熒光定量PCR試劑盒主講：劉偉

—1—細(xì)胞RNA提取一逆轉(zhuǎn)錄二熒光定量PCR試劑三

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1.材料與原理2.操作步驟一細(xì)胞RNA提取

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1.材料與原理樣品：293T細(xì)胞試劑：超純RNA提取試劑盒、氯仿、70%乙醇方法：柱式原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放。釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH和鹽濃度下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離。

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2.操作步驟細(xì)胞懸液離心，倒掉上清，加入1ml

RLT；反復(fù)吹打，使樣本充分裂解；室溫放置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離（1）裂解：（2）抽提：加入200ul氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2min；4℃12,000rpm離心10分鐘，此時樣品分為三層上層無色水相，中間白色蛋白質(zhì)相，下層紅色有機(jī)相，RNA在上層水相中

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（3）過柱子：

吸取上層水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中層）加入等體積70%的乙醇，顛倒混勻；將溶液全部加入到已裝入收集管（CollectionTube2ml)的吸附柱（SpinColumnRM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入；12,000rpm離心20s，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

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（4）洗滌：

向吸附柱加入700μl

Buffer

RW1，12,000rpm離心20s，倒掉收集管中的廢液，

將吸附柱重新放回收集管中；

向吸附柱中加入500μlBufferRW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），

12,000rpm離心20s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；重復(fù)步驟8；12,000rpm離心2min，棄廢液，吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干；

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（6）再洗滌：將吸附柱置于一個新的無RNase離心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的中間部位加入30-50μlRNase-FreeWater，室溫放置1min，12,000rpm離心1min，

收集RNA溶液，進(jìn)行后續(xù)試驗或-70℃保存RNA，防止降解。注意：1）RNase-FreeWate體積不應(yīng)小于30μl，體積過小影響回收率。

2）若提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50μl新的RNase-FreeWater重復(fù)步驟5。

3）若提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟5。

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（6）RNA檢測：用ddH2O，對儀器進(jìn)行調(diào)零；取1ul的RNA溶液進(jìn)行測定；測定樣品純度和濃度。純度：OD260/OD280=1.9-2.1<1.8蛋白質(zhì)或酚類污染>2.2RNA水解濃度：RNA(ug/ml)=40﹡OD260*稀釋倍數(shù)

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二逆轉(zhuǎn)錄1.材料2.步驟

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1.實驗材料：HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒，RNA2.實驗步驟：將RNA模板、PrimerMix、dNTPMix、DTT、RTBuffer、HiFi-MMLV和

RNase-

FreeWater溶解并置于冰上備用。根據(jù)以下表格配置反應(yīng)體系，總體積為20μl。

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試劑20μl反應(yīng)體系dNTPMix，2.5mMEach4μlPrimerMix2μlRNATemplate2μl5×RTBuffer4μlDTT，0.1M2μlHiFi-MMLV，200U/μl1μlRNase-FreeWater5

μl冰上配制短暫離心42℃50min70℃15min

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渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。42℃孵育30~50分鐘，70℃孵育15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR和熒光定量PCR，或置于-20℃長期保存。

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1.材料2.步驟三熒光定量PCR

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1.材料：2×UltraSYBRGreenMixture，cDNA，actin引物2.實驗步驟：稀釋模板：每稀釋一個倍數(shù)，需要將溶液混勻，并短暫離心。編號模板稀釋倍數(shù)水用量模板用量11倍0ul原液210倍45μl5μl（從1號管取）3100倍45μl5μl（從2號管?。?1000倍45μl5μl（從3號管取）510000倍45μl5μl（從4號管?。?45ul對照

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②配制PCR預(yù)混反應(yīng)體系：做5個樣本，配制8個樣本的預(yù)混體系，配制方式如下：試劑配制的8個孔的預(yù)混體系20μl反應(yīng)體系2×UltraSYBRMixture80μl10μlForwardPrimer，10μM6.4μl0.8μlReversePrimer，10μM人cDNA0μl2μlRNase-FreeWater57.6μl7.2

μl③將配制的預(yù)混體系，分裝到八連管中。共加6個孔，每個孔中加入18μl的預(yù)混體系。

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4.模板加入：每個孔中分別加入2μl模板，加樣順序如下：加樣孔123450樣品原液稀釋10倍稀釋100倍稀釋1000倍稀釋10000倍水加入體積2μl2μl2μl2μl2

μl2μl5.混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

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6.PCR反應(yīng)程序：步驟溫度時間預(yù)變性95℃10