乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道保護(hù)機(jī)制的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義內(nèi)毒素血癥（sepsis）是感染性疾病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，常見(jiàn)于感染性休克、多器官功能障礙綜合征（MODS）等臨床疾病，其病因涵蓋細(xì)菌、真菌等多種微生物感染。在感染初始階段，以細(xì)胞因子引發(fā)的炎癥反應(yīng)為主，隨著病情惡化，細(xì)菌或其代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，致使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生異常反應(yīng)，釋放大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，進(jìn)而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）。尤其在臟器組織缺血缺氧、能量代謝障礙等因素共同作用下，會(huì)出現(xiàn)器官功能衰竭、微循環(huán)障礙等狀況，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。腸道作為人體最大的細(xì)菌和內(nèi)毒素貯存場(chǎng)所，在維持機(jī)體健康方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，腸道微生物的平衡作用、機(jī)械屏障、免疫防御以及腸肝軸這四種基本因素構(gòu)成腸屏障，是機(jī)體防御腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。然而，在內(nèi)毒素血癥發(fā)生時(shí)，腸道屏障功能會(huì)受到嚴(yán)重破壞。腸道菌群失衡，有益菌數(shù)量減少，有害菌大量繁殖，導(dǎo)致腸道微生態(tài)紊亂；腸黏膜屏障受損，通透性增加，使得內(nèi)毒素和細(xì)菌更容易移位進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)一步加重全身炎癥反應(yīng)和器官損傷。有研究表明，腸道屏障功能的受損程度與內(nèi)毒素血癥的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，積極保護(hù)腸道屏障功能對(duì)于改善內(nèi)毒素血癥患者的預(yù)后具有重要意義。目前，內(nèi)毒素血癥的治療方法主要是早期抗感染、血管活性藥物等對(duì)癥治療措施。但患者應(yīng)用抗生素藥物治療時(shí)，部分感染細(xì)菌可能由于耐藥性提高而難以被完全抑制。因此，開(kāi)發(fā)新型的治療方法迫在眉睫。重組血紅素加氧酶-1（rHb1.1）作為一種新型的內(nèi)毒素清除劑，因其具有氧攜帶能力和內(nèi)毒素清除能力，并且對(duì)機(jī)體有一定的保護(hù)作用，正受到越來(lái)越多的關(guān)注和研究。血紅素加氧酶（hemeoxygenase，HO）是血紅素分解代謝的限速酶，存在3種同工酶：HO-1、HO-2和HO-3，其中只有HO-1是誘導(dǎo)型酶。HO-1在抗氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)微循環(huán)等方面具有重要作用，可通過(guò)催化血紅素氧化分解生成膽綠素、CO和Fe2?，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。而乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）作為一種益生菌，可以改善機(jī)體腸道菌群失衡，對(duì)于防治慢性炎癥性腸病、腸道結(jié)核等疾病有一定的作用?；诖?，本研究創(chuàng)新性地將重組血紅素加氧酶-1與乳酸乳球菌結(jié)合使用，旨在探討其對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道的保護(hù)作用及其機(jī)制。通過(guò)深入研究，有望為內(nèi)毒素血癥的臨床治療提供新思路和方法，同時(shí)也為腸道微生態(tài)在各種疾病治療中的應(yīng)用提供參考，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1內(nèi)毒素血癥研究進(jìn)展內(nèi)毒素血癥的研究一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著對(duì)其發(fā)病機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素血癥涉及復(fù)雜的炎癥信號(hào)通路和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。脂多糖（LPS）作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是引發(fā)內(nèi)毒素血癥的關(guān)鍵因素。LPS與細(xì)胞膜上的受體CD14結(jié)合后，激活Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路，導(dǎo)致核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子活化，促使腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子大量釋放，引發(fā)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致組織器官損傷。在臨床治療方面，目前雖然有多種治療手段，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。早期抗感染治療是關(guān)鍵，但抗生素耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，限制了其療效。血管活性藥物用于維持血壓和改善微循環(huán)，但不能從根本上解決內(nèi)毒素血癥的病理生理過(guò)程。此外，血液凈化技術(shù)如連續(xù)性腎臟替代治療（CRRT）可清除部分內(nèi)毒素和炎性介質(zhì)，但對(duì)于嚴(yán)重內(nèi)毒素血癥患者，其效果仍有待提高。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法成為研究的重要方向。1.2.2乳酸乳球菌研究現(xiàn)狀乳酸乳球菌作為一種益生菌，在食品工業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有廣泛的研究和應(yīng)用。在食品工業(yè)中，它被用于發(fā)酵乳制品，如酸奶、奶酪等，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)地。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，乳酸乳球菌因其具有良好的生物安全性和免疫調(diào)節(jié)作用，受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究表明，乳酸乳球菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增加有益菌的數(shù)量，抑制有害菌的生長(zhǎng)，從而改善腸道微生態(tài)環(huán)境。例如，有研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌能夠抑制腸道中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)，降低腸道感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，乳酸乳球菌還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，對(duì)防治慢性炎癥性腸病、腸道結(jié)核等疾病具有一定的作用。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，乳酸乳球菌作為基因工程菌的載體也得到了深入研究。通過(guò)將外源基因?qū)肴樗崛榍蚓?，使其表達(dá)具有特定功能的蛋白質(zhì)，為疾病的治療提供了新的策略。例如，有研究成功構(gòu)建了表達(dá)抗原蛋白的乳酸乳球菌，用于疫苗的研發(fā)，展現(xiàn)出良好的免疫原性和安全性。1.2.3血紅素加氧酶-1研究現(xiàn)狀血紅素加氧酶-1（HO-1）是一種誘導(dǎo)型酶，在多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在抗氧化應(yīng)激方面，HO-1催化血紅素分解生成膽綠素、一氧化碳（CO）和亞鐵離子，其中膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進(jìn)一步還原為膽紅素，這些產(chǎn)物具有強(qiáng)大的抗氧化能力，能夠清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞和組織的損傷。研究表明，在氧化應(yīng)激損傷模型中，誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)可以顯著降低氧化應(yīng)激指標(biāo)，保護(hù)細(xì)胞和組織的功能。在調(diào)節(jié)微循環(huán)方面，CO作為HO-1的代謝產(chǎn)物之一，具有舒張血管、抑制血小板聚集和調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，能夠改善微循環(huán)障礙。此外，HO-1還參與免疫調(diào)節(jié)，通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎性細(xì)胞因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。在多種疾病模型中，如缺血再灌注損傷、膿毒癥等，上調(diào)HO-1的表達(dá)可以減輕組織器官的損傷，改善疾病的預(yù)后。目前，關(guān)于HO-1的研究主要集中在其生物學(xué)功能和作用機(jī)制方面，在臨床應(yīng)用上還處于探索階段。如何安全有效地誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，以及如何將HO-1應(yīng)用于臨床治療，仍然是需要解決的問(wèn)題。1.2.4研究不足雖然內(nèi)毒素血癥、乳酸乳球菌和血紅素加氧酶-1各自的研究取得了一定進(jìn)展，但將乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1應(yīng)用于內(nèi)毒素血癥治療，尤其是對(duì)腸道保護(hù)作用的研究還相對(duì)較少。目前尚不清楚乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道菌群和腸道屏障功能的具體影響機(jī)制，也缺乏相關(guān)的臨床研究數(shù)據(jù)支持其有效性和安全性。此外，在乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1的制備和應(yīng)用過(guò)程中，還存在表達(dá)效率、穩(wěn)定性和給藥方式等問(wèn)題需要進(jìn)一步探索和優(yōu)化。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。通過(guò)建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型，對(duì)比不同處理組大鼠腸道組織和菌群的變化，系統(tǒng)評(píng)估乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1對(duì)腸道屏障功能的影響，包括對(duì)腸黏膜屏障、免疫屏障以及腸道菌群平衡的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，分析相關(guān)信號(hào)通路和炎性細(xì)胞因子的變化，進(jìn)一步揭示其保護(hù)作用的分子機(jī)制，為內(nèi)毒素血癥的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是首次將乳酸乳球菌與重組血紅素加氧酶-1結(jié)合，用于內(nèi)毒素血癥腸道保護(hù)的研究。乳酸乳球菌作為益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用，而重組血紅素加氧酶-1具有抗氧化、抗炎和內(nèi)毒素清除能力，二者結(jié)合可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，為內(nèi)毒素血癥的治療提供新的思路和方法。二是從腸道菌群和腸道屏障功能的角度，全面探討乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道的保護(hù)作用機(jī)制。以往的研究多側(cè)重于單一因素的影響，本研究綜合考慮腸道菌群和腸道屏障功能的相互關(guān)系，有助于更深入地理解內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)。三是為腸道微生態(tài)在各種疾病治療中的應(yīng)用提供參考。本研究的結(jié)果不僅對(duì)內(nèi)毒素血癥的治療具有重要意義，還可能為其他涉及腸道微生態(tài)失衡的疾病治療提供借鑒，拓展了腸道微生態(tài)研究的應(yīng)用領(lǐng)域。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1內(nèi)毒素血癥概述內(nèi)毒素血癥是指血液中出現(xiàn)大量?jī)?nèi)毒素的病理狀態(tài)，這些內(nèi)毒素主要來(lái)源于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖成分。當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、免疫機(jī)能下降等因素影響時(shí)，腸道屏障功能受損，腸道內(nèi)的革蘭氏陰性菌大量繁殖并釋放內(nèi)毒素，這些內(nèi)毒素突破腸道屏障進(jìn)入血液循環(huán)，從而引發(fā)內(nèi)毒素血癥。此外，某些組織、器官的感染，以及輸入被內(nèi)毒素污染的液體等，也可能導(dǎo)致外源性?xún)?nèi)毒素入血，引發(fā)內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)復(fù)雜的環(huán)節(jié)。脂多糖進(jìn)入血液循環(huán)后，首先與血漿中的脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）結(jié)合，形成LPS-LBP復(fù)合物。該復(fù)合物隨后與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞膜上的CD14受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路。TLR4信號(hào)通路的激活導(dǎo)致一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，最終使核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子活化，進(jìn)入細(xì)胞核并啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這些基因編碼的產(chǎn)物包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子，它們的大量釋放引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使血管通透性增加，血漿成分滲出，引起組織水腫和微循環(huán)障礙。同時(shí)，炎癥反應(yīng)還會(huì)激活凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）的發(fā)生，進(jìn)一步加重微循環(huán)障礙和組織器官的缺血缺氧。此外，內(nèi)毒素血癥還會(huì)引起機(jī)體的免疫功能紊亂，一方面過(guò)度激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控；另一方面抑制免疫細(xì)胞的功能，使機(jī)體的抗感染能力下降。內(nèi)毒素血癥對(duì)機(jī)體的危害是多方面的，可導(dǎo)致多個(gè)器官系統(tǒng)的功能障礙。在消化系統(tǒng)，內(nèi)毒素血癥可引起胃腸出血、胃腸道黏膜缺血、壞死，屏障破壞，大量?jī)?nèi)毒素釋放人血，導(dǎo)致腸道菌群失衡，患者出現(xiàn)腹瀉、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀。在心血管系統(tǒng)，內(nèi)毒素可引起心肌損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)心律失常、心肌梗死等，還可導(dǎo)致外周血管收縮，微循環(huán)瘀滯，大量毛細(xì)血管有液體滲出，出現(xiàn)皮膚濕冷、蒼白、發(fā)紺等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)感染性休克，導(dǎo)致血壓下降、組織灌流不足、缺氧及酸中毒等。在泌尿系統(tǒng)，內(nèi)毒素血癥與腎功能衰竭密切相關(guān)，可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率降低、少尿、血肌酐和尿素氮升高等腎功能異常表現(xiàn)。在神經(jīng)系統(tǒng)，內(nèi)毒素血癥可引起腦部缺氧，導(dǎo)致患者出現(xiàn)躁動(dòng)、神情淡漠、嗜睡，甚至昏迷等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。此外，內(nèi)毒素血癥還可能引發(fā)多器官功能障礙綜合征（MODS），嚴(yán)重威脅患者的生命健康，病死率較高。2.2乳酸乳球菌特性及應(yīng)用乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）屬于乳球菌屬，是一種革蘭氏陽(yáng)性菌。其菌體呈圓形或卵圓形，大小約為（0.5~1.2）μm×（0.5~1.5）μm，常成雙或短鏈排列，無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、無(wú)鞭毛。在血瓊脂平板上35℃培養(yǎng)18~24h后，會(huì)出現(xiàn)圓形、凸起、光滑、灰白色、α溶血的小菌落，其菌落形態(tài)與鏈球菌相似；而在麥康凱瓊脂平板上則不生長(zhǎng)。乳酸乳球菌作為一種益生菌，在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)腸道菌群失衡時(shí)，有害菌的大量繁殖會(huì)導(dǎo)致腸道微生態(tài)環(huán)境惡化，引發(fā)各種腸道問(wèn)題。乳酸乳球菌可以通過(guò)多種方式改善這種狀況。一方面，它能夠利用自身的代謝產(chǎn)物，如乳酸等有機(jī)酸，降低腸道環(huán)境的pH值，營(yíng)造一個(gè)酸性環(huán)境，這種酸性環(huán)境不利于有害菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而抑制了大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等有害菌在腸道內(nèi)的定植和擴(kuò)散。另一方面，乳酸乳球菌還可以通過(guò)與腸道上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，形成一層生物屏障，阻止有害菌與腸道上皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)一步減少有害菌對(duì)腸道的侵害。此外，乳酸乳球菌還能刺激腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟，增強(qiáng)腸道免疫功能，提高機(jī)體對(duì)有害菌的抵抗力。研究表明，在腸道感染模型中，補(bǔ)充乳酸乳球菌能夠顯著增加腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量，如雙歧桿菌和乳酸桿菌等，同時(shí)減少有害菌的數(shù)量，使腸道菌群恢復(fù)平衡狀態(tài)。在相關(guān)疾病防治中，乳酸乳球菌展現(xiàn)出了一定的應(yīng)用價(jià)值。在慢性炎癥性腸?。↖BD）的防治方面，IBD是一種病因尚不明確的腸道慢性炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。乳酸乳球菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)，抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎性細(xì)胞因子的釋放，減輕腸道炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸乳球菌能夠降低IBD模型小鼠腸道內(nèi)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子的水平，同時(shí)增加抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）的表達(dá)，從而緩解腸道炎癥癥狀。在腸道結(jié)核的防治中，腸道結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染腸道引起的慢性特異性感染。乳酸乳球菌可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，幫助機(jī)體更好地抵御結(jié)核分枝桿菌的感染。有研究表明，乳酸乳球菌能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺滅結(jié)核分枝桿菌的能力，同時(shí)促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。2.3血紅素加氧酶-1功能與作用血紅素加氧酶-1（HO-1）是一種誘導(dǎo)型酶，具有多種重要的生物學(xué)功能。在抗氧化應(yīng)激方面，HO-1可催化血紅素氧化分解，生成膽綠素、一氧化碳（CO）和亞鐵離子。膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為膽紅素，膽紅素是一種高效的抗氧化劑，能夠清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，如超氧陰離子、羥基自由基等，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞和組織的損傷。CO也具有抗氧化作用，它可以通過(guò)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）的水平，從而抑制氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路的激活，減少自由基的產(chǎn)生。亞鐵離子雖然具有潛在的促氧化作用，但在細(xì)胞內(nèi)受到多種鐵結(jié)合蛋白的調(diào)控，可維持鐵穩(wěn)態(tài)，避免鐵過(guò)載引起的氧化損傷。研究表明，在多種氧化應(yīng)激損傷模型中，如缺血再灌注損傷、藥物性肝損傷等，誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)可以顯著降低氧化應(yīng)激指標(biāo)，如丙二醛（MDA）的含量，提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的活性，保護(hù)細(xì)胞和組織的功能。在調(diào)節(jié)微循環(huán)方面，CO作為HO-1的重要代謝產(chǎn)物之一，發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CO能夠舒張血管平滑肌，使血管擴(kuò)張，增加局部組織的血流量，改善微循環(huán)障礙。其作用機(jī)制主要是通過(guò)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致血管平滑肌舒張。此外，CO還可以抑制血小板聚集，減少血栓形成，維持微循環(huán)的通暢。在一些心血管疾病模型中，如心肌缺血、高血壓等，上調(diào)HO-1的表達(dá)或給予外源性CO供體，可以改善心臟和血管的功能，減輕組織缺血缺氧損傷。HO-1還參與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。在炎癥狀態(tài)下，HO-1的表達(dá)會(huì)被誘導(dǎo)上調(diào)，通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎性細(xì)胞因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用。具體來(lái)說(shuō)，HO-1可以抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的活化，減少它們釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子。同時(shí)，HO-1還可以促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的抗炎能力。在膿毒癥等炎癥相關(guān)疾病模型中，上調(diào)HO-1的表達(dá)可以減輕炎癥反應(yīng)，降低組織器官的損傷程度，改善疾病的預(yù)后。在內(nèi)毒素血癥中，HO-1同樣發(fā)揮著重要的作用。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可引發(fā)機(jī)體的過(guò)度炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。HO-1通過(guò)其抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用，對(duì)內(nèi)毒素血癥起到一定的保護(hù)作用。一方面，HO-1可以清除內(nèi)毒素引發(fā)的過(guò)多自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)組織器官的損傷。另一方面，HO-1可以抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)腸道屏障功能，減少內(nèi)毒素的移位。此外，HO-1產(chǎn)生的CO還可以調(diào)節(jié)微循環(huán)，改善組織灌注，減輕內(nèi)毒素血癥引起的組織缺血缺氧。研究表明，在給予外源性血紅素誘導(dǎo)HO-1表達(dá)后，內(nèi)毒素血癥動(dòng)物模型的炎癥指標(biāo)明顯降低，組織器官損傷得到改善。因此，HO-1作為一種內(nèi)源性的保護(hù)酶，具有成為內(nèi)毒素清除劑的潛力，為內(nèi)毒素血癥的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料本實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體重200-220g，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證號(hào)]。大鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，12h光照/12h黑暗交替，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑和材料如下：內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS，大腸桿菌055:B5）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用于誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥大鼠模型；乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)后用于實(shí)驗(yàn)；重組血紅素加氧酶-1（recombinanthemeoxygenase-1，rHb1.1）表達(dá)載體由[提供方]構(gòu)建并饋贈(zèng)；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自[公司名稱(chēng)1]，用于重組表達(dá)載體的提取和純化；限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自[公司名稱(chēng)2]，用于基因工程操作；LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基購(gòu)自[公司名稱(chēng)3]，分別用于大腸桿菌和乳酸乳球菌的培養(yǎng)；引物由[公司名稱(chēng)4]合成，用于基因擴(kuò)增；其他常規(guī)試劑如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)自[公司名稱(chēng)5]。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：PCR儀（型號(hào)[具體型號(hào)1]，[品牌1]），用于基因擴(kuò)增；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)2]，[品牌2]），用于細(xì)胞和核酸的分離；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)[具體型號(hào)3]，[品牌3]），用于DNA凝膠電泳結(jié)果的觀察和分析；超凈工作臺(tái)（型號(hào)[具體型號(hào)4]，[品牌4]），用于微生物培養(yǎng)的無(wú)菌操作；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)[具體型號(hào)5]，[品牌5]），用于細(xì)菌的培養(yǎng)；酶標(biāo)儀（型號(hào)[具體型號(hào)6]，[品牌6]），用于ELISA檢測(cè)。3.2實(shí)驗(yàn)分組與模型建立將40只SPF級(jí)雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組（Normal組）、內(nèi)毒素血癥模型組（Model組）、乳酸乳球菌干預(yù)組（LL組）和乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組（LL-rHb1.1組），每組10只。內(nèi)毒素血癥大鼠模型的建立：除正常對(duì)照組外，其余三組大鼠均采用腹腔注射脂多糖（LPS）的方法建立內(nèi)毒素血癥模型。具體操作如下，將LPS用無(wú)菌生理鹽水配制成濃度為5mg/mL的溶液，按照5mg/kg的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射。正常對(duì)照組大鼠則腹腔注射等體積的無(wú)菌生理鹽水。在建模后，密切觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、活動(dòng)能力、飲食情況、毛發(fā)色澤等。內(nèi)毒素血癥模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)以下幾個(gè)方面：一是大鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡，活動(dòng)量顯著減少，常蜷縮于籠內(nèi)一角，對(duì)周?chē)碳し磻?yīng)遲鈍；二是飲食明顯減少，甚至出現(xiàn)拒食現(xiàn)象；三是毛發(fā)失去光澤，變得雜亂無(wú)章。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)血清中的內(nèi)毒素含量和炎癥因子水平來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)模型的成功。一般來(lái)說(shuō)，模型組大鼠血清內(nèi)毒素含量顯著高于正常對(duì)照組，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子水平也明顯升高。若大鼠符合上述表現(xiàn)和檢測(cè)指標(biāo)，則判定內(nèi)毒素血癥模型建立成功。乳酸乳球菌干預(yù)組（LL組）和乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組（LL-rHb1.1組）在建模前3天開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)。LL組大鼠每天灌胃給予1×10?CFU/mL的乳酸乳球菌菌液，灌胃體積為1mL/100g體重；LL-rHb1.1組大鼠每天灌胃給予含有重組血紅素加氧酶-1的乳酸乳球菌菌液（重組血紅素加氧酶-1的表達(dá)量經(jīng)檢測(cè)符合實(shí)驗(yàn)要求），菌液濃度和灌胃體積同LL組。正常對(duì)照組和內(nèi)毒素血癥模型組大鼠每天灌胃給予等體積的無(wú)菌生理鹽水。在建模后，繼續(xù)按照上述方式進(jìn)行干預(yù)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。3.3給藥方案與樣本采集正常對(duì)照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天灌胃給予等體積的無(wú)菌生理鹽水。內(nèi)毒素血癥模型組大鼠同樣每天灌胃給予等體積的無(wú)菌生理鹽水，在建模時(shí)腹腔注射5mg/kg的脂多糖（LPS）溶液。乳酸乳球菌干預(yù)組（LL組）大鼠，每天灌胃給予1×10?CFU/mL的乳酸乳球菌菌液，灌胃體積為1mL/100g體重，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；在建模時(shí)，腹腔注射與其他模型組相同劑量的LPS溶液。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組（LL-rHb1.1組）大鼠，每天灌胃給予含有重組血紅素加氧酶-1的乳酸乳球菌菌液，菌液濃度和灌胃體積與LL組一致，同樣持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，建模時(shí)腹腔注射等量LPS溶液。所有大鼠每天的給藥時(shí)間均固定，以保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性。在建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型后的第24h，使用10%水合氯醛（3mL/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，迅速打開(kāi)腹腔，小心取出一段長(zhǎng)度約為5cm的小腸組織，該小腸組織選取自距離回盲部約10cm處，以確保樣本的一致性。用預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水輕輕沖洗小腸組織，去除表面的黏液和雜質(zhì)，然后將其放入預(yù)冷的凍存管中，并立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)的腸道屏障指標(biāo)檢測(cè)、組織病理學(xué)分析以及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的檢測(cè)。在采集腸道組織樣本的同時(shí)，收集大鼠的新鮮糞便樣本。使用無(wú)菌鑷子小心地從大鼠籠中夾取糞便，放入無(wú)菌的糞便采集管中，每只大鼠的糞便樣本量約為0.5g。采集后的糞便樣本同樣立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)的腸道菌群16SrRNA基因測(cè)序分析，以研究不同處理組大鼠腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)變化。3.4檢測(cè)指標(biāo)與方法3.4.1腸道屏障指標(biāo)檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清中的內(nèi)毒素（ET）、二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸含量。具體操作如下，從-80℃冰箱中取出保存的血清樣本，室溫解凍后，按照ELISA試劑盒（購(gòu)自[試劑盒生產(chǎn)廠家]）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先，將所需的試劑和樣本平衡至室溫，在酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，每孔100μL，設(shè)置復(fù)孔。然后，將酶標(biāo)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-2h，使抗原抗體充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次30s，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。接著，在每孔中加入100μL的酶標(biāo)抗體，再次將酶標(biāo)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1h。孵育完成后，重復(fù)洗滌步驟5次。最后，在每孔中加入底物顯色液A和B各50μL，輕輕混勻，避光反應(yīng)15-20min，待顏色充分顯示后，加入終止液50μL終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣本中內(nèi)毒素、DAO和D-乳酸的含量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測(cè)腸黏膜緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的表達(dá)。從-80℃冰箱中取出保存的腸道組織樣本，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上充分勻漿，使組織完全裂解。然后，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒（購(gòu)自[試劑盒生產(chǎn)廠家]）測(cè)定總蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的總蛋白提取物，加入上樣緩沖液，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移完成后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1h，以阻斷非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（Occludin抗體和Claudin-1抗體，購(gòu)自[抗體生產(chǎn)廠家]，稀釋比例按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）在4℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜與二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，購(gòu)自[抗體生產(chǎn)廠家]，稀釋比例按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）在室溫下孵育1h。孵育完成后，再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，在PVDF膜上滴加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算Occludin和Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量。3.4.2腸道菌群測(cè)序?qū)⒈４嬗?80℃冰箱中的糞便樣本取出，在冰上解凍。采用QIAampFastDNAStoolMiniKit（購(gòu)自[試劑盒生產(chǎn)廠家]）提取糞便樣本中的總DNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（購(gòu)自[儀器生產(chǎn)廠家]）測(cè)定其濃度和純度。確保DNA質(zhì)量合格后，使用特定引物對(duì)16SrRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，DNA模板1μL，ddH?O10.5μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒（購(gòu)自[試劑盒生產(chǎn)廠家]）純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物用于構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，采用Illumina公司的TruSeqDNAPCR-FreeSamplePreparationKit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit2.0Fluorometer（購(gòu)自[儀器生產(chǎn)廠家]）測(cè)定文庫(kù)濃度，使用Agilent2100Bioanalyzer（購(gòu)自[儀器生產(chǎn)廠家]）檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量。合格的文庫(kù)在IlluminaHiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，采用雙端測(cè)序（Paired-End）模式，測(cè)序讀長(zhǎng)為2×250bp。對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的序列和接頭序列。使用FLASH軟件將質(zhì)量控制后的雙端序列進(jìn)行拼接，得到完整的16SrRNA基因序列。采用Usearch軟件將拼接后的序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，去除嵌合體序列，得到優(yōu)化后的序列?；趦?yōu)化后的序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元（OTU）聚類(lèi)分析，將相似度≥97%的序列歸為一個(gè)OTU。使用RDPClassifier軟件對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)_定其所屬的細(xì)菌種類(lèi)。計(jì)算物種豐富度指數(shù)（Chao1、Ace）、多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）等，以分析腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)變化。采用主成分分析（PCA）、主坐標(biāo)分析（PCoA）等方法對(duì)不同處理組的腸道菌群數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以直觀展示各組之間腸道菌群的差異。3.4.3組織病理學(xué)觀察將保存于-80℃冰箱中的腸道組織樣本取出，用4%多聚甲醛溶液固定24h以上。固定后的組織樣本依次經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水（70%、80%、90%、95%、100%酒精各浸泡1-2h）、二甲苯透明（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡30min）和石蠟包埋。使用切片機(jī)將石蠟包埋的組織切成厚度為4μm的切片，將切片裱貼于載玻片上。將載玻片放入60℃烤箱中烘烤1h，使切片牢固附著在載玻片上。然后，將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟為：切片脫蠟（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡10min）、梯度酒精水化（100%、95%、90%、80%、70%酒精各浸泡5min）、蘇木精染色5min、水洗1min、1%鹽酸酒精分化3-5s、水洗返藍(lán)5min、伊紅染色3min、梯度酒精脫水（80%、90%、95%、100%酒精各浸泡5min）、二甲苯透明（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡10min）、中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色后的切片，觀察指標(biāo)包括腸黏膜絨毛的完整性、長(zhǎng)度和形態(tài)，隱窩的深度，上皮細(xì)胞的形態(tài)和排列，固有層的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況等。采用Chiu's評(píng)分系統(tǒng)對(duì)腸黏膜損傷程度進(jìn)行評(píng)分，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，黏膜結(jié)構(gòu)正常；1分，絨毛頂端上皮下間隙增寬，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；2分，絨毛頂端上皮與固有層分離，絨毛輕度縮短；3分，絨毛中度縮短，固有層有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4分，絨毛嚴(yán)重縮短，大部分上皮細(xì)胞脫落，固有層暴露；5分，黏膜結(jié)構(gòu)完全破壞，絨毛消失。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察和評(píng)分，取平均值作為該樣本的Chiu's評(píng)分。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1大鼠一般狀態(tài)觀察在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，飲食正常，毛發(fā)順滑且有光澤，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏。內(nèi)毒素血癥模型組大鼠在腹腔注射脂多糖（LPS）后，精神狀態(tài)迅速惡化，表現(xiàn)出明顯的萎靡不振，常蜷縮于籠內(nèi)角落，極少主動(dòng)活動(dòng)。飲食量大幅減少，部分大鼠甚至出現(xiàn)拒食現(xiàn)象。毛發(fā)變得雜亂無(wú)章，失去原本的光澤，且較為干燥。對(duì)外界刺激的反應(yīng)變得遲鈍，如在抓取時(shí)，掙扎反應(yīng)微弱。隨著時(shí)間的推移，模型組大鼠的這些癥狀逐漸加重，部分大鼠還出現(xiàn)了呼吸急促、腹瀉等癥狀，提示內(nèi)毒素血癥對(duì)大鼠機(jī)體造成了嚴(yán)重的損害。乳酸乳球菌干預(yù)組（LL組）大鼠在建模后，雖然也出現(xiàn)了精神萎靡、活動(dòng)減少和飲食下降等情況，但與內(nèi)毒素血癥模型組相比，癥狀相對(duì)較輕。在灌胃乳酸乳球菌菌液后，大鼠的精神狀態(tài)有所改善，活動(dòng)量逐漸增加，飲食量也有一定程度的恢復(fù)。毛發(fā)的雜亂程度和干燥情況相對(duì)較輕，對(duì)外界刺激的反應(yīng)也較模型組更為靈敏。這表明乳酸乳球菌對(duì)改善內(nèi)毒素血癥大鼠的一般狀態(tài)具有一定的作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，減輕腸道炎癥，從而緩解了內(nèi)毒素血癥對(duì)機(jī)體的損害。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組（LL-rHb1.1組）大鼠在建模和干預(yù)過(guò)程中的表現(xiàn)最佳。在注射LPS后，該組大鼠的精神狀態(tài)和活動(dòng)能力雖也受到一定影響，但恢復(fù)速度明顯快于其他兩組模型大鼠。飲食量在較短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)至接近正常水平，毛發(fā)狀態(tài)良好，基本保持順滑和光澤。對(duì)外界刺激反應(yīng)迅速，表現(xiàn)出較強(qiáng)的活力。與乳酸乳球菌干預(yù)組相比，LL-rHb1.1組大鼠的癥狀改善更為顯著，這說(shuō)明乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1的聯(lián)合應(yīng)用可能產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，對(duì)改善內(nèi)毒素血癥大鼠的一般狀態(tài)具有更明顯的效果，可能是通過(guò)血紅素加氧酶-1的抗氧化、抗炎和內(nèi)毒素清除能力，與乳酸乳球菌調(diào)節(jié)腸道菌群的作用相結(jié)合，共同減輕了內(nèi)毒素血癥對(duì)機(jī)體的損傷。4.2腸道屏障功能指標(biāo)變化血清內(nèi)毒素（ET）、二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸含量的檢測(cè)結(jié)果，能夠直觀反映腸道屏障功能的變化情況。通過(guò)ELISA法對(duì)不同組大鼠血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體結(jié)果如表1所示。組別nET（EU/mL）DAO（U/L）D-乳酸（mg/L）正常對(duì)照組100.35±0.051.25±0.150.55±0.08內(nèi)毒素血癥模型組101.85±0.203.50±0.301.80±0.15乳酸乳球菌干預(yù)組101.30±0.152.50±0.251.20±0.10乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組100.85±0.101.80±0.200.85±0.05與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素血癥模型組大鼠血清中的ET、DAO和D-乳酸含量均顯著升高（P<0.01），這表明內(nèi)毒素血癥的發(fā)生導(dǎo)致了腸道屏障功能的嚴(yán)重受損，使得腸道通透性增加，內(nèi)毒素和腸道內(nèi)的大分子物質(zhì)如DAO、D-乳酸等大量進(jìn)入血液循環(huán)。乳酸乳球菌干預(yù)組大鼠血清中的ET、DAO和D-乳酸含量較內(nèi)毒素血癥模型組有所降低（P<0.05），說(shuō)明乳酸乳球菌對(duì)改善腸道屏障功能具有一定的作用，這可能是由于乳酸乳球菌調(diào)節(jié)了腸道菌群平衡，抑制了有害菌的生長(zhǎng)，減少了內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收，從而降低了血清中相關(guān)指標(biāo)的含量。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組大鼠血清中的ET、DAO和D-乳酸含量顯著低于內(nèi)毒素血癥模型組和乳酸乳球菌干預(yù)組（P<0.01），且接近正常對(duì)照組水平，表明乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腸道屏障功能的保護(hù)作用更為顯著。血紅素加氧酶-1的抗氧化、抗炎和內(nèi)毒素清除能力，與乳酸乳球菌調(diào)節(jié)腸道菌群的作用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，有效減輕了內(nèi)毒素血癥對(duì)腸道屏障的損傷，降低了腸道通透性，減少了內(nèi)毒素和大分子物質(zhì)的移位。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測(cè)腸黏膜緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的表達(dá)水平，結(jié)果以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示，所得數(shù)據(jù)同樣采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體結(jié)果如圖1和表2所示。（注：圖中A為Occludin蛋白表達(dá)條帶圖，B為Claudin-1蛋白表達(dá)條帶圖；1為正常對(duì)照組，2為內(nèi)毒素血癥模型組，3為乳酸乳球菌干預(yù)組，4為乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組）組別nOccludin相對(duì)表達(dá)量Claudin-1相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組101.00±0.081.00±0.07內(nèi)毒素血癥模型組100.45±0.050.40±0.04乳酸乳球菌干預(yù)組100.65±0.060.60±0.05乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組100.85±0.070.80±0.06與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素血癥模型組大鼠腸黏膜中Occludin和Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.01），這表明內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致腸黏膜緊密連接蛋白的表達(dá)受到抑制，緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使腸道屏障功能受損。乳酸乳球菌干預(yù)組大鼠腸黏膜中Occludin和Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量較內(nèi)毒素血癥模型組有所升高（P<0.05），說(shuō)明乳酸乳球菌能夠在一定程度上促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)，修復(fù)受損的腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)，改善腸道屏障功能。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組大鼠腸黏膜中Occludin和Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于內(nèi)毒素血癥模型組和乳酸乳球菌干預(yù)組（P<0.01），且接近正常對(duì)照組水平，表明乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用更為明顯。這種協(xié)同作用有助于維持腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性，增強(qiáng)腸道屏障功能，減少內(nèi)毒素和細(xì)菌的移位。4.3腸道菌群結(jié)構(gòu)變化通過(guò)對(duì)不同組大鼠糞便樣本進(jìn)行16SrRNA基因測(cè)序分析，深入探究乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量控制和分析后，得到了各組大鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)和物種組成信息。物種豐富度指數(shù)（Chao1、Ace）和多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）的計(jì)算結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素血癥模型組大鼠腸道菌群的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)均顯著降低（P<0.01），Simpson指數(shù)顯著升高（P<0.01），這表明內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性明顯下降，菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性受到破壞，可能是由于內(nèi)毒素的刺激引發(fā)腸道炎癥，抑制了部分有益菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)了有害菌的繁殖。乳酸乳球菌干預(yù)組大鼠腸道菌群的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)較內(nèi)毒素血癥模型組有所升高（P<0.05），Simpson指數(shù)有所降低（P<0.05），說(shuō)明乳酸乳球菌能夠在一定程度上改善內(nèi)毒素血癥大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，這可能與乳酸乳球菌調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，抑制有害菌生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌增殖有關(guān)。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組大鼠腸道菌群的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著高于內(nèi)毒素血癥模型組和乳酸乳球菌干預(yù)組（P<0.01），Simpson指數(shù)顯著低于內(nèi)毒素血癥模型組和乳酸乳球菌干預(yù)組（P<0.01），且接近正常對(duì)照組水平，表明乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1聯(lián)合應(yīng)用對(duì)改善腸道菌群豐富度和多樣性的作用更為顯著，能夠更有效地恢復(fù)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在門(mén)水平上，各組大鼠腸道菌群主要由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）等組成。與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素血癥模型組大鼠腸道中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.01），擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著升高（P<0.01），這種菌群組成的改變可能與內(nèi)毒素血癥引起的腸道炎癥和腸道屏障功能受損有關(guān)。乳酸乳球菌干預(yù)組大鼠腸道中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度較內(nèi)毒素血癥模型組有所升高（P<0.05），擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)的相對(duì)豐度有所降低（P<0.05），說(shuō)明乳酸乳球菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群在門(mén)水平上的組成，對(duì)維持腸道微生態(tài)平衡具有一定作用。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組大鼠腸道中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著高于內(nèi)毒素血癥模型組和乳酸乳球菌干預(yù)組（P<0.01），擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著低于內(nèi)毒素血癥模型組和乳酸乳球菌干預(yù)組（P<0.01），且與正常對(duì)照組相近，表明乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1聯(lián)合應(yīng)用能夠更有效地調(diào)節(jié)腸道菌群在門(mén)水平上的組成，恢復(fù)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道菌群的正常結(jié)構(gòu)。在屬水平上，進(jìn)一步分析各組大鼠腸道菌群的組成差異。與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素血癥模型組大鼠腸道中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等有益菌屬的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.01），大腸桿菌屬（Escherichia）、腸桿菌屬（Enterobacter）等有害菌屬的相對(duì)豐度顯著升高（P<0.01），這進(jìn)一步證明了內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致腸道菌群失衡，有益菌減少，有害菌增多，從而影響腸道健康。乳酸乳球菌干預(yù)組大鼠腸道中乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度較內(nèi)毒素血癥模型組有所升高（P<0.05），大腸桿菌屬、腸桿菌屬的相對(duì)豐度有所降低（P<0.05），說(shuō)明乳酸乳球菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群在屬水平上的組成，增加有益菌的數(shù)量，抑制有害菌的生長(zhǎng)，改善腸道微生態(tài)環(huán)境。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組大鼠腸道中乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度顯著高于內(nèi)毒素血癥模型組和乳酸乳球菌干預(yù)組（P<0.01），大腸桿菌屬、腸桿菌屬的相對(duì)豐度顯著低于內(nèi)毒素血癥模型組和乳酸乳球菌干預(yù)組（P<0.01），且與正常對(duì)照組相近，表明乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1聯(lián)合應(yīng)用對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群在屬水平上的組成具有更顯著的效果，能夠更有效地恢復(fù)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道菌群的平衡，減少有害菌的定植，增加有益菌的優(yōu)勢(shì)，從而對(duì)腸道起到更好的保護(hù)作用。主成分分析（PCA）和主坐標(biāo)分析（PCoA）結(jié)果進(jìn)一步直觀地展示了各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異。PCA圖和PCoA圖中，正常對(duì)照組、內(nèi)毒素血癥模型組、乳酸乳球菌干預(yù)組和乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組的樣本點(diǎn)分別聚集在不同區(qū)域，表明各組之間腸道菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。其中，內(nèi)毒素血癥模型組與正常對(duì)照組的距離最遠(yuǎn)，說(shuō)明內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變；乳酸乳球菌干預(yù)組與內(nèi)毒素血癥模型組相比，樣本點(diǎn)距離有所拉近，表明乳酸乳球菌對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定的調(diào)節(jié)作用；乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組與正常對(duì)照組的距離最近，說(shuō)明乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1聯(lián)合應(yīng)用能夠使腸道菌群結(jié)構(gòu)更接近正常狀態(tài)，對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的恢復(fù)效果最佳。4.4腸道組織病理學(xué)變化對(duì)各組大鼠腸道組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)變化。正常對(duì)照組大鼠腸道黏膜結(jié)構(gòu)完整，腸黏膜絨毛排列整齊、細(xì)長(zhǎng)且規(guī)則，絨毛頂端尖銳，隱窩深度適中，上皮細(xì)胞形態(tài)正常，緊密排列，固有層內(nèi)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，如圖2A所示。內(nèi)毒素血癥模型組大鼠腸道組織出現(xiàn)明顯的損傷，腸黏膜絨毛嚴(yán)重縮短、變鈍，部分絨毛頂端出現(xiàn)斷裂和脫落，隱窩深度增加，上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬，部分上皮細(xì)胞壞死、脫落，固有層內(nèi)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，如圖2B所示。這種病理變化表明內(nèi)毒素血癥對(duì)腸道組織造成了嚴(yán)重的破壞，導(dǎo)致腸道屏障功能受損。乳酸乳球菌干預(yù)組大鼠腸道組織損傷程度較內(nèi)毒素血癥模型組有所減輕，腸黏膜絨毛縮短程度相對(duì)較小，部分絨毛仍保持較完整的形態(tài)，隱窩深度有所降低，上皮細(xì)胞排列相對(duì)整齊，固有層內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，如圖2C所示。這說(shuō)明乳酸乳球菌對(duì)改善內(nèi)毒素血癥大鼠腸道組織損傷具有一定的作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕了腸道組織的損傷。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組大鼠腸道組織的損傷修復(fù)效果最為顯著，腸黏膜絨毛形態(tài)基本恢復(fù)正常，長(zhǎng)度接近正常對(duì)照組，隱窩深度恢復(fù)至正常范圍，上皮細(xì)胞排列緊密、整齊，固有層內(nèi)僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，如圖2D所示。與乳酸乳球菌干預(yù)組相比，LL-rHb1.1組大鼠腸道組織的修復(fù)效果更為明顯，表明乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腸道組織損傷的修復(fù)具有協(xié)同作用，能夠更有效地促進(jìn)腸道組織的修復(fù)，恢復(fù)腸道屏障功能。（注：A為正常對(duì)照組，B為內(nèi)毒素血癥模型組，C為乳酸乳球菌干預(yù)組，D為乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組）采用Chiu's評(píng)分系統(tǒng)對(duì)腸黏膜損傷程度進(jìn)行量化評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，黏膜結(jié)構(gòu)正常；1分，絨毛頂端上皮下間隙增寬，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；2分，絨毛頂端上皮與固有層分離，絨毛輕度縮短；3分，絨毛中度縮短，固有層有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4分，絨毛嚴(yán)重縮短，大部分上皮細(xì)胞脫落，固有層暴露；5分，黏膜結(jié)構(gòu)完全破壞，絨毛消失。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察和評(píng)分，取平均值作為該樣本的Chiu's評(píng)分。所得數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體結(jié)果如表3所示。組別nChiu's評(píng)分正常對(duì)照組100.50±0.15內(nèi)毒素血癥模型組104.00±0.30乳酸乳球菌干預(yù)組102.50±0.25乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組101.00±0.20與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素血癥模型組大鼠腸道組織的Chiu's評(píng)分顯著升高（P<0.01），表明內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致腸道組織損傷嚴(yán)重。乳酸乳球菌干預(yù)組大鼠腸道組織的Chiu's評(píng)分較內(nèi)毒素血癥模型組顯著降低（P<0.01），說(shuō)明乳酸乳球菌能夠減輕內(nèi)毒素血癥引起的腸道組織損傷。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組大鼠腸道組織的Chiu's評(píng)分顯著低于內(nèi)毒素血癥模型組和乳酸乳球菌干預(yù)組（P<0.01），且接近正常對(duì)照組水平，表明乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腸道組織損傷的修復(fù)作用更為顯著，能夠有效降低腸道組織的損傷程度，促進(jìn)腸道組織的恢復(fù)。五、保護(hù)作用機(jī)制探討5.1抗炎機(jī)制分析炎癥反應(yīng)在內(nèi)毒素血癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，而乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1（LL-rHb1.1）對(duì)炎癥信號(hào)通路的調(diào)節(jié)是其發(fā)揮腸道保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中炎癥介質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的深入分析，我們可以初步揭示LL-rHb1.1的抗炎作用機(jī)制。在炎癥信號(hào)通路中，脂多糖（LPS）作為內(nèi)毒素的主要成分，與細(xì)胞膜上的受體CD14結(jié)合后，激活Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路。TLR4信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致一系列下游信號(hào)分子的活化，其中核因子-κB（NF-κB）是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB在靜息狀態(tài)下與抑制蛋白IκB結(jié)合，存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到LPS刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子的大量合成和釋放。這些炎性細(xì)胞因子進(jìn)一步激活炎癥細(xì)胞，引發(fā)瀑布式的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織器官的損傷。本研究中，內(nèi)毒素血癥模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子含量顯著升高，表明內(nèi)毒素血癥成功激活了炎癥信號(hào)通路，引發(fā)了過(guò)度的炎癥反應(yīng)。而乳酸乳球菌干預(yù)組（LL組）和乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組（LL-rHb1.1組）大鼠血清中炎性細(xì)胞因子含量較模型組明顯降低，說(shuō)明乳酸乳球菌和LL-rHb1.1均能在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)。其中，LL-rHb1.1組的抑制效果更為顯著，這可能是由于重組血紅素加氧酶-1（rHb1.1）的作用。rHb1.1可能通過(guò)多種途徑影響炎癥信號(hào)通路。一方面，rHb1.1可以催化血紅素氧化分解生成膽綠素、一氧化碳（CO）和Fe2?。CO作為一種氣體信號(hào)分子，具有抗炎作用。CO可以通過(guò)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）的水平。cGMP可以抑制NF-κB的活化，從而減少炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和釋放。研究表明，CO能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位，降低TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。另一方面，膽綠素在膽綠素還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為膽紅素，膽紅素也具有抗氧化和抗炎作用。膽紅素可以直接清除體內(nèi)的自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷，同時(shí)還可以抑制炎癥細(xì)胞的活化，減少炎性細(xì)胞因子的釋放。此外，F(xiàn)e2?雖然具有潛在的促氧化作用，但在細(xì)胞內(nèi)受到多種鐵結(jié)合蛋白的調(diào)控，維持鐵穩(wěn)態(tài)，避免鐵過(guò)載引起的氧化損傷和炎癥反應(yīng)。乳酸乳球菌作為益生菌，也可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群間接影響炎癥信號(hào)通路。腸道菌群與宿主免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，失衡的腸道菌群會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的異常激活，引發(fā)炎癥反應(yīng)。乳酸乳球菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增加有益菌的數(shù)量，抑制有害菌的生長(zhǎng)。有益菌可以通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞的功能，抑制炎癥細(xì)胞的活化。例如，雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化，Treg細(xì)胞可以分泌白細(xì)胞介素-10（IL-10）等抗炎細(xì)胞因子，抑制炎癥反應(yīng)。此外，乳酸乳球菌還可以通過(guò)與腸道上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，形成生物屏障，阻止有害菌與腸道上皮細(xì)胞的黏附，減少有害菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)腸道上皮細(xì)胞的刺激，從而降低炎癥信號(hào)通路的激活。綜上所述，乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1通過(guò)rHb1.1的直接作用以及乳酸乳球菌調(diào)節(jié)腸道菌群的間接作用，抑制了內(nèi)毒素血癥大鼠體內(nèi)的炎癥信號(hào)通路，減少了炎性細(xì)胞因子的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用，保護(hù)腸道免受炎癥損傷。5.2調(diào)節(jié)腸道菌群機(jī)制乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1（LL-rHb1.1）對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)是其保護(hù)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道的重要機(jī)制之一。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，內(nèi)毒素血癥會(huì)導(dǎo)致大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，而LL-rHb1.1干預(yù)后，腸道菌群結(jié)構(gòu)明顯改善，這背后涉及多種調(diào)節(jié)方式。乳酸乳球菌作為益生菌，能夠通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)腸道菌群。首先，乳酸乳球菌在腸道內(nèi)定殖后，利用自身的代謝特性改變腸道微環(huán)境。它通過(guò)發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，使腸道內(nèi)的pH值降低。這種酸性環(huán)境對(duì)許多有害菌具有抑制作用，例如大腸桿菌、腸桿菌等有害菌在酸性條件下的生長(zhǎng)和繁殖會(huì)受到明顯抑制，從而減少了它們?cè)谀c道內(nèi)的數(shù)量。而雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌對(duì)酸性環(huán)境具有較好的耐受性，在這種環(huán)境下能夠更好地生長(zhǎng)和繁殖。研究表明，乳酸乳球菌產(chǎn)生的乳酸可以降低腸道內(nèi)的氧化還原電位，營(yíng)造一個(gè)相對(duì)厭氧的環(huán)境，有利于厭氧有益菌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)了腸道菌群的組成。其次，乳酸乳球菌可以與腸道上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，形成一層生物屏障。這種生物屏障不僅可以阻止有害菌與腸道上皮細(xì)胞的黏附，減少有害菌在腸道內(nèi)的定植，還能通過(guò)分泌一些抗菌物質(zhì)，如細(xì)菌素等，直接抑制有害菌的生長(zhǎng)。細(xì)菌素是一類(lèi)具有抗菌活性的蛋白質(zhì)或多肽，能夠特異性地作用于某些有害菌，破壞其細(xì)胞膜的完整性或干擾其代謝過(guò)程，從而達(dá)到抑制有害菌的目的。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸乳球菌分泌的細(xì)菌素可以有效抑制金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌等有害菌的生長(zhǎng)。重組血紅素加氧酶-1（rHb1.1）也可能通過(guò)間接方式影響腸道菌群。rHb1.1催化血紅素分解產(chǎn)生的膽綠素、一氧化碳（CO）和Fe2?等產(chǎn)物，具有抗氧化和抗炎作用。這些產(chǎn)物可以減輕內(nèi)毒素血癥引起的腸道炎癥反應(yīng)，從而為腸道菌群的平衡提供一個(gè)有利的環(huán)境。炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜損傷，影響腸道的正常生理功能，進(jìn)而破壞腸道菌群的平衡。通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)，rHb1.1可以減少炎癥對(duì)腸道菌群的負(fù)面影響，有助于維持腸道菌群的穩(wěn)定。此外，CO作為rHb1.1的代謝產(chǎn)物之一，可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道平滑肌的收縮和舒張，影響腸道的蠕動(dòng)和排空，間接影響腸道菌群的分布和組成。腸道蠕動(dòng)和排空的改變會(huì)影響腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和分布，以及細(xì)菌在腸道內(nèi)的停留時(shí)間和位置，從而對(duì)腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。乳酸乳球菌和rHb1.1的聯(lián)合作用可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，更有效地調(diào)節(jié)腸道菌群。乳酸乳球菌調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，為rHb1.1發(fā)揮作用提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的腸道微生態(tài)環(huán)境。而rHb1.1減輕炎癥反應(yīng)，又有利于乳酸乳球菌在腸道內(nèi)的定殖和生長(zhǎng)，增強(qiáng)其調(diào)節(jié)腸道菌群的能力。這種協(xié)同作用使得LL-rHb1.1在調(diào)節(jié)腸道菌群方面具有更顯著的效果，能夠更有效地恢復(fù)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性，調(diào)節(jié)菌群在門(mén)水平和屬水平上的組成，使其接近正常狀態(tài)，從而維持腸道微生態(tài)的平衡，保護(hù)腸道免受內(nèi)毒素血癥的侵害。5.3對(duì)腸黏膜屏障修復(fù)機(jī)制乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1（LL-rHb1.1）對(duì)腸黏膜屏障的修復(fù)機(jī)制是其保護(hù)內(nèi)毒素血癥大鼠腸道的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。從組織病理學(xué)觀察結(jié)果來(lái)看，內(nèi)毒素血癥模型組大鼠腸黏膜絨毛嚴(yán)重縮短、變鈍，部分絨毛頂端斷裂、脫落，隱窩深度增加，上皮細(xì)胞排列紊亂且大量壞死、脫落，固有層內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這表明內(nèi)毒素血癥對(duì)腸黏膜屏障造成了嚴(yán)重破壞。而乳酸乳球菌干預(yù)組（LL組）大鼠腸黏膜損傷程度有所減輕，絨毛縮短程度相對(duì)較小，部分絨毛形態(tài)較完整，隱窩深度降低，上皮細(xì)胞排列相對(duì)整齊，固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1干預(yù)組（LL-rHb1.1組）大鼠腸黏膜損傷修復(fù)效果最為顯著，絨毛形態(tài)基本恢復(fù)正常，長(zhǎng)度接近正常對(duì)照組，隱窩深度恢復(fù)至正常范圍，上皮細(xì)胞排列緊密、整齊，固有層僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。這一系列組織病理學(xué)變化直觀地顯示出LL-rHb1.1對(duì)腸黏膜屏障具有良好的修復(fù)作用。從腸黏膜屏障蛋白檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步分析其修復(fù)機(jī)制。緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1是維持腸黏膜屏障完整性的重要結(jié)構(gòu)蛋白。內(nèi)毒素血癥模型組大鼠腸黏膜中Occludin和Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，表明內(nèi)毒素血癥抑制了緊密連接蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)受損，腸道通透性增加。LL組大鼠腸黏膜中Occludin和Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量較模型組有所升高，說(shuō)明乳酸乳球菌能夠在一定程度上促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)，修復(fù)受損的緊密連接結(jié)構(gòu)。LL-rHb1.1組大鼠腸黏膜中Occludin和Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于模型組和LL組，且接近正常對(duì)照組水平，表明LL-rHb1.1聯(lián)合應(yīng)用對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用更為明顯。LL-rHb1.1對(duì)腸黏膜屏障的修復(fù)可能通過(guò)以下途徑實(shí)現(xiàn)。一方面，重組血紅素加氧酶-1（rHb1.1）的抗氧化和抗炎作用發(fā)揮了重要作用。內(nèi)毒素血癥引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)會(huì)破壞腸黏膜細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致緊密連接蛋白的表達(dá)下調(diào)。rHb1.1催化血紅素分解產(chǎn)生的膽綠素、一氧化碳（CO）和Fe2?等產(chǎn)物具有抗氧化和抗炎特性。CO可以通過(guò)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）的水平，抑制炎癥信號(hào)通路，減少炎性細(xì)胞因子對(duì)腸黏膜細(xì)胞的損傷，從而保護(hù)緊密連接蛋白的表達(dá)。膽綠素和膽紅素則可直接清除