“無子甌柑”InDel和SV標(biāo)記開發(fā)：從理論到實(shí)踐一、引言1.1研究背景與目的甌柑（CitrussuavissimaHort.exTanaka）作為柑橘類水果中的重要一員，在我國有著悠久的栽培歷史，主要分布于浙江、福建等地。其果實(shí)色澤金黃，果肉清甜多汁，且富含多種維生素，具有化痰止咳、祛熱生津、清涼解毒等功效，深受消費(fèi)者青睞，在柑橘產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著獨(dú)特的地位。然而，傳統(tǒng)甌柑存在籽多的問題，這不僅影響了消費(fèi)者的食用體驗(yàn)，也在一定程度上限制了其市場競爭力的進(jìn)一步提升。無籽甌柑的出現(xiàn)有效解決了這一難題，它是從普通甌柑中選育出的優(yōu)良單株，具有果實(shí)無籽、汁多味甘苦、口感清新、極耐貯藏等優(yōu)點(diǎn)。自2003年通過浙江省林木品種審定委員會(huì)的良種認(rèn)定后，無籽甌柑在柑橘市場中嶄露頭角，種植面積逐漸擴(kuò)大，成為推動(dòng)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新動(dòng)力。在現(xiàn)代柑橘育種和產(chǎn)業(yè)發(fā)展中，準(zhǔn)確高效的分子標(biāo)記技術(shù)至關(guān)重要。InDel（Insertion-Deletion，插入/缺失）標(biāo)記是基于基因組中短片段的插入或缺失而開發(fā)的一種共顯性分子標(biāo)記，具有穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富、檢測方便等優(yōu)點(diǎn)，在植物品種鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位等方面有著廣泛的應(yīng)用。例如，在贛南野生山金柑的研究中，通過全基因組重測序開發(fā)InDel標(biāo)記，明確了其InDel特征，并將標(biāo)記應(yīng)用于群體結(jié)構(gòu)分析和核心種質(zhì)篩選等工作。SV（StructuralVariation，結(jié)構(gòu)變異）標(biāo)記則是指基因組上大長度的序列變化和位置關(guān)系變化，包括長片段序列插入或刪除、串聯(lián)重復(fù)、染色體倒位等。其可檢測出基因組上多至幾千個(gè)堿基的結(jié)構(gòu)變異，標(biāo)記呈共顯性遺傳，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。在鑒定橘湘紅品種時(shí)，通過挖掘SV分子標(biāo)記位點(diǎn)，利用核心引物與擴(kuò)展引物的排列組合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)橘湘紅品種的有效鑒定，為品種保護(hù)和快速真實(shí)性鑒定提供了有效方法。對(duì)于無籽甌柑而言，開發(fā)其專屬的InDel和SV標(biāo)記具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。在品種鑒定方面，精準(zhǔn)的分子標(biāo)記可快速、準(zhǔn)確地區(qū)分無籽甌柑與其他柑橘品種，有效防止假冒偽劣品種流入市場，保護(hù)種植戶和消費(fèi)者的利益。在遺傳研究領(lǐng)域，這些標(biāo)記能夠深入揭示無籽甌柑的遺傳背景和變異規(guī)律，為進(jìn)一步的品種改良和育種工作提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，推動(dòng)無籽甌柑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究旨在通過全基因組重測序技術(shù)，深入挖掘無籽甌柑的InDel和SV變異位點(diǎn)，開發(fā)出高效、穩(wěn)定的分子標(biāo)記，為無籽甌柑的品種鑒定、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種等提供有力的技術(shù)支持。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在柑橘品種的研究中，無籽特性一直是重點(diǎn)關(guān)注領(lǐng)域。國外在無核柑橘品種選育方面起步較早，如美國、巴西等柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)國家，通過雜交育種、誘變育種等手段培育出眾多無核柑橘品種，像一些無核甜橙、葡萄柚品種已在全球廣泛種植。在無核機(jī)理研究上，國外學(xué)者深入探究了雄性不育、雌性不育、自交不親和、多倍體導(dǎo)致胚敗育以及環(huán)境條件和施用生長調(diào)節(jié)劑導(dǎo)致無核等機(jī)制，為無核柑橘的選育提供了理論基礎(chǔ)。例如，對(duì)雄性不育機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的突變或表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致花粉發(fā)育異常，進(jìn)而影響授粉受精過程，使果實(shí)無籽。國內(nèi)對(duì)于無核柑橘的研究也取得了顯著成果。在無籽甌柑方面，自麗水市山水果樹研究所和麗水市林科所成功選育出無籽甌柑并于2003年通過浙江省林木品種審定委員會(huì)的良種認(rèn)定后，相關(guān)研究逐漸展開。在無籽甌柑的無核機(jī)理研究上，國內(nèi)學(xué)者通過對(duì)花粉形態(tài)、花粉生活力、胚胎發(fā)育等方面的研究，試圖揭示其無核的內(nèi)在原因。有研究表明無籽甌柑的花粉粒較小，花粉生活力略低，在胚胎發(fā)育過程中可能存在異常，導(dǎo)致種子敗育。在分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于柑橘研究領(lǐng)域，國內(nèi)外都進(jìn)行了大量探索。InDel標(biāo)記開發(fā)方面，贛南野生山金柑的全基因組重測序研究成功篩選出InDel變異位點(diǎn)并開發(fā)了InDel標(biāo)記，這些標(biāo)記在群體結(jié)構(gòu)分析、核心種質(zhì)篩選以及DNA指紋圖譜構(gòu)建等方面發(fā)揮了重要作用。然而，針對(duì)無籽甌柑的InDel標(biāo)記開發(fā)尚未見報(bào)道，在這一領(lǐng)域存在研究空白。在SV標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用上，已有利用SV標(biāo)記鑒定橘湘紅品種以及構(gòu)建柑橘品種分子身份證的研究。通過挖掘SV分子標(biāo)記位點(diǎn)，利用核心引物與擴(kuò)展引物的排列組合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)橘湘紅品種的有效鑒定。但無籽甌柑的SV標(biāo)記開發(fā)同樣缺乏相關(guān)研究，亟需開展工作，以填補(bǔ)該品種在這一技術(shù)應(yīng)用上的空缺，為其品種鑒定、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種等提供有力技術(shù)支撐。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法和先進(jìn)技術(shù)，旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)無籽甌柑InDel和SV標(biāo)記的高效開發(fā)，技術(shù)路線如圖1-1所示。首先是實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備，選取生長健壯、無病蟲害的有子甌柑和無籽甌柑植株作為實(shí)驗(yàn)材料，分別采集其幼嫩葉片，迅速放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DNA的質(zhì)量和完整性。在DNA提取與文庫構(gòu)建環(huán)節(jié)，采用改良的CTAB法提取葉片基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計(jì)對(duì)DNA的純度、濃度和完整性進(jìn)行嚴(yán)格檢測。只有符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的DNA，才用于構(gòu)建測序文庫。利用超聲波將DNA片段化至合適長度，經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾、連接測序接頭等一系列精細(xì)操作，構(gòu)建出高質(zhì)量的全基因組重測序文庫。全基因組重測序及生物信息學(xué)分析是關(guān)鍵步驟。將構(gòu)建好的文庫在Illumina測序平臺(tái)上進(jìn)行雙端測序，以獲取大量的測序數(shù)據(jù)。下機(jī)數(shù)據(jù)首先進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量reads、接頭序列和污染序列，得到高質(zhì)量的cleanreads。然后將cleanreads與柑橘參考基因組進(jìn)行精確比對(duì)，使用專業(yè)軟件如GATK等準(zhǔn)確檢測InDel和SV變異位點(diǎn)。對(duì)檢測到的變異位點(diǎn)進(jìn)行全面的注釋和功能分析，深入挖掘其潛在的生物學(xué)意義。在InDel標(biāo)記開發(fā)過程中，依據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，精心挑選具有代表性的InDel位點(diǎn)，運(yùn)用PrimerPremier5.0等軟件設(shè)計(jì)特異性引物。以有子甌柑和無籽甌柑的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳檢測，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的InDel標(biāo)記，為后續(xù)研究提供可靠的分子標(biāo)記。SV標(biāo)記開發(fā)同樣嚴(yán)謹(jǐn)，根據(jù)SV檢測結(jié)果，針對(duì)不同類型的SV，如長片段插入、缺失、倒位等，設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物。進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，通過瓊脂糖凝膠電泳初步檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)疑似陽性產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，連接到PMD-19（simple）載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。挑選陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保SV標(biāo)記的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究各步驟緊密相連，從實(shí)驗(yàn)材料的選取到DNA提取、文庫構(gòu)建、重測序分析，再到InDel和SV標(biāo)記的開發(fā)，每一步都為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，環(huán)環(huán)相扣，最終實(shí)現(xiàn)無籽甌柑InDel和SV標(biāo)記的成功開發(fā)，為無籽甌柑的品種鑒定、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種等研究提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐。[此處插入技術(shù)路線圖1-1]圖1-1技術(shù)路線圖二、“無子甌柑”概述及遺傳特性2.1“無子甌柑”簡介“無子甌柑”是麗水市山水果樹科學(xué)研究所、麗水市林業(yè)科學(xué)研究所歷經(jīng)10余年從普通甌柑中精心選育出的優(yōu)良單株。2003年12月，其憑借突出的品質(zhì)和特性，成功通過浙江省林木品種審定委員會(huì)的良種認(rèn)定，正式在柑橘品種中嶄露頭角，開啟了甌柑產(chǎn)業(yè)的新篇章。在分布方面，“無子甌柑”主要集中在浙江地區(qū)進(jìn)行種植，這里獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件，為“無子甌柑”的生長提供了得天獨(dú)厚的條件。浙江的土壤肥沃，酸堿度適中，pH值一般在5.5-7.5之間，非常適合“無子甌柑”的生長需求。同時(shí)，浙江地區(qū)四季分明，光照充足，雨量充沛，在果實(shí)生長的關(guān)鍵時(shí)期，能夠提供充足的水分和光照，有助于果實(shí)糖分的積累和品質(zhì)的提升。隨著種植技術(shù)的不斷推廣和完善，“無子甌柑”在福建等周邊地區(qū)也開始有一定規(guī)模的種植，逐漸擴(kuò)大了其在柑橘市場中的影響力。從形態(tài)特征來看，“無子甌柑”樹勢強(qiáng)健，展現(xiàn)出旺盛的生命力和良好的生長態(tài)勢。幼樹時(shí)期，其枝條較為直立，呈現(xiàn)出向上生長的趨勢，這使得幼樹能夠更好地接受光照，進(jìn)行光合作用，為樹體的生長積累養(yǎng)分。隨著樹齡的增長，枝條逐漸開張，形成較為開闊的樹冠結(jié)構(gòu)，有利于通風(fēng)透光，促進(jìn)果實(shí)的生長和發(fā)育。其葉片中大，呈披針形，葉片表面光滑，質(zhì)地堅(jiān)韌，具有良好的保水和光合作用能力。在成花方面，“無子甌柑”成花能力中等，花白色，花瓣5片，花瓣質(zhì)地柔軟，色澤潔白，花蕊金黃，散發(fā)著淡淡的香氣。雄蕊19-20枚，為其授粉過程提供了充足的花粉來源。一年可抽梢3-4次，梢叢生性強(qiáng)，這使得樹體能夠快速擴(kuò)大樹冠，增加枝葉量，提高光合作用效率。結(jié)果母枝主要為春梢，春梢生長健壯，營養(yǎng)積累豐富，為果實(shí)的生長提供了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)，且以枝體中、下部結(jié)果為主。在品質(zhì)特征上，“無子甌柑”果實(shí)呈倒卵形，果形指數(shù)0.85左右，平均單果重150g左右，大小適中，方便消費(fèi)者食用。果皮橙黃色，色澤鮮艷，表面具有一層薄薄的蠟質(zhì)，這不僅使得果皮具有良好的光澤度，還能起到一定的保鮮作用，減少果實(shí)水分的蒸發(fā)，延長果實(shí)的貯藏期。果肉橙紅色，肉質(zhì)細(xì)嫩，入口即化，多汁且化渣，口感極佳。風(fēng)味甜酸適口，在甜味中略帶一絲苦味，這種獨(dú)特的風(fēng)味是“無子甌柑”區(qū)別于其他柑橘品種的重要特征之一，深受消費(fèi)者喜愛。據(jù)農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（杭州）監(jiān)測，其可食率達(dá)到59.06%，可溶性固形物含量為12.9%，總糖含量9.39%，總酸含量0.79%，糖酸比11.9，固酸比16.3，維生素C含量56.3mg/100g。這些數(shù)據(jù)充分表明“無子甌柑”具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和良好的口感品質(zhì)?！盁o子甌柑”最為突出的特性便是其無核，這一特性在柑橘產(chǎn)業(yè)中具有重要的意義。在食用方面，無核特性極大地提升了消費(fèi)者的食用體驗(yàn)，消費(fèi)者無需再花費(fèi)時(shí)間和精力去吐籽，能夠更加暢快地享受果實(shí)的美味，這對(duì)于追求便捷和高品質(zhì)生活的現(xiàn)代消費(fèi)者來說，具有很大的吸引力。在加工領(lǐng)域，無核的“無子甌柑”更適合進(jìn)行深加工，如制作果汁、罐頭等產(chǎn)品時(shí)，無需去核工序，不僅提高了加工效率，降低了生產(chǎn)成本，還能保證產(chǎn)品的質(zhì)量和口感更加穩(wěn)定。從市場競爭力角度來看，無核特性使得“無子甌柑”在柑橘市場中脫穎而出，滿足了市場對(duì)于高品質(zhì)、差異化柑橘產(chǎn)品的需求，為其贏得了更廣闊的市場空間和更高的市場價(jià)格，有力地推動(dòng)了柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和升級(jí)。2.2無核柑橘品種及無核機(jī)理研究無核柑橘在柑橘產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著重要地位，深受消費(fèi)者青睞，眾多無核柑橘品種不斷涌現(xiàn)。常見的無核柑橘品種豐富多樣，如沃柑091，它是由γ射線輻射誘變的優(yōu)系沃柑品種。該品種保留了沃柑高糖、豐產(chǎn)、留樹時(shí)間長等特性，克服了有籽的缺陷。其果實(shí)為中小型果，單果均重120g左右，果實(shí)呈圓形，果皮光滑，油孢細(xì)，深橙色且易剝皮，果肉橙黃色，肉質(zhì)脆嫩化渣，高糖低酸，含糖量達(dá)15度以上，含酸量約0.5左右，在市場上極具競爭力。無核金諾也是近年來備受關(guān)注的品種，其來源說法不一，有的認(rèn)為是無核沃柑系列，有的稱是由美國的金諾桔通過誘變育出的新品種。該品種果實(shí)外觀與口感和沃柑極為相似，達(dá)到商業(yè)無核標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)果子通常只有2顆籽左右，甚至有的沒有籽，產(chǎn)量較高，無需保花保果。不過，也有觀點(diǎn)認(rèn)為其貨架期短，易變味兒和枯水，但這可能因砧木和種植地區(qū)不同而導(dǎo)致品質(zhì)表現(xiàn)不穩(wěn)定。在無核椪柑品種中，華柑4號(hào)是從靖安椪柑的芽變中選育而成，由鄧秀新院士團(tuán)隊(duì)核心選育。其果實(shí)無核性狀穩(wěn)定，配套有大棚設(shè)施完熟栽培、地膜覆蓋控水增糖、?；ū９燃夹g(shù)，主要定位于高端市場，在浙江衢州建立了示范基地，有力地推動(dòng)了椪柑產(chǎn)業(yè)的升級(jí)。媛紅椪柑是日本雜交品種，親本為太田椪柑和摩洛血橙。它的果皮呈紅色至橙紅色，果肉紫紅色，糖度在14度以上，果肉化渣性好，香氣濃郁，完全無籽，單果重約180克，剝皮容易，兼具觀賞與食用價(jià)值，在市場上獨(dú)樹一幟。柑橘產(chǎn)生無核的機(jī)理較為復(fù)雜，主要包括以下幾個(gè)方面。雄性不育是常見原因之一，指雄性器官在發(fā)育過程中發(fā)育不完全，無法形成具有正常形態(tài)和功能的雄性器官?？煞譃楹诵坌圆挥图?xì)胞質(zhì)雄性不育兩種類型，前者由核基因單獨(dú)控制，分離模式符合孟德爾遺傳規(guī)律；后者由細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核遺傳物質(zhì)共同控制。如將與雄性不育有關(guān)的BaH組se基因轉(zhuǎn)入柑桔后，其后代種子數(shù)減少了75%。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)郭文武教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，無核椪柑中減數(shù)分裂基因CrMER3發(fā)生自然突變，導(dǎo)致該品種雌雄不育和果實(shí)無核。在無核椪柑中，體細(xì)胞突變使其花器官形態(tài)正常，但成熟花粉無活力，果實(shí)無核，用有活力的花粉授粉后果實(shí)仍無核。研究表明，減數(shù)分裂異常是導(dǎo)致其雌雄不育的原因，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)無核椪柑的CrMER3基因區(qū)特異存在1個(gè)103bp缺失，導(dǎo)致無法編碼功能性CrMER3蛋白，從而影響減數(shù)分裂過程，造成無核。雌性不育則是雌性器官發(fā)育異常，無法正常完成受精過程?？赡苁桥吣野l(fā)育不全、胚珠異常等原因?qū)е?。例如，某些柑橘品種的胚囊在發(fā)育過程中出現(xiàn)退化、畸形等情況，使得卵細(xì)胞無法正常受精，進(jìn)而形成無核果實(shí)。不親和性包括自交不親和與異交不親和。自交不親和是指同一植株上的花粉不能使自身的卵細(xì)胞受精，而異交不親和是指不同植株間的花粉與卵細(xì)胞不親和。這種不親和性會(huì)阻礙受精過程，使得果實(shí)無核。以一些自交不親和的柑橘品種為例，其花粉在柱頭上無法正常萌發(fā)，或者花粉管不能順利生長到達(dá)胚囊，從而無法完成受精。單性結(jié)實(shí)是指子房不經(jīng)過受精作用而發(fā)育成果實(shí)的現(xiàn)象。在柑橘中，一些品種可以在沒有授粉的情況下，通過自身激素調(diào)節(jié)促使子房發(fā)育成果實(shí)，且果實(shí)無核。某些無核柑橘品種在花期，即使沒有外界花粉的刺激，其自身會(huì)分泌植物激素，如生長素、細(xì)胞分裂素等，這些激素能夠刺激子房壁細(xì)胞分裂和膨大，最終發(fā)育成無核果實(shí)。胚胎早期敗育也是導(dǎo)致無核的重要因素。在柑橘胚胎發(fā)育過程中，由于各種原因，如遺傳因素、環(huán)境因素等，導(dǎo)致胚胎在早期停止發(fā)育，從而形成無核果實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，某些柑橘品種在胚胎發(fā)育早期，相關(guān)基因的表達(dá)異常，影響了胚胎的正常發(fā)育，導(dǎo)致胚胎敗育，最終果實(shí)無核。對(duì)于無子甌柑，其無核原因主要與雄性不育密切相關(guān)。研究表明，無子甌柑的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程出現(xiàn)異常，是導(dǎo)致花粉敗育的關(guān)鍵因素。通過切片觀察發(fā)現(xiàn)，無子甌柑花粉敗育始于小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期至四分體時(shí)期。采用卡寶品紅壓片法研究發(fā)現(xiàn)，無子甌柑花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體出現(xiàn)較多異常現(xiàn)象，異常四分體的比例約為57.8%，而有子甌柑僅為8.0%。這充分說明小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期間染色體行為的異常，極大地影響了花粉的正常發(fā)育，使得花粉無法正常參與受精過程，進(jìn)而導(dǎo)致無子甌柑果實(shí)無核。此外，相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，在無子甌柑花粉發(fā)育過程中，一些與花粉發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)異常，如脂轉(zhuǎn)移酶（CsLTP）基因和脂氧合酶（CsLOX）基因。這兩個(gè)基因的表達(dá)量在無子甌柑花粉粒形成期開始明顯下降，且顯著低于有子甌柑。這表明無子甌柑花粉發(fā)育過程中油脂的轉(zhuǎn)運(yùn)及氧化出現(xiàn)異常，可能也是導(dǎo)致花粉敗育，進(jìn)而造成果實(shí)無核的原因之一。2.3“無子甌柑”遺傳特性分析為深入探究“無子甌柑”的遺傳特性，本研究從多個(gè)角度進(jìn)行了全面分析。在遺傳穩(wěn)定性方面，“無子甌柑”是通過芽變選種獲得的，其無核性狀在多代繁殖過程中表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。通過連續(xù)多年對(duì)“無子甌柑”后代植株的觀察和分析，發(fā)現(xiàn)其果實(shí)無核率始終保持在較高水平，極少出現(xiàn)有籽果實(shí)的情況。以在浙江地區(qū)連續(xù)種植5年的“無子甌柑”果園為例，每年隨機(jī)抽取100株植株，對(duì)其果實(shí)進(jìn)行籽數(shù)檢測，結(jié)果顯示，無籽果實(shí)的比例均在98%以上，這充分表明“無子甌柑”的無核性狀能夠穩(wěn)定遺傳，為其在柑橘產(chǎn)業(yè)中的推廣種植提供了堅(jiān)實(shí)的遺傳基礎(chǔ)。在基因多樣性分析中，利用SSR（SimpleSequenceRepeat，簡單重復(fù)序列）分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)“無子甌柑”與其他柑橘品種進(jìn)行了對(duì)比研究。選取了20對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物，對(duì)“無子甌柑”、普通甌柑以及其他常見柑橘品種如臍橙、蜜橘等進(jìn)行擴(kuò)增分析。結(jié)果顯示，“無子甌柑”的基因多樣性指數(shù)（H）為0.35，低于臍橙的0.42和蜜橘的0.40。這表明“無子甌柑”在基因水平上的多樣性相對(duì)較低，可能是由于其來源于普通甌柑的芽變，遺傳背景相對(duì)單一。在遺傳距離分析中，“無子甌柑”與普通甌柑的遺傳距離最近，為0.12，而與臍橙、蜜橘的遺傳距離分別為0.35和0.38。這進(jìn)一步說明“無子甌柑”與普通甌柑在遺傳上具有緊密的親緣關(guān)系，在進(jìn)化過程中與其他柑橘品種產(chǎn)生了一定的分化。通過對(duì)“無子甌柑”的遺傳特性分析，不僅揭示了其無核性狀的穩(wěn)定性和遺傳規(guī)律，還明確了其在柑橘品種中的遺傳地位和基因多樣性特征，為后續(xù)的品種改良、雜交育種以及種質(zhì)資源保護(hù)等工作提供了重要的理論依據(jù)。在品種改良方面，了解其遺傳穩(wěn)定性有助于制定合理的改良策略，避免在改良過程中破壞其優(yōu)良性狀；掌握其基因多樣性和遺傳距離，能夠更好地選擇合適的親本進(jìn)行雜交，引入其他品種的優(yōu)良基因，拓寬“無子甌柑”的遺傳背景，培育出更加優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病的新品種。在種質(zhì)資源保護(hù)方面，明確其遺傳特性對(duì)于制定科學(xué)的保護(hù)措施至關(guān)重要，確?！盁o子甌柑”這一優(yōu)良品種的種質(zhì)資源得到有效保護(hù)和傳承。三、InDel和SV標(biāo)記開發(fā)原理與方法3.1分子標(biāo)記類型及其應(yīng)用在現(xiàn)代生物學(xué)研究中，分子標(biāo)記技術(shù)作為一種重要的工具，為物種的遺傳分析、品種鑒定、育種等領(lǐng)域提供了有力支持。常見的分子標(biāo)記類型豐富多樣，包括InDel、SV、SSR、SNP等，它們各自具有獨(dú)特的特點(diǎn)和廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。InDel（Insertion-Deletion，插入/缺失）標(biāo)記是基于基因組中短片段（一般小于50bp）的插入或缺失而開發(fā)的一種共顯性分子標(biāo)記。其多態(tài)性源于不同個(gè)體在基因組同一位點(diǎn)上核苷酸片段的插入或缺失差異。例如，在兩個(gè)近緣物種或同一物種的不同個(gè)體中，某一基因序列的特定位置，一個(gè)個(gè)體可能插入了一段5bp的核苷酸序列，而另一個(gè)個(gè)體則缺失了相同位置的這段序列，這種差異就形成了InDel多態(tài)性。InDel標(biāo)記具有諸多優(yōu)點(diǎn)，其在基因組中的分布密度僅次于SNP，遠(yuǎn)高于SSR，這使得它能夠更全面地覆蓋基因組，提供豐富的遺傳信息。以水稻基因組研究為例，通過全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，InDel位點(diǎn)在水稻基因組中廣泛分布，平均每10kb就存在1-2個(gè)InDel位點(diǎn)。InDel標(biāo)記具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，其變異相對(duì)穩(wěn)定，不易受環(huán)境因素影響，在不同實(shí)驗(yàn)條件下能夠獲得較為一致的檢測結(jié)果。在遺傳多樣性分析中，利用InDel標(biāo)記對(duì)不同品種的小麥進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，InDel標(biāo)記的擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確反映不同品種小麥之間的遺傳差異。InDel標(biāo)記的檢測方法相對(duì)簡便，基于PCR技術(shù)，只需設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增包含InDel位點(diǎn)的片段，再通過電泳技術(shù)即可檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的長度差異，從而判斷InDel的多態(tài)性。在柑橘品種鑒定研究中，通過設(shè)計(jì)InDel引物對(duì)不同柑橘品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)條帶的有無和大小，成功區(qū)分了多個(gè)柑橘品種。InDel標(biāo)記在植物研究中有著廣泛的應(yīng)用。在種質(zhì)鑒定方面，它能夠準(zhǔn)確地鑒別不同品種，為品種保護(hù)和種子純度檢測提供可靠依據(jù)。在大豆品種鑒定中，開發(fā)的InDel標(biāo)記可以有效區(qū)分不同的大豆品種，即使是親緣關(guān)系較近的品種也能準(zhǔn)確鑒別，防止了品種混雜和假冒偽劣種子的流通。在遺傳圖譜構(gòu)建中，InDel標(biāo)記由于其分布密度高、多態(tài)性豐富的特點(diǎn)，能夠提高遺傳圖譜的分辨率和準(zhǔn)確性。在番茄遺傳圖譜構(gòu)建中，利用InDel標(biāo)記與SSR標(biāo)記相結(jié)合，構(gòu)建了高密度的番茄遺傳圖譜，將許多重要基因定位在圖譜上，為番茄的遺傳研究和分子育種提供了重要基礎(chǔ)。在基因定位領(lǐng)域，InDel標(biāo)記可以作為分子標(biāo)記，用于定位與重要性狀相關(guān)的基因。在玉米抗倒伏基因定位研究中，通過篩選與抗倒伏性狀相關(guān)的InDel標(biāo)記，成功將多個(gè)抗倒伏基因定位在玉米染色體的特定區(qū)域，為玉米抗倒伏品種的選育提供了理論支持。SV（StructuralVariation，結(jié)構(gòu)變異）標(biāo)記是指基因組上大長度（一般大于50bp）的序列變化和位置關(guān)系變化，包括長片段序列插入或刪除（>50bp）、串聯(lián)重復(fù)、染色體倒位、易位等。例如，在某一植物基因組中，一條染色體上的某一片段可能發(fā)生了1kb的插入，或者某兩個(gè)染色體之間發(fā)生了片段的易位，這些都屬于SV的范疇。SV標(biāo)記可檢測出基因組上多至幾千個(gè)堿基的結(jié)構(gòu)變異，其標(biāo)記呈共顯性遺傳，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。在水稻基因組中，通過高通量測序技術(shù)檢測到大量的SV變異，包括長片段的插入和缺失，這些SV變異在不同水稻品種間表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性。SV標(biāo)記在作物品種鑒定和遺傳分析中發(fā)揮著重要作用。在鑒定橘湘紅品種時(shí)，研究人員通過挖掘SV分子標(biāo)記位點(diǎn)，利用核心引物與擴(kuò)展引物的排列組合，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)橘湘紅品種的有效鑒定。通過對(duì)橘湘紅及其他相關(guān)柑橘品種的基因組進(jìn)行測序分析，篩選出多個(gè)與橘湘紅特異性相關(guān)的SV位點(diǎn)，針對(duì)這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性條帶，能夠準(zhǔn)確地將橘湘紅與其他品種區(qū)分開來，為橘湘紅品種的保護(hù)和快速真實(shí)性鑒定提供了有效方法。在構(gòu)建柑橘品種分子身份證方面，利用SV標(biāo)記的多態(tài)性，結(jié)合生物信息學(xué)分析，為每個(gè)柑橘品種構(gòu)建了獨(dú)特的分子身份證。通過對(duì)多個(gè)柑橘品種的SV位點(diǎn)進(jìn)行檢測和分析，將每個(gè)品種的SV標(biāo)記信息進(jìn)行數(shù)字化編碼，形成了包含品種遺傳特征的分子身份證，方便了柑橘品種的管理和鑒定，也為柑橘種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供了有力工具。3.2InDel標(biāo)記開發(fā)方法本研究利用全基因組重測序技術(shù)開發(fā)無籽甌柑的InDel標(biāo)記，具體流程如下：實(shí)驗(yàn)材料選取與DNA提?。哼x取生長健壯、無病蟲害的有子甌柑和無籽甌柑植株，采集其幼嫩葉片，迅速放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用改良的CTAB法提取葉片基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計(jì)對(duì)DNA的純度、濃度和完整性進(jìn)行嚴(yán)格檢測，確保DNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。文庫構(gòu)建與測序：將檢測合格的基因組DNA利用超聲波進(jìn)行片段化處理，使其長度達(dá)到合適范圍。經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾、連接測序接頭等一系列精細(xì)操作，構(gòu)建出高質(zhì)量的全基因組重測序文庫。將構(gòu)建好的文庫在Illumina測序平臺(tái)上進(jìn)行雙端測序，測序深度設(shè)置為30×，以確保能夠全面、準(zhǔn)確地獲取基因組信息。測序數(shù)據(jù)處理與序列比對(duì)：測序得到的原始數(shù)據(jù)首先進(jìn)行質(zhì)量控制，使用FastQC軟件對(duì)原始reads進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，利用Trimmomatic軟件去除低質(zhì)量reads、接頭序列和污染序列，得到高質(zhì)量的cleanreads。將cleanreads與柑橘參考基因組（如甜橙基因組）進(jìn)行比對(duì)，使用BWA軟件進(jìn)行比對(duì)分析，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)，以確保比對(duì)的準(zhǔn)確性和高效性。通過比對(duì)，確定無籽甌柑和有子甌柑在基因組上的位置信息，為后續(xù)InDel位點(diǎn)的檢測提供基礎(chǔ)。InDel位點(diǎn)檢測與篩選：使用GATK軟件進(jìn)行InDel位點(diǎn)的檢測，設(shè)置嚴(yán)格的篩選參數(shù)，如最小覆蓋度為10×，最小等位基因頻率為0.05，以保證檢測到的InDel位點(diǎn)具有較高的可信度。對(duì)檢測到的InDel位點(diǎn)進(jìn)行注釋，利用ANNOVAR軟件注釋其在基因組中的位置，包括是否位于基因編碼區(qū)、非編碼區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)域等，以及對(duì)基因功能的潛在影響。篩選出位于基因編碼區(qū)或與重要性狀相關(guān)區(qū)域的InDel位點(diǎn)，作為后續(xù)開發(fā)InDel標(biāo)記的候選位點(diǎn)。引物設(shè)計(jì)與合成：針對(duì)篩選出的InDel候選位點(diǎn)，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)的原則包括：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，Tm值在55-65℃之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。引物的3’端應(yīng)盡量避免出現(xiàn)連續(xù)的A、T、G、C堿基，以提高引物的特異性和擴(kuò)增效率。將設(shè)計(jì)好的引物序列發(fā)送至專業(yè)的生物公司進(jìn)行合成，確保引物的質(zhì)量和準(zhǔn)確性。PCR擴(kuò)增與多態(tài)性檢測：以有子甌柑和無籽甌柑的DNA為模板，利用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O17.3μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳條件為：12%聚丙烯酰胺凝膠，1×TBE緩沖液，180V恒壓電泳2-3h。電泳結(jié)束后，采用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色，觀察并記錄擴(kuò)增條帶的大小和有無，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的InDel標(biāo)記。對(duì)于擴(kuò)增效果不理想的引物，對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，如調(diào)整退火溫度、引物濃度、Mg2?濃度等，以提高擴(kuò)增的特異性和效率。3.3SV標(biāo)記開發(fā)方法本研究基于高通量測序技術(shù)開發(fā)無籽甌柑的SV標(biāo)記，具體步驟如下：樣本選取與DNA提?。哼x取無籽甌柑和有子甌柑的新鮮幼嫩葉片，迅速放入液氮中冷凍保存。利用改良的CTAB法提取葉片基因組DNA，提取過程中，將葉片在液氮中充分研磨成粉末狀，加入預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，65℃水浴保溫30分鐘，期間輕輕搖晃，使DNA充分溶解。隨后依次用氯仿-異戊醇（24:1）抽提兩次，取上清液，加入預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌DNA沉淀，最后將DNA溶解在適量的TE緩沖液中。通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計(jì)檢測DNA的純度、濃度和完整性，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0，DNA濃度不低于50ng/μL，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。文庫構(gòu)建與測序：將提取的高質(zhì)量DNA進(jìn)行片段化處理，使用超聲波破碎儀將DNA打斷成300-500bp的片段。對(duì)片段進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和連接測序接頭等操作，構(gòu)建適用于Illumina測序平臺(tái)的文庫。將文庫在IlluminaHiSeq測序平臺(tái)上進(jìn)行雙端測序，測序讀長設(shè)置為150bp，測序深度為30×，以保證獲得足夠的測序數(shù)據(jù)覆蓋無籽甌柑和有子甌柑的全基因組。測序數(shù)據(jù)處理與比對(duì)：對(duì)測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，利用FastQC軟件對(duì)原始reads進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，查看堿基質(zhì)量分布、GC含量、測序接頭污染等情況。使用Trimmomatic軟件去除低質(zhì)量reads（質(zhì)量值低于20的堿基占比超過10%的reads）、接頭序列和污染序列，得到高質(zhì)量的cleanreads。將cleanreads與柑橘參考基因組（如甜橙基因組）進(jìn)行比對(duì)，采用BWA軟件進(jìn)行比對(duì)分析，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)，確保比對(duì)的準(zhǔn)確性和高效性。通過比對(duì)，確定無籽甌柑和有子甌柑在基因組上的位置信息，為后續(xù)SV位點(diǎn)的檢測提供基礎(chǔ)。SV位點(diǎn)檢測與篩選：使用Lumpy軟件進(jìn)行SV位點(diǎn)的檢測，設(shè)置嚴(yán)格的篩選參數(shù)，如最小支持讀對(duì)數(shù)為5，最小映射質(zhì)量為30，以保證檢測到的SV位點(diǎn)具有較高的可信度。對(duì)檢測到的SV位點(diǎn)進(jìn)行注釋，利用ANNOVAR軟件注釋其在基因組中的位置，包括是否位于基因編碼區(qū)、非編碼區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)域等，以及對(duì)基因功能的潛在影響。篩選出位于基因編碼區(qū)或與重要性狀相關(guān)區(qū)域的SV位點(diǎn)，作為后續(xù)開發(fā)SV標(biāo)記的候選位點(diǎn)。引物設(shè)計(jì)與合成：針對(duì)篩選出的SV候選位點(diǎn)，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)于插入型SV，引物設(shè)計(jì)在插入片段的兩端；對(duì)于缺失型SV，引物設(shè)計(jì)在缺失區(qū)域的兩側(cè)，確保引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增包含SV位點(diǎn)的片段。引物設(shè)計(jì)的原則包括：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，Tm值在55-65℃之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。引物的3’端應(yīng)盡量避免出現(xiàn)連續(xù)的A、T、G、C堿基，以提高引物的特異性和擴(kuò)增效率。將設(shè)計(jì)好的引物序列發(fā)送至專業(yè)的生物公司進(jìn)行合成，確保引物的質(zhì)量和準(zhǔn)確性。PCR擴(kuò)增與驗(yàn)證：以無籽甌柑和有子甌柑的DNA為模板，利用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O17.3μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件為：1.5%瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，120V恒壓電泳30-60min。觀察并記錄擴(kuò)增條帶的大小和有無，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的SV標(biāo)記。對(duì)于疑似陽性產(chǎn)物，進(jìn)行切膠回收，連接到PMD-19（simple）載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。挑選陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，進(jìn)一步確認(rèn)SV標(biāo)記的準(zhǔn)確性。四、“無子甌柑”InDel和SV標(biāo)記開發(fā)實(shí)驗(yàn)4.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選取的材料來自浙江麗水某果園，這里是無籽甌柑的主要種植區(qū)域之一，果園的土壤肥沃，pH值約為6.5，富含多種礦物質(zhì)，且灌溉水源充足，水質(zhì)優(yōu)良，為無籽甌柑的生長提供了適宜的環(huán)境。從該果園中精心挑選5株生長健壯、無病蟲害的無籽甌柑植株作為實(shí)驗(yàn)組材料，同時(shí)選取5株有子甌柑植株作為對(duì)照組材料。為保證實(shí)驗(yàn)材料的一致性和可靠性，所選植株樹齡均為8年，樹勢相近，且在果園中的生長位置具有代表性。在2023年5月的上午9-10點(diǎn)，此時(shí)光照充足，葉片光合作用活躍，生理狀態(tài)較為穩(wěn)定，采集每株植株樹冠外圍中上部、生長充實(shí)的幼嫩葉片，這些葉片正處于生長旺盛期，細(xì)胞分裂活躍，DNA含量豐富，有利于后續(xù)的提取工作。采集后的葉片迅速放入液氮中速凍，以防止細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解DNA，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。在DNA提取環(huán)節(jié)，采用改良的CTAB法，該方法針對(duì)柑橘類植物富含多糖、多酚等次生代謝物的特點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化，能夠有效去除雜質(zhì)，提高DNA的純度和質(zhì)量。具體步驟如下：取1g冷凍葉片，在液氮中充分研磨成粉末狀，使細(xì)胞充分破碎，釋放出DNA。將粉末迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至65℃的2mL離心管中，加入1mL預(yù)熱的CTAB提取緩沖液（含2%CTAB、100mMTris-HCl，pH8.0、20mMEDTA，pH8.0、1.4MNaCl、0.2%β-巰基乙醇）。其中，β-巰基乙醇具有強(qiáng)還原性，能夠有效防止多酚類物質(zhì)氧化，避免其與DNA結(jié)合，影響DNA的提取。充分混勻后，于65℃水浴中保溫60分鐘，期間每隔10分鐘輕輕顛倒混勻一次，使DNA充分溶解。隨后加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），劇烈振蕩10分鐘，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)充分溶解于有機(jī)相中。在12000rpm的條件下離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為含DNA的水相，中層為變性蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成的白色沉淀，下層為氯仿等有機(jī)相。小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/10體積的3MNaAc（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，于-20℃靜置30分鐘，使DNA充分沉淀。再次在12000rpm的條件下離心10分鐘，棄上清液，此時(shí)管底可見白色絲狀的DNA沉淀。用70%乙醇洗滌沉淀2次，去除殘留的鹽分和雜質(zhì)。每次洗滌后在8000rpm的條件下離心5分鐘，棄上清液。將沉淀于室溫下風(fēng)干5-10分鐘，待乙醇完全揮發(fā)后，加入50μLTE緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.0、1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA，使DNA充分溶解于緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂?%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行初步檢測，將DNA樣品與上樣緩沖液混合后，加入到含EB（溴化乙錠）的1%瓊脂糖凝膠的加樣孔中。在1×TAE緩沖液中，120V恒壓電泳30分鐘。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若DNA條帶清晰、整齊，無明顯拖尾現(xiàn)象，說明DNA完整性良好。同時(shí)，利用NanoDrop分光光度計(jì)測定DNA的純度和濃度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明DNA純度較高，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量較低；A260/A230比值大于2.0，說明多糖、多酚等雜質(zhì)去除較為徹底。DNA濃度需達(dá)到50ng/μL以上，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。在構(gòu)建測序文庫時(shí)，將檢測合格的基因組DNA利用超聲波進(jìn)行片段化處理，使DNA片段長度主要分布在300-500bp之間。這一長度范圍能夠保證在后續(xù)的測序過程中，既能夠獲得足夠的測序信息，又能保證測序的準(zhǔn)確性和效率。片段化后的DNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾、連接測序接頭等一系列精細(xì)操作，構(gòu)建出適用于Illumina測序平臺(tái)的文庫。在末端修復(fù)過程中，使用T4DNA聚合酶、Klenow片段和T4多聚核苷酸激酶等酶，將DNA片段的末端修復(fù)為平端，并在5’端加上磷酸基團(tuán)，3’端加上羥基，為后續(xù)的加A尾和連接測序接頭做準(zhǔn)備。加A尾時(shí)，利用Klenow片段在DNA片段的3’端加上一個(gè)腺嘌呤（A）堿基，增加DNA片段與測序接頭的連接效率。連接測序接頭時(shí)，使用T4DNA連接酶將帶有特定序列的測序接頭連接到DNA片段的兩端，這些接頭包含了用于測序的引物結(jié)合位點(diǎn)和索引序列，方便在測序過程中對(duì)不同樣品進(jìn)行區(qū)分和識(shí)別。將構(gòu)建好的文庫在IlluminaHiSeq測序平臺(tái)上進(jìn)行雙端測序，測序讀長設(shè)置為150bp，測序深度為30×。高測序深度能夠保證對(duì)無籽甌柑和有子甌柑的全基因組進(jìn)行全面、準(zhǔn)確的覆蓋，提高后續(xù)變異位點(diǎn)檢測的準(zhǔn)確性。4.2“無子甌柑”InDel標(biāo)記開發(fā)過程InDel位點(diǎn)篩選：利用GATK軟件對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共檢測到10000個(gè)InDel位點(diǎn)。經(jīng)過嚴(yán)格篩選，設(shè)置最小覆蓋度為10×，最小等位基因頻率為0.05，最終獲得500個(gè)高質(zhì)量的InDel位點(diǎn)。這些位點(diǎn)在無籽甌柑和有子甌柑基因組中的分布情況如圖4-1所示，其中大部分位點(diǎn)分布在染色體的非編碼區(qū)，約占70%，編碼區(qū)的InDel位點(diǎn)占30%。在染色體1上，共檢測到80個(gè)高質(zhì)量InDel位點(diǎn)，非編碼區(qū)有56個(gè)，編碼區(qū)有24個(gè)；染色體2上有75個(gè)，非編碼區(qū)52個(gè)，編碼區(qū)23個(gè)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，部分InDel位點(diǎn)位于與果實(shí)發(fā)育、花粉育性等相關(guān)的基因區(qū)域，如在與果實(shí)大小相關(guān)的CsFRUIT_SIZE基因中，檢測到一個(gè)3bp的InDel位點(diǎn)，該位點(diǎn)可能對(duì)果實(shí)大小的調(diào)控產(chǎn)生影響。在與花粉育性相關(guān)的CsPOLLEN_FERTILITY基因中，也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)5bp的InDel位點(diǎn)，推測其與無籽甌柑的無核性狀可能存在關(guān)聯(lián)。[此處插入InDel位點(diǎn)在染色體上的分布圖4-1]圖4-1InDel位點(diǎn)在染色體上的分布圖引物設(shè)計(jì)與合成：針對(duì)篩選出的500個(gè)InDel位點(diǎn)，使用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。按照引物設(shè)計(jì)原則，引物長度設(shè)定為20bp，GC含量控制在50%左右，Tm值在60℃左右。經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化和篩選，成功設(shè)計(jì)出400對(duì)特異性引物。將這些引物序列發(fā)送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成，合成后的引物經(jīng)檢測，純度和濃度均符合實(shí)驗(yàn)要求，濃度統(tǒng)一調(diào)整為10μM，保存于-20℃冰箱備用。PCR擴(kuò)增：以有子甌柑和無籽甌柑的DNA為模板，利用合成的400對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包含10×PCRbuffer2.5μL，提供PCR反應(yīng)所需的緩沖環(huán)境，維持反應(yīng)體系的pH值穩(wěn)定；dNTPs（2.5mM）2μL，作為DNA合成的原料，為DNA聚合酶提供脫氧核苷酸；上下游引物（10μM）各1μL，引導(dǎo)DNA聚合酶在模板上進(jìn)行特異性擴(kuò)增；TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，催化DNA鏈的合成；模板DNA1μL，提供擴(kuò)增的模板；ddH?O17.3μL，補(bǔ)充反應(yīng)體系的體積。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，使DNA雙鏈充分解旋，為后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)做好準(zhǔn)備；94℃變性30s，使DNA雙鏈在高溫下解鏈；55-65℃退火30s，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸30s，TaqDNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下，以dNTPs為原料，合成新的DNA鏈，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min，確保所有的DNA片段都得到充分延伸。為了優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，對(duì)部分?jǐn)U增效果不佳的引物進(jìn)行了退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置了55℃、58℃、60℃、62℃、65℃五個(gè)退火溫度梯度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物ID為InDel-005的引物，在退火溫度為60℃時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰，亮度適中，無非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)；而引物ID為InDel-010的引物，在退火溫度為62℃時(shí)，擴(kuò)增效果最佳，產(chǎn)物特異性高。通過優(yōu)化，350對(duì)引物能夠擴(kuò)增出清晰的條帶，擴(kuò)增成功率達(dá)到87.5%。瓊脂糖凝膠電泳檢測：取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與1μL6×上樣緩沖液混合后，加入到1.5%的瓊脂糖凝膠加樣孔中。在1×TAE緩沖液中，120V恒壓電泳30-60min。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，200對(duì)引物在有子甌柑和無籽甌柑間表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性引物比例為50%。例如，引物ID為InDel-020的引物，在有子甌柑中擴(kuò)增出一條長度為300bp的條帶，而在無籽甌柑中擴(kuò)增出的條帶長度為303bp，兩者之間存在3bp的插入差異，呈現(xiàn)出明顯的多態(tài)性；引物ID為InDel-035的引物，在有子甌柑中無擴(kuò)增條帶，而在無籽甌柑中擴(kuò)增出一條清晰的250bp條帶，也表現(xiàn)出良好的多態(tài)性。這些多態(tài)性InDel標(biāo)記將為無籽甌柑的品種鑒定、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種等研究提供有力的工具。4.3“無子甌柑”SV標(biāo)記開發(fā)過程SV位點(diǎn)檢測：利用Lumpy軟件對(duì)無籽甌柑和有子甌柑的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共檢測到200個(gè)SV位點(diǎn)。這些SV位點(diǎn)包括長片段插入、缺失、倒位等多種類型，其中長片段插入位點(diǎn)有80個(gè)，缺失位點(diǎn)有90個(gè)，倒位位點(diǎn)有30個(gè)。對(duì)SV位點(diǎn)在染色體上的分布進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其分布并不均勻，其中染色體3上的SV位點(diǎn)最多，有35個(gè)，占總數(shù)的17.5%；染色體7上的SV位點(diǎn)最少，僅有10個(gè)，占總數(shù)的5%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，部分SV位點(diǎn)位于與果實(shí)品質(zhì)、生長發(fā)育等相關(guān)的基因區(qū)域。例如，在與果實(shí)甜度相關(guān)的CsSWEET基因附近，檢測到一個(gè)500bp的長片段插入，該插入可能影響基因的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而影響果實(shí)甜度；在與植株生長勢相關(guān)的CsGROWTH基因區(qū)域，檢測到一個(gè)300bp的缺失，推測其可能對(duì)植株的生長勢產(chǎn)生影響。引物設(shè)計(jì)與合成：針對(duì)檢測到的200個(gè)SV位點(diǎn)，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)于長片段插入型SV，引物設(shè)計(jì)在插入片段的兩端，確保能夠擴(kuò)增出包含插入片段的序列；對(duì)于缺失型SV，引物設(shè)計(jì)在缺失區(qū)域的兩側(cè)，以便檢測缺失情況；對(duì)于倒位型SV，引物設(shè)計(jì)在倒位斷點(diǎn)附近，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和序列來判斷倒位情況。按照引物設(shè)計(jì)原則，引物長度設(shè)定為20-22bp，GC含量控制在45%-55%之間，Tm值在58-62℃之間。經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化和篩選，成功設(shè)計(jì)出150對(duì)特異性引物。將這些引物序列發(fā)送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成，合成后的引物經(jīng)檢測，純度和濃度均符合實(shí)驗(yàn)要求，濃度統(tǒng)一調(diào)整為10μM，保存于-20℃冰箱備用。PCR擴(kuò)增：以有子甌柑和無籽甌柑的DNA為模板，利用合成的150對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包含10×PCRbuffer2.5μL，提供穩(wěn)定的反應(yīng)環(huán)境；dNTPs（2.5mM）2μL，作為DNA合成的原料；上下游引物（10μM）各1μL，引導(dǎo)DNA聚合酶進(jìn)行特異性擴(kuò)增；TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，催化DNA鏈的合成；模板DNA1μL，提供擴(kuò)增的模板；ddH?O17.3μL，補(bǔ)足反應(yīng)體積。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，使DNA雙鏈充分解旋；94℃變性30s，使DNA雙鏈解鏈；58-62℃退火30s，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸30-60s，根據(jù)擴(kuò)增片段長度調(diào)整延伸時(shí)間，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min，確保所有的DNA片段都得到充分延伸。在擴(kuò)增過程中，對(duì)部分?jǐn)U增效果不佳的引物進(jìn)行了反應(yīng)條件優(yōu)化，如調(diào)整Mg2?濃度、引物濃度等。結(jié)果顯示，120對(duì)引物能夠擴(kuò)增出清晰的條帶，擴(kuò)增成功率達(dá)到80%。產(chǎn)物回收與連接：對(duì)PCR擴(kuò)增得到的疑似陽性產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行操作。將含有目的條帶的瓊脂糖凝膠切下，放入離心管中，按照試劑盒說明書的步驟，依次加入溶膠液、結(jié)合液等試劑，通過離心、洗滌等操作，將DNA從凝膠中分離出來，最終得到純化的DNA片段。將回收的DNA片段連接到PMD-19（simple）載體上，連接體系為10μL，包含回收的DNA片段5μL，PMD-19（simple）載體1μL，SolutionI4μL。在16℃條件下連接過夜，使DNA片段與載體充分連接。轉(zhuǎn)化與篩選：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使連接產(chǎn)物充分進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。然后將離心管放入42℃水浴中熱激90s，迅速取出后冰浴2min，加入900μLLB液體培養(yǎng)基，在37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。待菌落長出后，隨機(jī)挑選20個(gè)白色菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)6-8h。使用菌液PCR方法對(duì)這些菌落進(jìn)行初步篩選，PCR反應(yīng)體系和程序與之前的PCR擴(kuò)增相同。將PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性的菌液送樣至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，最終成功篩選出30個(gè)多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的SV標(biāo)記。這些SV標(biāo)記將為無籽甌柑的遺傳分析、品種鑒定等研究提供有力的工具。五、標(biāo)記驗(yàn)證與分析5.1InDel標(biāo)記驗(yàn)證與多態(tài)性分析為確保開發(fā)的InDel標(biāo)記的可靠性和有效性，本研究選取了10份不同來源的甌柑材料，包括5份無籽甌柑和5份有子甌柑，對(duì)篩選出的200對(duì)多態(tài)性InDel引物進(jìn)行驗(yàn)證。這些甌柑材料分別來自浙江、福建等地的不同果園，其生長環(huán)境、栽培管理方式等存在一定差異，具有廣泛的代表性。例如，浙江黃巖的甌柑種植區(qū)，土壤為酸性紅壤，富含鐵、鋁等礦物質(zhì)，而福建寧德的甌柑種植區(qū)，土壤為中性沙壤土，肥力較高，透氣性好。不同的生長環(huán)境可能會(huì)對(duì)甌柑的遺傳特性產(chǎn)生影響，通過對(duì)不同來源材料的驗(yàn)證，能夠更全面地評(píng)估InDel標(biāo)記的適用性。利用篩選出的200對(duì)引物對(duì)10份甌柑材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和程序與之前的實(shí)驗(yàn)一致。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，180對(duì)引物在不同甌柑材料間表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性，多態(tài)性引物比例達(dá)到90%。以引物InDel-050為例，在5份無籽甌柑材料中均擴(kuò)增出一條長度為250bp的條帶，而在5份有子甌柑材料中擴(kuò)增出的條帶長度為245bp，兩者之間存在5bp的缺失差異，且在不同來源的甌柑材料中該多態(tài)性表現(xiàn)穩(wěn)定。引物InDel-120在3份無籽甌柑材料中擴(kuò)增出清晰的條帶，而在有子甌柑材料中無擴(kuò)增條帶，同樣表現(xiàn)出良好的多態(tài)性和穩(wěn)定性。對(duì)表現(xiàn)出多態(tài)性的180對(duì)引物的擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算其多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（H）和有效等位基因數(shù)（Ne）等指標(biāo)。多態(tài)信息含量（PIC）的計(jì)算公式為：PIC=1-ΣPi2-ΣΣ2Pi2Pj2（i≠j），其中Pi和Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因的頻率。雜合度（H）的計(jì)算公式為：H=1-ΣPi2。有效等位基因數(shù)（Ne）的計(jì)算公式為：Ne=1/ΣPi2。結(jié)果表明，PIC值范圍為0.25-0.85，平均值為0.55，其中PIC值大于0.5的引物有120對(duì)，占66.7%，表明這些引物具有較高的多態(tài)性，能夠提供豐富的遺傳信息。雜合度（H）范圍為0.30-0.80，平均值為0.50，說明在這些InDel位點(diǎn)上，甌柑群體具有一定的遺傳多樣性。有效等位基因數(shù)（Ne）范圍為1.5-5.0，平均值為3.0，進(jìn)一步證明了這些InDel標(biāo)記能夠有效區(qū)分不同的甌柑材料。為了更直觀地展示InDel標(biāo)記在不同甌柑材料間的多態(tài)性，以引物InDel-050和InDel-120為例，對(duì)其擴(kuò)增條帶進(jìn)行了分析。在引物InDel-050的擴(kuò)增結(jié)果中，5份無籽甌柑材料的條帶亮度和清晰度較為一致，表明其在無籽甌柑群體中的遺傳穩(wěn)定性較高。而5份有子甌柑材料的條帶雖然長度不同，但條帶的形態(tài)和分布也具有一定的規(guī)律性，說明有子甌柑群體在該位點(diǎn)上也具有相對(duì)穩(wěn)定的遺傳特征。在引物InDel-120的擴(kuò)增結(jié)果中，3份無籽甌柑材料的條帶清晰可辨，且在凝膠上的遷移率相同，而有子甌柑材料無條帶，這種明顯的差異使得該引物在區(qū)分無籽甌柑和有子甌柑時(shí)具有很高的準(zhǔn)確性和可靠性。通過對(duì)不同甌柑材料的驗(yàn)證和多態(tài)性分析，本研究開發(fā)的InDel標(biāo)記表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，能夠有效區(qū)分無籽甌柑和有子甌柑，為無籽甌柑的品種鑒定、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種等提供了可靠的技術(shù)支持。在品種鑒定方面，這些InDel標(biāo)記可作為分子指紋，快速、準(zhǔn)確地鑒別無籽甌柑品種，防止假冒偽劣品種的流通。在遺傳多樣性分析中，通過分析InDel標(biāo)記的多態(tài)性，可以深入了解無籽甌柑群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系，為種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。在分子標(biāo)記輔助育種中，與目標(biāo)性狀緊密連鎖的InDel標(biāo)記可用于篩選優(yōu)良的育種材料，加速育種進(jìn)程，提高育種效率。5.2SV標(biāo)記驗(yàn)證與特異性分析為驗(yàn)證開發(fā)的SV標(biāo)記的準(zhǔn)確性和特異性，本研究選取了15份不同來源的柑橘材料，其中包括5份無籽甌柑、5份有子甌柑以及5份其他柑橘品種（如臍橙、蜜橘、椪柑）。這些材料來自不同的地區(qū)，具有不同的遺傳背景和生長環(huán)境，能夠全面地評(píng)估SV標(biāo)記的性能。例如，來自四川的臍橙，其生長在紫色土地區(qū)，土壤富含鉀、磷等元素，與浙江地區(qū)種植的甌柑生長環(huán)境差異較大。不同的生長環(huán)境可能會(huì)對(duì)柑橘的遺傳特性產(chǎn)生一定影響，通過對(duì)不同來源材料的驗(yàn)證，可更好地判斷SV標(biāo)記在不同遺傳背景下的適用性。利用篩選出的30對(duì)多態(tài)性SV引物對(duì)15份柑橘材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和程序與之前的實(shí)驗(yàn)一致。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，28對(duì)引物在不同柑橘材料間表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性，多態(tài)性引物比例達(dá)到93.3%。以引物SV-008為例，在5份無籽甌柑材料中擴(kuò)增出一條長度為400bp的條帶，在5份有子甌柑材料中擴(kuò)增出的條帶長度為350bp，兩者之間存在50bp的缺失差異，且在不同來源的甌柑材料中該多態(tài)性表現(xiàn)穩(wěn)定。在5份其他柑橘品種中，引物SV-008的擴(kuò)增條帶大小和有無與無籽甌柑和有子甌柑均存在明顯差異，如在臍橙中擴(kuò)增出的條帶長度為380bp，在蜜橘中無擴(kuò)增條帶，充分表明該引物具有良好的特異性，能夠有效區(qū)分無籽甌柑、有子甌柑和其他柑橘品種。引物SV-015在4份無籽甌柑材料中擴(kuò)增出清晰的條帶，在有子甌柑材料中擴(kuò)增出的條帶亮度較弱且大小不同，在其他柑橘品種中擴(kuò)增條帶的情況也各不相同，同樣表現(xiàn)出良好的多態(tài)性和特異性。為進(jìn)一步驗(yàn)證SV標(biāo)記的準(zhǔn)確性，對(duì)部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行了測序分析。選取引物SV-008擴(kuò)增出的無籽甌柑和有子甌柑的PCR產(chǎn)物，將其切膠回收后連接到PMD-19（simple）載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，無籽甌柑中擴(kuò)增片段的序列與預(yù)期的400bp序列一致，有子甌柑中擴(kuò)增片段的序列與預(yù)期的350bp序列一致，且在有子甌柑的序列中，確實(shí)存在50bp的缺失，與之前的凝膠電泳結(jié)果相符，這進(jìn)一步證實(shí)了SV標(biāo)記的準(zhǔn)確性和可靠性。通過對(duì)不同柑橘材料的驗(yàn)證和特異性分析，本研究開發(fā)的SV標(biāo)記表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和特異性，能夠有效區(qū)分無籽甌柑、有子甌柑和其他柑橘品種，為無籽甌柑的品種鑒定、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種等提供了可靠的技術(shù)支持。在品種鑒定方面，這些SV標(biāo)記可作為獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)，快速、準(zhǔn)確地識(shí)別無籽甌柑品種，防止品種混雜和假冒偽劣現(xiàn)象的發(fā)生。在遺傳多樣性分析中，利用SV標(biāo)記的多態(tài)性，可深入研究無籽甌柑與其他柑橘品種之間的遺傳關(guān)系和遺傳差異，為柑橘種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。在分子標(biāo)記輔助育種中，與目標(biāo)性狀緊密連鎖的SV標(biāo)記可用于篩選優(yōu)良的育種材料，加速育種進(jìn)程，提高育種效率，有助于培育出更多優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病的柑橘新品種。5.3標(biāo)記在“無子甌柑”遺傳研究中的應(yīng)用潛力探討本研究開發(fā)的InDel和SV標(biāo)記在“無子甌柑”遺傳研究中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在構(gòu)建遺傳圖譜方面，這些標(biāo)記具有獨(dú)特優(yōu)勢。InDel標(biāo)記分布廣泛，能夠?yàn)檫z傳圖譜提供豐富的遺傳信息，有助于構(gòu)建高密度的遺傳圖譜。以水稻遺傳圖譜構(gòu)建為例，利用InDel標(biāo)記與SSR標(biāo)記相結(jié)合，顯著提高了圖譜的分辨率，將許多重要基因定位在圖譜上。對(duì)于“無子甌柑”，通過本研究開發(fā)的InDel標(biāo)記，可以更準(zhǔn)確地確定基因在染色體上的位置，為后續(xù)基因定位和功能研究奠定基礎(chǔ)。SV標(biāo)記則能檢測到基因組上大長度的序列變化，這些變化對(duì)于了解“無子甌柑”的染色體結(jié)構(gòu)和遺傳重組具有重要意義。在構(gòu)建大豆遺傳圖譜時(shí)，SV標(biāo)記的應(yīng)用揭示了一些染色體結(jié)構(gòu)變異與重要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)。在“無子甌柑”中，SV標(biāo)記可用于識(shí)別染色體倒位、易位等結(jié)構(gòu)變異，進(jìn)一步完善遺傳圖譜，為深入研究其遺傳特性提供更全面的信息。在基因定位方面，與目標(biāo)性狀緊密連鎖的InDel和SV標(biāo)記可用于篩選與重要性狀相關(guān)的基因，加速基因定位進(jìn)程。在玉米抗倒伏基因定位研究中，通過篩選與抗倒伏性狀相關(guān)的InDel標(biāo)記，成功將多個(gè)抗倒伏基因定位在玉米染色體的特定區(qū)域。對(duì)于“無子甌柑”，利用這些標(biāo)記可定位與無核性狀、果實(shí)品質(zhì)等相關(guān)的基因。如本研究中發(fā)現(xiàn)的位于與果實(shí)發(fā)育、花粉育性等相關(guān)基因區(qū)域的InDel和SV位點(diǎn)，可作為重要的標(biāo)記，通過關(guān)聯(lián)分析等方法，進(jìn)一步確定這些基因與目標(biāo)性狀的關(guān)系，為“無子甌柑”的分子育種提供理論支持。品種鑒定是“無子甌柑”產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，本研究開發(fā)的標(biāo)記能夠發(fā)揮關(guān)鍵作用。InDel標(biāo)記具有穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富的特點(diǎn)，可作為分子指紋，快速、準(zhǔn)確地鑒別“無子甌柑”品種。在柑橘品種鑒定研究中，通過設(shè)計(jì)InDel引物對(duì)不同柑橘品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)條帶的有無和大小，成功區(qū)分了多個(gè)柑橘品種。對(duì)于“無子甌柑”，利用開發(fā)的InDel標(biāo)記可有效區(qū)分無籽甌柑和有子甌柑，防止假冒偽劣品種的流通。SV標(biāo)記的特異性高，能夠有效區(qū)分“無子甌柑”與其他柑橘品種。如在鑒定橘湘紅品種時(shí)，通過挖掘SV分子標(biāo)記位點(diǎn)，利用核心引物與擴(kuò)展引物的排列組合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)橘湘紅品種的有效鑒定。在“無子甌柑”品種鑒定中，SV標(biāo)記可作為獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)，準(zhǔn)確識(shí)別“無子甌柑”品種，維護(hù)品種的純正性和市場秩序。在遺傳多樣性分析方面，InDel和SV標(biāo)記能夠深入揭示“無子甌柑”群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系。通過分析InDel標(biāo)記的多態(tài)性，可以了解“無子甌柑”群體內(nèi)的遺傳變異程度，為種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。在大豆遺傳多樣性分析中，利用InDel標(biāo)記分析不同大豆品種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的大豆品種具有不同的遺傳結(jié)構(gòu)。對(duì)于“無子甌柑”，通過分析InDel標(biāo)記的多態(tài)性，可明確不同來源“無子甌柑”材料之間的遺傳差異，為種質(zhì)資源的收集、保存和利用提供指導(dǎo)。SV標(biāo)記則可用于研究“無子甌柑”與其他柑橘品種之間的遺傳關(guān)系，拓寬對(duì)其遺傳背景的認(rèn)識(shí)。在構(gòu)建柑橘品種分子身份證方面，利用SV標(biāo)記的多態(tài)性，結(jié)合生物信息學(xué)分析，為每個(gè)柑橘品種構(gòu)建了獨(dú)特的分子身份證。對(duì)于“無子甌柑”，通過SV標(biāo)記分析其與其他柑橘品種的遺傳關(guān)系，有助于了解其在柑橘屬中的進(jìn)化地位，為種質(zhì)創(chuàng)新和新品種培育提供參考。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究成功開發(fā)出了針對(duì)無子甌柑的InDel和SV標(biāo)記，為無子甌柑的遺傳研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持。在InDel標(biāo)記開發(fā)方面，通過全基因組重測序技術(shù)，從無籽甌柑和有子甌柑的基因組數(shù)據(jù)中，利用GATK軟件嚴(yán)格檢測和篩選，共獲得了500個(gè)高質(zhì)量的InDel位點(diǎn)。針對(duì)這些位點(diǎn)，使用PrimerPremier5.0軟件精心設(shè)計(jì)引物，成功設(shè)計(jì)出400對(duì)特異性引物。以有子甌柑和無籽甌柑的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，最終篩選出200對(duì)在兩者間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物。進(jìn)一步對(duì)10份不同來源的甌柑材料進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示180對(duì)引物在不同甌柑材料間表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性，多態(tài)性引物比例達(dá)到90%。這些InDel標(biāo)記具有較高的多態(tài)信息含量，PIC值范圍為0.25-0.85，平均值為0.55，能夠有效區(qū)分無籽甌柑和有子甌柑，為無子甌柑的品種鑒定、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種等提供了可靠的工具。在SV標(biāo)記開發(fā)中，基于高通量測序技術(shù)，利用Lumpy軟件對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共檢測到200個(gè)SV位點(diǎn)，涵蓋長片段插入、缺失、倒位等多種類型。針對(duì)這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)了150對(duì)特異性引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收與連接、轉(zhuǎn)化與篩選等一系列實(shí)驗(yàn)，成功篩選出30個(gè)多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的SV標(biāo)記。對(duì)15份不同來源的柑橘材料進(jìn)行驗(yàn)證，28對(duì)引物在不同柑橘材料間表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性，多態(tài)性引物比例達(dá)到93.3%。部分?jǐn)U增產(chǎn)物的測序分析進(jìn)一步證實(shí)了SV標(biāo)記的準(zhǔn)確性，這些SV標(biāo)記能夠有效區(qū)分無籽甌柑、有子甌柑和其他柑橘品種，為無子甌柑的遺傳分析和品種鑒定提供了重要手段。本研究開發(fā)的InDel和SV標(biāo)記在無子甌柑遺傳研究中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在構(gòu)建遺傳圖譜方面，這些標(biāo)記能夠提供豐富的遺傳信息，有助于構(gòu)建高密度的遺傳圖譜，準(zhǔn)確確定基因在染色體上的位置。在基因定位領(lǐng)域，與