ICS65.020.30

CCSB44

44

廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB44/T2338—2021

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原核酸液相芯片法定性分析

LaboratoryanimalsQualitativeanalysisofpathogennucleicacidswithsuspension

arraymethod

2021-10-18發(fā)布2022-01-18實(shí)施

廣東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB44/T2338—2021

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4縮略語.............................................................................1

5原理...............................................................................2

6主要設(shè)備和材料.....................................................................2

7試劑...............................................................................2

8方法...............................................................................3

9結(jié)果...............................................................................6

10防止交叉污染的措施................................................................7

附錄A（規(guī)范性）溶液的配制...........................................................8

附錄B（資料性）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原液相基因芯片引物.........................................9

I

DB44/T2338—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由廣東省科學(xué)技術(shù)廳提出并組織實(shí)施。

本文件由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（GD/TC93）歸口。

本文件起草單位：廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所。

本文件主要起草人：黃韌、袁文、王靜、徐鳳姣、朱余軍，伍妙梨、黃碧洪、羅銀珠、何麗芳、閔

凡貴、叢峰、張鈺、郭鵬舉。

II

DB44/T2338—2021

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原核酸液相芯片法定性分析

1范圍

本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原核酸的液相芯片定性分析方法。

本文件適用于基于液相芯片方法的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原核酸的定性分析。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

液相芯片技術(shù)suspensionarraytechnology

液相芯片技術(shù)又被稱為懸浮陣列、流式熒光術(shù)、xMAP技術(shù)等。它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗

原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過紅、綠兩束激光分別識(shí)別微球編碼和

報(bào)告熒光來達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，是繼基因芯

片、蛋白芯片之后的新一代高通量多分子分析技術(shù)平臺(tái)。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

cDNA互補(bǔ)DNA（complementaryDNA）

CPE細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect）

DEPC焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

DNA脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

MFI中位熒光強(qiáng)度值（medianfluorescenceintensity）

PBS磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）

PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）

RNA核糖核酸（ribonucleicacid）

SA-PE鏈霉親和素-藻紅蛋白（streptavidinR-phycoerythrin）

xMAP多分子分析技術(shù)（flexiblemulti-analyteprofilingtechnology）

1

DB44/T2338—2021

5原理

本文件方法的核酸擴(kuò)增原理是基于每種病原微生物都可通過特異性的PCR引物來進(jìn)行核酸擴(kuò)增，在

每種特定目的片段的擴(kuò)增引物5′端與對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽（TAG）序列的3′端通過間臂連接，另一條原始引物

的5′端添加生物素標(biāo)記；這樣所擴(kuò)增的基因片段既帶有TAG標(biāo)簽，也帶有生物素標(biāo)記，以供后期的液相

芯片特異性識(shí)別目標(biāo)分子。

本文件方法的液相芯片檢測原理是采用2種熒光染料對(duì)直徑約為5.6μmol/L帶磁性聚苯乙烯小球

（以下簡稱微球）進(jìn)行著色，通過不同混合比例產(chǎn)生100種不同配比的顏色，每一種顏色賦予唯一編碼，

通過編碼識(shí)別染色的微球。這些熒光微球表面帶有羧基基團(tuán)（如羧基、親和素和組氨酸等）可共鍵結(jié)合

（或稱偶聯(lián)）不同類型的探針（如抗原、抗體、寡核苷酸探針等），形成帶標(biāo)記的熒光微球。待測樣本

（如蛋白、核酸等）以生物素標(biāo)記，再與結(jié)合了探針的熒光微球進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)，生物素標(biāo)記與添

加到反應(yīng)體系中的以PE熒光染料標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin）或稱SA-PE發(fā)生連接可實(shí)現(xiàn)熒光信

號(hào)的放大。因此，整個(gè)反應(yīng)結(jié)束后形成的陽性復(fù)合物可檢測到微球的熒光和SA-PE的熒光信號(hào)。液相芯

片檢測儀工作時(shí)，上述復(fù)合物在液流系統(tǒng)中快速通過，第一束紅色激光識(shí)別微球染料和編碼，第二束綠

色激光讀取SA-PE熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，儀器將獲取到的兩種光信號(hào)進(jìn)行快速處理并形成數(shù)字信號(hào)，經(jīng)軟件

分析后計(jì)算得到每一種待測樣本的含量。因此，液相芯片技術(shù)是集流式細(xì)胞技術(shù)、熒光標(biāo)記微球、激光、

數(shù)字信號(hào)處理和傳統(tǒng)的生化技術(shù)于一體，可以實(shí)現(xiàn)快速高通量多分子定性及定量分析的技術(shù)。

6主要設(shè)備和材料

液相芯片檢測儀。

PCR儀。

全自動(dòng)核酸提取儀。

超聲波儀。

高速冷凍離心機(jī)。

普通離心機(jī)。

漩渦振蕩器。

組織勻漿器。

生物安全柜。

PCR超凈工作臺(tái)。

冰箱（-20℃）。

微量移液器（0.1μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL）。

滅菌離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），滅菌吸頭（10μL，200μL，1mL），滅菌PCR擴(kuò)

增反應(yīng)管（0.2mL，八連管或96孔板）。聚乙烯薄膜袋：90mm×150mm自封袋，使用前紫外滅菌20

min。

采樣工具：剪刀、鑷子和滅菌棉拭子等。

7試劑

以下所用的試劑除特別注明者外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水或去離子水，應(yīng)符合GB/T6682

所規(guī)定一級(jí)水的要求。所有涉及分子生物學(xué)操作的水均為無DNA酶、無RNA酶水。

2

DB44/T2338—2021

表面帶有羧基的特定編碼微球（濃度為1.25×107beads/mL）。

滅菌PBS。配制方法見附錄A。

PCR用水：經(jīng)DEPC處理的水或商品無DNA酶、無RNA酶水，見附錄A。

核酸抽提試劑：推薦針對(duì)不同的樣本基質(zhì)類型和不同病原微生物的核酸類型選取不同的基

因組提取試劑盒。

反轉(zhuǎn)錄試劑：PrimeScriptRTreagentKit或其他類似產(chǎn)品。

注：PrimeScriptRTreagentKit是本文件中適合的市售產(chǎn)品的使用實(shí)例，給出這一信息是為了方便本文件使用

者，并不表示對(duì)這一產(chǎn)品的認(rèn)可。亦可使用其他類似試劑。

PCR試劑：QIAGENMultiplexPCRPlusKit或其他類似產(chǎn)品。

注：QIAGENMultiplexPCRPlusKit是本文件中適合的市售產(chǎn)品的使用實(shí)例，給出這一信息是為了方便本文件使

用者，并不表示對(duì)這一產(chǎn)品的認(rèn)可。亦可使用其他類似試劑。

SA-PE反應(yīng)液（1mg/mL）。

1×TM雜交緩沖液，配制見附錄A。

引物：各病原微生物特異性正向引物的5′端與對(duì)應(yīng)的TAG序列的3′端通過間臂（Spacer）連

接修飾，特異性反向引物5′端標(biāo)記生物素（biotin），所有的引物合成后均需要進(jìn)行色譜級(jí)（HPLC）

純化。

8方法

生物安全措施

對(duì)于可能潛在人獸共患病的樣本，應(yīng)在生物安全二級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作，采樣應(yīng)在生物安全柜

中進(jìn)行。采樣結(jié)束，動(dòng)物尸體及采樣器材應(yīng)高壓滅菌后處理。實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由

具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行相應(yīng)操作。

采樣及樣本的處理

采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過程中須戴一次性手套。采樣及樣本處理過程操

作人員應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)。

8.2.1臟器組織

剖檢，無菌采集動(dòng)物臟器組織，剪取待檢樣本0.5g～2.0g于無菌離心管，加入5倍體積滅菌PBS，

使用勻漿器充分勻漿1min～2min，然后將組織懸液在4℃，5000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一

無菌離心管中，編號(hào)備用。

8.2.2盲腸內(nèi)容物或糞便

無菌采集動(dòng)物盲腸內(nèi)容物或糞便，取待檢樣本1.0g～2.0g于無菌5mL離心管，加入5倍體積滅菌

PBS，使用勻漿器充分勻漿1min～2min，8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，

編號(hào)備用。

8.2.3血液樣本

無菌采集動(dòng)物血液0.2mL～0.5mL，加入檸檬酸鈉或EDTA抗凝管中，輕輕顛倒混勻3次～5次，編號(hào)

備用。

3

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8.2.4拭子取樣

對(duì)活體動(dòng)物取樣可采集肛拭子、咽喉拭子、泄殖腔拭子、鼻拭子、皮膚拭子等，浸泡3mL無菌PBS

中，5min～10min，充分混勻后，4℃，8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，

編號(hào)備用。

8.2.5細(xì)胞培養(yǎng)物

應(yīng)通過以下任一方法取樣：

——直接刮取樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細(xì)胞培養(yǎng)物于15mL離心管中，1500g離心5

min，棄上清，加1mL滅菌PBS重懸細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌1.5mL離心管中，

編號(hào)備用；

——將樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移于15mL離心管

中，8000g離心5min，去細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到無菌15mL離心管中，編號(hào)備用。

8.2.6細(xì)菌分離培養(yǎng)物

經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)的固體菌落或液體培養(yǎng)物，或待鑒定的純化培養(yǎng)物，取適量樣本裝于無菌1.5

mL離心管中，編號(hào)備用。

8.2.7飼料、墊料和飲水

飼料、墊料：取約5g～10g飼料和墊料置于50mL無菌離心管中，加入3倍體積滅菌PBS（飼料和墊

料需全部浸泡于液體中）。密封后浸泡5min～10min，充分混勻，將混懸液轉(zhuǎn)移至15mL無菌離心管，

4℃，8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號(hào)備用。

飲水：取200μL～1000μL實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水直接轉(zhuǎn)移到無菌1.5mL離心管中，編號(hào)備用。

8.2.8設(shè)施設(shè)備

用滅菌棉拭子拭取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備出風(fēng)口初效濾膜表面約5cm2沉積物，將拭子置入滅菌15mL離

心管，加入3mL滅菌PBS，浸泡5min～10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃，8000g離

心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號(hào)備用。

8.2.9樣本的存放

采集或處理的樣本在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h，若需長期保存，須放置于-80℃冰箱，

但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

8.2.10采樣廢棄物處理

采樣結(jié)束，動(dòng)物尸體應(yīng)使用生物安全垃圾袋包裝完整，高壓滅菌后交由醫(yī)療垃圾處理單位進(jìn)行處理，

采樣器材應(yīng)使用消毒液浸泡或高壓滅菌消毒，并做好實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及采樣室的消毒。

樣本核酸提取

8.3.1在核酸提取區(qū)操作，采用DNA或RNA提取商業(yè)試劑盒或其他類似試劑盒。

8.3.2取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對(duì)照+陰性對(duì)照，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行

編號(hào)，按試劑盒操作說明書進(jìn)行。

8.3.3提取好的DNA在2℃～8℃冰箱可保存一月，-20℃冰柜可穩(wěn)定保存兩年；提取好的RNA應(yīng)盡

4

DB44/T2338—2021

快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，若暫時(shí)不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

核酸擴(kuò)增

8.4.1反轉(zhuǎn)錄（可選）

根據(jù)不同病原微生物的核酸類型選擇是否進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，DNA病毒和病原菌可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

在PCR溶液配制區(qū)操作，RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表1。反應(yīng)液的配制在冰上操作，反應(yīng)條件為37℃

25min；85℃5s。反應(yīng)產(chǎn)物即為cDNA，立即進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，若不能立即進(jìn)行PCR，cDNA保存溫

度不能低于-20℃。長時(shí)間保藏應(yīng)置于-80℃冰箱。10μL反應(yīng)體系可最大使用500ng的TotalRNA。

表1RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

反應(yīng)組份用量/μL終濃度

5×PrimeScriptBuffer21×

PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5

OliogdTPrimer（50μmol/L）0.525pmol

RandomPrimer6mers（100μmol/L）0.550pmol

RNA模板5

PCR用水1.5

總體積10

注：可使用其他類似的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可做相應(yīng)調(diào)整。

8.4.2PCR

8.4.2.1PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)液的配制在冰浴上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)

照，其中陽性對(duì)照以含有目的病原微生物的組織或培養(yǎng)物提取的核酸作為陽性對(duì)照模板，其中陰性對(duì)照

以不含有目的病原微生物（可以是正常動(dòng)物組織或正常培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，空白對(duì)照即為不加

模板對(duì)照（NoTemplateControl，NTC），即在反應(yīng)中用水來代替模板。

表2PCR反應(yīng)體系配制表

反應(yīng)組份用量/μL終濃度

2×buffer101×

引物組合物混合液（10μmol/L）2200nmol/L

DNA/cDNA模板4

PCR用水4

總體積20

8.4.2.2PCR反應(yīng)參數(shù)

5

DB44/T2338—2021

PCR反應(yīng)參數(shù)見表3。

表3PCR反應(yīng)參數(shù)

步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)

預(yù)變性95℃2min1

變性95℃30s

退火60℃90s35

延伸72℃30s

延伸72℃10min1

注：可使用其他類似的一步法或兩步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可做相應(yīng)調(diào)整。

PCR產(chǎn)物雜交

8.5.1所有試劑恢復(fù)到室溫，所有的操作均應(yīng)避光，可選用不透明離心管或用鋁鉑膜包裹遮光的離心

管進(jìn)行操作。

8.5.2取出裝有偶聯(lián)好探針微球的貯存管，于旋渦震蕩器上震蕩，再用40khz超聲波儀處理20s，

使微球充分分散。

8.5.3熒光編碼微球工作液的制備：將2500個(gè)/μL熒光編碼微球用1×TmHybrdizationBuffer稀

釋到1μL約含有125個(gè)/種熒光編碼微球。

8.5.4SA-PE工作液制備：將1mg/mLSA-PE用1×TmHybrdizationBuffer稀釋到10μg/μL。

8.5.5充分重懸熒光編碼微球工作液，每個(gè)樣品孔和對(duì)照孔加入微球工作液20μL，隨后樣品孔中加

入5μLPCR產(chǎn)物，對(duì)照孔中也分別加入5μLPCR陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照產(chǎn)物，最后加入75

μL的SA-PE工作液，充分混勻，于金屬加熱器中37℃～45℃孵育25min～45min。

液相芯片檢測儀讀取熒光

8.6.1在PCR擴(kuò)增進(jìn)行時(shí)，打開液相芯片檢測所有相關(guān)儀器，并將儀器的上樣加熱底板預(yù)先加熱至

45℃。

8.6.2按照液相芯片檢測儀操作說明書，進(jìn)行各個(gè)參數(shù)的設(shè)置。

8.6.3每個(gè)樣品上機(jī)時(shí)，應(yīng)同時(shí)選擇特定編碼微球，并填寫每種熒光微球?qū)?yīng)病原微生物名稱。

8.6.4檢測體積為75μL，流速為快速，每種熒光微球設(shè)置計(jì)數(shù)為至少50個(gè)，計(jì)數(shù)時(shí)間為60s。

8.6.5取出雜交好的待檢樣本放入液相芯片檢測儀，并在軟件界面進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)注。開啟檢測。

8.6.6同一批樣品建議在30min內(nèi)讀取數(shù)據(jù)完畢。

9結(jié)果

數(shù)據(jù)有效性分析

每種特定編碼微球個(gè)數(shù)不少于50個(gè)，空白對(duì)照熒光強(qiáng)度不高于100，陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度不高于200，

陽性對(duì)照與自身對(duì)應(yīng)寡核苷酸探針特異性雜交熒光強(qiáng)度高于空白對(duì)照五倍以上。

結(jié)果計(jì)算

6

DB44/T2338—2021

液相芯片定性比值結(jié)果（Luminexqualitativeratioresult，LQRR）等于樣品校正后的熒光強(qiáng)度

中位值（Medianflorescenceintensity，MFI）與空白對(duì)照MFI的平均值（MFIB）的比值，見公式（1）。

LQRR=MFI/MFIB········································································(1)

式中：

LQRR———液相芯片定性比值；

MFI———檢測樣品熒光強(qiáng)度中位值；

MFIB———空白對(duì)照熒光強(qiáng)度中位值。

儀器檢測后，自帶的數(shù)據(jù)分析軟件自動(dòng)按上述公式進(jìn)行計(jì)算，直接輸出結(jié)果。

結(jié)果分析與定性判定

9.3.1關(guān)聯(lián)某種病原微生物的特定編碼微球在液相芯片檢測儀中獲得的數(shù)值如LQRR≥3，判定該樣本

為該種病原微生物核酸檢測結(jié)果陽性。

9.3.2關(guān)聯(lián)某種病原微生物的特定編碼微球在液相芯片檢測儀中獲得的數(shù)值如LQRR<2，判定該樣本為

該種病原微生物核酸檢測結(jié)果陰性。

9.3.3關(guān)聯(lián)某種病原微生物的特定編碼微球在液相芯片檢測儀中獲得的數(shù)值如2≤LQRR<3，判定該樣

本為該種病原微生物核酸檢測結(jié)果可疑?？梢蓸悠窇?yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)，如結(jié)果值仍介于此區(qū)間，則判定為

陰性。

10防止交叉污染的措施

按照GB/T19495.2中的要求執(zhí)行。

7

DB44/T2338—2021

A

A

附錄A

（規(guī)范性）

溶液的配制

A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制

A.1.1A液

0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H20）27.6g，先加適量去離子水溶解，最

后定容至1000mL，混勻。

A.1.2B液

0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或

Na2HPO4·2H2O35.6g），先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。

A.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制

取A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，加800mL無離子水溶解稀釋，用HCl調(diào)pH至7.2，

最后定容至1000mL，經(jīng)121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

A.2無RNase去離子水的配制

實(shí)驗(yàn)用去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

A.31×TM雜交緩沖液

NaCl0.2mol/L

Tris0.1mol/L

TritonX-1000.08%

調(diào)pH至8.0過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8

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B

B

附錄B

（資料性）

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原液相基因芯片引物

針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大、小鼠、猴、兔、禽類病原保守核酸序列設(shè)計(jì)液相基因芯片特異引物組合。

表B.1大小鼠病原液相基因芯片引物列表

病原序列（5′-3′）

小鼠腦脊髓炎病毒TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-GATCTAAGTYAACCGACTCC

（TMEV）Bio-GAAGGAAGGGGCAACACATA

小鼠肝炎病毒CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TGGMATCCTCAAGAAGACCACTT

（MHV）Bio-ATGCCMGAAAACCARGAGTAATG

小鼠諾如病毒TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-spacer18-TCTGTYCTGCGCTGGGTGC

（MNV）Bio-GCTGCGCCATCACTCATCC

呼腸孤病毒III型CACTACACATTTATCATAACAAAT-spacer18-CCTCGCCTACGTGAAGAAGT

（REO3）Bio-CATCATCGAGTCCCTGGGTG

小鼠細(xì)小病毒MVM株TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-TTGTTCCACCACCACTAAATG

（MVM）Bio-GGTTTGTGTTCAAGATCTAGTTC

小鼠細(xì)小病毒MPV株ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CACCAGCAACAGACAACCAA

（MVM）Bio-TGAATGCGTTGAGTGTTCTC

淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎AATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-GAGTCCAGAAGCTTTCTGATGTCAT

病毒（LCMV）

Bio-CAAGTATTCACACGGCATGGAT

漢坦病毒ATACTTTACAAACAAATAACACAC-spacer18-GGACACAATCAATGGGGATACAAC

（HV）

Bio-CCATATCATCCCCTAAGTGGAA

仙臺(tái)病毒CTAAACATACAAATACACATTTCA–spacer18-CCCAGCCATATACTCAGTCGTGCT

（SV）

Bio-TCCACAACTTTTGTGACAGGACAC

小鼠肺炎病毒ATCTCAATTACAATAACACACAAA-spacer18-GATCACAGAGCCCGTCAAAAT

（PVM）

Bio-CATATAACATCCAATACGAGTTTGAA

小鼠流行性腹瀉病毒AATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-ATCAAGCACGATTTGGAAC

（EDIM）

Bio-GATTCAGTTCGCAATGTAAGTCC

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表B.1大小鼠病原液相基因芯片引物列表（續(xù)）

病原序列（5′-3′）

肺支原體TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-spacer18-AGCGTTTGCTTCACTTTGAA

（Mpul）

Bio-GGGCATTTCCTCCCTAAGCT

鼠痘病毒CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TACGGTGTATATGGCTACTCA

（ECT）

Bio-ACTGCTGCTTCCTATACTCG

小鼠腺病毒TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-AGACTCACACTGCGTATAGTCC

（MAD）

Bio-CCAGAACTCGGTTATCCCCA

小鼠巨細(xì)胞病毒CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-GCCCTCTTCATCCCTTACCT

（MCMV）

Bio-GACCTCCATGTCCTTCATGC

多瘤病毒ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CCATGCTCCCTTCTATGCGAT

（POlY）

Bio-TCAGTCAGCCATAGATGCAA

大鼠冠狀病毒CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TGGMATCCTCAAGAAGACCACTT

（RCV）

Bio-ATGCCMGAAAACCARGAGTAATG

大鼠泰勒病毒ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-GGAAACTTAGAGCAGACATCG

（RTV）

Bio-TCCACAGAGAACAACCATCG

大鼠細(xì)小病毒RMV株TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-Spacer18-ACACCATGCCAACTGCAGATG

（RMV）

Bio-ATTGTTCACTCCCTGTGTTTGTGTT

大鼠細(xì)小病毒RRV株AATAACAACTCACTATATCATAAC-Spacer18-GATGATAAGCGGTTCAGGG

（RPV）

Bio-AAGAGCTCCGGTATCTCTGTC

大鼠細(xì)小病毒H-1株CTAAACATACAAATACACATTTCA-Spacer18-CTCTAGCAACTCTGCTGAAG

（H1）

Bio-CAGTTATTCCTTGGAGGCAT

大鼠細(xì)小病毒KRV株ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-Spacer18-AACCAGACGCTGGAATCGCTAA

（KRV）

Bio-TGTAGCAGTCTAGATGCATGA

ICATTAAACAACTCTTAACTACACAA-spacer18-CGCAGAATCGCAAATACAC

（內(nèi)標(biāo)基因）Bio-TAACAATAAGCTCGCAGTCG

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表B.2兔病原液相基因芯片引物列表

病原序列（5′-3′）

兔出血熱病毒CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-CTCTCCACAAAATAACCCATTCACA

（RHDV）

Bio-CCAACCCTGGTCCAATCTCG

兔輪狀病毒TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-ATGGTTCGCTTGTGTCTTAGTTG

（RRV）

Bio-ATGCGTTGGGTGTAGTTCCTGTA

仙臺(tái)病毒CTAAACATACAAATACACATTTCA-spacer18-TGACAACAAACGGAGTAAACGC

（SV）

ACCATAGGTCCAAACAGCCATTC

表B.3猴病原液相基因芯片引物列表

病原序列（5′-3′）

猴免疫缺陷病毒CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-ACGACCCGGCGGAAAGAAAAAGT

（SIV）Bio-TGCACCAGATGACGCAGACAGT

猴T細(xì)胞淋巴白血病病毒TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-GTGCCAATCATGGACCTGCC

（STLV）Bio-TCCTGGAGCGTCGATTAGAAGG

猴逆轉(zhuǎn)錄病毒ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-AYGGGGCTACTGCYCCATA

（SRV）Bio-GCCATTACCKGCYTGTTGATT

表B.4禽病原液相基因芯片引物列表

病原序列（5′-3′）

禽流感病毒TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-ATGAGTCTTCTACCCGAGG

（AIV）

Bio-TCAGAGGTGACAGGATTG

新城疫病毒ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CTCATCTCAGACAGGGTCAATC

（NDV）

Bio-ATGGAGTCACCAAGGGG

傳染性支氣管炎病毒ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-spacer18-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC

（IBV）

Bio-GCATTGTTCCTCTCCTCATC

傳染性喉氣管病毒ATCTCAATTACAATAACACACAAA-spacer18-GCAGCGAAAAGAAGGC

（ILTV）

Bio-TCATCGTGCTCGGTGTCC

雞毒支原體CACTACACATTTATCATAACAAAT-spacer18-ATCTAAAACCGTGTTGCTAA

（MG）

Bio-AGGAGGTAATCCACCCCCA

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表B.4禽病原液相基因芯片引物列表（續(xù)）

病原序列（5′-3′）

滑液囊支原體CTTTCTTAATACATTACAACATAC-spacer18-CCTTTTAGACTGGAATAACGGT

（MS）

Bio-GCTAATGTTCCGCACCC

雞傳染性貧血病毒ATACTTTACAAACAAATAACACAC-spacer18-GCTCTC