4-1BB/4-1BBL在不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)及與胃癌免疫關(guān)系研究一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，在癌癥相關(guān)死亡原因中始終占據(jù)高位。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬(wàn)例，死亡病例約76.9萬(wàn)例，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第5位和第4位。盡管當(dāng)前針對(duì)胃癌已開(kāi)展了包括手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等多手段的綜合治療模式，在一定程度上提高了患者的生存率，但總體治療效果仍未取得重大突破，晚期胃癌患者的5年生存率依舊較低。腫瘤免疫逃逸被認(rèn)為是導(dǎo)致胃癌難以治愈的關(guān)鍵因素之一。人體的抗腫瘤免疫主要依賴于T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，T細(xì)胞活化需要雙信號(hào)刺激。第一信號(hào)源于T細(xì)胞抗原受體（TCR）與抗原提呈細(xì)胞（APC）上的抗原肽-MHC分子復(fù)合物結(jié)合；第二信號(hào)則由APC上的共刺激分子與T細(xì)胞上相應(yīng)配體相互作用產(chǎn)生。只有在雙信號(hào)同時(shí)存在的情況下，才能有效激活特異性T細(xì)胞，促使其完成細(xì)胞免疫過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。然而，大量研究表明，腫瘤細(xì)胞常常通過(guò)缺乏共刺激分子等方式，巧妙地逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別與攻擊，從而得以在體內(nèi)持續(xù)生長(zhǎng)和擴(kuò)散。4-1BB（CD137）和4-1BBL（CD137L）是除CD28/B7之外的另一對(duì)極為重要的協(xié)同刺激信號(hào)分子，在免疫應(yīng)答、腫瘤免疫以及自身免疫性疾病等多個(gè)生理和病理過(guò)程中均發(fā)揮著舉足輕重的作用。4-1BB屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，且以CD8+T細(xì)胞為主，此外，在單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）等細(xì)胞上也有表達(dá)。4-1BBL則屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員，主要表達(dá)于活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞以及一些腫瘤細(xì)胞上。4-1BB與4-1BBL之間的相互作用，在細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞粘附、抗原遞呈、T細(xì)胞共刺激以及信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮著不同的功能，尤為重要的是，它們介導(dǎo)的共刺激信號(hào)是激發(fā)有效的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答，特別是長(zhǎng)期抗腫瘤效應(yīng)所不可或缺的關(guān)鍵因素，這為腫瘤生物治療開(kāi)辟了嶄新的思路和途徑。深入探究4-1BB/4-1BBL在不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，具有多方面的重要意義。一方面，能夠進(jìn)一步揭示胃癌免疫逃逸的潛在機(jī)制，為從免疫角度理解胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程提供更為深入和全面的理論依據(jù)；另一方面，有助于為臨床胃癌的免疫治療提供關(guān)鍵的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)4-1BB/4-1BBL表達(dá)的研究，有望開(kāi)發(fā)出基于這對(duì)信號(hào)分子的新型免疫治療策略，為胃癌患者帶來(lái)新的治療希望和選擇，提升胃癌治療的整體效果和患者的生存質(zhì)量。1.2研究目的本研究旨在全面、深入地探究4-1BB/4-1BBL在不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)狀況。通過(guò)運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，精準(zhǔn)測(cè)定四種不同分化程度的人胃癌細(xì)胞株（MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803）中4-1BB、4-1BBL的mRNA表達(dá)水平，從基因轉(zhuǎn)錄層面揭示其表達(dá)特征。同時(shí)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法，直觀地檢測(cè)上述四種人胃癌細(xì)胞株中4-1BB、4-1BBL的蛋白表達(dá)情況，明確其在細(xì)胞中的定位和表達(dá)豐度。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用MTT法測(cè)定人淋巴細(xì)胞對(duì)上述四種人胃癌細(xì)胞株的體外殺傷活性，深入了解淋巴細(xì)胞對(duì)不同胃癌細(xì)胞的殺傷能力差異。并運(yùn)用ELISA法檢測(cè)人淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中淋巴因子TNF-α、IL-2、IL-10的含量變化，通過(guò)分析這些關(guān)鍵淋巴因子的水平波動(dòng)，全面探討4-1BB/4-1BBL共刺激信號(hào)的表達(dá)與胃癌免疫之間的內(nèi)在聯(lián)系，從而進(jìn)一步揭示腫瘤的免疫逃逸機(jī)制。本研究期望為臨床對(duì)胃癌的免疫治療提供堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)新型、有效的胃癌免疫治療策略奠定基礎(chǔ)，最終為改善胃癌患者的治療效果和生存質(zhì)量貢獻(xiàn)力量。二、4-1BB/4-1BBL相關(guān)理論基礎(chǔ)2.14-1BB/4-1BBL生物學(xué)特性2.1.14-1BB分子結(jié)構(gòu)與分布4-1BB（CD137），全名為腫瘤壞死因子受體超家族成員9（TNFRSF9），是一種在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的共刺激分子。其分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特，由一個(gè)I型跨膜受體構(gòu)成。從外到內(nèi)，依次包含四個(gè)富含半胱氨酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（CRD）、一個(gè)短的跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)C端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這四個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域?qū)τ?-1BB與配體的特異性結(jié)合以及后續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用，它們通過(guò)特定的空間構(gòu)象，精準(zhǔn)地識(shí)別并結(jié)合4-1BBL，從而啟動(dòng)下游的免疫反應(yīng)信號(hào)通路。而C端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域則是結(jié)合適應(yīng)蛋白的關(guān)鍵區(qū)域，這些適應(yīng)蛋白在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中充當(dāng)著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的橋梁，將細(xì)胞外的刺激信號(hào)有效地傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能和行為。4-1BB在多種細(xì)胞類(lèi)型中均有表達(dá)。在免疫系統(tǒng)中，它主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，且CD8+T細(xì)胞相較于CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平更高，這使得4-1BB在共刺激CD8+T細(xì)胞的活化、增殖和功能發(fā)揮方面具有更為顯著的作用。此外，NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）以及活化的單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞上也存在4-1BB的表達(dá)。在NK細(xì)胞上，4-1BB信號(hào)傳導(dǎo)能夠顯著增加抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC），增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力，從而在腫瘤免疫監(jiān)視和抗病毒免疫等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在樹(shù)突狀細(xì)胞中，4-1BB的表達(dá)有助于調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟、抗原呈遞能力以及細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而影響T細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答的類(lèi)型。除了免疫細(xì)胞，4-1BB在一些腫瘤細(xì)胞上也有表達(dá)，如人類(lèi)白血病細(xì)胞和多種肺部腫瘤細(xì)胞系。腫瘤細(xì)胞表面的4-1BB表達(dá)可能參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，同時(shí)也為基于4-1BB的腫瘤免疫治療提供了潛在的靶點(diǎn)。2.1.24-1BBL分子結(jié)構(gòu)與分布4-1BBL（CD137L），屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員，是4-1BB的特異性配體。它是一種細(xì)胞結(jié)合的II型跨膜蛋白，以可溶性形式存在時(shí)，包含一個(gè)短的N端細(xì)胞質(zhì)區(qū)、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及與4-1BB結(jié)合的胞外TNF同源結(jié)構(gòu)域（THD）。這種結(jié)構(gòu)使得4-1BBL能夠穩(wěn)定地錨定在細(xì)胞表面，并通過(guò)其胞外結(jié)構(gòu)域與4-1BB特異性結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)。4-1BBL的三聚體結(jié)構(gòu)對(duì)于其與4-1BB的高效結(jié)合以及激活下游信號(hào)通路至關(guān)重要，三聚體形式能夠增強(qiáng)4-1BBL與4-1BB的親和力，促進(jìn)信號(hào)的有效傳遞。4-1BBL主要表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞（APC），如B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。在B淋巴細(xì)胞活化過(guò)程中，4-1BBL的表達(dá)上調(diào)，與T細(xì)胞表面的4-1BB相互作用，提供共刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖以及細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。在巨噬細(xì)胞中，4-1BBL的表達(dá)參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬功能、炎癥反應(yīng)以及抗原呈遞能力，通過(guò)與4-1BB的相互作用，激活巨噬細(xì)胞，使其發(fā)揮更強(qiáng)的免疫防御作用。樹(shù)突狀細(xì)胞作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，其表面的4-1BBL在啟動(dòng)初始T細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)與T細(xì)胞上的4-1BB結(jié)合，為T(mén)細(xì)胞提供重要的共刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和分化。此外，活化的T細(xì)胞自身也能表達(dá)4-1BBL，通過(guò)自身分泌的4-1BBL與自身或鄰近T細(xì)胞表面的4-1BB結(jié)合，形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞的活化和功能。在一些腫瘤細(xì)胞中，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞以及部分胃癌細(xì)胞株，也有4-1BBL的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的4-1BBL可能通過(guò)與免疫細(xì)胞上的4-1BB相互作用，影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和免疫逃逸過(guò)程。2.24-1BB/4-1BBL在免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制2.2.1T細(xì)胞活化的雙信號(hào)理論T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中扮演著核心角色，其活化過(guò)程受到嚴(yán)格且精細(xì)的調(diào)控，而雙信號(hào)理論則是闡釋T細(xì)胞活化機(jī)制的重要基礎(chǔ)。該理論指出，T細(xì)胞的活化需要兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)的協(xié)同作用，這兩個(gè)信號(hào)猶如開(kāi)啟T細(xì)胞免疫功能的“鑰匙”，缺一不可。T細(xì)胞活化的第一信號(hào)，源自T細(xì)胞抗原受體（TCR）與抗原提呈細(xì)胞（APC）表面的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）復(fù)合物的特異性結(jié)合。TCR是T細(xì)胞識(shí)別抗原的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，它能夠特異性地識(shí)別由APC攝取、加工處理后呈遞在其表面的抗原肽-MHC復(fù)合物。這種識(shí)別過(guò)程具有高度的特異性，如同鎖與鑰匙的精準(zhǔn)匹配，確保T細(xì)胞能夠準(zhǔn)確地識(shí)別外來(lái)病原體或腫瘤細(xì)胞等抗原。當(dāng)TCR與抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合后，會(huì)引發(fā)TCR復(fù)合物的構(gòu)象變化，進(jìn)而激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動(dòng)T細(xì)胞活化的初始進(jìn)程。然而，僅有第一信號(hào)的刺激，T細(xì)胞雖然能夠被激活，但這種激活往往是不完全的，無(wú)法使其充分發(fā)揮免疫效應(yīng)，甚至可能導(dǎo)致T細(xì)胞進(jìn)入無(wú)反應(yīng)狀態(tài)（anergy）或發(fā)生凋亡。為了使T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)完全活化，還需要第二信號(hào)的協(xié)同作用。第二信號(hào)由共刺激分子提供，這些共刺激分子廣泛存在于APC和T細(xì)胞表面，它們之間的相互作用為T(mén)細(xì)胞活化提供了重要的輔助信號(hào)。在眾多共刺激分子中，最為經(jīng)典的是APC表面的B7分子（包括B7-1和B7-2）與T細(xì)胞表面的CD28分子之間的相互作用。當(dāng)B7分子與CD28分子結(jié)合后，會(huì)激活CD28分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，引發(fā)一系列下游信號(hào)傳導(dǎo)事件，如激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶C（PKC）等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫活性。除了B7/CD28信號(hào)通路外，還有其他共刺激分子對(duì)也在T細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，如ICOS/ICOSL、OX40/OX40L等，它們共同構(gòu)成了復(fù)雜的共刺激信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化過(guò)程。雙信號(hào)理論強(qiáng)調(diào)了T細(xì)胞活化過(guò)程中兩個(gè)信號(hào)的協(xié)同作用，第一信號(hào)賦予T細(xì)胞對(duì)抗原的特異性識(shí)別能力，確保免疫應(yīng)答的精準(zhǔn)性；第二信號(hào)則為T(mén)細(xì)胞的充分活化提供必要的輔助刺激，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫效應(yīng)，兩者相互配合，共同啟動(dòng)和調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，使機(jī)體能夠有效地抵御病原體的入侵和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。2.2.24-1BB/4-1BBL介導(dǎo)的共刺激信號(hào)通路4-1BB與4-1BBL之間的相互作用，能夠激活一系列關(guān)鍵的信號(hào)通路，對(duì)T細(xì)胞的生物學(xué)功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。當(dāng)4-1BBL與T細(xì)胞表面的4-1BB特異性結(jié)合后，會(huì)引發(fā)4-1BB分子的三聚化，進(jìn)而招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs）家族成員，尤其是TRAF1和TRAF2。TRAF1和TRAF2與4-1BB的結(jié)合，成為激活下游信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，它們能夠進(jìn)一步激活多條重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路是4-1BB/4-1BBL介導(dǎo)的重要信號(hào)通路之一。TRAF1和TRAF2的招募能夠激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，使IκB蛋白發(fā)生磷酸化并被泛素化降解，從而釋放出NF-κB。游離的NF-κB得以進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)一系列基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這些基因產(chǎn)物在T細(xì)胞的增殖、存活和功能發(fā)揮中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，NF-κB的激活能夠促進(jìn)T細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Bfl-1的表達(dá)，增強(qiáng)T細(xì)胞的存活能力，使其能夠在免疫應(yīng)答過(guò)程中持續(xù)發(fā)揮作用。NF-κB還參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細(xì)胞因子對(duì)于T細(xì)胞的活化、增殖和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也在4-1BB/4-1BBL介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。4-1BB/4-1BBL相互作用能夠激活p38MAPK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等MAPK家族成員。p38MAPK的激活可以通過(guò)磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如ATF-2、Elk-1等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與T細(xì)胞的活化、分化和炎癥反應(yīng)。在T細(xì)胞活化過(guò)程中，p38MAPK的激活能夠促進(jìn)T細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫效應(yīng)。ERK的激活則主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和存活，通過(guò)激活下游的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫活性。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路同樣受到4-1BB/4-1BBL信號(hào)的調(diào)控。4-1BB/4-1BBL結(jié)合后，能夠激活PI3K，使其催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活A(yù)KT，AKT進(jìn)一步磷酸化下游的多種底物，如mTOR、GSK-3β等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖、存活和凋亡等過(guò)程。在T細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)T細(xì)胞的代謝重編程，增強(qiáng)T細(xì)胞的能量供應(yīng)和生物合成能力，為T(mén)細(xì)胞的活化、增殖和功能發(fā)揮提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。PI3K/AKT信號(hào)通路還參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的存活和抗凋亡能力，通過(guò)抑制促凋亡蛋白Bim的表達(dá)，增強(qiáng)T細(xì)胞的存活能力，使其能夠在免疫應(yīng)答中持續(xù)發(fā)揮作用。4-1BB/4-1BBL介導(dǎo)的共刺激信號(hào)通路通過(guò)激活NF-κB、MAPK和PI3K/AKT等多條關(guān)鍵信號(hào)通路，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、存活和功能發(fā)揮，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫活性，在抗腫瘤免疫應(yīng)答、抗病毒免疫應(yīng)答以及自身免疫性疾病等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1胃癌細(xì)胞株選擇本研究選取了四種具有代表性的人胃癌細(xì)胞株，分別為MKN-28、SGC-7901、BGC-823和MGC-803，它們展現(xiàn)出不同的分化程度，在胃癌研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。MKN-28細(xì)胞株源自人胃腺癌，屬于高分化類(lèi)型。高分化的腫瘤細(xì)胞在形態(tài)和功能上與正常組織細(xì)胞更為相似，其生長(zhǎng)相對(duì)較為緩慢，侵襲和轉(zhuǎn)移能力相對(duì)較弱。選擇MKN-28細(xì)胞株，有助于探究在相對(duì)接近正常生理狀態(tài)下，4-1BB/4-1BBL在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)特征以及對(duì)腫瘤免疫的影響。研究表明，高分化胃癌細(xì)胞可能通過(guò)特定的免疫逃逸機(jī)制來(lái)維持自身的生長(zhǎng)和生存，對(duì)MKN-28細(xì)胞株中4-1BB/4-1BBL表達(dá)的研究，能夠?yàn)榻沂具@類(lèi)免疫逃逸機(jī)制提供重要線索。SGC-7901細(xì)胞株是低分化胃腺癌細(xì)胞株，低分化意味著其細(xì)胞形態(tài)和功能與正常組織細(xì)胞差異較大，具有較強(qiáng)的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在腫瘤免疫過(guò)程中，低分化的胃癌細(xì)胞往往表現(xiàn)出更為復(fù)雜的免疫逃逸策略。研究SGC-7901細(xì)胞株中4-1BB/4-1BBL的表達(dá)情況，對(duì)于深入了解低分化胃癌細(xì)胞如何逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊具有重要意義，有望為開(kāi)發(fā)針對(duì)低分化胃癌的免疫治療策略提供關(guān)鍵靶點(diǎn)。BGC-823細(xì)胞株同樣屬于低分化胃癌細(xì)胞，它在胃癌研究中被廣泛應(yīng)用于探討腫瘤的生物學(xué)行為和治療靶點(diǎn)。與SGC-7901細(xì)胞株相比，雖然它們都為低分化胃癌細(xì)胞，但在基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)以及對(duì)免疫細(xì)胞的作用等方面可能存在差異。對(duì)BGC-823細(xì)胞株中4-1BB/4-1BBL表達(dá)的研究，能夠與SGC-7901細(xì)胞株的研究結(jié)果相互補(bǔ)充和驗(yàn)證，更全面地揭示低分化胃癌細(xì)胞與免疫逃逸之間的關(guān)系，為臨床治療低分化胃癌提供更豐富的理論依據(jù)。MGC-803細(xì)胞株為低分化粘液腺癌，其獨(dú)特的粘液分泌特性使其在腫瘤微環(huán)境的形成和腫瘤的進(jìn)展中可能發(fā)揮特殊作用。粘液腺癌的腫瘤細(xì)胞分泌大量的粘液，這些粘液可能影響腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用，干擾免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷。研究MGC-803細(xì)胞株中4-1BB/4-1BBL的表達(dá)，有助于深入了解粘液腺癌的免疫逃逸機(jī)制，以及4-1BB/4-1BBL信號(hào)通路在這種特殊類(lèi)型胃癌中的作用，為開(kāi)發(fā)針對(duì)性的免疫治療方法提供理論支持。這四種不同分化程度的胃癌細(xì)胞株涵蓋了胃癌的多種生物學(xué)特性，通過(guò)對(duì)它們中4-1BB/4-1BBL表達(dá)的研究，可以全面、系統(tǒng)地分析不同分化程度的胃癌細(xì)胞與免疫逃逸之間的關(guān)聯(lián)，為揭示胃癌免疫逃逸的復(fù)雜機(jī)制提供多角度的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床胃癌的免疫治療提供更具針對(duì)性的理論基礎(chǔ)。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器本研究主要使用了以下試劑與儀器：主要實(shí)驗(yàn)試劑：TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，該試劑常用于從細(xì)胞和組織中提取總RNA，其高效的裂解和核酸分離能力確保了RNA的高質(zhì)量提取。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品，具有高逆轉(zhuǎn)錄效率和準(zhǔn)確性，能夠?qū)⑻崛〉腞NA高效地逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供優(yōu)質(zhì)模板。PCR試劑盒同樣來(lái)自TaKaRa公司，包含了PCR反應(yīng)所需的各種成分，如TaqDNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等，保證了PCR反應(yīng)的特異性和高效性。4-1BB、4-1BBL兔抗人多克隆抗體購(gòu)自SantaCruz公司，該公司的抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白，為免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)4-1BB和4-1BBL的蛋白表達(dá)提供了可靠工具。免疫組化檢測(cè)試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，包含了免疫組化實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑，如二抗、顯色劑等，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作流程，提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。MTT（四甲基偶氮唑鹽）購(gòu)自Sigma公司，常用于細(xì)胞活力和增殖的檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶活性，間接反映細(xì)胞的存活和增殖情況。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品，RPMI-1640培養(yǎng)基是一種常用的細(xì)胞培養(yǎng)基，能夠?yàn)榧?xì)胞提供適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；胎牛血清則為細(xì)胞培養(yǎng)提供了豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，用于從外周血中分離淋巴細(xì)胞，其獨(dú)特的密度梯度特性能夠有效地分離出純度較高的淋巴細(xì)胞。TNF-α、IL-2、IL-10ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，這些試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-2、IL-10等淋巴因子的含量，為研究免疫細(xì)胞的功能和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供了重要手段。主要實(shí)驗(yàn)儀器：PCR擴(kuò)增儀為Eppendorf公司產(chǎn)品，具有精確的溫度控制和快速的升降溫速度，能夠保證PCR反應(yīng)在最佳條件下進(jìn)行，提高擴(kuò)增效率和特異性。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司，可對(duì)PCR擴(kuò)增后的凝膠進(jìn)行成像和分析，準(zhǔn)確地檢測(cè)和分析目的基因的表達(dá)水平。酶標(biāo)儀為T(mén)hermo公司產(chǎn)品，用于ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)吸光度值，從而定量分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液中淋巴因子的含量。CO?培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司，能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，滿足細(xì)胞培養(yǎng)的要求，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供了無(wú)菌的工作環(huán)境，有效防止了微生物的污染。離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司，具有多種離心模式和高轉(zhuǎn)速，可用于細(xì)胞的收集、洗滌和分離等操作。倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的變化。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1RT-PCR測(cè)定mRNA表達(dá)采用TRIzol試劑提取四種人胃癌細(xì)胞株（MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803）的總RNA。具體步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞用PBS清洗2次，每1×106個(gè)細(xì)胞加入1mlTRIzol試劑，充分吹打混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。隨后加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min，12000rpm離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層無(wú)色水相含有RNA，小心吸取水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，12000rpm離心10min，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄上清，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，7500rpm離心5min，盡量棄盡乙醇，室溫晾干或真空干燥RNA沉淀。最后加入適量的DEPC水溶解RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度，OD260/OD280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取1-5μg總RNA，利用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如下：在0.5ml微量離心管中，加入總RNA、5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、Oligo(dT)Primer（50μM）1μl、Random6mers（100μM）1μl，補(bǔ)充適量的DEPCH2O使總體積達(dá)20μl。輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件為：37℃15min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5s（逆轉(zhuǎn)錄酶失活），4℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用TaKaRaPCR試劑盒。PCR反應(yīng)體系（25μl）包括：10×PCRBuffer2.5μl、dNTPMixture（各2.5mM）2μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、cDNA模板1μl、TaKaRaTaq（5U/μl）0.25μl，加ddH2O至25μl。4-1BB引物序列：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為[X]bp；4-1BBL引物序列：上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為[X]bp；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為[X]bp。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，[退火溫度]退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析目的基因的表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)目的基因條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值來(lái)半定量分析4-1BB、4-1BBL的mRNA表達(dá)水平。3.2.2免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定蛋白表達(dá)將四種人胃癌細(xì)胞株以適當(dāng)密度接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)。首先用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，固定過(guò)程中需在室溫下進(jìn)行，以確保細(xì)胞形態(tài)和抗原結(jié)構(gòu)的完整性。固定結(jié)束后，再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。為了減少非特異性染色，將細(xì)胞用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10-15min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。之后用PBS洗滌3次，每次5min。接著用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液室溫封閉30min，封閉過(guò)程中需將24孔板置于濕盒中，以防止溶液蒸發(fā)。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，不洗，直接加入適當(dāng)稀釋的4-1BB、4-1BBL兔抗人多克隆抗體（根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)推薦的稀釋比例進(jìn)行稀釋?zhuān)话銥?:100-1:500），4℃孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗（稀釋比例一般為1:200-1:500），室溫孵育30-60min。孵育完成后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。最后進(jìn)行顯色反應(yīng)，使用DAB顯色試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1-2min，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，分析4-1BB、4-1BBL的蛋白表達(dá)情況及細(xì)胞定位，陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。3.2.3MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞殺傷活性取健康志愿者外周血，用淋巴細(xì)胞分離液通過(guò)密度梯度離心法分離人淋巴細(xì)胞。具體操作如下：將外周血與等量的PBS混勻，緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液上層，注意保持界面清晰，1800rpm離心20min。此時(shí)血液分為三層，上層為血漿和血小板，中層為淋巴細(xì)胞分離液，下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。小心吸取中層白膜層（主要含淋巴細(xì)胞）轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，1500rpm離心10min，棄上清，用培養(yǎng)基重懸淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。將四種人胃癌細(xì)胞株調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。分別以效靶比（淋巴細(xì)胞：胃癌細(xì)胞）為50:1、25:1、12.5:1的比例將淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞加入96孔板中，每孔總體積為200μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置只含胃癌細(xì)胞的對(duì)照組和只含淋巴細(xì)胞的空白組。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μlMTT（5mg/ml）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后1500rpm離心10min，小心吸棄上清，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處的吸光度（OD值）。按照公式計(jì)算淋巴細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷率：殺傷率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/對(duì)照組OD值]×100%。3.2.4ELISA法檢測(cè)淋巴因子含量將淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞按照效靶比25:1的比例加入24孔板中，每孔總體積為1ml，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置只含胃癌細(xì)胞的對(duì)照組和只含淋巴細(xì)胞的空白組。將24孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，1500rpm離心10min，收集上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆?。使用TNF-α、IL-2、IL-10ELISA檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-2、IL-10的含量。具體步驟如下：將所需數(shù)量的酶標(biāo)板條固定于酶標(biāo)板框架上，每孔加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，設(shè)復(fù)孔，然后加入50μl生物素標(biāo)記的抗體工作液，輕輕振蕩混勻，37℃孵育60min。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次浸泡30s，拍干。每孔加入100μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素工作液，37℃孵育30min。再次洗滌酶標(biāo)板5次。每孔加入90μl底物溶液，37℃避光孵育15-20min。最后每孔加入50μl終止液，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出樣品中TNF-α、IL-2、IL-10的含量。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.14-1BB/4-1BBL在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況4.1.1mRNA表達(dá)水平通過(guò)RT-PCR技術(shù)，對(duì)四種胃癌細(xì)胞株（MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803）中4-1BB和4-1BBL的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，在凝膠電泳圖上，四種細(xì)胞株均出現(xiàn)了與預(yù)期片段大小相符的特異性條帶（圖1）。其中，4-1BB基因擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度為[X]bp，4-1BBL基因擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度為[X]bp，內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為[X]bp。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以目的基因條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值表示mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，4-1BB的mRNA表達(dá)水平從高到低依次為：MGC-803（77.30％）、BGC-823（71.68％）、SGC-7901（40.06％）、MKN-28（37.65％）。這表明4-1BB在不同分化程度的胃癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，且在低分化的MGC-803和BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)相對(duì)較高，而在高分化的MKN-28細(xì)胞株中表達(dá)相對(duì)較低。4-1BBL的mRNA表達(dá)水平從高到低依次為：MKN-28（46.63％）、SGC-7901（37.13％）、BGC-823（20.43％）、MGC-803（14.14％），即4-1BBL在高分化的MKN-28細(xì)胞株中表達(dá)最高，隨著胃癌細(xì)胞分化程度的降低，其表達(dá)水平逐漸下降。<圖片1：4-1BB/4-1BBL在胃癌細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)（M：Marker；1：MKN-28；2：SGC-7901；3：BGC-823；4：MGC-803）>不同分化程度的胃癌細(xì)胞株中4-1BB和4-1BBLmRNA表達(dá)水平的差異，可能與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性及免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)。4-1BB在低分化胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)，可能反映了這些細(xì)胞在生長(zhǎng)、增殖和侵襲過(guò)程中對(duì)免疫逃逸機(jī)制的更強(qiáng)依賴，通過(guò)高表達(dá)4-1BB來(lái)干擾免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和攻擊。而4-1BBL在高分化胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)，可能提示高分化胃癌細(xì)胞在免疫逃逸過(guò)程中采取了與低分化細(xì)胞不同的策略，或許通過(guò)調(diào)節(jié)4-1BBL的表達(dá)來(lái)影響免疫細(xì)胞的功能，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。4.1.2蛋白表達(dá)水平采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)四種胃癌細(xì)胞株中4-1BB和4-1BBL的蛋白表達(dá)情況，陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒（圖2）。結(jié)果顯示，四種胃癌細(xì)胞株（BGC-823、SGC-7901、MGC-803、MKN-28）的細(xì)胞膜和胞漿均有4-1BB陽(yáng)性表達(dá)。4-1BB著色程度由深到淺依次為：MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-28，這與mRNA水平的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了4-1BB在低分化的MGC-803和BGC-823細(xì)胞株中蛋白表達(dá)相對(duì)較高，而在高分化的MKN-28細(xì)胞株中表達(dá)相對(duì)較低。對(duì)于4-1BBL，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示四種胃癌細(xì)胞株的細(xì)胞膜和胞漿也均有陽(yáng)性表達(dá)。4-1BBL著色程度由深到淺依次為：SGC-7901、BGC-823、MGC-803、MKN-28，雖然與mRNA表達(dá)水平的排序略有差異，但總體上也表明4-1BBL在不同胃癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，且在SGC-7901細(xì)胞株中表達(dá)相對(duì)較高。<圖片2：4-1BB/4-1BBL在胃癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×400；A：4-1BB在MGC-803中的表達(dá)；B：4-1BB在BGC-823中的表達(dá)；C：4-1BB在SGC-7901中的表達(dá)；D：4-1BB在MKN-28中的表達(dá)；E：4-1BBL在SGC-7901中的表達(dá)；F：4-1BBL在BGC-823中的表達(dá)；G：4-1BBL在MGC-803中的表達(dá)；H：4-1BBL在MKN-28中的表達(dá)）>4-1BB和4-1BBL在蛋白水平的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證了它們?cè)谖赴┘?xì)胞中的存在及分布。4-1BB在低分化胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)，可能賦予這些細(xì)胞更強(qiáng)的免疫逃逸能力，通過(guò)與免疫細(xì)胞表面的4-1BBL相互作用，干擾免疫細(xì)胞的活化和功能，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷。而4-1BBL在不同細(xì)胞株中的表達(dá)差異，可能影響著胃癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用方式和強(qiáng)度，進(jìn)而影響腫瘤免疫微環(huán)境的形成和腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。這種蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平的相互印證，為深入研究4-1BB/4-1BBL在胃癌免疫逃逸中的作用機(jī)制提供了更為全面和可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2人淋巴細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性運(yùn)用MTT法測(cè)定不同效靶比（50:1、25:1、12.5:1）和不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）下人淋巴細(xì)胞對(duì)四種胃癌細(xì)胞株（MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803）的殺傷活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中可以清晰地看出，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨著效靶比的升高，人淋巴細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性均呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢(shì)。在相同效靶比條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，殺傷活性也逐漸增強(qiáng)。在效靶比為50:1時(shí)，培養(yǎng)72h后，人淋巴細(xì)胞對(duì)MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803細(xì)胞株的殺傷率分別達(dá)到了[X1]%、[X2]%、[X3]%、[X4]%，與效靶比為12.5:1時(shí)培養(yǎng)24h的殺傷率相比，有顯著提高。<圖片3：不同效靶比和時(shí)間下人淋巴細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性>進(jìn)一步分析殺傷活性與4-1BB/4-1BBL表達(dá)的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)，4-1BBL表達(dá)相對(duì)較高的MKN-28細(xì)胞株，在相同條件下，人淋巴細(xì)胞對(duì)其殺傷活性相對(duì)較高。在效靶比為25:1，培養(yǎng)48h時(shí)，人淋巴細(xì)胞對(duì)MKN-28細(xì)胞株的殺傷率為[X5]%，高于對(duì)4-1BBL表達(dá)較低的MGC-803細(xì)胞株的殺傷率[X6]%。這表明胃癌細(xì)胞表面4-1BBL的表達(dá)水平可能與人淋巴細(xì)胞的殺傷活性密切相關(guān)，較高的4-1BBL表達(dá)可能有助于增強(qiáng)人淋巴細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。而4-1BB表達(dá)較高的MGC-803和BGC-823細(xì)胞株，雖然人淋巴細(xì)胞對(duì)其殺傷活性在隨著效靶比和時(shí)間增加而增強(qiáng)，但與4-1BB表達(dá)較低的細(xì)胞株相比，并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律。這可能暗示4-1BB在人淋巴細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷活性中的作用較為復(fù)雜，并非簡(jiǎn)單的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系，或許還受到其他因素的調(diào)控和影響。4.3共培養(yǎng)上清液中淋巴因子含量變化采用ELISA法對(duì)淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)48h后的上清液中TNF-α、IL-2、IL-10的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表中數(shù)據(jù)可以看出，不同胃癌細(xì)胞株與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中淋巴因子含量存在明顯差異。與MKN-28細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中，TNF-α含量最高，達(dá)到（[X1]±[X2]）pg/ml，IL-2含量為（[X3]±[X4]）pg/ml。這可能與MKN-28細(xì)胞株相對(duì)較高的4-1BBL表達(dá)水平有關(guān)，4-1BBL與淋巴細(xì)胞表面的4-1BB相互作用，激活淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其分泌TNF-α和IL-2等淋巴因子。研究表明，4-1BB/4-1BBL信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力。IL-10在與MGC-803細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中含量最高，為（[X5]±[X6]）pg/ml。IL-10是一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，MGC-803細(xì)胞可能通過(guò)高表達(dá)4-1BB等機(jī)制，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌更多的IL-10，從而抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。已有研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分泌IL-10，來(lái)抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，營(yíng)造有利于腫瘤生長(zhǎng)的免疫微環(huán)境。<表1：淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中淋巴因子含量（pg/ml，x±s，n=3）>細(xì)胞株TNF-αIL-2IL-10MKN-28[X1]±[X2][X3]±[X4][X7]±[X8]SGC-7901[X9]±[X10][X11]±[X12][X13]±[X14]BGC-823[X15]±[X16][X17]±[X18][X19]±[X20]MGC-803[X21]±[X22][X23]±[X24][X5]±[X6]進(jìn)一步分析淋巴因子含量與4-1BB/4-1BBL表達(dá)及淋巴細(xì)胞殺傷活性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，4-1BBL表達(dá)較高的胃癌細(xì)胞株，與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-2含量相對(duì)較高，同時(shí)淋巴細(xì)胞對(duì)其殺傷活性也相對(duì)較高。如MKN-28細(xì)胞株4-1BBL表達(dá)較高，其共培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-2含量較高，淋巴細(xì)胞對(duì)其殺傷率也較高。這表明4-1BBL通過(guò)與4-1BB相互作用，促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌TNF-α和IL-2等淋巴因子，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的殺傷活性，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。而4-1BB表達(dá)較高的MGC-803細(xì)胞株，共培養(yǎng)上清液中IL-10含量較高，淋巴細(xì)胞對(duì)其殺傷活性相對(duì)較低。這可能是因?yàn)?-1BB在MGC-803細(xì)胞株中的高表達(dá)，通過(guò)某種機(jī)制誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌更多的IL-10，抑制了免疫反應(yīng)，降低了淋巴細(xì)胞的殺傷活性。五、討論5.14-1BB/4-1BBL表達(dá)差異對(duì)胃癌免疫逃逸的影響腫瘤免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而4-1BB/4-1BBL作為重要的共刺激信號(hào)分子，其在不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)差異與免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)。在本研究中，通過(guò)對(duì)四種不同分化程度的胃癌細(xì)胞株（MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803）的研究，發(fā)現(xiàn)4-1BB和4-1BBL的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的差異，這些差異可能在胃癌免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。從mRNA和蛋白表達(dá)水平來(lái)看，4-1BB在低分化的MGC-803和BGC-823細(xì)胞株中表達(dá)相對(duì)較高，而在高分化的MKN-28細(xì)胞株中表達(dá)相對(duì)較低。低分化胃癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，它們高表達(dá)4-1BB可能是一種免疫逃逸策略。研究表明，腫瘤細(xì)胞表面的4-1BB可以與免疫細(xì)胞表面的4-1BBL結(jié)合，激活免疫細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，但這種激活可能并不總是促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。在某些情況下，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)4-1BB可能會(huì)干擾免疫細(xì)胞的正常功能，使其無(wú)法有效地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。4-1BB與4-1BBL結(jié)合后，可能激活免疫細(xì)胞內(nèi)的抑制性信號(hào)通路，導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能受損，如抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌，使T細(xì)胞無(wú)法充分發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。低分化胃癌細(xì)胞高表達(dá)4-1BB，還可能通過(guò)與免疫細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合4-1BBL，減少免疫細(xì)胞表面4-1BBL與4-1BB的有效結(jié)合，從而削弱免疫細(xì)胞的活化和功能，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。4-1BBL在高分化的MKN-28細(xì)胞株中表達(dá)最高，隨著胃癌細(xì)胞分化程度的降低，其表達(dá)水平逐漸下降。4-1BBL作為4-1BB的配體，其表達(dá)差異同樣對(duì)胃癌免疫逃逸產(chǎn)生影響。在高分化的MKN-28細(xì)胞中，雖然4-1BBL表達(dá)較高，但免疫逃逸現(xiàn)象仍然存在，這可能是由于腫瘤細(xì)胞存在其他免疫逃逸機(jī)制來(lái)對(duì)抗4-1BBL介導(dǎo)的免疫激活作用。腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)下調(diào)MHC分子的表達(dá)，減少抗原呈遞，使免疫細(xì)胞難以識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原，從而逃避4-1BBL介導(dǎo)的免疫監(jiān)視。腫瘤細(xì)胞還可能分泌免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、IL-10等，抑制免疫細(xì)胞的活性，抵消4-1BBL的免疫激活作用。而在低分化胃癌細(xì)胞中，4-1BBL表達(dá)較低，使得免疫細(xì)胞無(wú)法獲得足夠的共刺激信號(hào)來(lái)有效激活，T細(xì)胞的活化、增殖和殺傷功能受到抑制，腫瘤細(xì)胞得以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊。5.24-1BB/4-1BBL與淋巴細(xì)胞殺傷活性及淋巴因子分泌的關(guān)系4-1BB/4-1BBL共刺激信號(hào)在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞殺傷活性以及淋巴因子分泌方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這一作用機(jī)制對(duì)于理解腫瘤免疫過(guò)程至關(guān)重要。從本研究結(jié)果來(lái)看，4-1BBL表達(dá)相對(duì)較高的MKN-28細(xì)胞株，人淋巴細(xì)胞對(duì)其殺傷活性相對(duì)較高。這一現(xiàn)象背后的機(jī)制與4-1BB/4-1BBL介導(dǎo)的共刺激信號(hào)通路密切相關(guān)。當(dāng)4-1BBL與淋巴細(xì)胞表面的4-1BB結(jié)合后，能夠激活一系列下游信號(hào)通路，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化和增殖。4-1BB/4-1BBL結(jié)合會(huì)引發(fā)4-1BB分子的三聚化，招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs），進(jìn)而激活核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，啟動(dòng)一系列與淋巴細(xì)胞活化、增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的活性，使其能夠更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。4-1BB/4-1BBL信號(hào)還能激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)其殺傷能力。在淋巴因子分泌方面，4-1BB/4-1BBL共刺激信號(hào)同樣有著顯著影響。研究表明，4-1BBL表達(dá)較高的胃癌細(xì)胞株，與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-2含量相對(duì)較高。TNF-α是一種具有強(qiáng)大抗腫瘤活性的細(xì)胞因子，它能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以通過(guò)激活其他免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，間接增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。4-1BB/4-1BBL信號(hào)激活后，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)TNF-α基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而使淋巴細(xì)胞分泌更多的TNF-α。IL-2是T細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所必需的細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫功能。4-1BB/4-1BBL信號(hào)通路的激活，能夠上調(diào)T細(xì)胞表面IL-2受體的表達(dá)，增加T細(xì)胞對(duì)IL-2的敏感性，同時(shí)促進(jìn)T細(xì)胞分泌IL-2，形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫活性。而對(duì)于4-1BB表達(dá)較高的MGC-803細(xì)胞株，共培養(yǎng)上清液中IL-10含量較高，淋巴細(xì)胞對(duì)其殺傷活性相對(duì)較低。IL-10是一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，它可以抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，阻礙抗原呈遞細(xì)胞的功能，從而抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答。MGC-803細(xì)胞高表達(dá)4-1BB，可能通過(guò)某種機(jī)制誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌更多的IL-10。4-1BB與4-1BBL結(jié)合后，在MGC-803細(xì)胞中可能激活了不同于其他細(xì)胞株的信號(hào)通路，促進(jìn)了IL-10的分泌。腫瘤細(xì)胞還可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，使免疫細(xì)胞對(duì)4-1BB/4-1BBL信號(hào)的響應(yīng)發(fā)生改變，導(dǎo)致IL-10的分泌增加，抑制了免疫反應(yīng)，降低了淋巴細(xì)胞的殺傷活性。4-1BB/4-1BBL共刺激信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的活化、增殖以及淋巴因子的分泌，影響著淋巴細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性，在腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮著復(fù)雜而關(guān)鍵的作用。深入研究這一作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示胃癌免疫逃逸的機(jī)制，為開(kāi)發(fā)基于4-1BB/4-1BBL的胃癌免疫治療策略提供理論依據(jù)。5.3研究結(jié)果對(duì)胃癌免疫治療的潛在意義本研究深入揭示了4-1BB/4-1BBL在不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)特征，以及其與淋巴細(xì)胞殺傷活性和淋巴因子分泌之間的緊密聯(lián)系，這些發(fā)現(xiàn)為以4-1BB/4-1BBL為靶點(diǎn)的胃癌免疫治療策略開(kāi)發(fā)提供了極具價(jià)值的理論依據(jù)，展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景?；?-1BB/4-1BBL的單抗藥物開(kāi)發(fā)具有重要的研究?jī)r(jià)值。研究表明，4-1BB單抗能夠激活T細(xì)胞，顯著增強(qiáng)其抗腫瘤活性。在黑色素瘤和前列腺癌等動(dòng)物模型中，4-1BB單抗的使用成功抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，提高了小鼠的生存率。然而，早期開(kāi)發(fā)的激動(dòng)型4-1BB抗體面臨著諸多挑戰(zhàn)，由于4-1BB在體內(nèi)廣泛表達(dá)，抗體使用后會(huì)過(guò)度激活機(jī)體T細(xì)胞，從而帶來(lái)潛在的肝毒性和全身免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。為了克服這些問(wèn)題，科學(xué)家們正在積極探索新的開(kāi)發(fā)策略。例如，瘤內(nèi)給藥策略被認(rèn)為可以最大化地利用4-1BB激動(dòng)劑，使腫瘤微環(huán)境中的淋巴細(xì)胞有效活化，進(jìn)而有效控制用藥劑量，減輕這類(lèi)產(chǎn)品劑量依賴的肝臟毒性。雙特異性抗體的研發(fā)也是一個(gè)重要方向，靶向腫瘤抗原或腫瘤基質(zhì)成分的4-1BB雙特異性抗體，可使誘導(dǎo)的T細(xì)胞激活局限于表達(dá)靶抗原的組織，從而減輕系統(tǒng)毒性。在胃癌治療中，開(kāi)發(fā)特異性針對(duì)胃癌細(xì)胞表面4-1BB的單抗藥物，有望通過(guò)激活T細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)，結(jié)合上述優(yōu)化策略，如采用瘤內(nèi)給藥方式或設(shè)計(jì)雙特異性抗體，或許能夠在提高治療效果的同時(shí)，降低藥物的毒副作用，為胃癌患者提供更安全、有效的治療手段。聯(lián)合治療方案也是胃癌免疫治療的重要研究方向。4-1BB/4-1BBL信號(hào)通路與其他免疫治療靶點(diǎn)的聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同增效的潛力。PD-1/PD-L1抑制劑通過(guò)阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制，恢復(fù)T細(xì)胞的抗腫瘤活性。將4-1BB單抗與PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合使用，可能從不同角度增強(qiáng)T細(xì)胞的活化和功能。4-1BB單抗可以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和存活，而PD-1/PD-L1抑制劑可以解除腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，兩者結(jié)合有望更有效地激活T細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。臨床研究表明，在黑色素瘤患者中，4-1BB單抗與PD-1抑制劑的聯(lián)合治療取得了較好的療效。在胃癌治療中，這種聯(lián)合治療方案也值得深入探索。還可以考慮將4-1BB/4-1BBL信號(hào)通路與化療、放療等傳統(tǒng)治療方法相結(jié)合?；熀头暖熆梢灾苯託[瘤細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)引起腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡，釋放腫瘤抗原，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。與4-1BB/4-1BBL介導(dǎo)的免疫治療相結(jié)合，可能會(huì)增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，提高治療效果。在動(dòng)物模型中，化療聯(lián)合4-1BB激動(dòng)劑的治療方案顯示出比單一治療更好的抗腫瘤效果。對(duì)于不同分化程度的胃癌細(xì)胞，由于其4-1BB/4-1BBL表達(dá)水平和免疫逃逸機(jī)制存在差異，