mm，高2mm的環(huán)形模具中。在記錄中注明模具的材質(zhì)。應(yīng)在填入材料之前將環(huán)形模具置于三維體外骨組織模型的中間缺損處，成型后移除。5.2.2空白組三維體外骨組織模型和培養(yǎng)基5.2.3陽性對照組三維體外骨組織模型、培養(yǎng)基和陽性對照材料如羥基磷灰石5.2.4陰性對照組三維體外骨組織模型、培養(yǎng)基和陰性對照材料如純鎂5.2.5試驗(yàn)組三維體外骨組織模型、培養(yǎng)基和試驗(yàn)材料5.2.6材料在二維細(xì)胞模型和三維體外骨組織模型中細(xì)胞毒性測試5.2.6.1材料在三維體外骨組織模型中細(xì)胞毒性測試將試驗(yàn)骨修復(fù)材料置于三維體外骨組織模型的中間缺損處。為防止材料在加入培養(yǎng)基后離散，其上覆蓋商用膠原膜，加入1-2mL培養(yǎng)基培養(yǎng)。在12h、24h、48h三個時間點(diǎn)，使用移液器向每樣中加入100μLCCK-8溶液，孵育3.5小時。每樣取120μL加入到96孔板中，至少3個復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀測量450nm處的吸光度。5.2.6.2材料在二維細(xì)胞模型中細(xì)胞毒性測試參照ISO10993-5:2009，用完全培養(yǎng)基配制成4×104細(xì)胞/mL細(xì)胞懸液，接種在96孔板中，每孔內(nèi)加入100μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)1天使細(xì)胞貼壁。用完全培養(yǎng)基配置1mg/mL材料溶液，每孔加入10μL，相當(dāng)于0.01mg材料/孔，并保證初始接種103個細(xì)胞對應(yīng)0.0025mg材料。設(shè)置空白組、陽性對照組、陰性對照組，和試驗(yàn)組，至少3個復(fù)孔。在12h、24h、48h三個時間點(diǎn)，使用移液器向板的每個孔中加入10μLCCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育3.5小時。5.2.7材料成骨活性測試5.2.7.1成骨誘導(dǎo)將試驗(yàn)骨修復(fù)材料置于三維體外骨組織模型的中間缺損處。為防止材料在加入培養(yǎng)基后離散，其上覆蓋商用膠原膜，加入1-2mL成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)28天，每2天換液1次。5.2.7.2茜素紅染色4在培養(yǎng)第28天，進(jìn)行茜素紅S染色以及定量。將貼壁混合細(xì)胞使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次，加入固定液覆蓋細(xì)胞固定30min。吸去固定液，PBS清洗3次，滴加茜素紅S染液，覆蓋樣品，于室溫下染色30min。吸去茜素紅S染液，蒸餾水清洗3次，晾干，顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)中的鈣質(zhì)染色。進(jìn)一步對鈣質(zhì)進(jìn)行定量，每個培養(yǎng)皿中加入1mL的10%溴代十六烷基吡啶（CPC）搖床上輕搖1h以結(jié)合茜素紅，洗脫好的CPC移入EP管中，用10%CPC稀釋20倍，用于測定。酶標(biāo)儀測定波長562nm吸光度。5.2.7.3Westernblot法檢測成骨相關(guān)蛋白在培養(yǎng)第14天和28天提取組織總蛋白，通過westernblot法檢測成骨相關(guān)蛋白。包括啟動成骨分化的Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2）、調(diào)控骨礦化的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix（OSX）、骨橋蛋白（osteopontin,OPN）、骨鈣素（osteocalcin,OC）。配制10%分離膠，配制5%濃縮膠。隨后用SDS對各組蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣量，一般為20μg，可適量加至40μg。在電泳槽中加入已經(jīng)配置混合均勻的RunningBuffer，在1-2個泳道中加入3μLMarker，其余每個泳道加入已制備好的蛋白樣品。首先86V跑出濃縮膠，然后200V電泳至分離出目的條帶。轉(zhuǎn)膜完成后，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1h。將相應(yīng)的抗體置于PVDF膜上，室溫孵育1-2h或者4℃冰箱過夜。加入牛奶稀釋的二抗室溫孵育1-2h。完成后可于顯影儀顯影。6.結(jié)果評價(jià)6.1材料細(xì)胞毒性評價(jià)按式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%………………（1）式中：As:實(shí)驗(yàn)組吸光度；Ac:對照組吸光度；Ab:空白組吸光度。6.2材料成骨活性評價(jià)6.2.1礦化結(jié)節(jié)按式（2）計(jì)算礦化結(jié)節(jié)：礦化結(jié)節(jié)評價(jià)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%………………（2）式中：As:實(shí)驗(yàn)組吸光度；Ac:對照組吸光度；Ab:空白孔吸光度。6.2.2成骨相關(guān)蛋白表達(dá)按式（3）計(jì)算成骨相關(guān)蛋白表達(dá)：5蛋白相對表達(dá)量=I目的蛋白/I內(nèi)參蛋白………………（3）式中：I目的蛋白：目的蛋白灰度值（如Runx2、OSX、O