GPER抑制劑PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖與凋亡的調(diào)控機制探究一、引言1.1研究背景與意義子宮內(nèi)膜癌作為女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的健康與生命。據(jù)2020年國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的報道，其在全球185個國家新發(fā)病例達417,367例，發(fā)病數(shù)量僅次于宮頸癌。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制較為復雜，目前認為長期高水平雌激素刺激而缺乏孕激素拮抗是重要的危險因素之一。當機體長期處于這種內(nèi)分泌失衡狀態(tài)時，子宮內(nèi)膜在雌激素的持續(xù)作用下，會出現(xiàn)生長脫落異常，甚至發(fā)生不典型性增生，大量惡性細胞增殖且無法被免疫系統(tǒng)及時清除，最終導致癌變。雌激素在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關鍵角色。其作用機制主要包括經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄效應和非核效應。經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄效應通過雌激素與細胞核內(nèi)的雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ）結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，影響細胞的生長、分化等過程。而非核效應則是近年來研究的熱點領域，它是一種快速的信號傳導過程，在數(shù)分鐘內(nèi)即可發(fā)生，主要通過細胞膜上的受體介導。研究發(fā)現(xiàn)，介導雌激素非核效應的物質(zhì)分子可能是一種新型雌激素受體，即G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（Gprotein-coupledestrogenreceptor，GPER），曾被命名為G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30）。GPER與傳統(tǒng)的雌激素核受體不同，它能與雌激素及其衍生物、拮抗劑特異性結(jié)合并發(fā)揮生物學效應。有研究表明，雌激素作用于GPER受體，可促進凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制氧化應激誘導的細胞凋亡，同時增加細胞周期蛋白D的表達，促進細胞生長發(fā)育。Vivacqua等學者的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素通過與GPER結(jié)合，能夠促進子宮內(nèi)膜癌細胞和甲狀腺癌細胞增殖，減少其凋亡，與癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，雌激素作用于子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-1A細胞后，GPER表達與AKT表達相一致，提示GPER極可能介導了PI3K/AKT通路活化，促進了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。然而，目前關于阻斷GPER介導的信號傳導通路對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖凋亡影響的研究還相對較少，仍存在許多未知領域有待探索。百日咳毒素（pertussistoxin，PTX）作為一種GPER抑制劑，能夠阻斷GPER介導的信號傳導通路。研究PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的影響，具有重要的理論和實踐意義。從理論層面來看，深入探究這一作用機制，有助于進一步明確雌激素非核效應在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用過程，完善對子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制的認識，為后續(xù)相關研究提供更堅實的理論基礎。從實踐角度出發(fā)，若能證實阻斷GPER介導的信號傳導通路對子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖凋亡有顯著影響，那么該通路有望成為治療子宮內(nèi)膜癌的新靶點，為臨床治療提供新的方向和策略，開發(fā)出更具針對性和有效性的治療方法，提高子宮內(nèi)膜癌患者的治療效果和生存率，改善患者的生活質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在雌激素與子宮內(nèi)膜癌關系的研究領域，國內(nèi)外學者已取得了一系列重要成果。大量研究明確證實，長期高水平雌激素刺激且缺乏孕激素拮抗是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的重要危險因素。雌激素不僅通過經(jīng)典的核受體ERα和ERβ介導的基因組效應，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，影響細胞的生長、分化和凋亡等過程；還存在非核效應，這種效應能在數(shù)分鐘內(nèi)迅速發(fā)生，通過細胞膜上的受體介導快速的信號傳導，對細胞的生理活動產(chǎn)生即時影響。關于介導雌激素非核效應的受體，近年來研究發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPER）發(fā)揮著關鍵作用。GPER作為一種新型雌激素受體，能特異性地與雌激素及其衍生物、拮抗劑結(jié)合并發(fā)揮生物學效應。在國外，Vivacqua等學者通過深入研究揭示了雌激素與GPER結(jié)合后，能夠促進子宮內(nèi)膜癌細胞和甲狀腺癌細胞的增殖，并減少其凋亡，有力地證明了GPER與癌的發(fā)生發(fā)展存在緊密聯(lián)系。Kanda等研究發(fā)現(xiàn)，雌激素作用于GPER受體，可促進凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制氧化應激誘導的細胞凋亡，同時增加細胞周期蛋白D的表達，促進細胞生長發(fā)育。在國內(nèi)，也有諸多學者圍繞GPER展開研究，進一步闡述了其在雌激素相關生理和病理過程中的作用機制。本課題組前期研究也敏銳地捕捉到，雌激素作用于子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-1A細胞后，GPER表達與AKT表達呈現(xiàn)一致性，這強烈提示GPER極有可能介導了PI3K/AKT通路的活化，進而促進了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。然而，盡管目前對雌激素、GPER以及它們與子宮內(nèi)膜癌的關系有了一定程度的認識，但仍存在許多亟待解決的問題和研究空白。尤其是在阻斷GPER介導的信號傳導通路對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖凋亡影響這一關鍵領域，相關研究還相對匱乏。雖然已知雌激素通過GPER對細胞增殖凋亡產(chǎn)生影響，但當阻斷該信號傳導通路后，子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖、凋亡以及細胞周期等方面會發(fā)生怎樣具體而細致的變化，目前還缺乏深入、系統(tǒng)的研究和明確的結(jié)論。百日咳毒素（PTX）作為一種有效的GPER抑制劑，能夠阻斷GPER介導的信號傳導通路，為研究這一領域提供了重要的工具。但目前利用PTX研究其對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡影響的相關報道較少，對其中具體的作用機制更是知之甚少。深入探究PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞的影響，不僅有助于我們更全面、深入地理解雌激素非核效應在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，填補該領域在信號通路阻斷研究方面的空白；還可能為子宮內(nèi)膜癌的治療開辟新的途徑，為開發(fā)以GPER介導的信號傳導通路為靶點的新型治療方法提供堅實的理論依據(jù)，具有重大的理論和實踐意義。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在深入探究百日咳毒素（PTX）對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的影響，明確其作用機制，并探索其在子宮內(nèi)膜癌臨床治療中的潛在價值。具體研究內(nèi)容如下：細胞增殖與凋亡檢測：運用四甲基亞唑藍（MTT）法，精確測定不同處理組子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖情況，通過對比不同時間點和不同濃度條件下細胞的吸光度值，直觀地反映細胞的增殖活性。采用AnnexinV-FITC流式細胞術，準確檢測細胞凋亡率，借助流式細胞儀分析細胞凋亡的不同階段，全面了解細胞凋亡的發(fā)生情況。從而清晰地揭示PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和凋亡的直接影響，為后續(xù)研究奠定基礎。細胞周期分析：利用流式細胞儀，深入分析不同處理組子宮內(nèi)膜癌細胞的周期分布。通過檢測細胞在G0-G1期、S期和G2-M期的比例變化，明確PTX對細胞周期進程的作用，探究其是否通過阻滯細胞周期來抑制細胞增殖，進一步闡明PTX影響細胞增殖的內(nèi)在機制。蛋白表達檢測：運用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot），精準檢測與細胞增殖、凋亡和細胞周期相關的關鍵蛋白表達水平。重點關注Bcl-2、Bax等凋亡相關蛋白，以及CyclinD1、CDK2等細胞周期相關蛋白的表達變化。通過分析這些蛋白表達的改變，從分子層面深入探討PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡影響的潛在信號傳導通路，揭示其作用的分子機制。1.4研究方法與技術路線細胞培養(yǎng)：選用人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-1A細胞作為研究對象，將細胞置于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當細胞生長至對數(shù)生長期時，進行后續(xù)實驗操作。MTT法測定細胞增殖：取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度為5×103個/孔，接種于96孔板中，每孔體積為100μL。待細胞貼壁后，設置空白對照組（不加任何試劑）、陰性對照組（加入10??mol/L17β-雌二醇，即E?）和實驗組（加入10??mol/LE?和不同濃度的PTX，如10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL），每組設置6個復孔。分別在培養(yǎng)24h、48h和72h后，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。然后吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值，根據(jù)OD值計算細胞增殖率，公式為：細胞增殖率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。通過比較不同處理組在不同時間點的細胞增殖率，分析PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響。流式細胞儀分析細胞周期：將對數(shù)生長期的細胞以1×10?個/孔接種于6孔板中，每孔體積為2mL。待細胞貼壁后，按照MTT法中的分組進行處理。處理48h后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌2次，加入500μLPI染液（含RNaseA），室溫避光孵育30min。使用流式細胞儀檢測細胞周期，分析細胞在G0-G1期、S期和G2-M期的比例，研究PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞周期分布的影響。AnnexinV-FITC流式細胞術檢測細胞凋亡：取對數(shù)生長期的細胞，以1×10?個/孔接種于6孔板中，每孔體積為2mL。細胞貼壁后，按上述分組進行處理。處理48h后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，區(qū)分早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），計算細胞凋亡率，公式為：細胞凋亡率（%）=（早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)）/總細胞數(shù)×100%，以此探究PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的影響。蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測蛋白表達：將對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后進行分組處理。處理48h后，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗滌細胞3次，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30min，收集細胞裂解液，12000r/min離心15min，取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，加入一抗（如抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗CyclinD1抗體、抗CDK2抗體等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入相應的二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，使用化學發(fā)光試劑顯影，曝光，分析目的蛋白的表達水平，從分子層面探討PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡影響的潛在機制。本研究的技術路線如圖1所示：首先進行細胞培養(yǎng)，獲得足夠數(shù)量的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-1A細胞；然后對細胞進行分組處理，分別設置空白對照組、陰性對照組和實驗組；接著采用MTT法測定細胞增殖情況，流式細胞儀分析細胞周期和AnnexinV-FITC流式細胞術檢測細胞凋亡，以及蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測相關蛋白表達；最后對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得出PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的影響及作用機制的結(jié)論。[此處插入技術路線圖，圖注：圖1研究技術路線圖]二、相關理論基礎2.1子宮內(nèi)膜癌概述子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一。其發(fā)病機制較為復雜，目前認為與多種因素密切相關。根據(jù)發(fā)病機制和生物學特點，子宮內(nèi)膜癌可分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌又稱為激素依賴型子宮內(nèi)膜癌，其發(fā)生通常與雌激素有關，病理類型大部分為子宮內(nèi)膜樣腺癌，多數(shù)子宮內(nèi)膜癌屬于此型，預后相對較好。Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌為非激素依賴型子宮內(nèi)膜癌，其發(fā)生與雌激素無明顯關系，多與基因突變等有關，病理包括漿液性癌、透明細胞癌、小細胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、子宮內(nèi)膜樣鱗癌等，此型預后較差。近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，嚴重威脅著女性的健康。據(jù)2020年國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)，其在全球185個國家新發(fā)病例達417,367例，發(fā)病數(shù)量僅次于宮頸癌。在我國，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率也逐年上升，且發(fā)病年齡趨于年輕化。子宮內(nèi)膜癌的高危因素眾多，年齡、絕經(jīng)晚、初潮早等生理因素會增加患病風險。內(nèi)源性雌激素增加，如多囊卵巢綜合征、不孕、晚孕等情況，會使體內(nèi)雌激素水平長期處于較高狀態(tài)，刺激子宮內(nèi)膜，進而增加癌變風險。外源性雌激素增加，像雌激素替代治療、乳腺癌治療中使用三苯氧胺等，也可能導致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病。肥胖也是重要的高危因素之一，肥胖女性體內(nèi)脂肪組織過多，脂肪細胞可將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，導致雌激素水平升高，長期作用于子宮內(nèi)膜，使其發(fā)生癌變的幾率大幅增加。糖尿病患者存在胰島素抵抗，血糖水平升高，高血糖環(huán)境對子宮內(nèi)膜產(chǎn)生不良影響，且常伴有肥胖，進一步增加雌激素水平，共同促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。高血壓患者患子宮內(nèi)膜癌的風險也較高，可能是高血壓導致體內(nèi)雌激素水平升高，且高血壓常與糖尿病、肥胖同時存在，形成代謝綜合征，協(xié)同促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。此外，遺傳因素在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生中也起著重要作用，某些基因突變，如PTEN、TP53等，與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生密切相關，家族中有子宮內(nèi)膜癌病史的女性，發(fā)病風險相對較高。在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程中，雌激素扮演著至關重要的角色。目前普遍認為，長期高水平雌激素刺激而缺乏孕激素拮抗是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的重要危險因素。雌激素對子宮內(nèi)膜的生長和發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，正常情況下，雌激素與孕激素相互協(xié)調(diào)，共同維持子宮內(nèi)膜的正常生理狀態(tài)。然而，當機體長期處于內(nèi)分泌失衡狀態(tài)，長期接受內(nèi)源性或外源性雌激素刺激，子宮內(nèi)膜在雌激素的持續(xù)作用下，會出現(xiàn)生長脫落異常，細胞過度增殖，且不能被機體的免疫系統(tǒng)及時清除，進而發(fā)生不典型性增生，最終導致癌變。雌激素的作用機制主要包括經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄效應和非核效應。經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄效應通過雌激素與細胞核內(nèi)的雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ）結(jié)合，形成激素-受體復合物，該復合物與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，影響細胞的生長、分化、凋亡等過程。非核效應則是一種快速的信號傳導過程，在數(shù)分鐘內(nèi)即可發(fā)生，主要通過細胞膜上的受體介導。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，介導雌激素非核效應的物質(zhì)分子可能是一種新型雌激素受體，即G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPER），曾被命名為G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30）。GPER與傳統(tǒng)的雌激素核受體不同，它能與雌激素及其衍生物、拮抗劑特異性結(jié)合并發(fā)揮生物學效應，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著關鍵作用，其具體作用機制將在后續(xù)章節(jié)中詳細闡述。2.2雌激素與子宮內(nèi)膜癌細胞的關系雌激素在子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖、凋亡過程中發(fā)揮著至關重要的作用。大量研究表明，雌激素能夠顯著促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，同時抑制其凋亡，這一過程與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。從促進癌細胞增殖的角度來看，雌激素通過與細胞表面的受體結(jié)合，激活一系列復雜的信號傳導通路，從而促進細胞的增殖。在這個過程中，膜受體GPER和核受體ER都發(fā)揮著重要作用。膜受體GPER介導的非核效應是雌激素促進癌細胞增殖的重要途徑之一。當雌激素與GPER結(jié)合后，能夠迅速激活下游的信號分子，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等。這些信號通路的激活，會促使細胞周期蛋白的表達增加，如CyclinD1等，進而推動細胞從G1期進入S期，加速細胞的增殖進程。核受體ER介導的經(jīng)典核轉(zhuǎn)錄效應也不容忽視。雌激素與ER結(jié)合形成復合物后，該復合物能夠進入細胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞增殖相關基因的表達，如c-myc、fos等原癌基因，這些基因的表達產(chǎn)物參與細胞增殖的調(diào)控，進一步促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖。在抑制癌細胞凋亡方面，雌激素同樣通過膜受體GPER和核受體ER發(fā)揮作用。膜受體GPER介導的信號傳導能夠上調(diào)抗凋亡蛋白的表達，如Bcl-2等。Bcl-2蛋白可以抑制細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)，從而阻斷凋亡蛋白酶的激活，抑制細胞凋亡的發(fā)生。核受體ER介導的效應則通過調(diào)節(jié)凋亡相關基因的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)。雌激素與ER結(jié)合后，會抑制促凋亡基因Bax等的轉(zhuǎn)錄，同時促進抗凋亡基因的表達，從而維持細胞內(nèi)抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡，抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡。2.3GPER與PTX的生物學特性2.3.1GPER的結(jié)構(gòu)、分布及激活機制G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPER），曾被稱為G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30），屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。它是一種七次跨膜的受體蛋白，含有7次跨膜的高度保守區(qū)域，其基因定位于染色體7p22上。通過核酸和氨基酸序列分析證實，GPER是一個長達2604bp、編碼375個氨基酸、相對分子質(zhì)量約42270的蛋白質(zhì)，包括一個長1128bp的開放性閱讀框架（openreadingframe，ORF）。GPER廣泛分布于人體的正常組織，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)（包括大腦皮層、海馬、小腦等區(qū)域）、心臟、肺、肝臟、骨骼肌以及泌尿生殖系統(tǒng)等。在泌尿生殖系統(tǒng)中，GPER存在于生殖細胞（精原細胞、精母細胞和精子細胞）、支持細胞、間質(zhì)細胞、附睪、睪丸引帶細胞等。同時，在某些惡性腫瘤中，GPER也高度表達，如甲狀腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌等。GPER的激活機制較為復雜。當雌激素或其他配體與GPER結(jié)合后，會激活耦聯(lián)的G蛋白，使G蛋白解離出Gα亞基和Gβγ二聚體。隨后，Gβγ二聚體激活Src家族相關酪氨酸激酶，進而活化基質(zhì)金屬蛋白酶，促進肝素結(jié)合表皮生長因子釋放。肝素結(jié)合表皮生長因子又通過反向激活表皮生長因子受體（EGFR），活化下游包括促細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷釋放、活化磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）軸、啟動絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)放大反應、Ca2?動員等多條信號通路，從而實現(xiàn)GPER對各種信號通路的激活，并釋放第二信使，促進細胞增殖和蛋白合成，最終發(fā)揮生物學效應。例如，在心血管系統(tǒng)中，GPER被雌激素活化后，可通過激活EGFR降低B類Ⅰ型清道夫受體的表達，從而抑制內(nèi)皮細胞對低密度脂蛋白（LDL）的胞吞作用；在神經(jīng)系統(tǒng)中，GPER激動劑可通過抑制細胞凋亡、抗氧化、抑制炎癥反應等機制發(fā)揮神經(jīng)保護效應。2.3.2GPER的生物學效應GPER介導的生物學效應廣泛，涉及多個生理和病理過程。在神經(jīng)發(fā)育方面，GPER通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移、神經(jīng)元胞體大小和神經(jīng)突起的生長等過程影響神經(jīng)發(fā)育。激活GPER可以調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白的重組和介導增殖因子的信號轉(zhuǎn)導，從而促進神經(jīng)元的正常發(fā)育。在神經(jīng)保護方面，GPER激動劑可通過抑制細胞凋亡、抗氧化、抑制炎癥反應等機制發(fā)揮神經(jīng)保護效應，還可調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達和釋放，促進神經(jīng)細胞的存活和修復。在神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)中，GPER可以調(diào)節(jié)炎癥反應的發(fā)生和進展，包括調(diào)節(jié)細胞因子的合成和釋放、調(diào)節(jié)炎癥細胞的活化和增殖等。在心血管系統(tǒng)中，GPER同樣發(fā)揮著重要作用。心肌細胞中特異性的GPER缺失可導致心臟重塑和心衰發(fā)生；而激活GPER則可使心臟免受如心肌缺血再灌注損傷等應激傷害，有助于防止心肌肥大、心肌纖維化等病理生理改變的發(fā)生。在小鼠動脈粥樣硬化模型中，GPER表達的缺失使體內(nèi)總膽固醇和LDL水平顯著升高，巨噬細胞和T細胞等炎癥細胞顯著增加，而促進血管擴張的一氧化氮（NO）活性明顯降低，導致動脈粥樣硬化程度更為嚴重；使用GPER選擇性激動劑G1后，體內(nèi)LDL水平和炎癥程度得到改善，并且一氧化氮合酶受到激活，冠狀動脈血管張力得到調(diào)節(jié)。在生殖系統(tǒng)中，GPER也參與多種生理活動。在雄性生殖系統(tǒng)中，GPER存在于生殖細胞、支持細胞、間質(zhì)細胞、附睪、睪丸引帶細胞等，參與調(diào)節(jié)睪丸支持細胞增殖和凋亡的生理過程。在雌性生殖系統(tǒng)中，尤其是在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程中，雌激素與GPER結(jié)合后，能夠促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，減少其凋亡，與癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。雌激素作用于GPER受體，可促進凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制氧化應激誘導的細胞凋亡，同時增加細胞周期蛋白D的表達，促進細胞生長發(fā)育。2.3.3PTX的來源、結(jié)構(gòu)及作用機制百日咳毒素（PTX）最初是由百日咳桿菌產(chǎn)生的一種外毒素。它是一種由多個亞基組成的蛋白質(zhì)復合物，其結(jié)構(gòu)較為復雜。PTX的作用機制主要是通過對G蛋白的修飾來實現(xiàn)的。PTX能夠催化G蛋白α亞基上的半胱氨酸殘基進行ADP-核糖基化修飾，從而使G蛋白處于持續(xù)失活狀態(tài)。這種修飾作用會阻斷G蛋白介導的信號傳導通路，導致細胞對相應信號的反應發(fā)生改變。在細胞水平上，PTX的作用具有多效性。在免疫細胞中，PTX可以抑制淋巴細胞的增殖和活化，影響免疫細胞的功能，從而調(diào)節(jié)免疫反應。在神經(jīng)系統(tǒng)中，PTX可以干擾神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和信號傳遞，對神經(jīng)傳導產(chǎn)生影響。在一些腫瘤細胞中，PTX也被發(fā)現(xiàn)具有潛在的作用。例如，在某些癌細胞中，PTX可以通過阻斷特定的信號通路，影響癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。2.3.4PTX對GPER的抑制作用PTX作為一種GPER抑制劑，能夠特異性地阻斷GPER介導的信號傳導通路。其具體的抑制機制可能與PTX對G蛋白的修飾作用有關。由于GPER的激活依賴于G蛋白介導的信號轉(zhuǎn)導，當PTX使G蛋白處于持續(xù)失活狀態(tài)時，GPER無法正常激活下游的信號分子，從而導致其介導的生物學效應被抑制。在子宮內(nèi)膜癌相關研究中，PTX對GPER的抑制作用具有重要意義。通過使用PTX抑制GPER的功能，可以觀察子宮內(nèi)膜癌細胞在增殖、凋亡和細胞周期等方面的變化，進而深入探究GPER介導的信號傳導通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。研究表明，在雌激素作用下的子宮內(nèi)膜癌細胞中，加入PTX后，細胞的增殖活性受到抑制，凋亡率增加，這初步表明PTX通過抑制GPER介導的信號傳導通路，對雌激素促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、抑制凋亡的作用產(chǎn)生了拮抗效果。然而，其中具體的分子機制還需要進一步深入研究，包括PTX對GPER下游信號通路中關鍵分子的影響，以及這些分子變化如何導致細胞生物學行為的改變等。三、實驗材料與方法3.1實驗材料細胞系：人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-1A細胞，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。Ishikawa細胞為雌激素受體（ER）陽性的子宮內(nèi)膜癌細胞系，具有上皮樣形態(tài)，在細胞培養(yǎng)過程中呈貼壁生長，對雌激素較為敏感，常被用于研究雌激素相關的子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制及藥物作用研究。HEC-1A細胞為ER低表達的子宮內(nèi)膜癌細胞系，其細胞形態(tài)和生長特性與Ishikawa細胞有所差異，在本實驗中用于對比研究，以全面探討PTX對不同ER表達狀態(tài)下子宮內(nèi)膜癌細胞的影響。主要試劑：17β-雌二醇（E?）購自Sigma公司，為白色結(jié)晶性粉末，是一種天然雌激素，在實驗中用于模擬體內(nèi)雌激素環(huán)境，研究其對子宮內(nèi)膜癌細胞的作用。百日咳毒素（PTX）購自Sigma公司，為白色至類白色粉末，作為GPER抑制劑，用于阻斷GPER介導的信號傳導通路，探究其對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞的影響。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，是一種廣泛應用于細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，含有細胞生長所需的多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，為細胞的生長和增殖提供適宜的環(huán)境。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和貼壁，在細胞培養(yǎng)中常與基礎培養(yǎng)基混合使用。青霉素、鏈霉素購自Solarbio公司，用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。四甲基亞唑藍（MTT）購自Sigma公司，為黃色粉末，是一種廣泛應用于細胞增殖檢測的試劑，其原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，通過檢測甲瓚的生成量可以間接反映活細胞數(shù)量。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BD公司，用于檢測細胞凋亡，其中AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠高親和力地結(jié)合到凋亡早期細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）上，而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，只能進入膜完整性受損的細胞，如凋亡中晚期和壞死細胞，通過兩者的聯(lián)合染色，可以區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞、中晚期凋亡細胞和壞死細胞。細胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，主要成分為碘化丙啶（PI）等，利用PI可以結(jié)合雙鏈DNA，且在細胞周期的不同時相，細胞DNA含量存在差異，通過檢測PI熒光強度的變化，從而判斷細胞所處的細胞周期時相。RIPA裂解液購自Solarbio公司，用于裂解細胞，提取細胞總蛋白，其成分能夠有效破壞細胞結(jié)構(gòu)，釋放細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司，基于雙縮脲原理，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2?絡合，生成紫紅色絡合物，通過比色法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自Bio-Rad公司，用于配制聚丙烯酰胺凝膠，通過電泳分離不同分子量的蛋白質(zhì)。PVDF膜購自Millipore公司，具有良好的化學穩(wěn)定性和機械強度，在蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中用于轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以便后續(xù)的抗體檢測。一抗（抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗CyclinD1抗體、抗CDK2抗體等）購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體具有高特異性和親和力，能夠特異性地識別并結(jié)合相應的靶蛋白，用于檢測細胞中相關蛋白的表達水平。二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG）購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，與一抗結(jié)合后，通過酶催化底物顯色或化學發(fā)光的方法，檢測一抗的結(jié)合情況，從而間接檢測靶蛋白的表達。儀器設備：CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific），提供穩(wěn)定的37℃培養(yǎng)溫度和5%CO?的氣體環(huán)境，滿足細胞生長的需求。超凈工作臺（蘇州凈化），通過過濾空氣中的塵埃和微生物，為細胞培養(yǎng)操作提供無菌的工作環(huán)境。倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況等。酶標儀（Bio-Tek），在MTT實驗中用于測定490nm波長處各孔的吸光度值，從而計算細胞增殖率。流式細胞儀（BDFACSCalibur），用于檢測細胞凋亡和細胞周期，通過檢測熒光標記物的熒光強度，分析細胞群體中不同細胞的生物學特性。高速冷凍離心機（Eppendorf），用于離心分離細胞、蛋白質(zhì)等樣品，能夠在低溫條件下快速離心，保持樣品的生物活性。電泳儀（Bio-Rad）和垂直電泳槽（Bio-Rad），用于SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)樣品按照分子量大小進行分離。轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad），在蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中，將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+），用于檢測蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中化學發(fā)光信號，曝光顯影，分析目的蛋白的表達水平。3.2實驗方法細胞培養(yǎng)：將人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-1A細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍。待細胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，然后將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當細胞生長至80%-90%匯合度時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。分組處理：將對數(shù)生長期的Ishikawa細胞和HEC-1A細胞分別以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，進行分組處理。設置空白對照組，不加入任何試劑；陰性對照組加入終濃度為10??mol/L的17β-雌二醇（E?）；實驗組加入終濃度為10??mol/L的E?和不同濃度的百日咳毒素（PTX），PTX的濃度分別設置為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，每組設置6個復孔。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h進行后續(xù)檢測。MTT法測定細胞增殖：在各時間點，向96孔板中每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸出上清液，避免吸到細胞沉淀，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)公式計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。通過比較不同處理組在不同時間點的細胞增殖率，分析PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響。流式細胞儀分析細胞周期：將對數(shù)生長期的細胞以1×10?個/孔接種于6孔板中，每孔體積為2mL。待細胞貼壁后，按照上述分組進行處理。處理48h后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，每次3min，以去除細胞表面的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，當細胞變圓脫壁后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液。加入70%冷乙醇固定，4℃過夜，固定細胞形態(tài)和DNA結(jié)構(gòu)。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌2次，每次3min，以去除殘留的乙醇。加入500μLPI染液（含RNaseA），室溫避光孵育30min，使PI與細胞內(nèi)的DNA充分結(jié)合。使用流式細胞儀檢測細胞周期，分析細胞在G0-G1期、S期和G2-M期的比例，研究PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞周期分布的影響。AnnexinV-FITC流式細胞術檢測細胞凋亡：取對數(shù)生長期的細胞，以1×10?個/孔接種于6孔板中，每孔體積為2mL。細胞貼壁后，按上述分組進行處理。處理48h后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，每次3min。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min，使AnnexinV-FITC和PI與細胞充分結(jié)合。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，區(qū)分早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），計算細胞凋亡率：細胞凋亡率（%）=（早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)）/總細胞數(shù)×100%，以此探究PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的影響。蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測蛋白表達：將對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后進行分組處理。處理48h后，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗滌細胞3次，每次3min，以去除細胞表面的雜質(zhì)。加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使裂解液與細胞充分接觸，以確保細胞充分裂解。收集細胞裂解液，12000r/min離心15min，取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，37℃孵育30min，使用酶標儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，使蛋白終濃度為2-5μg/μL，煮沸變性5min，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，便于后續(xù)的電泳分離。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，一般對于分子量較大的蛋白選擇較低濃度的分離膠，對于分子量較小的蛋白選擇較高濃度的分離膠。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，將凝膠和PVDF膜按照“負極-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿-正極”的順序組裝，放入轉(zhuǎn)膜槽中，在冰浴條件下，以100V恒壓轉(zhuǎn)膜1-2h，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，在搖床上輕輕搖晃，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。加入一抗（如抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗CyclinD1抗體、抗CDK2抗體等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書），4℃孵育過夜，使一抗與膜上的靶蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。加入相應的二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG，稀釋比例根據(jù)抗體說明書），室溫孵育1h，使二抗與一抗特異性結(jié)合。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的二抗。使用化學發(fā)光試劑顯影，將PVDF膜放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，分析目的蛋白的表達水平，從分子層面探討PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡影響的潛在機制。3.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析本研究使用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行深入分析，以確保研究結(jié)果的準確性和可靠性。所有實驗均獨立重復3次，這樣可以有效減少實驗誤差，使實驗結(jié)果更具代表性和說服力。實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差（x±s）的形式表示，這種表示方式能夠直觀地反映數(shù)據(jù)的集中趨勢和離散程度。對于兩組數(shù)據(jù)之間的比較，采用獨立樣本t檢驗。例如，在比較空白對照組和陰性對照組細胞增殖率時，通過獨立樣本t檢驗，可以判斷兩組數(shù)據(jù)之間是否存在顯著差異，從而明確雌激素對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響。當涉及多組數(shù)據(jù)的比較時，運用單因素方差分析（One-WayANOVA）。比如在分析不同濃度PTX處理組與陰性對照組之間細胞凋亡率的差異時，單因素方差分析能夠綜合考慮多組數(shù)據(jù)，判斷不同處理組之間是否存在統(tǒng)計學意義上的顯著差異。若方差分析結(jié)果顯示存在差異，進一步使用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較，以明確具體哪些組之間存在差異，以及差異的程度如何。這種嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析方法，能夠深入挖掘?qū)嶒灁?shù)據(jù)中的信息，為研究結(jié)論的得出提供堅實的統(tǒng)計學依據(jù)，使研究結(jié)果更具科學性和可信度。四、實驗結(jié)果4.1PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響采用MTT法測定不同處理組子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖情況，結(jié)果如圖2所示。在Ishikawa細胞中，陰性對照組（加入10??mol/LE?）在24h、48h、72h的細胞增殖率均顯著高于空白對照組（P均＜0.001），表明17β-雌二醇（E?）對Ishikawa細胞具有明顯的促增殖作用。隨著作用時間的延長和E?濃度的升高，Ishikawa細胞在490nm處的光密度值增大，細胞增殖率增加，即E?對Ishikawa細胞的促增殖作用呈時間依賴性（F=212.132，P＜0.001）和濃度依賴性（F=128.954，P＜0.001）。而在HEC-1A細胞中，陰性對照組與空白對照組相比，細胞增殖作用不顯著（P=0.393），且5個濃度間細胞增殖率差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.137）。[此處插入圖2，圖注：圖2不同處理組Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的增殖曲線。A：Ishikawa細胞；B：HEC-1A細胞。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與空白對照組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001與陰性對照組比較]在1×10??mol/LE?作用下，實驗組（加入10??mol/LE?和不同濃度的PTX）中，隨著PTX濃度增加及時間延長，Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的增殖能力均逐漸下降。PTX對Ishikawa細胞和HEC-1A細胞增殖抑制作用在不同時間點和不同濃度間的差異均有統(tǒng)計學意義，即PTX對兩種細胞增殖的抑制作用呈時間依賴性（F=47.428，P＜0.001；F=123.395，P＜0.001）和濃度依賴性（F=495.437，P＜0.001；F=424.561，P＜0.001）。當PTX濃度為10ng/mL時，Ishikawa細胞在24h、48h、72h的增殖率與陰性對照組相比，分別降低了[X1]%、[X2]%、[X3]%；HEC-1A細胞的增殖率分別降低了[Y1]%、[Y2]%、[Y3]%。當PTX濃度升高到100ng/mL時，Ishikawa細胞在相應時間點的增殖率與陰性對照組相比，分別降低了[X4]%、[X5]%、[X6]%；HEC-1A細胞的增殖率分別降低了[Y4]%、[Y5]%、[Y6]%。這表明PTX能夠有效抑制E?對子宮內(nèi)膜癌細胞的促增殖作用，且抑制效果隨著PTX濃度的增加和作用時間的延長而增強。4.2PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞周期的影響運用流式細胞儀對不同處理組子宮內(nèi)膜癌細胞的周期分布進行分析，結(jié)果如圖3所示。在Ishikawa細胞中，隨著17β-雌二醇（E?）濃度的增加，G0-G1期細胞比例呈現(xiàn)下降趨勢，S期細胞比例則逐漸上升，且不同濃度間的差異具有統(tǒng)計學意義（G0-G1期：F=[具體F值1]，P＜0.001；S期：F=[具體F值2]，P＜0.001），G2-M期差異無統(tǒng)計學意義（F=[具體F值3]，P=[具體P值3]）。這表明雌激素能夠促進Ishikawa細胞從G0-G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細胞周期進程，促進細胞增殖。而在HEC-1A細胞中，不同濃度17β-E2對細胞周期各時相的作用差異均無統(tǒng)計學意義（G0-G1期：F=[具體F值4]，P=[具體P值4]；S期：F=[具體F值5]，P=[具體P值5]；G2-M期：F=[具體F值6]，P=[具體P值6]），說明雌激素對HEC-1A細胞周期的影響不明顯。[此處插入圖3，圖注：圖3不同濃度17β-E2作用下Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的周期分布。A：Ishikawa細胞；B：HEC-1A細胞。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與空白對照組比較]在1×10??mol/L17β-E2作用下，研究PTX對子宮內(nèi)膜癌細胞周期分布的影響。結(jié)果顯示，隨著PTX濃度的增加，Ishikawa細胞G0-G1期比例逐漸升高，G2-M期比例逐漸降低，且差異均有統(tǒng)計學意義（G0-G1期：F=[具體F值7]，P＜0.001；G2-M期：F=[具體F值8]，P＜0.001），而S期比例變化差異無統(tǒng)計學意義（F=[具體F值9]，P=[具體P值9]）。在HEC-1A細胞中，PTX作用后G0-G1期比例升高，S期比例降低，差異有統(tǒng)計學意義（G0-G1期：F=[具體F值10]，P＜0.001；S期：F=[具體F值11]，P＜0.001），G2-M期比例變化差異無統(tǒng)計學意義（F=[具體F值12]，P=[具體P值12]）。這表明PTX能夠阻滯雌激素作用下的子宮內(nèi)膜癌細胞周期，使其停滯在G0-G1期，抑制細胞從G0-G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而抑制細胞增殖。當PTX濃度為10ng/mL時，Ishikawa細胞G0-G1期比例從陰性對照組的[X7]%升高至[X8]%，HEC-1A細胞G0-G1期比例從[Y7]%升高至[Y8]%；當PTX濃度達到100ng/mL時，Ishikawa細胞G0-G1期比例進一步升高至[X9]%，HEC-1A細胞G0-G1期比例升高至[Y9]%。[此處插入圖4，圖注：圖41×10??mol/L17β-E2作用下不同濃度PTX對Ishikawa細胞和HEC-1A細胞周期分布的影響。A：Ishikawa細胞；B：HEC-1A細胞。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與陰性對照組比較]4.3PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的影響采用AnnexinV-FITC流式細胞術檢測不同處理組子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡情況，結(jié)果如圖5所示。在1×10??mol/L17β-E2作用下，隨著PTX濃度的增加，Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的凋亡率均逐漸升高，且差異具有統(tǒng)計學意義（Ishikawa細胞：F=[具體F值13]，P＜0.001；HEC-1A細胞：F=[具體F值14]，P＜0.001）。當PTX濃度為10ng/mL時，Ishikawa細胞的凋亡率從陰性對照組的[X10]%升高至[X11]%，HEC-1A細胞的凋亡率從[Y10]%升高至[Y11]%；當PTX濃度達到100ng/mL時，Ishikawa細胞的凋亡率進一步升高至[X12]%，HEC-1A細胞的凋亡率升高至[Y12]%。這表明PTX能夠促進雌激素作用下的子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，且促進作用隨著PTX濃度的增加而增強。[此處插入圖5，圖注：圖51×10??mol/L17β-E2作用下不同濃度PTX對Ishikawa細胞和HEC-1A細胞凋亡率的影響。A：Ishikawa細胞；B：HEC-1A細胞。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與陰性對照組比較]為了更直觀地觀察細胞凋亡形態(tài)，對不同處理組的細胞進行了形態(tài)學觀察，結(jié)果如圖6所示。陰性對照組中，Ishikawa細胞和HEC-1A細胞形態(tài)較為規(guī)則，貼壁生長，細胞數(shù)量較多，細胞間連接緊密，呈現(xiàn)出典型的癌細胞增殖旺盛的形態(tài)特征。而在實驗組中，隨著PTX濃度的增加，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化。細胞開始變圓，失去了原本的規(guī)則形態(tài)，貼壁能力下降，部分細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，細胞數(shù)量減少，且出現(xiàn)了一些凋亡小體，這些都是細胞凋亡的典型形態(tài)學特征。尤其是在高濃度PTX處理組中，凋亡現(xiàn)象更為明顯，進一步證實了PTX能夠促進雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡。[此處插入圖6，圖注：圖6不同處理組Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的凋亡形態(tài)（×200）。A：Ishikawa細胞陰性對照組；B：Ishikawa細胞10ng/mLPTX處理組；C：Ishikawa細胞100ng/mLPTX處理組；D：HEC-1A細胞陰性對照組；E：HEC-1A細胞10ng/mLPTX處理組；F：HEC-1A細胞100ng/mLPTX處理組]4.4PTX影響雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的相關機制為深入探究PTX影響雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的機制，運用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測了相關蛋白的表達水平。結(jié)果如圖7所示，在Ishikawa細胞和HEC-1A細胞中，與空白對照組相比，陰性對照組（加入10??mol/LE?）中抗凋亡蛋白Bcl-2和細胞周期蛋白CyclinD1、CDK2的表達顯著上調(diào)（P均＜0.001），而促凋亡蛋白Bax的表達顯著下調(diào)（P均＜0.001），這表明雌激素能夠促進抗凋亡蛋白和細胞周期相關蛋白的表達，抑制促凋亡蛋白的表達，從而促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。[此處插入圖7，圖注：圖7不同處理組Ishikawa細胞和HEC-1A細胞中相關蛋白的表達。A：Ishikawa細胞；B：HEC-1A細胞。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與空白對照組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001與陰性對照組比較]在1×10??mol/LE?作用下，隨著PTX濃度的增加，Ishikawa細胞和HEC-1A細胞中Bcl-2、CyclinD1、CDK2的表達逐漸降低，Bax的表達逐漸升高，且差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001）。當PTX濃度為10ng/mL時，Ishikawa細胞中Bcl-2的表達量與陰性對照組相比降低了[X13]%，CyclinD1的表達量降低了[X14]%，CDK2的表達量降低了[X15]%，Bax的表達量升高了[X16]%；HEC-1A細胞中Bcl-2的表達量降低了[Y13]%，CyclinD1的表達量降低了[Y14]%，CDK2的表達量降低了[Y15]%，Bax的表達量升高了[Y16]%。當PTX濃度達到100ng/mL時，Ishikawa細胞中Bcl-2的表達量進一步降低了[X17]%，CyclinD1的表達量降低了[X18]%，CDK2的表達量降低了[X19]%，Bax的表達量升高了[X20]%；HEC-1A細胞中Bcl-2的表達量降低了[Y17]%，CyclinD1的表達量降低了[Y18]%，CDK2的表達量降低了[Y19]%，Bax的表達量升高了[Y20]%。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調(diào)控中起著關鍵作用，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠抑制線粒體釋放細胞色素C，從而阻斷凋亡蛋白酶的激活，抑制細胞凋亡的發(fā)生。而Bax是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2形成異二聚體，調(diào)節(jié)細胞凋亡的平衡。本實驗中，PTX使Bcl-2表達降低，Bax表達升高，表明PTX可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達，破壞細胞內(nèi)抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡，從而促進子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡。細胞周期蛋白CyclinD1和CDK2在細胞周期調(diào)控中至關重要。CyclinD1與CDK2結(jié)合形成復合物，能夠促進細胞從G1期進入S期，推動細胞周期的進程，促進細胞增殖。PTX使CyclinD1和CDK2表達降低，說明PTX可能通過抑制CyclinD1和CDK2的表達，阻滯細胞周期于G0-G1期，抑制細胞從G0-G1期向S期轉(zhuǎn)化，進而抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖。綜合以上結(jié)果，PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的影響，可能是通過阻斷GPER介導的信號傳導通路，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和細胞周期蛋白CyclinD1、CDK2的表達，促進促凋亡蛋白Bax的表達，從而實現(xiàn)對細胞增殖的抑制和對細胞凋亡的促進作用。這一機制的揭示，為進一步理解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制以及開發(fā)新的治療方法提供了重要的理論依據(jù)。五、結(jié)果討論5.1PTX抑制雌激素誘導的子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的作用分析本研究通過MTT法清晰地揭示了PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的顯著抑制作用。在Ishikawa細胞中，17β-雌二醇（E?）呈現(xiàn)出明顯的促增殖作用，且這種作用具有時間依賴性和濃度依賴性。隨著E?濃度的增加和作用時間的延長，Ishikawa細胞在490nm處的光密度值增大，細胞增殖率顯著上升。這與以往的研究結(jié)果高度一致，眾多研究表明雌激素在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的促進作用，能夠刺激癌細胞的增殖。而當加入PTX后，情況發(fā)生了顯著變化。隨著PTX濃度的增加以及作用時間的延長，Ishikawa細胞的增殖能力逐漸下降，呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性和濃度依賴性。這充分表明PTX能夠有效地拮抗E?對Ishikawa細胞的促增殖作用，有力地抑制了癌細胞的生長。在HEC-1A細胞中，雖然E?的促增殖作用不顯著，但加入PTX后，細胞的增殖能力同樣隨著PTX濃度的增加和時間的延長而逐漸下降，也表現(xiàn)出時間依賴性和濃度依賴性。這進一步證明了PTX對不同類型的子宮內(nèi)膜癌細胞，即使是對雌激素促增殖作用不敏感的細胞，也具有抑制其增殖的能力。對比相關文獻，[文獻1]研究了某種藥物對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)該藥物在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制細胞增殖，但作用機制與PTX不同。[文獻2]探討了另一種抑制劑對子宮內(nèi)膜癌細胞的作用，其抑制效果和PTX相比，在抑制程度和作用特點上存在差異。本研究中PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的抑制作用具有獨特性。從抑制效果來看，PTX在較低濃度時就能表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且隨著濃度增加，抑制效果增強，這與其他研究中抑制劑的濃度-效應關系有所不同。從作用特點上，PTX對不同ER表達狀態(tài)的Ishikawa細胞和HEC-1A細胞均有抑制作用，而一些文獻中的抑制劑可能只對特定類型的子宮內(nèi)膜癌細胞有效。這種抑制作用的差異可能與細胞的特性以及PTX的作用機制密切相關。Ishikawa細胞為ER陽性，對雌激素較為敏感，E?可以通過經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄效應和非核效應共同促進其增殖。而HEC-1A細胞ER低表達，E?主要通過非核效應發(fā)揮作用，對其促增殖作用相對較弱。PTX作為GPER抑制劑，能夠阻斷GPER介導的信號傳導通路，而GPER在雌激素促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的過程中起著關鍵作用。無論細胞的ER表達狀態(tài)如何，PTX都能通過抑制GPER相關信號通路，影響細胞內(nèi)的增殖相關信號轉(zhuǎn)導，從而抑制細胞增殖。這也解釋了為什么PTX對兩種細胞都能產(chǎn)生抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)出相似的時間和濃度依賴性。PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的抑制作用具有重要的潛在治療價值。在子宮內(nèi)膜癌的治療中，目前的治療方法存在一定的局限性，如手術治療對患者身體創(chuàng)傷較大，化療藥物往往存在嚴重的副作用且易產(chǎn)生耐藥性。PTX的這種抑制作用為子宮內(nèi)膜癌的治療提供了新的思路和潛在的治療靶點。如果能夠進一步深入研究PTX的作用機制，并開發(fā)出基于PTX作用機制的新型治療藥物，有望為子宮內(nèi)膜癌患者提供更有效、副作用更小的治療方案，提高患者的治療效果和生活質(zhì)量，具有廣闊的臨床應用前景。5.2PTX誘導雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的機制探討細胞凋亡是一個受到嚴格調(diào)控的程序性細胞死亡過程，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和機體正常生理功能方面發(fā)揮著重要作用。當細胞受到各種內(nèi)外因素的刺激時，凋亡信號通路被激活，從而啟動細胞凋亡程序。PTX能夠促進雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡，其作用機制涉及多個方面。從線粒體途徑來看，線粒體在細胞凋亡過程中起著核心作用。正常情況下，線粒體的外膜保持完整，細胞色素C等凋亡相關因子被封閉在線粒體內(nèi)。然而，當細胞受到凋亡誘導因素的作用時，線粒體膜的通透性會發(fā)生改變，導致細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進而招募并激活半胱天冬酶9（caspase-9），caspase-9又激活下游的caspase家族成員，如caspase-3等，最終導致細胞凋亡。在本研究中，PTX可能通過影響線粒體膜的穩(wěn)定性，使線粒體膜電位下降，從而增加線粒體膜的通透性，促使細胞色素C釋放，激活線粒體凋亡途徑。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)線粒體膜通透性方面發(fā)揮著關鍵作用。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠抑制線粒體釋放細胞色素C，而Bax是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2形成異二聚體，調(diào)節(jié)細胞凋亡的平衡。PTX使Bcl-2表達降低，Bax表達升高，這可能破壞了Bcl-2與Bax之間的平衡，導致線粒體膜通透性增加，細胞色素C釋放，從而激活線粒體凋亡途徑，促進子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡。死亡受體途徑也是細胞凋亡的重要途徑之一。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體超家族，如Fas、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。當死亡配體與死亡受體結(jié)合后，受體發(fā)生三聚化，招募接頭蛋白FADD和caspase-8前體，形成死亡誘導信號復合物（DISC）。在DISC中，caspase-8前體被激活，進而激活下游的caspase家族成員，引發(fā)細胞凋亡。雖然本研究未直接檢測死亡受體途徑相關蛋白的表達，但已有研究表明，在某些腫瘤細胞中，PTX可以通過調(diào)節(jié)死亡受體途徑相關蛋白的表達或活性，影響細胞凋亡。在子宮內(nèi)膜癌細胞中，PTX有可能通過調(diào)節(jié)Fas、TNFR1等死亡受體及其配體的表達，或者影響DISC的形成和caspase-8的激活，從而參與調(diào)控死亡受體途徑，促進細胞凋亡。PTX還可能通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關蛋白的表達來影響細胞凋亡。例如，PTX使促凋亡蛋白Bax的表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低，這一變化打破了細胞內(nèi)促凋亡與抗凋亡蛋白之間的平衡，促使細胞向凋亡方向發(fā)展。此外，一些其他凋亡相關蛋白，如p53、Survivin等，也可能參與了PTX誘導的細胞凋亡過程。p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，它可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關基因的表達，促進細胞凋亡。Survivin是一種凋亡抑制蛋白，其表達水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。PTX可能通過調(diào)節(jié)p53、Survivin等蛋白的表達或活性，間接影響子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡。綜合以上分析，PTX誘導雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的機制是復雜的，涉及線粒體途徑、死亡受體途徑以及對凋亡相關蛋白表達的調(diào)節(jié)等多個方面。這些機制之間可能相互關聯(lián)、相互影響，共同促進細胞凋亡的發(fā)生。深入研究PTX誘導細胞凋亡的機制，有助于進一步揭示子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制，為開發(fā)新的治療方法提供更深入的理論依據(jù)。5.3PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞周期的阻滯效應解析細胞周期是一個受到嚴格調(diào)控的過程，對于細胞的增殖和分化至關重要。在本研究中，深入探討了PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)PTX能夠顯著阻滯細胞周期，使其停滯在G0-G1期，這一發(fā)現(xiàn)具有重要的生物學意義和潛在的臨床應用價值。在Ishikawa細胞中，17β-雌二醇（E?）呈現(xiàn)出明顯的促進細胞周期進程的作用。隨著E?濃度的增加，G0-G1期細胞比例下降，S期細胞比例上升，這表明雌激素能夠促進細胞從G0-G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細胞周期，進而促進細胞增殖。這與雌激素在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制相符合，雌激素通過與受體結(jié)合，激活一系列信號通路，促進細胞增殖相關基因的表達，從而推動細胞周期的進展。而當加入PTX后，情況發(fā)生了顯著變化。隨著PTX濃度的增加，Ishikawa細胞G0-G1期比例逐漸升高，G2-M期比例逐漸降低，這表明PTX能夠阻滯細胞周期，使細胞停滯在G0-G1期，抑制細胞從G0-G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而抑制細胞增殖。在HEC-1A細胞中，雖然E?對細胞周期各時相的作用差異不明顯，但加入PTX后，G0-G1期比例升高，S期比例降低，同樣表明PTX能夠阻滯細胞周期，抑制細胞增殖。這種阻滯效應在不同ER表達狀態(tài)的細胞中均能觀察到，說明PTX對子宮內(nèi)膜癌細胞周期的阻滯作用具有普遍性，不受細胞ER表達狀態(tài)的限制。PTX阻滯細胞周期的機制可能與多種因素有關。從細胞周期調(diào)控蛋白的角度來看，PTX可能通過抑制細胞周期蛋白CyclinD1和CDK2的表達來實現(xiàn)對細胞周期的阻滯。CyclinD1與CDK2結(jié)合形成復合物，能夠促進細胞從G1期進入S期，推動細胞周期的進程。本研究中，WesternBlot結(jié)果顯示，隨著PTX濃度的增加，CyclinD1和CDK2的表達逐漸降低，這與細胞周期的變化趨勢一致，進一步證實了PTX可能通過抑制CyclinD1和CDK2的表達，阻滯細胞周期于G0-G1期。此外，PTX還可能通過影響其他細胞周期調(diào)控因子的表達或活性，如p21、p27等，來調(diào)節(jié)細胞周期。p21和p27是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠抑制CDK的活性，從而阻滯細胞周期。PTX可能通過上調(diào)p21、p27的表達，抑制CDK的活性，使細胞周期停滯在G0-G1期。對比相關文獻，[文獻3]研究了另一種抑制劑對子宮內(nèi)膜癌細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)該抑制劑主要通過影響S期相關蛋白的表達來阻滯細胞周期，與PTX主要阻滯細胞在G0-G1期的作用機制不同。[文獻4]探討了某藥物對腫瘤細胞周期的作用，其作用靶點和PTX也存在差異。本研究中PTX對子宮內(nèi)膜癌細胞周期的阻滯作用具有獨特性，主要表現(xiàn)為對G0-G1期的阻滯，且這種阻滯作用與抑制CyclinD1和CDK2的表達密切相關。PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞周期的阻滯效應，與細胞的增殖和凋亡密切相關。細胞周期的阻滯會導致細胞增殖能力下降，因為細胞無法順利進入S期進行DNA復制和細胞分裂。同時，細胞周期的阻滯也可能會觸發(fā)細胞凋亡機制。當細胞周期受到阻滯時，細胞內(nèi)的應激反應會被激活，如DNA損傷修復機制等。如果細胞無法有效修復損傷或適應這種阻滯狀態(tài)，就會啟動凋亡程序，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在本研究中，PTX在阻滯細胞周期的同時，也促進了細胞凋亡，這進一步說明了細胞周期阻滯與細胞凋亡之間的密切聯(lián)系。PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞周期的阻滯效應，為深入理解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制提供了新的視角。同時，也為子宮內(nèi)膜癌的治療提供了潛在的靶點和治療策略。如果能夠進一步開發(fā)基于PTX作用機制的藥物，通過阻滯細胞周期來抑制癌細胞的增殖，有望為子宮內(nèi)膜癌患者提供更有效的治療方法。5.4研究結(jié)果的臨床應用前景與潛在價值本研究結(jié)果具有廣泛的臨床應用前景和潛在價值，為子宮內(nèi)膜癌的診斷、治療和預后評估提供了新的思路和方法。在子宮內(nèi)膜癌的診斷方面，深入研究PTX對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞的影響，有助于揭示子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制。通過檢測相關蛋白的表達，如Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK2等，以及GPER的表達水平，有可能開發(fā)出新型的診斷標志物。這些標志物可以更準確地判斷子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生風險，輔助早期診斷，提高診斷的準確性和特異性。在一些研究中，通過檢測腫瘤組織中特定蛋白的表達水平，能夠有效地鑒別子宮內(nèi)膜癌與正常組織，為早期診斷提供了重要依據(jù)。未來，基于本研究的結(jié)果，有望進一步篩選出更具特異性和敏感性的標志物，應用于臨床診斷，實現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療。在治療領域，本研究表明PTX能夠抑制雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，促進其凋亡，阻滯細胞周期，這為子宮內(nèi)膜癌的治療提供了新的潛在靶點。以GPER介導的信號傳導通路為靶點，開發(fā)新型的治療藥物或治療策略具有廣闊的前景。一方面，可以研發(fā)特異性更強、副作用更小的GPER抑制劑，類似PTX的作用機制，阻斷信號傳導通路，抑制癌細胞的生長和擴散。另一方面，可以聯(lián)合其他傳統(tǒng)治療方法，如手術、化療、放療等，提高治療效果。有研究報道，將靶向治療與化療相結(jié)合，能夠顯著提高腫瘤患者的生存率和治療效果。未來，基于PTX作用機制的聯(lián)合治療方案，可能為子宮內(nèi)膜癌患者帶來更好的治療效果，改善患者的預后。對于子宮內(nèi)膜癌患者的預后評估，本研究結(jié)果也具有重要意義。通過監(jiān)測患者體內(nèi)相關蛋白的表達變化以及PTX對這些蛋白的影響，可以更準確地評估患者的預后情況。高表達抗凋亡蛋白Bcl-2和細胞周期蛋白CyclinD1、CDK2，同時低表達促凋亡蛋白Bax的患者，可能預后較差。而PTX能夠調(diào)節(jié)這些蛋白的表達，使患者的預后得到改善。通過定期檢測這些蛋白的表達水平，醫(yī)生可以及時了解患者的病情變化，調(diào)整治療方案，為患者提供更個性化的治療和管理，提高患者的生存質(zhì)量和生存率。六、研究結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論本研究深入探討了百日咳毒素（PTX）對雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的影響，通過一系列實驗，取得了以下重要研究成果：PTX抑制細胞增殖：MTT法檢測結(jié)果表明，17β-雌二醇（E?）對Ishikawa細胞具有明顯的促增殖作用，呈時間依賴性和濃度依賴性；而對HEC-1A細胞的促增殖作用不顯著。在E?作用下，加入PTX后，Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的增殖能力均隨著PTX濃度的增加及時間的延長而逐漸下降，呈現(xiàn)出時間依賴性和濃度依賴性。這明確證實了PTX能夠有效抑制E?對子宮內(nèi)膜癌細胞的促增殖作用，抑制癌細胞的生長。PTX阻滯細胞周期：流式細胞儀分析結(jié)果顯示，E?能夠促進Ishikawa細胞從G0-G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細胞周期進程；而對HEC-1A細胞周期各時相的作用差異不明顯。在E?作用下，隨著PTX濃度的增加，Ishikawa細胞G0-G1期比例逐漸升高，G2-M期比例逐漸降低；HEC-1A細胞G0-G1期比例升高，S期比例降低。這充分說明PTX能夠阻滯雌激素作用下的子宮內(nèi)膜癌細胞周期，使其停滯在G0-G1期，抑制細胞從G0-G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而抑制細胞增殖。PTX促進細胞凋亡：AnnexinV-FITC流式細胞術檢測結(jié)果表明，在E?作用下，隨著PTX濃度的增加，Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的凋亡率均逐漸升高。細胞形態(tài)學觀察也進一步證實了PTX能夠促進雌激素作用下子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡，細胞出現(xiàn)變圓、貼壁能力下降、脫落以及凋亡小體形成等典型凋亡特征。作用機制：蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測結(jié)果顯示，E?能夠促進抗凋亡蛋白Bcl-2和細胞周期蛋白CyclinD1、CDK2的表達，抑制促凋亡蛋白Bax的表達；而在E?作用下，隨著PTX濃度的增加，Bcl