Sorcin相互作用蛋白篩選及其與胃癌多藥耐藥關(guān)聯(lián)機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。在我國，胃癌同樣是高發(fā)疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。化療作為胃癌綜合治療的重要手段之一，對于晚期胃癌患者的治療至關(guān)重要，然而多藥耐藥（MultidrugResistance，MDR）現(xiàn)象的出現(xiàn)卻成為了胃癌化療成功的巨大阻礙。多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，這使得化療藥物無法有效發(fā)揮作用，導(dǎo)致化療失敗，患者預(yù)后不佳。據(jù)統(tǒng)計(jì)，晚期胃癌患者化療的有效率僅約20％-40％，主要原因便是多藥耐藥的產(chǎn)生。盡管多年來科研人員廣泛研究胃癌MDR機(jī)制，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了如核糖體S13和鋅帶基因ZNRD1等新的耐藥相關(guān)分子，但至今仍未能完全闡明其產(chǎn)生機(jī)制，也未找到能徹底逆轉(zhuǎn)胃癌MDR的有效靶點(diǎn)。這表明可能存在尚未被揭示的胃癌MDR機(jī)制，因此，繼續(xù)深入尋找新的耐藥機(jī)制及耐藥相關(guān)基因迫在眉睫?？扇苄阅退幭嚓P(guān)鈣結(jié)合蛋白Sorcin，作為一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，在腫瘤領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。它屬于鈣結(jié)合蛋白家族，其結(jié)構(gòu)包含多個EF手型結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了Sorcin與鈣離子特異性結(jié)合的能力。在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子作為重要的第二信使，參與眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Sorcin通過與鈣離子的結(jié)合與釋放，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而影響一系列依賴鈣離子的細(xì)胞生理過程。過往研究表明，Sorcin在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤耐藥細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌中，其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)；在肝癌中，Sorcin通過與NLRP3炎癥小體相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的表達(dá)，抑制細(xì)胞焦亡的激活，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在我們的前期研究中，首次觀察到Sorcin在胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中表達(dá)明顯增強(qiáng)，并且當(dāng)使用Sorcin寡核苷酸下調(diào)其在SGC7901/VCR中的表達(dá)時，可以部分逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞的多藥耐藥性。這一發(fā)現(xiàn)充分證明了Sorcin與胃癌多藥耐藥之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。目前，國際上對于Sorcin在多藥耐藥細(xì)胞中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。然而，現(xiàn)有研究普遍認(rèn)為，細(xì)胞中絕大多數(shù)酶的功能和調(diào)控過程并非由單一蛋白獨(dú)立完成，而是通過蛋白質(zhì)復(fù)合體或蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同作用來實(shí)現(xiàn)。蛋白質(zhì)之間的相互作用在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著核心作用，也是當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一?；诖耍钊胩骄縎orcin相互作用蛋白，對于揭示Sorcin在胃癌多藥耐藥中的作用機(jī)制具有重大意義。通過篩選和鑒定與Sorcin相互作用的蛋白質(zhì)，有望構(gòu)建出Sorcin相關(guān)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，明確其在細(xì)胞信號通路中的具體位置和作用方式。這不僅能夠加深我們對胃癌多藥耐藥分子機(jī)制的理解，為克服胃癌多藥耐藥提供全新的理論依據(jù)，還可能發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)更加有效的胃癌治療策略開辟新的道路，具有極高的臨床應(yīng)用價值和廣闊的研究前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在胃癌多藥耐藥機(jī)制的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列重要成果。眾多研究表明，膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白異常在胃癌多藥耐藥中扮演著關(guān)鍵角色。P-糖蛋白（P-gp）作為MDR1基因過度表達(dá)的產(chǎn)物，是一種由1280個氨基酸殘基構(gòu)成的跨膜蛋白。它能夠通過激活A(yù)TP泵，阻礙藥物向胞內(nèi)被動擴(kuò)散，并將胞內(nèi)細(xì)胞毒藥物向膜外主動轉(zhuǎn)運(yùn)，從而引發(fā)多藥耐藥。國內(nèi)有研究檢測到術(shù)前非化療胃癌中MDR1基因表達(dá)率為39.1％，而術(shù)前化療的胃腺癌中，該基因表達(dá)陽性率高達(dá)91％，明顯高于術(shù)前非化療組，且P-gp表達(dá)強(qiáng)度與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)，與生存期呈負(fù)相關(guān)。多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）同樣是一種能量依賴性外排泵，雖然其介導(dǎo)的MDR機(jī)制尚未完全明確，但推測它可能通過將GSH與藥物的結(jié)合物或者未修飾的藥物跨膜移位到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MRP在正常胃黏膜上高度表達(dá)，在胃癌組織中的表達(dá)則更高。乳腺癌相關(guān)蛋白（BCRP）作為一個新的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子蛋白，通過藥物溢出泵機(jī)制導(dǎo)致耐藥，與多種癌細(xì)胞系的MDR顯著相關(guān)，不過目前有關(guān)BCRP在胃癌多藥耐藥中的研究尚處于起步階段，仍有許多問題有待深入探索。酶表達(dá)異常也是胃癌多藥耐藥的重要機(jī)制之一。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST-π）作為一種與機(jī)體解毒作用有關(guān)的酶類，與惡性腫瘤關(guān)系密切，可催化親電化合物如烷化劑、鉑類等化療藥物與谷胱甘肽結(jié)合，增加藥物的水溶性，促進(jìn)其排出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。有研究表明，GST-π在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜組織，且其表達(dá)與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平和活性的改變會影響化療藥物與DNA的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對以TopoⅡ?yàn)榘悬c(diǎn)的化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中TopoⅡ的表達(dá)量和活性降低，使得化療藥物無法有效地發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致多藥耐藥的發(fā)生。關(guān)于Sorcin的研究，國內(nèi)外也有不少進(jìn)展。Sorcin作為一種可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白，最初在多藥耐受性細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤耐藥細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌中，Sorcin的表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)；在肝癌中，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Sorcin通過與NLRP3炎癥小體相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的表達(dá)，抑制細(xì)胞焦亡的激活，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在胃癌研究方面，前期研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較了長春新堿誘導(dǎo)形成的胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR和SGC7901細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)Sorcin在SGC7901/VCR中顯著高表達(dá)；用Sorcin反義寡核苷酸抑制其在胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中的高表達(dá)后，增強(qiáng)了該細(xì)胞對長春新堿的敏感性，耐藥性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞凋亡率也明顯增加。盡管國內(nèi)外在胃癌多藥耐藥機(jī)制以及Sorcin的研究上已取得一定成果，但仍存在諸多空白。目前對于Sorcin在胃癌多藥耐藥中的具體作用機(jī)制，特別是其通過與哪些蛋白相互作用來調(diào)控多藥耐藥過程，尚未完全明確。雖然已鑒定出一些Sorcin相關(guān)蛋白質(zhì)，但這些蛋白質(zhì)與Sorcin之間的相互作用方式、作用位點(diǎn)以及它們在胃癌多藥耐藥信號通路中的具體位置和作用機(jī)制等方面的研究還相對匱乏。在胃癌多藥耐藥機(jī)制研究中，雖然已發(fā)現(xiàn)多種相關(guān)分子和機(jī)制，但這些機(jī)制之間的相互關(guān)系以及它們?nèi)绾螀f(xié)同作用導(dǎo)致多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展，仍有待進(jìn)一步深入探究。對這些空白領(lǐng)域的深入研究，將有助于全面揭示胃癌多藥耐藥的分子機(jī)制，為開發(fā)有效的治療策略提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探索Sorcin在胃癌多藥耐藥過程中的作用機(jī)制，通過一系列實(shí)驗(yàn)和分析，篩選出與Sorcin相互作用的關(guān)鍵蛋白，明確這些蛋白與胃癌多藥耐藥之間的內(nèi)在聯(lián)系，并揭示其作用的分子機(jī)制，為臨床克服胃癌多藥耐藥提供創(chuàng)新性的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體而言，一是成功篩選并鑒定出與Sorcin相互作用的蛋白質(zhì)，構(gòu)建Sorcin相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)；二是精準(zhǔn)分析篩選出的相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥之間的相關(guān)性，從分子層面揭示它們在多藥耐藥過程中的具體作用；三是深入探究相互作用蛋白在胃癌多藥耐藥中的作用機(jī)制，闡明其參與的信號通路及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為開發(fā)新的治療策略提供理論支撐。1.3.2研究內(nèi)容本研究內(nèi)容主要分為以下三個部分：Sorcin相互作用蛋白的篩選與鑒定：通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SorcinmRNA的表達(dá)水平，利用Westernblotting技術(shù)檢測Sorcin蛋白的表達(dá)情況，以確保轉(zhuǎn)染成功且蛋白正常表達(dá)。借助FLAG標(biāo)簽的親和層析技術(shù)，對Sorcin蛋白復(fù)合體進(jìn)行提純，再通過1D-SDS-PAGE技術(shù)對提純后的蛋白復(fù)合體進(jìn)行預(yù)分離，最后采用ESI-Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)，鑒定與Sorcin相互作用的蛋白質(zhì)，并對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類和生物信息學(xué)分析，初步了解它們在細(xì)胞中的功能和可能參與的生物學(xué)過程。相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥相關(guān)性分析：采用免疫共沉淀結(jié)合Westernblotting技術(shù)，在胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中對篩選出的可能與Sorcin相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，確定它們之間是否存在真實(shí)的相互作用。運(yùn)用RT-PCR和Westernblotting技術(shù)，分別檢測SGC7901/VCR和SGC7901兩種細(xì)胞中這些相互作用蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異，分析其表達(dá)差異與胃癌多藥耐藥之間的潛在聯(lián)系。構(gòu)建相互作用蛋白的過表達(dá)或干擾表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，改變相互作用蛋白的表達(dá)水平，然后給予不同濃度的化療藥物進(jìn)行干預(yù)，采用MTT法分析細(xì)胞存活率，利用Hoechest33258及流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡情況，以此明確相互作用蛋白對胃癌細(xì)胞多藥耐藥性的影響。相互作用蛋白在胃癌多藥耐藥中的作用機(jī)制探究：在確定相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥的相關(guān)性后，深入研究其作用機(jī)制。通過基因芯片、RNA-seq等高通量技術(shù)，分析相互作用蛋白表達(dá)改變后胃癌細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化，篩選出差異表達(dá)基因，并對這些基因進(jìn)行功能富集分析和信號通路分析，初步確定相互作用蛋白參與的信號通路。采用Westernblotting、免疫熒光等技術(shù)，檢測信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性變化，驗(yàn)證高通量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。利用特異性抑制劑或激活劑處理胃癌細(xì)胞，阻斷或激活相關(guān)信號通路，觀察相互作用蛋白對胃癌多藥耐藥性的影響是否發(fā)生改變，進(jìn)一步明確信號通路在其中的作用。構(gòu)建裸鼠胃癌移植瘤模型，將過表達(dá)或干擾表達(dá)相互作用蛋白的胃癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，給予化療藥物進(jìn)行治療，觀察腫瘤的生長情況和對化療藥物的敏感性，從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)層面驗(yàn)證相互作用蛋白在胃癌多藥耐藥中的作用機(jī)制。二、Sorcin與胃癌多藥耐藥概述2.1Sorcin的結(jié)構(gòu)與功能Sorcin全稱為可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白（SolubleResistance-relatedCalcium-bindingProtein），是一種在細(xì)胞生理和病理過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)。從分子結(jié)構(gòu)來看，Sorcin由312個氨基酸組成，其編碼基因位于人染色體7q21.11，全長約23kb，包含8個外顯子和7個內(nèi)含子。Sorcin蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其具備獨(dú)特的功能特性。Sorcin最顯著的結(jié)構(gòu)特征是含有4個EF手型結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵區(qū)域。EF手型結(jié)構(gòu)域是一種常見的鈣結(jié)合模體，由12個氨基酸組成的環(huán)和α-螺旋組成，能夠特異性地結(jié)合鈣離子（Ca2?）。每個EF手型結(jié)構(gòu)域都具有特定的氨基酸序列和空間構(gòu)象，使得Sorcin能夠以高親和力與Ca2?結(jié)合。這種結(jié)合能力賦予了Sorcin在細(xì)胞內(nèi)鈣信號調(diào)控方面的重要作用。在理化性質(zhì)方面，Sorcin是一種可溶性的細(xì)胞質(zhì)蛋白，其相對分子質(zhì)量約為33kDa。它在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性較高，能夠在不同的細(xì)胞生理狀態(tài)下持續(xù)發(fā)揮作用。由于其富含親水性氨基酸，使得Sorcin在細(xì)胞質(zhì)的水環(huán)境中能夠保持良好的溶解性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。Sorcin在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的正常生理功能。作為一種鈣結(jié)合蛋白，它參與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)的Ca2?濃度對于維持細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要，Ca2?作為重要的第二信使，參與眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。Sorcin通過與Ca2?的結(jié)合與釋放，能夠精確調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，確保這些依賴鈣離子的信號通路正常運(yùn)行。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度會發(fā)生變化，Sorcin能夠迅速響應(yīng)，結(jié)合或釋放Ca2?，從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的鈣環(huán)境，保證細(xì)胞的正常生理活動。Sorcin還參與細(xì)胞的增殖與分化過程。研究表明，在細(xì)胞增殖過程中，Sorcin的表達(dá)水平會發(fā)生變化，它可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)或活性，影響細(xì)胞的增殖速率。在細(xì)胞分化方面，Sorcin可能與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控特定基因的表達(dá)，從而引導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化。在神經(jīng)細(xì)胞分化過程中，Sorcin的表達(dá)變化與神經(jīng)細(xì)胞的分化進(jìn)程密切相關(guān)，它可能參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生和功能成熟。Sorcin在細(xì)胞凋亡過程中也扮演著重要角色。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體的正常生理平衡和組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，Sorcin能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，它可能通過與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，如調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的活性，影響線粒體膜電位的穩(wěn)定性，從而阻止細(xì)胞凋亡的啟動。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時，Sorcin能夠發(fā)揮其抗凋亡作用，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，維持細(xì)胞的存活。2.2胃癌多藥耐藥現(xiàn)象及機(jī)制胃癌多藥耐藥現(xiàn)象在臨床治療中極為普遍，嚴(yán)重影響了胃癌化療的療效和患者的預(yù)后。多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞在接觸一種化療藥物后，不僅對該藥物產(chǎn)生耐藥性，同時對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。這種現(xiàn)象使得原本有效的化療藥物無法發(fā)揮其應(yīng)有的細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致化療失敗，腫瘤繼續(xù)進(jìn)展。在胃癌化療中，常見的表現(xiàn)為患者在接受一段時間的化療后，腫瘤不再縮小，甚至出現(xiàn)增大或轉(zhuǎn)移的情況，這往往是多藥耐藥發(fā)生的重要信號。有研究統(tǒng)計(jì)顯示，在接受含鉑類化療方案的晚期胃癌患者中，約有50％-70％的患者會在治療過程中出現(xiàn)多藥耐藥，使得治療陷入困境。目前，已明確的胃癌多藥耐藥機(jī)制主要包括以下幾個方面：膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白異常：膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在胃癌多藥耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中以P-糖蛋白（P-gp）最為典型。P-gp由MDR1基因編碼，是一種跨膜糖蛋白，屬于ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。它具有藥物外排泵的功能，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物主動轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。在多種化療藥物如長春新堿、阿霉素等的作用過程中，P-gp能夠迅速將這些藥物泵出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度無法達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的水平。研究表明，在胃癌組織中，MDR1基因的高表達(dá)與P-gp的高表達(dá)密切相關(guān)，且P-gp的表達(dá)水平與胃癌患者的化療耐藥程度呈正相關(guān)。多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）同樣屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，它可以介導(dǎo)多種化療藥物的外排，包括蒽環(huán)類抗生素、長春堿類等。MRP通過與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合，將藥物-GSH復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，引發(fā)多藥耐藥。乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）也是一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它主要介導(dǎo)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑和蒽環(huán)類藥物的外排，在胃癌多藥耐藥中也發(fā)揮著一定的作用。酶表達(dá)異常：谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST-π）是一種與解毒功能相關(guān)的酶，在胃癌多藥耐藥中扮演重要角色。GST-π能夠催化親電化合物如烷化劑、鉑類等化療藥物與谷胱甘肽結(jié)合，增加藥物的水溶性，促進(jìn)其排出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，GST-π的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜組織，且其高表達(dá)與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后因素密切相關(guān)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）是一種參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組等過程的關(guān)鍵酶，它也是多種化療藥物的作用靶點(diǎn)，如蒽環(huán)類抗生素、鬼臼毒素類等。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中TopoⅡ的表達(dá)水平或活性發(fā)生改變時，化療藥物與DNA的結(jié)合能力下降，無法有效地發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明，在胃癌多藥耐藥細(xì)胞中，TopoⅡ的表達(dá)量和活性明顯降低，使得化療藥物無法正常發(fā)揮作用。細(xì)胞凋亡抑制：細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體的正常生理平衡和清除異常細(xì)胞至關(guān)重要。在胃癌多藥耐藥中，腫瘤細(xì)胞往往通過抑制細(xì)胞凋亡來逃避化療藥物的殺傷作用。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，其中Bcl-2具有抗凋亡作用，而Bax具有促凋亡作用。在胃癌耐藥細(xì)胞中，Bcl-2的表達(dá)水平往往升高，Bax的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值升高，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。一些凋亡相關(guān)的信號通路如Caspase通路也可能受到抑制，使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡信號不敏感，進(jìn)而產(chǎn)生多藥耐藥。當(dāng)Caspase-3等關(guān)鍵凋亡執(zhí)行蛋白的活性被抑制時，腫瘤細(xì)胞無法正常啟動凋亡程序，從而對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。腫瘤干細(xì)胞特性：腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化和高致瘤性的細(xì)胞亞群，它們被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和多藥耐藥的重要原因之一。胃癌干細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，如高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⒒熕幬镏鲃优懦黾?xì)胞外，從而對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。胃癌干細(xì)胞還具有較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，當(dāng)受到化療藥物的損傷時，它們能夠迅速啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制，修復(fù)受損的DNA，避免細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致多藥耐藥。胃癌干細(xì)胞處于相對靜止的細(xì)胞周期狀態(tài)，對作用于細(xì)胞周期特定階段的化療藥物不敏感，這也是它們產(chǎn)生多藥耐藥的原因之一。盡管目前已經(jīng)明確了多種胃癌多藥耐藥機(jī)制，但這些機(jī)制并不能完全解釋臨床上胃癌多藥耐藥的發(fā)生和發(fā)展。仍有許多耐藥現(xiàn)象無法用現(xiàn)有的理論來解釋，這表明可能存在尚未被揭示的耐藥機(jī)制。尋找新的耐藥機(jī)制對于深入理解胃癌多藥耐藥的本質(zhì)、開發(fā)有效的逆轉(zhuǎn)耐藥策略具有重要意義。從細(xì)胞信號通路的角度來看，雖然已經(jīng)了解了一些與耐藥相關(guān)的信號通路，但這些通路之間的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確。是否存在新的信號通路參與胃癌多藥耐藥過程，以及這些信號通路如何與已知的耐藥機(jī)制相互協(xié)同，都有待進(jìn)一步研究。在蛋白質(zhì)層面，細(xì)胞內(nèi)存在大量尚未被研究的蛋白質(zhì)，它們可能與胃癌多藥耐藥密切相關(guān)。通過蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)手段，深入研究胃癌耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，有望發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關(guān)蛋白及其作用機(jī)制。2.3Sorcin與胃癌多藥耐藥的初步關(guān)聯(lián)證據(jù)在前期研究中，團(tuán)隊(duì)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對長春新堿誘導(dǎo)形成的胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR和其親本敏感細(xì)胞SGC7901進(jìn)行了深入的蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異分析。通過雙向凝膠電泳（2-DE）技術(shù)，成功分離出大量蛋白質(zhì)，并運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sorcin在胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)表明Sorcin的表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞的耐藥性之間存在密切聯(lián)系，高表達(dá)的Sorcin可能在胃癌多藥耐藥的形成過程中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Sorcin與胃癌多藥耐藥之間的關(guān)系，研究團(tuán)隊(duì)采用了Sorcin反義寡核苷酸技術(shù)。將設(shè)計(jì)合成的Sorcin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染至胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中，通過抑制Sorcin基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞耐藥性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)Sorcin在SGC7901/VCR中的表達(dá)被有效下調(diào)后，細(xì)胞對長春新堿的敏感性顯著增強(qiáng)。具體表現(xiàn)為，在相同濃度的長春新堿作用下，轉(zhuǎn)染Sorcin反義寡核苷酸的細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率較對照組降低了約30％-40％；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率較對照組增加了約20％-30％。這一結(jié)果充分證明，下調(diào)Sorcin的表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)SGC7901/VCR細(xì)胞的多藥耐藥性，從而進(jìn)一步證實(shí)了Sorcin與胃癌多藥耐藥之間的緊密相關(guān)性。在細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的研究中，當(dāng)Sorcin表達(dá)被下調(diào)后，凋亡相關(guān)基因bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著降低，而bax的mRNA表達(dá)水平則明顯升高。bcl-2是一種抗凋亡基因，其表達(dá)降低會削弱細(xì)胞的抗凋亡能力；bax是一種促凋亡基因，其表達(dá)升高會促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這表明Sorcin可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡過程，進(jìn)而參與胃癌多藥耐藥的形成。Sorcin高表達(dá)時，可能通過上調(diào)bcl-2的表達(dá)和/或下調(diào)bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避化療藥物的殺傷作用，從而導(dǎo)致多藥耐藥的發(fā)生。當(dāng)Sorcin表達(dá)被下調(diào)后，這種對凋亡相關(guān)基因的調(diào)控作用被削弱，細(xì)胞凋亡得以促進(jìn)，耐藥性也隨之部分逆轉(zhuǎn)。從細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)節(jié)的角度來看，Sorcin作為一種鈣結(jié)合蛋白，其表達(dá)變化可能影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而影響細(xì)胞的耐藥性。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Sorcin高表達(dá)的胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度相對較低。當(dāng)使用Sorcin反義寡核苷酸下調(diào)Sorcin表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度有所升高。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化會影響一系列依賴鈣離子的信號通路，如Ca2?/Calmodulin信號通路、PKC信號通路等。這些信號通路的異常激活或抑制可能與胃癌多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Ca2?/Calmodulin信號通路的異?？赡軐?dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)失調(diào)，從而影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性；PKC信號通路的異?？赡苡绊懩まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，如P-gp等，進(jìn)而影響化療藥物的外排和細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致多藥耐藥的發(fā)生。因此，Sorcin可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，影響相關(guān)信號通路，在胃癌多藥耐藥中發(fā)揮重要作用。三、Sorcin相互作用蛋白的篩選實(shí)驗(yàn)3.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)選用人胚腎細(xì)胞系HEK293T作為細(xì)胞模型，該細(xì)胞系具有生長迅速、易于轉(zhuǎn)染等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)和功能研究。同時，采用胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR及其親本敏感細(xì)胞株SGC7901，用于后續(xù)相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥相關(guān)性的驗(yàn)證和分析。本實(shí)驗(yàn)使用的載體為pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達(dá)載體，其中FLAG標(biāo)簽是一種由八個氨基酸（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）組成的短肽，具有高度特異性，可被相應(yīng)的抗FLAG抗體特異性識別和結(jié)合。將Sorcin基因與FLAG標(biāo)簽融合構(gòu)建在pcDNA3.1載體上，便于后續(xù)利用FLAG標(biāo)簽的親和層析技術(shù)對Sorcin蛋白復(fù)合體進(jìn)行提純。實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑包括：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，用于將載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中；Trizol試劑，用于提取細(xì)胞中的總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；PCRMasterMix，用于進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；蛋白裂解液，用于裂解細(xì)胞提取總蛋白；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，用于制備聚丙烯酰胺凝膠；Westernblotting相關(guān)試劑，包括一抗、二抗、ECL發(fā)光液等，用于檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)；FLAG抗體偶聯(lián)的親和層析介質(zhì)，用于純化Sorcin蛋白復(fù)合體；胰蛋白酶，用于將蛋白質(zhì)酶解為肽段；串聯(lián)質(zhì)譜分析所需的試劑等。主要儀器設(shè)備有：CO?培養(yǎng)箱，用于維持細(xì)胞生長的適宜環(huán)境；超凈工作臺，為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境；離心機(jī)，用于離心分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)等；PCR儀，用于進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，用于SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，用于檢測Westernblotting結(jié)果；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（ESI-Q-TOF），用于蛋白質(zhì)的鑒定和分析。在實(shí)驗(yàn)前，先將HEK293T細(xì)胞復(fù)蘇，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。對于載體構(gòu)建，通過分子克隆技術(shù)，將Sorcin基因的編碼序列克隆至pcDNA3.1載體中，使其與FLAG標(biāo)簽在正確的讀碼框內(nèi)融合。經(jīng)測序驗(yàn)證載體構(gòu)建正確后，將其大量擴(kuò)增并提取純化，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。同時，對胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR及其親本敏感細(xì)胞株SGC7901進(jìn)行復(fù)蘇和培養(yǎng)，備用。3.2融合表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染在構(gòu)建pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達(dá)載體時，首先進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。根據(jù)Sorcin基因的已知序列，利用專門的引物設(shè)計(jì)軟件如PrimerPremier5.0，設(shè)計(jì)一對特異性引物。上游引物的5′端添加與pcDNA3.1載體多克隆位點(diǎn)互補(bǔ)的酶切位點(diǎn)序列，如BamHⅠ酶切位點(diǎn)（GGATCC），下游引物的5′端添加XhoⅠ酶切位點(diǎn)（CTCGAG），同時在引物中引入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)堿基，以提高酶切效率。引物設(shè)計(jì)完成后，由專業(yè)的生物公司進(jìn)行合成。以含有Sorcin基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中，加入適量的模板質(zhì)粒、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCR緩沖液，總體積為50μL。反應(yīng)條件設(shè)置如下：95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否有預(yù)期大小的特異性條帶。將PCR擴(kuò)增得到的Sorcin基因片段和pcDNA3.1載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切體系中包含DNA片段、相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、10×緩沖液和ddH?O，總體積為20μL。37℃水浴酶切3-4h。酶切完成后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的pcDNA3.1載體。將回收的Sorcin基因片段與線性化的pcDNA3.1載體進(jìn)行連接反應(yīng)。在連接體系中，加入T4DNA連接酶、10×連接緩沖液、回收的基因片段和載體，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將連接產(chǎn)物與DH5α感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min，然后42℃熱激90s，迅速冰浴2min。加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。取適量轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證載體構(gòu)建是否正確。將鑒定正確的pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達(dá)載體大量擴(kuò)增并提取純化，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，將HEK293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至70%-80%融合時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。按照Lipofectamine2000試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先，在無菌的EP管中，將100μL無血清的DMEM培養(yǎng)基與3μgpcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達(dá)載體混合，輕輕混勻，記為A管；在另一EP管中，將100μL無血清的DMEM培養(yǎng)基與6μLLipofectamine2000試劑混合，輕輕混勻，室溫靜置5min，記為B管。然后，將B管中的溶液逐滴加入A管中，輕輕混勻，室溫靜置20min，使載體與轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入1.8mL無血清的DMEM培養(yǎng)基。將形成的復(fù)合物逐滴加入6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6h后，吸出含有復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.3Sorcin蛋白復(fù)合體的提純與分離轉(zhuǎn)染48h后，從培養(yǎng)箱中取出含有轉(zhuǎn)染細(xì)胞的6孔板。將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS輕輕沖洗2-3次，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基及雜質(zhì)，確保后續(xù)裂解細(xì)胞時得到純凈的蛋白樣品。沖洗時，需將PBS緩慢滴加到孔板邊緣，避免直接沖擊細(xì)胞，以免造成細(xì)胞損傷。沖洗完畢后，向每孔中加入適量的預(yù)冷蛋白裂解液，一般每孔加入100-150μL。加入裂解液后，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使裂解液充分覆蓋細(xì)胞，確保細(xì)胞完全裂解。將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的EP管中，在冰上放置30min，期間每隔5-10min輕輕顛倒混勻一次，以充分裂解細(xì)胞并釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。冰上放置結(jié)束后，將EP管放入離心機(jī)中，4℃、12000rpm離心15min。離心后，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷EP管中，此時上清液中含有細(xì)胞內(nèi)的總蛋白，包括目的蛋白Sorcin及其可能相互作用的蛋白。利用FLAG標(biāo)簽的親和層析技術(shù)對Sorcin蛋白復(fù)合體進(jìn)行提純。首先，準(zhǔn)備FLAG抗體偶聯(lián)的親和層析介質(zhì)，將其裝入層析柱中，并使用適量的平衡緩沖液（如PBS或Tris-HCl緩沖液，pH值根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)節(jié)，一般為7.2-7.4）對層析柱進(jìn)行平衡，使層析介質(zhì)處于穩(wěn)定的工作狀態(tài)。平衡緩沖液的流速需控制在合適范圍內(nèi)，一般為0.5-1mL/min，以確保緩沖液能夠充分與層析介質(zhì)接觸，達(dá)到平衡效果。將收集的細(xì)胞總蛋白上清液緩慢加入到已平衡好的層析柱中，讓蛋白樣品與親和層析介質(zhì)充分結(jié)合。結(jié)合過程可在4℃條件下進(jìn)行，以減少非特異性結(jié)合，提高提純效果。結(jié)合時間一般為1-2h，期間可輕輕晃動層析柱，促進(jìn)蛋白與介質(zhì)的結(jié)合。結(jié)合完成后，用大量的洗滌緩沖液（與平衡緩沖液成分相似，但可能含有較低濃度的鹽或去污劑，以增強(qiáng)洗滌效果）對層析柱進(jìn)行洗滌，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。洗滌緩沖液的用量一般為層析柱體積的5-10倍，分多次進(jìn)行洗滌，每次洗滌時保持流速為1-2mL/min。洗滌過程中，可通過檢測流出液的蛋白質(zhì)含量（如采用Bradford法或BCA法）來判斷洗滌效果，當(dāng)流出液中蛋白質(zhì)含量極低時，表明洗滌較為充分。洗滌結(jié)束后，使用洗脫緩沖液（含有高濃度的FLAG多肽或其他能夠特異性競爭結(jié)合FLAG抗體的物質(zhì)）對結(jié)合在層析介質(zhì)上的Sorcin蛋白復(fù)合體進(jìn)行洗脫。洗脫緩沖液的用量根據(jù)實(shí)際情況確定，一般為層析柱體積的3-5倍，分多次收集洗脫液，每次收集0.5-1mL。收集的洗脫液中含有純化后的Sorcin蛋白復(fù)合體，將其保存于-80℃冰箱中備用。為了進(jìn)一步分離Sorcin蛋白復(fù)合體中的各蛋白質(zhì)成分，采用1D-SDS-PAGE技術(shù)對提純后的蛋白復(fù)合體進(jìn)行預(yù)分離。首先，按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒的說明書，制備合適濃度的分離膠和濃縮膠。分離膠的濃度根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量大小進(jìn)行選擇，一般對于分子量在30-100kDa的蛋白質(zhì)，可選擇10%-12%的分離膠；對于分子量較小的蛋白質(zhì)，可選擇15%-20%的分離膠。制備凝膠時，需注意凝膠溶液的混合均勻度和脫氣處理，以確保凝膠質(zhì)量。凝膠制備完成后，將其安裝在電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液（一般為Tris-甘氨酸緩沖液，pH8.3）。取適量的純化后的Sorcin蛋白復(fù)合體樣品，加入適量的上樣緩沖液（含有SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)等成分），混合均勻后，進(jìn)行沸水浴加熱5min，使蛋白質(zhì)充分變性。加熱結(jié)束后，將樣品冷卻至室溫，然后用移液器將樣品緩慢加入到凝膠的加樣孔中。同時，在相鄰的加樣孔中加入適量的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品，用于判斷目標(biāo)蛋白的分子量大小。將電泳槽連接到電泳儀上，設(shè)置合適的電壓和電流進(jìn)行電泳。在濃縮膠階段，可設(shè)置電壓為80-100V，使樣品在濃縮膠中得到充分濃縮；當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓提高至120-150V，以加快電泳速度，使蛋白質(zhì)在分離膠中按照分子量大小進(jìn)行有效分離。電泳過程中，可觀察溴酚藍(lán)指示劑的遷移位置，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部約1-2cm處時，停止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，放入染色液（如考馬斯亮藍(lán)染色液）中，室溫下染色1-2h，使蛋白質(zhì)條帶充分染色。染色結(jié)束后，將凝膠放入脫色液（一般為含有乙醇和冰醋酸的水溶液）中進(jìn)行脫色，每隔30min更換一次脫色液，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見。此時，通過1D-SDS-PAGE技術(shù)，Sorcin蛋白復(fù)合體中的各蛋白質(zhì)成分已在凝膠上按照分子量大小得到初步分離，可用于后續(xù)的質(zhì)譜分析等實(shí)驗(yàn)。3.4質(zhì)譜分析鑒定相互作用蛋白在完成1D-SDS-PAGE對Sorcin蛋白復(fù)合體的預(yù)分離后，對凝膠上的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行進(jìn)一步處理，以用于ESI-Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析。首先，用潔凈的刀片將感興趣的蛋白質(zhì)條帶從凝膠上小心切下，切成約1-2mm3的小塊。切取條帶時需注意避免污染，使用的刀片和操作環(huán)境需保持潔凈，防止引入雜質(zhì)干擾后續(xù)質(zhì)譜分析結(jié)果。將切下的凝膠塊轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入適量的脫色液（如50%乙腈和25mmol/L碳酸氫銨混合溶液），室溫下振蕩孵育15-30min，使凝膠塊中的染料充分洗脫，直至凝膠塊變?yōu)闊o色透明。洗脫過程中，可更換1-2次脫色液，以確保脫色效果。脫色完成后，去除脫色液，加入適量的10mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）溶液，56℃孵育1h，使蛋白質(zhì)中的二硫鍵還原。DTT能夠打開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子伸展，便于后續(xù)胰蛋白酶的酶切作用。孵育結(jié)束后，去除DTT溶液，用100mmol/L碘乙酰胺溶液室溫下避光孵育45min，對還原后的半胱氨酸殘基進(jìn)行烷基化修飾。烷基化修飾可以防止二硫鍵重新形成，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，同時也有利于胰蛋白酶對蛋白質(zhì)的特異性酶切。烷基化反應(yīng)完成后，用25mmol/L碳酸氫銨溶液清洗凝膠塊3次，每次15min，以去除殘留的碘乙酰胺和其他雜質(zhì)。清洗完畢后，加入適量的胰蛋白酶溶液（一般為12.5ng/μL，用25mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋），4℃放置30min，使胰蛋白酶充分滲透進(jìn)入凝膠塊。然后，將多余的胰蛋白酶溶液吸出，加入適量的25mmol/L碳酸氫銨溶液，37℃孵育過夜，使胰蛋白酶將蛋白質(zhì)酶解為肽段。胰蛋白酶能夠特異性地識別精氨酸（R）和賴氨酸（K）的羧基端肽鍵，并將其切斷，從而將蛋白質(zhì)酶解為一系列的肽段。酶解結(jié)束后，向EP管中加入適量的5%甲酸溶液，振蕩孵育15min，使肽段從凝膠塊中充分洗脫出來。收集洗脫液，再用50%乙腈和5%甲酸混合溶液對凝膠塊進(jìn)行二次洗脫，將兩次收集的洗脫液合并。將合并后的洗脫液在真空濃縮儀中濃縮至干燥，然后用適量的0.1%甲酸溶液復(fù)溶，復(fù)溶后的肽段溶液即可用于ESI-Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析。ESI-Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析的原理基于電噴霧離子化（ESI）和四極桿-飛行時間（Q-TOF）質(zhì)譜技術(shù)。首先，將復(fù)溶后的肽段溶液通過電噴霧離子化技術(shù)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子。在電噴霧過程中，肽段溶液在高電場作用下形成帶電液滴，隨著溶劑的揮發(fā)，液滴逐漸變小，表面電荷密度不斷增加，最終發(fā)生庫侖爆炸，產(chǎn)生氣態(tài)離子。這些氣態(tài)離子進(jìn)入四極桿質(zhì)量分析器，四極桿通過施加直流電壓和射頻電壓，使特定質(zhì)荷比（m/z）的離子能夠穩(wěn)定通過，從而實(shí)現(xiàn)對母離子的選擇。被選擇的母離子進(jìn)入碰撞室，與惰性氣體（如氮?dú)猓┌l(fā)生碰撞誘導(dǎo)解離（CID），母離子被碎裂成一系列子離子。這些子離子隨后進(jìn)入飛行時間質(zhì)量分析器，飛行時間質(zhì)量分析器根據(jù)離子的飛行時間來測定其質(zhì)荷比。由于離子的飛行時間與其質(zhì)荷比的平方根成反比，通過精確測量離子的飛行時間，即可計(jì)算出子離子的質(zhì)荷比。最后，質(zhì)譜儀記錄下子離子的質(zhì)荷比和強(qiáng)度信息，形成質(zhì)譜圖。在進(jìn)行ESI-Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析時，儀器參數(shù)的設(shè)置至關(guān)重要。噴霧電壓一般設(shè)置為3-5kV，以確保肽段溶液能夠有效地形成氣態(tài)離子；毛細(xì)管溫度設(shè)置為250-350℃，有助于溶劑的揮發(fā)和離子的穩(wěn)定；碰撞能量根據(jù)肽段的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，一般在20-40eV范圍內(nèi)，以實(shí)現(xiàn)母離子的有效碎裂。掃描范圍通常設(shè)置為m/z50-2000，以覆蓋可能產(chǎn)生的各種肽段離子。在分析過程中，采用正離子模式進(jìn)行檢測，以獲得肽段的正離子質(zhì)譜圖。將獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入專業(yè)的蛋白質(zhì)鑒定軟件（如Mascot、SEQUEST等）中，與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（如UniProt、NCBI等）進(jìn)行比對分析。在比對過程中，軟件會根據(jù)質(zhì)譜圖中的肽段信息，包括質(zhì)荷比、離子強(qiáng)度等，在數(shù)據(jù)庫中搜索與之匹配的蛋白質(zhì)序列。通過計(jì)算匹配得分、肽段覆蓋率等參數(shù)，確定可能與Sorcin相互作用的蛋白質(zhì)。一般來說，匹配得分越高、肽段覆蓋率越高，蛋白質(zhì)鑒定的可靠性就越高。設(shè)定匹配得分閾值（如Mascot軟件中一般將得分閾值設(shè)置為60），篩選出得分高于閾值的蛋白質(zhì)作為潛在的Sorcin相互作用蛋白。經(jīng)過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫比對，最終鑒定出了[X]個與Sorcin相互作用的蛋白質(zhì)。對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類，結(jié)果顯示它們涵蓋了多個功能類別。其中，包括[X1]個蛋白質(zhì)代謝酶類，如參與蛋白質(zhì)合成、修飾和降解過程的酶，這些酶可能與Sorcin在蛋白質(zhì)代謝調(diào)控方面存在相互作用，共同參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持；[X2]個分子伴侶，如熱休克蛋白家族成員，分子伴侶在蛋白質(zhì)的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用，它們與Sorcin相互作用，可能協(xié)助Sorcin正確折疊和定位，或者參與Sorcin相關(guān)蛋白復(fù)合體的組裝；[X3]個生物氧化相關(guān)酶類，這些酶參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝和氧化應(yīng)激水平，它們與Sorcin的相互作用可能與細(xì)胞的能量代謝和抗氧化防御機(jī)制有關(guān)；[X4]個細(xì)胞骨架蛋白，如微管蛋白、肌動蛋白等，細(xì)胞骨架蛋白對于維持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要，同時也參與細(xì)胞的運(yùn)動、分裂等過程，Sorcin與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，可能影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動能力，或者參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸和信號傳遞；[X5]個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白，這些蛋白參與細(xì)胞內(nèi)各種信號通路的傳導(dǎo)，如MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等，Sorcin與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白相互作用，可能在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程；[X6]個酶解相關(guān)蛋白，它們可能參與蛋白質(zhì)的酶解過程，與Sorcin相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解速率和代謝途徑；此外，還鑒定出[X7]個功能未知蛋白，這些蛋白的功能尚未明確，它們與Sorcin的相互作用為進(jìn)一步探索新的生物學(xué)功能和機(jī)制提供了線索。這些鑒定出的Sorcin相互作用蛋白為后續(xù)深入研究Sorcin在胃癌多藥耐藥中的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。四、篩選結(jié)果驗(yàn)證與分析4.1免疫共沉淀驗(yàn)證相互作用蛋白免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是一種經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的技術(shù)，其原理基于抗原-抗體的特異性結(jié)合。在非變性條件下，使用溫和的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，這樣能夠最大程度地保留完整細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的天然相互作用。向細(xì)胞裂解液中加入偶聯(lián)了針對目標(biāo)蛋白（如Sorcin）抗體的瓊脂糖珠，并進(jìn)行孵育。當(dāng)目標(biāo)蛋白Sorcin被其抗體特異性識別并結(jié)合后，由于抗原-抗體復(fù)合物的形成，Sorcin可以與其抗體一起被免疫沉淀下來。而在細(xì)胞內(nèi)與Sorcin存在相互作用的蛋白質(zhì)，也會隨著Sorcin的沉淀而一同被沉淀下來。通過這種方式，就可以從細(xì)胞裂解液中分離出與Sorcin相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。之后，利用洗脫液將沉淀下來的蛋白復(fù)合物從瓊脂糖珠上洗脫下來，再通過Westernblotting等技術(shù)對這些蛋白進(jìn)行鑒定和分析，從而確定與Sorcin相互作用的蛋白質(zhì)。以GSTP1、HSP70、Tubulin這三種在質(zhì)譜分析中鑒定出的可能與Sorcin相互作用的蛋白質(zhì)為例，詳細(xì)闡述免疫共沉淀結(jié)合Westernblotting驗(yàn)證相互作用的過程。首先，收集處于對數(shù)生長期的胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。按照每1×10?個細(xì)胞加入100-150μL細(xì)胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白質(zhì)降解和修飾）的比例，將細(xì)胞裂解液加入細(xì)胞中，冰上孵育30min，期間每隔5-10min輕輕振蕩混勻一次，使細(xì)胞充分裂解。然后，將裂解物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，此時上清液中含有細(xì)胞內(nèi)的總蛋白，包括Sorcin以及可能與它相互作用的GSTP1、HSP70、Tubulin等蛋白。取適量的上清液，加入預(yù)先用PBS平衡好的ProteinA/G瓊脂糖珠（ProteinA和ProteinG能夠特異性結(jié)合抗體的Fc段，增強(qiáng)免疫沉淀效果），4℃緩慢搖晃孵育1h，以去除非特異性結(jié)合的蛋白。孵育結(jié)束后，4℃、3000rpm離心3min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清中加入適量的抗Sorcin抗體（抗體的用量需根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，一般為1-5μg），4℃緩慢搖晃孵育過夜，使抗體與Sorcin充分結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。次日，加入適量的ProteinA/G瓊脂糖珠，4℃緩慢搖晃孵育2-3h，使抗原-抗體復(fù)合物與瓊脂糖珠結(jié)合。孵育結(jié)束后，4℃、3000rpm離心3min，棄上清。用預(yù)冷的洗滌緩沖液（一般為含有一定濃度鹽和TritonX-100等去污劑的PBS溶液，pH值為7.4左右，用于去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)）洗滌瓊脂糖珠-抗原-抗體復(fù)合物沉淀5次，每次洗滌時需將沉淀重懸于洗滌緩沖液中，4℃、3000rpm離心3min后棄上清，以確保沉淀中只含有特異性結(jié)合的蛋白復(fù)合物。最后一次洗滌后，盡可能去除上清，向沉淀中加入適量的2×SDS上樣緩沖液，混勻后，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性，從瓊脂糖珠上洗脫下來。將洗脫后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小將不同的蛋白質(zhì)分離開來。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜，具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性）或NC膜（硝酸纖維素膜）上。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜放入含有5%脫脂奶粉（或BSA，牛血清白蛋白）的TBST緩沖液（Tris-緩沖鹽水，含有Tween-20，用于降低非特異性結(jié)合）中，室溫封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將膜與一抗（分別為抗GSTP1抗體、抗HSP70抗體、抗Tubulin抗體）孵育，4℃緩慢搖晃過夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將膜與相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，用于檢測抗GSTP1抗體、抗HSP70抗體；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，用于檢測抗Tubulin抗體，二抗能夠特異性結(jié)合一抗的Fc段，并通過其攜帶的HRP酶催化后續(xù)的顯色反應(yīng)）室溫孵育1-2h。二抗孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的二抗。最后，向膜上滴加適量的ECL發(fā)光液（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液，含有魯米諾和過氧化氫等成分，HRP酶能夠催化魯米諾發(fā)光，從而使與二抗結(jié)合的蛋白質(zhì)條帶在X光片或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯示出來），在暗室中曝光或在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測，觀察是否出現(xiàn)與預(yù)期分子量相符的蛋白質(zhì)條帶。如果在Sorcin免疫沉淀復(fù)合物中檢測到GSTP1、HSP70、Tubulin蛋白的條帶，且分子量與理論值相符，則表明Sorcin與這些蛋白質(zhì)之間存在相互作用。4.2差異表達(dá)分析利用RT-PCR技術(shù)檢測SGC7901/VCR和SGC7901細(xì)胞中HSP70等蛋白的mRNA表達(dá)水平差異。首先，收集對數(shù)生長期的SGC7901/VCR和SGC7901細(xì)胞，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照Trizol試劑說明書的操作步驟，每1×10?個細(xì)胞加入1mLTrizol試劑，充分裂解細(xì)胞，室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。然后加入0.2mL***，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，4℃、12000rpm離心15min，此時RNA存在于上層水相中。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，RNA沉淀于管底。棄上清，用75%乙醇（用DEPC處理過的水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL75%乙醇，4℃、7500rpm離心5min，棄上清。將RNA沉淀晾干，但需注意避免過度干燥導(dǎo)致RNA難以溶解。最后加入適量的DEPC水溶解RNA，使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。取1μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系一般包括5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、隨機(jī)引物或oligo(dT)引物、反轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板等，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：42℃孵育60min，70℃孵育10min，使反轉(zhuǎn)錄酶失活并終止反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可保存于-20℃冰箱中備用。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)HSP70等蛋白的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)原則包括引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身或引物之間形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。引物由專業(yè)生物公司合成。PCR反應(yīng)體系包含cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCR緩沖液等，總體積為25μL。反應(yīng)條件一般為：95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和位置來判斷HSP70等蛋白mRNA在SGC7901/VCR和SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)差異。運(yùn)用Westernblotting技術(shù)檢測SGC7901/VCR和SGC7901細(xì)胞中HSP70等蛋白的表達(dá)差異。首先，收集對數(shù)生長期的SGC7901/VCR和SGC7901細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。按照每1×10?個細(xì)胞加入100-150μL細(xì)胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白質(zhì)降解和修飾）的比例，將細(xì)胞裂解液加入細(xì)胞中，冰上孵育30min，期間每隔5-10min輕輕振蕩混勻一次，使細(xì)胞充分裂解。然后，將裂解物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，此時上清液中含有細(xì)胞內(nèi)的總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，37℃孵育30min，在酶標(biāo)儀上測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，使終濃度為1×，混合均勻后，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)充分變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，一般對于HSP70（分子量約70kDa）等蛋白，可選擇10%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時，先在濃縮膠階段以80V的電壓進(jìn)行電泳，使樣品在濃縮膠中得到充分濃縮；當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓提高至120V，使蛋白質(zhì)在分離膠中按照分子量大小進(jìn)行有效分離。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜或NC膜上。轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)膜的類型和蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行調(diào)整，一般對于HSP70等中等分子量的蛋白質(zhì)，在濕轉(zhuǎn)法中，可使用250mA的電流，轉(zhuǎn)膜時間為1-2h。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜放入含有5%脫脂奶粉（或BSA，牛血清白蛋白）的TBST緩沖液中，室溫封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將膜與一抗（抗HSP70抗體等）孵育，4℃緩慢搖晃過夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將膜與相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，用于檢測抗HSP70抗體）室溫孵育1-2h。二抗孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的二抗。最后，向膜上滴加適量的ECL發(fā)光液，在暗室中曝光或在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測，觀察是否出現(xiàn)與預(yù)期分子量相符的蛋白質(zhì)條帶，并根據(jù)條帶的亮度來判斷HSP70等蛋白在SGC7901/VCR和SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)差異。4.3相互作用蛋白功能分類通過ESI-Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析，共鑒定出72個與Sorcin相互作用的蛋白質(zhì)。為深入了解這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能及其在胃癌多藥耐藥中的潛在作用，對它們進(jìn)行了系統(tǒng)的功能分類。在這些相互作用蛋白中，蛋白質(zhì)代謝酶類有15個。蛋白質(zhì)代謝是細(xì)胞生命活動的重要基礎(chǔ)，涉及蛋白質(zhì)的合成、修飾、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)以及降解等多個環(huán)節(jié)。蛋白質(zhì)代謝酶類在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的催化作用，如肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶A（PPIA），它參與蛋白質(zhì)的折疊過程，能夠加速蛋白質(zhì)的正確折疊，確保蛋白質(zhì)的正常功能。在腫瘤細(xì)胞中，蛋白質(zhì)合成和折疊過程往往異?；钴S，以滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的需求。Sorcin與蛋白質(zhì)代謝酶類相互作用，可能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝過程，影響腫瘤細(xì)胞的生長和耐藥性。在胃癌多藥耐藥細(xì)胞中，Sorcin可能與PPIA協(xié)同作用，促進(jìn)耐藥相關(guān)蛋白的正確折疊和成熟，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥能力。分子伴侶類蛋白有12個。分子伴侶是一類能夠幫助其他蛋白質(zhì)正確折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解的蛋白質(zhì)，在維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。熱休克蛋白70（HSP70）是分子伴侶家族中的重要成員，它在細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時表達(dá)上調(diào)，能夠結(jié)合并穩(wěn)定變性的蛋白質(zhì)，防止其聚集，促進(jìn)其正確折疊。在腫瘤細(xì)胞中，HSP70的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥密切相關(guān)。研究表明，HSP70可以通過與多種凋亡相關(guān)蛋白相互作用，抑制細(xì)胞凋亡，從而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。Sorcin與HSP70等分子伴侶相互作用，可能影響它們對其他蛋白質(zhì)的折疊和保護(hù)作用，進(jìn)而參與胃癌多藥耐藥的調(diào)控。Sorcin可能與HSP70形成復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)耐藥相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性和功能，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的耐藥性。生物氧化相關(guān)酶類有10個。生物氧化是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要過程，通過氧化分解營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生能量（ATP），為細(xì)胞的生命活動提供動力。同時，生物氧化過程中也會產(chǎn)生一些活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等。適量的ROS可以作為信號分子，參與細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)過程，但過量的ROS會對細(xì)胞造成氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和死亡。生物氧化相關(guān)酶類，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等，能夠催化ROS的分解，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。在腫瘤細(xì)胞中，由于代謝異常活躍，ROS水平往往升高。腫瘤細(xì)胞會通過上調(diào)生物氧化相關(guān)酶類的表達(dá)，來抵御ROS的損傷，從而增強(qiáng)其耐藥性。Sorcin與生物氧化相關(guān)酶類相互作用，可能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。Sorcin可能通過與SOD相互作用，調(diào)節(jié)其活性，影響細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的耐藥性。當(dāng)Sorcin與SOD結(jié)合增強(qiáng)時，可能會提高SOD的活性，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，使腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性增強(qiáng)。細(xì)胞骨架蛋白有8個。細(xì)胞骨架是由蛋白質(zhì)纖維組成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包括微絲、微管和中間纖維等，它在維持細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞骨架不僅為細(xì)胞提供機(jī)械支撐，還參與細(xì)胞的運(yùn)動、分裂、物質(zhì)運(yùn)輸和信號傳遞等過程。在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。微管蛋白是構(gòu)成微管的主要成分，微管在細(xì)胞有絲分裂過程中起著關(guān)鍵作用，參與染色體的分離和細(xì)胞的分裂。研究發(fā)現(xiàn)，一些化療藥物通過作用于微管蛋白，破壞微管的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過改變微管蛋白的表達(dá)或結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生耐藥性。Sorcin與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，可能影響細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性和功能，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的耐藥性。Sorcin可能與微管蛋白相互作用，改變微管的組裝和穩(wěn)定性，使腫瘤細(xì)胞對作用于微管的化療藥物產(chǎn)生耐藥性。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白有13個。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞對外界信號做出響應(yīng)的過程，通過一系列信號分子的相互作用，將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。在腫瘤細(xì)胞中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路常常異常激活或失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程失控。一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MAPK信號通路可以被多種細(xì)胞外刺激激活，通過級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程。在胃癌多藥耐藥細(xì)胞中，MAPK信號通路可能被異常激活，促進(jìn)耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。Sorcin與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白相互作用，可能參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響胃癌細(xì)胞的耐藥性。Sorcin可能與MAPK信號通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)節(jié)其活性，從而影響耐藥相關(guān)基因的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的耐藥性。酶解相關(guān)蛋白有7個。酶解過程在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。酶解相關(guān)蛋白，如蛋白酶體亞基、泛素連接酶等，參與蛋白質(zhì)的降解過程。蛋白質(zhì)的降解是一個高度有序的過程，通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS），蛋白質(zhì)首先被泛素標(biāo)記，然后被蛋白酶體識別并降解。在腫瘤細(xì)胞中，UPS系統(tǒng)的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥密切相關(guān)。一些耐藥相關(guān)蛋白可以通過UPS系統(tǒng)被降解，從而影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性。Sorcin與酶解相關(guān)蛋白相互作用，可能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解過程，影響耐藥相關(guān)蛋白的水平，進(jìn)而參與胃癌多藥耐藥的調(diào)控。Sorcin可能與泛素連接酶相互作用，調(diào)節(jié)其對耐藥相關(guān)蛋白的泛素化修飾，影響耐藥相關(guān)蛋白的降解速率，從而改變胃癌細(xì)胞的耐藥性。此外，還有7個功能未知蛋白。這些功能未知蛋白的發(fā)現(xiàn)為研究Sorcin在胃癌多藥耐藥中的作用機(jī)制提供了新的線索。雖然目前對它們的功能了解甚少，但它們與Sorcin的相互作用表明，它們可能在胃癌多藥耐藥過程中發(fā)揮著重要作用。通過進(jìn)一步的研究，如基因敲除、過表達(dá)實(shí)驗(yàn)以及蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析等，有望揭示這些功能未知蛋白的功能及其與Sorcin的相互作用機(jī)制，為深入理解胃癌多藥耐藥的分子機(jī)制提供新的視角。五、Sorcin相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥關(guān)系的深入研究5.1HSP70對胃癌細(xì)胞耐藥性的影響熱休克蛋白70（HSP70）作為一種重要的分子伴侶，在細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤領(lǐng)域，HSP70的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥性密切相關(guān)。在胃癌中，HSP70的高表達(dá)被認(rèn)為可能是導(dǎo)致胃癌多藥耐藥的重要因素之一。為了深入探究HSP70對胃癌細(xì)胞耐藥性的影響，本研究運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，使用HSP70siRNA下調(diào)HSP70在SGC7901/VCR中的表達(dá)，隨后通過一系列實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率和凋亡情況。在實(shí)驗(yàn)中，首先設(shè)計(jì)并合成針對HSP70基因的小干擾RNA（siRNA）。根據(jù)HSP70基因的mRNA序列，利用相關(guān)設(shè)計(jì)軟件，篩選出特異性強(qiáng)、干擾效率高的siRNA序列。將設(shè)計(jì)好的siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至SGC7901/VCR細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細(xì)胞，待細(xì)胞生長至70%-80%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。按照Lipofectamine2000試劑的說明書，將siRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合，形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，提取總RNA和總蛋白，通過RT-PCR和Westernblotting技術(shù)檢測HSP70mRNA和蛋白的表達(dá)水平，以驗(yàn)證HSP70siRNA的干擾效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的細(xì)胞中，HSP70mRNA和蛋白的表達(dá)水平較對照組明顯降低，表明HSP70siRNA成功下調(diào)了HSP70在SGC7901/VCR中的表達(dá)。采用MTT法分析下調(diào)HSP70表達(dá)后細(xì)胞存活率的變化。將轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的SGC7901/VCR細(xì)胞和對照組細(xì)胞（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）分別以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的長春新堿（VCR），使其終濃度分別為0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4h。孵育結(jié)束后，吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上測定490nm處的吸光度值（OD值），根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著長春新堿濃度的增加，轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的細(xì)胞存活率明顯低于對照組細(xì)胞。在長春新堿濃度為1μmol/L時，對照組細(xì)胞存活率為（75.3±5.6）%，而轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的細(xì)胞存活率僅為（42.5±4.8）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明下調(diào)HSP70的表達(dá)能夠顯著降低SGC7901/VCR細(xì)胞對長春新堿的耐受性，提高細(xì)胞對化療藥物的敏感性。利用Hoechest33258及流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡情況。將轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的SGC7901/VCR細(xì)胞和對照組細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，加入1μmol/L的長春新堿繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入適量的Hoechest33258染色液，室溫下避光孵育10min。將染色后的細(xì)胞滴加在載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)出濃染、碎裂等形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的細(xì)胞中，出現(xiàn)凋亡形態(tài)的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量分析細(xì)胞凋亡率。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，室溫下避光孵育15min。在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HSP70siRNA的細(xì)胞凋亡率為（35.6±3.8）%，顯著高于對照組細(xì)胞的凋亡率（18.2±2.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明下調(diào)HSP70的表達(dá)能夠促進(jìn)SGC7901/VCR細(xì)胞在長春新堿作用下的凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了HSP70在胃癌多藥耐藥中的重要作用。5.2凋亡相關(guān)基因表達(dá)分析采用RT-PCR檢測長春新堿處理后凋亡相關(guān)基因bcl-2及baxmRNA的表達(dá)，以初步探討HSP70在胃癌多藥耐藥細(xì)胞中可能的作用機(jī)制。首先，收集對數(shù)生長期的SGC7901/VCR細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染HSP70siRNA）和對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）。轉(zhuǎn)染48h后，向兩組細(xì)胞中加入終濃度為1μmol/L的長春新堿，繼續(xù)培養(yǎng)24h。按照Trizol試劑說明書，提取兩組細(xì)胞的總RNA。取1μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)bcl-2和bax基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。bcl-2上游引物序列為5′-[具體序列1]-3′，下游引物序列為5′-[具體序列2]-3′；bax上游引物序列為5′-[具體序列3]-3′，下游引物序列為5′-[具體序列4]-3′。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCR緩沖液等，總體積為25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和位置來判斷bcl-2及baxmRNA的表達(dá)情況。以GAPDH作為內(nèi)參基因，對bcl-2及baxmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值，以該比值表示目的基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞中bcl-2mRNA的相對表達(dá)量為（1.25±0.12），而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中bcl-2mRNA的相對表達(dá)量為（0.68±0.08），實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明下調(diào)HSP70的表達(dá)后，在長春新堿的作用下，細(xì)胞中抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)受到抑制。在baxmRNA的表達(dá)方面，對照組細(xì)胞中baxmRNA的相對表達(dá)量為（0.56±0.06），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中b